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Längsschnittliche In-vivo-Bildgebung von Netzhautzellen mit maßgeschneiderten Adeno-assoziierten Virus-Serotypen mittels konfokaler Scanning-Laser-Ophthalmoskopie

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DOI:

10.3791/67106

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11. Oktober 2024

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1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAV)-Vektoren für die zellspezifische Markierung und die in vivo-Bildgebung mit einem konfokalen Scanning-Laser-Ophthalmoskop (CSLO). Diese Methode ermöglicht die Untersuchung verschiedener retinaler Zelltypen und ihres Beitrags zur Funktion und Erkrankung der Netzhaut.

Zusammenfassung

Die dynamische Natur der zellulären Prozesse der Netzhaut erfordert Fortschritte bei der Genübertragung und Live-Überwachungstechniken, um das Verständnis und die Behandlung von Augenerkrankungen zu verbessern. In dieser Studie wird ein optimierter Ansatz für adeno-assoziierte Viren (AAV) vorgestellt, bei dem spezifische Serotypen und Promotoren verwendet werden, um eine optimale Transfektionseffizienz in gezielten Netzhautzellen, einschließlich retinaler Ganglienzellen (RGCs) und Müller-Gliazellen, zu erreichen. Unter Ausnutzung der Präzision der konfokalen Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (CSLO) stellt diese Arbeit eine nicht-invasive Methode für die In-vivo-Bildgebung vor, die die longitudinale Expression des AAV-vermittelten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) erfasst. Dieser Ansatz macht terminale Verfahren überflüssig und bewahrt die Kontinuität der Beobachtung und das Wohlbefinden des Probanden. Darüber hinaus kann das GFP-Signal in AAV-infizierten RGCs entlang der Sehbahn bis zum Colliculus superior (SC) und dem Nucleus geniculatus lateralis (LGN) verfolgt werden, was das Potenzial für eine direkte Kartierung der Sehbahn ermöglicht. Diese Ergebnisse liefern ein detailliertes Protokoll und demonstrieren die Anwendung dieses leistungsstarken Werkzeugs für Echtzeitstudien des Verhaltens von Netzhautzellen, der Krankheitspathogenese und der Wirksamkeit gentherapeutischer Interventionen, die wertvolle Einblicke in die lebende Netzhaut und ihre Verbindungen bieten.

Einleitung

Als einziger optisch zugänglicher Teil des Zentralnervensystems dient die Netzhaut als wertvolles Modell für die neurowissenschaftliche Forschung1. Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Ausgangsneuronen der Netzhaut, die visuelle Informationen an das Gehirn übertragen, spielen eine entscheidende Rolle für die Sehfunktion. Ihr Verlust oder ihre Funktionsstörung führt zu Sehstörungen und irreversibler Blindheit, wie sie beim Glaukom und anderen Optikusneuropathien beobachtetwerden 2. Müller-Gliazellen, die wichtigsten Gliazellen in der Netzhaut, sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Netzhauthomöostase, die strukturelle und metabolische Unterstützung der Neuronen, die Regulierung des Neurotransmitterspiegels und die Unterstützung der Netzhautreparatur und -regeneration3. Ihre Funktionsstörung ist an verschiedenen Netzhauterkrankungen beteiligt, darunter die diabetische Retinopathie4, die altersbedingte Makuladegeneration5 und das okuläre ischämische Syndrom6. RGCs und Müller-Gliazellen weisen enge Wechselwirkungen und Interdependenz auf; Müller-Gliazellen stellen eine wesentliche Unterstützung für RGCs dar, während die RGC-Aktivität die Müller-Glia-Funktion beeinflussen kann 3,7. Die Untersuchung sowohl von RGCs als auch von Müller-Gliazellen ist entscheidend für das Verständnis der Netzhautfunktion und die Entwicklung wirksamer Behandlungen für mehrere Netzhauterkrankungen.

Aktuelle Assessments in der Netzhautforschung nutzen vor allem Techniken wie die optische Kohärenztomographie (OCT), um die Dicke der retinalen Nervenfaserschicht oder die Trajektorien von Axonbündeln zu messen 8,9. Diese Methoden sind zwar von unschätzbarem Wert für den Nachweis von RGC-Verlusten, bieten jedoch aufgrund der begrenzten Auflösung keinen detaillierten Überblick über die RGC-Morphologie und die Gliazellen. Auch wenn fortschrittliche Techniken wie die Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (AO-SLO) mit adaptiver Optik die Bildgebung von RGCs, Photorezeptoren und Gliazellen in der lebenden menschlichen Netzhaut auf zellulärer Ebene ermöglichen10, beschränken ihre technische Komplexität und ihre eingeschränkte Zugänglichkeit ihren Einsatz in erster Linie auf spezialisierte Forschungsumgebungen. Angesichts dieser Einschränkungen besteht ein anhaltender Bedarf an der Entwicklung zugänglicherer und zuverlässigerer Methoden für die eingehende Untersuchung spezifischer retinaler Zellpopulationen in vivo.

Dementsprechend zielt dieses Protokoll darauf ab, einen alternativen Bildgebungsansatz einzuführen, der für Forschungsanwendungen in Netzhautzellen geeignet ist. Es kombiniert die Leistungsfähigkeit der AAV-vermittelten zelltypspezifischen Markierung mit der nicht-invasiven Natur der CSLO-Bildgebung. Adeno-assoziierte Viren (AAVs) sind vielseitige Gentransfervektoren, die für ihre geringe Immunogenität und ihre Fähigkeit bekannt sind, ein breites Spektrum von Zelltypen zu transduzieren, einschließlich sich teilender und nicht teilender Zellen11. Dies macht sie zu idealen Werkzeugen, um bestimmte Zellpopulationen innerhalb der komplexen Netzhautumgebung ins Visier zu nehmen. Durch die Verwendung von AAV-Vektoren mit sorgfältig ausgewählten Serotypen und Promotoren kann eine selektive Expression von fluoreszierenden Proteinen in mehreren Zelltypen von Interesse, wie z.B. RGCs und Müller-Glia, erreicht werden. Zum Beispiel ist AAV2 für seine höhere Transduktionseffizienz in den RGCsbekannt 12,13, während AAV8 ausgesprochen effektiv auf Photorezeptorenabzielt 14, und AAV9 zeigt starke Transfektionsfähigkeiten in Müller-Gliazellen15, was eine breite Wirksamkeit über verschiedene retinale Zellschichten hinweg zeigt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Wirksamkeit von AAV nicht nur von der Wahl des Serotyps abhängt, sondern auch von den Promotoren, die die Intensität und Zellspezifität der Transgenexpression bestimmen, was die Bedeutung einer sorgfältigen Selektion unterstreicht, um eine optimale Transduktion zu erreichen.

Für die RGC-Markierung verwendet dieses Protokoll AAV2 mit dem humanen Synapsin (hSyn)-Promotor. AAV2 zeigt eine effiziente Transduktion von RGCs nach intravitrealer Injektion13, und der hSyn-Promotor, ein ubiquitärer neuronaler Promotor, treibt eine starke und spezifische Transgenexpression in diesen Zellenan 16. Für Müller-Gliazellen verwendet das Protokoll AAV9-Vektoren, die vom GfaABC1D-Promotor17 angetrieben werden, der eine starke Transgenexpression in diesen Zellenzeigt 15. Dieser gezielte Markierungsansatz ermöglicht es den Forschern, diese Zellen vom umgebenden Netzhautgewebe zu unterscheiden und sie über die Zeit zu verfolgen, was eine Grundlage für die In-vivo-Überwachung von Netzhautzellen und ihre Reaktionen auf Veränderungen der Bioumwelt bietet.

Die konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (CSLO) ist ein nicht-invasives Bildgebungsverfahren, das hochauflösende Bilder der lebenden Netzhaut liefert und die Echtzeit-Visualisierung von fluoreszenzmarkierten retinalen Zellpopulationen ermöglicht 18,19,20. Ein fokussierter Laserstrahl scannt die Netzhaut und erfasst emittiertes Licht, das durch eine Lochblende fällt, um unscharfe Signale zu eliminieren, was zu schärferen Bildern mit verbessertem Kontrast führt. Dieses Protokoll verwendet ein Heidelberg Spectralis CSLO-System, das in großem Umfang für die Bildgebung von Netzhautzellen bei lebenden Tieren eingesetzt wird, einschließlich Studien zur Visualisierung transgen-markierter RGCs21, 22und Mikroglia23. Durch den Einsatz der HRA CSLO-Einheit mit einem 488-nm-Laser und entsprechenden Filtern können Forscher fluoreszenzmarkierte RGCs oder Müller-Gliazellen in lebenden Tieren nach intravitrealer Injektion von AAV-Vektoren, die fluoreszierende Reportergene tragen, abbilden. Das longitudinale Bildgebungsprotokoll mit wöchentlichen Sitzungen, die sowohl die zentrale als auch die periphere Netzhaut abdecken, verfolgt die Veränderungen im Laufe der Zeit. Um das Wohlergehen der Tiere in den Vordergrund zu stellen, nutzt das Protokoll das automatische Eye-Tracking-System (ART) der HRA CSLO-Einheit, das eine präzise Bildaufnahme ohne Vollnarkose oder Kontaktlinsen ermöglicht.

Dieses Protokoll nutzt die kombinierte Leistung von AAV und CSLO, um die longitudinale Überwachung bestimmter retinaler Zelltypen in vivo zu ermöglichen. Durch die Kombination der Zelltypspezifität der AAV-vermittelten Markierung mit den nicht-invasiven, hochauflösenden Bildgebungsmöglichkeiten von CSLO ermöglicht diese Methode den Forschern, die dynamischen Veränderungen in RGCs und Müller-Gliazellen als Reaktion auf verschiedene Stimuli oder Eingriffe zu untersuchen. Diese Erkenntnisse bergen ein erhebliches Potenzial für die Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Strategien für Netzhauterkrankungen.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University, Peking, genehmigt. Für alle Experimente wurden vier Wochen alte adulte männliche C57BL/6J-Mäuse (mit einem Gewicht zwischen 15 und 20 g) verwendet und in temperaturkontrollierten Räumen mit einem 12/12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Standard-Nagetierfutter und Wasser waren ad libitum verfügbar. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. AAV-vermittelte Transfektion von Netzhautzellen

HINWEIS: Für die gezielte Transduktion von RGCs verwendet dieses Protokoll AAV2-hSyn-eGFP, das den hSyn-Promotor enthält, um eine robuste Expression von verstärktem GFP zu fördern. Die Müller-Gliazellen werden mit AAV9-GfaABC1D-eGFP angegriffen. Um eine optimale Transduktionseffizienz und eine robuste Transgenexpression zu erreichen, wird für intravitreale Injektionen bei Mäusen ein minimaler AAV-Titer von 1 x10 12 viralen Genomen (vg)/ml empfohlen13.

  1. Halten Sie sich bei der Durchführung von AAV-vermittelten Transfektionsverfahren von Netzhautzellen an strenge Sicherheitsprotokolle, um eine versehentliche Exposition zu verhindern und eine sichere Arbeitsumgebung zu gewährleisten.
  2. Führen Sie alle Verfahren mit viralen Vektoren in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank (BSC) durch. Statten Sie das Personal während der gesamten Dauer des Eingriffs mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) aus, einschließlich Laborkitteln, Handschuhen und Augenschutz.
  3. Entsorgen Sie alle scharfen und scharfen Gegenstände und biologisch gefährlichen Materialien ordnungsgemäß in Übereinstimmung mit den institutionellen Sicherheitsprotokollen, um die Einhaltung der Vorschriften zu gewährleisten und das gesamte Laborpersonal zu schützen.

2. Vorbereitung von viralen Vektoren und Tieren

  1. Beziehen Sie AAV2-hSyn-eGFP oder die AAV9-GfaABC1D-eGFP-Vektoren, die bei -80 °C gelagert wurden. Tauen Sie die Vektoren unmittelbar vor der Verwendung auf Eis auf, um die Integrität des Virus zu erhalten.
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital-Natrium in einer Dosierung von 50 mg/kg. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Reflexe des hinteren Fußes testen, bevor Sie weitere Maßnahmen ergreifen.
  3. Schneiden Sie die Schnurrhaare, um Eingriffe in den Operationsbereich während des Eingriffs zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Orbita 2 s lang mit einer 20%igen Povidon-Jod-Lösung, spülen Sie sie dann gründlich mit steriler normaler Kochsalzlösung aus.
  4. Tragen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacain topisch auf, um Beschwerden zu minimieren und unwillkürliche Augenbewegungen zu verhindern.

3. Handhabung und intravitreale Injektion von viralen Vektoren

  1. Übertragen Sie 1 μl der ausgewählten AAV-Lösung (entweder AAV2-hSyn-eGFP oder AAV9-GfaABC1D-eGFP) auf ein Stück sauberen, vorgekühlten Paraffinfilm, um Temperaturschwankungen zu vermeiden, die die Virusaktivität beeinträchtigen könnten.
  2. Aspirieren Sie die AAV-Lösung mit einer Hamilton-Glasspritze mit einer abgeschrägten 33-G-Nadel unter dem ophthalmologischen Operationsmikroskop.
  3. Legen Sie die Maus in Bauchlage unter das Mikroskop. Neigen Sie den Kopf leicht, um die für die Injektion vorgesehene Augenseite anzuheben. Passen Sie die Vergrößerung des Mikroskops an und optimieren Sie sie, um den oberen Bereich der Mausorbita eindeutig zu identifizieren.
  4. Führen Sie die Nadel 1-2 mm posterior des Limbus am oberen Skleralrand des Auges in die Glaskörperhöhle ein. Injizieren Sie die AAV-Lösungen langsam, um einen Rückfluss oder druckinduzierte Schäden zu vermeiden.
    HINWEIS: Lage der Injektionsstelle: Führen Sie die Injektion im oberen temporalen Quadranten des Auges durch, etwa 1 mm hinter dem Limbus. Wählen Sie diesen Ort, um große Blutgefäße zu vermeiden und das Risiko einer Beschädigung der Linse zu minimieren. Vermeiden Sie Injektionsstellen, die zu nahe am Limbus liegen, um ein Eindringen der Iris oder einen Abrieb der Linse zu verhindern. Vermeidung von Gefäßen: Verwenden Sie ein Operationsmikroskop, um die geplante Injektionsstelle vor der Injektion sorgfältig auf sichtbare Blutgefäße zu untersuchen. Wenn Schiffe vorhanden sind, passen Sie den Eintrittspunkt leicht an, um sie zu vermeiden. Führen Sie die Nadel in einem flachen Winkel parallel zur Iris ein, um das Risiko einer Gefäßschädigung weiter zu verringern. Vermeiden Sie wiederholte Injektionen in denselben Bereich, um das Risiko einer subretinalen Blutung zu verringern.
  5. Halten Sie die Nadel 30 s lang an Ort und Stelle, damit sich die Vektoren in der Glaskammer verteilen und auf der Netzhautoberfläche absetzen können, wodurch die Chancen auf eine erfolgreiche Transduktion maximiert werden.
  6. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um das Risiko eines Glaskörperrückflusses zu minimieren.
  7. Tragen Sie unmittelbar nach der Injektion eine topische antibiotische Salbe auf die Injektionsstelle auf. Stellen Sie sicher, dass die Salbe gleichmäßig aufgetragen wird, um die Augenoberfläche vollständig zu bedecken und Augeninfektionen und Entzündungen zu vermeiden.
    HINWEIS: Die antibiotische Salbe enthält 1 mg/g Dexamethason, 3500 IE/g Neomycinsulfat und 6000 IE/g Polymyxin-B-Sulfat.
  8. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um die Körpertemperatur während der Genesung von der Narkose aufrechtzuerhalten, und überwachen Sie sie genau auf Anzeichen von Beschwerden oder Anomalien. Sobald sie sich vollständig erholt haben und keine Komplikationen aufweisen, bringen Sie sie in ihre Käfige zurück, wo Sie Zugang zu normalem Futter und Wasser haben.

4. In-vivo-Bildgebung mit CSLO

  1. Zubereitung von Tieren
    1. Wählen Sie die Maus aus, die nach 4 Wochen intravitrealer Injektion mit AAV2-hSyn-eGFP oder AAV9-GfaABC1D-eGFP infiziert ist. Tragen Sie einen Tropfen einer Augenlösung mit 0,5 % Tropicamid und 0,5 % Phenylephrin auf die Augenoberfläche auf, um die Pupille auf einen Durchmesser von etwa 2 mm zu erweitern22.
      HINWEIS: Für die optimale Fluoreszenzmarkierung der Netzhautzellen nach intravitrealer Injektion wird ein Zeitintervall von mindestens 4 Wochen für die AAV-Transduktion empfohlen13. Darüber hinaus wurden in unseren Experimenten zur Quetschung des Sehnervs (ONC) die Netzhäute 4 Wochen nach der Infektion sowie an den Tagen 7 und 14 nach der Quetschverletzung abgebildet. Diese Zeitpunkte wurden gewählt, um sowohl die anfängliche AAV-Expression als auch das Fortschreiten der Netzhautveränderungen nach ONC zu erfassen.
    2. Decken Sie die Bildgebungsplattform mit einem Stück des sauberen Pads ab, um eine mögliche Kontamination mit tierischen Exkrementen während des Operationsprozesses zu vermeiden.
      HINWEIS: Die speziell angefertigte Bildgebungsplattform bietet dem Tier ausreichend Platz, um sich in Bauchlage zu legen, wodurch Stabilität gewährleistet und Bewegungen während der manuellen Fixierung für eine optimale Bildaufnahme minimiert werden.
    3. Schieben Sie die Maus vorsichtig auf die Bildgebungsplattform und lassen Sie eine Akklimatisierungsphase von 2-5 Minuten vor der Bildgebung ein, um Stress zu minimieren und die Anpassung an die Bildgebungsumgebung zu erleichtern.
    4. Halten Sie das Tier mit Hilfe eines zweiten Technikers sanft fest, während Sie während des gesamten Eingriffs einen bewussten Zustand bewahren. Stellen Sie nach 15 Sekunden Bildgebung ein Ruheintervall von 10 Sekunden bereit, um das Blinzeln der Augen zu ermöglichen und die Feuchtigkeit der Hornhaut zu erhalten.
      HINWEIS: Schrubben Sie die Kopfhaut sanft, um eine spontane Augenlidstraffung zu induzieren, und vermeiden Sie die Verwendung von erzwungener Augenlidfixierung oder zusätzlichen Vorrichtungen wie Clips, wodurch das Risiko von Augenverletzungen verringert wird. Eine Vollnarkose wird nicht eingesetzt, um die optische Klarheit bei längeren Bildgebungssitzungen zu erhalten, da sie die vorübergehende Linsentrübung verschlimmern kann. Bringen Sie während des gesamten Eingriffs eine qualitativ hochwertige Bildaufnahme mit Komfort und Sicherheit für die Tiere in Einklang. Schließen Sie den gesamten Eingriff innerhalb von 5 Minuten ab, um das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten und die Bildqualität zu erhalten.
    5. Passen Sie die Kopfhaltung an und richten Sie das Kameraobjektiv aus, indem Sie den Fokusknopf (Abbildung 1B) und den Mikromanipulator (Abbildung 1C) so abstimmen, dass der Bereich of Interest (ROI) für die nachfolgende In-vivo-Bildgebung ausgerichtet ist.
  2. Systemkonfiguration
    1. Befestigen Sie ein berührungsloses 55°-Weitwinkelobjektiv an der Kamera, um das Sichtfeld des Fundusbereichs zu erweitern.
    2. Stellen Sie das Filterrad auf Position A (Angiographie), um die Erfassung des Infrarot- (IR) und Fluoreszenzangiographie-Bildgebungsmodus (FA) zu ermöglichen (Abbildung 1A). Schalten Sie den Laser und das Netzteil ein, um das CSLO-Bildgebungssystem zu aktivieren.
    3. Öffnen Sie die Software Heidelberg Eye Explorer und erstellen Sie eine neue Untersuchung, indem Sie auf das Symbol Neuer Patient oben in der Menüleiste klicken. Geben Sie die relevanten Tierinformationen ein und akzeptieren Sie die standardmäßige Hornhautkrümmung von 7,7 mm im Pop-up-Fenster.
    4. Wählen Sie die gelbe Startschaltfläche (Abbildung 1E) auf dem Bildschirm des Bedienfelds aus, um den Live-Imaging-Modus zu starten.
  3. In-vivo-CSLO-Bildgebung
    1. Wählen Sie auf dem Bedienfeld den IR-Modus (Abbildung 1G) mit Autofluoreszenz bei 820 nm Anregungswellenlänge. Um eine hochauflösende Bildgebung zu erzielen, wird die High Res. Der Modus (HR) wird entweder über die Fensterschnittstelle oder über das manuelle Bedienfeld aktiviert (Abbildung 1F).
      HINWEIS: Die Infrarot-Reflexionsbildgebung (IR) ist in der Regel der erste Schritt in der ophthalmischen CLSO-Bildgebung, die vor der Fluoreszenzangiographie (FA) aufgenommen wird, um eine Basisansicht zu erhalten. Gleichmäßige Beleuchtung, minimale Artefakte und scharfe Fokussierung auf die wichtigsten Netzhautgefäße sind entscheidend für die Zuverlässigkeit der Fokussierung auf der Z-Ebene und das Erzielen hochwertiger IR-Bilder.
    2. Bewegen Sie das Objektiv mit dem Joystick in Richtung Mausauge mit dem XYZ-Mikromanipulator zur Feineinstellung. Untersuchen Sie die optische Transparenz und drehen Sie den Empfindlichkeitsregler (Abbildung 1D) gegen den Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Fundusbildes auf 40 % bis 60 % zu verringern, wodurch eine Überbelichtung des Fundus vermieden und die Visualisierung von Netzhautdetails verbessert wird.
    3. Stellen Sie den Fokusknopf und den Mikromanipulator ein, bis die Papille und die Netzhautgefäße auf dem Fundus eindeutig identifiziert sind.
      HINWEIS: Kriterien für die optimale Fokusebene: (1) Gleichmäßig ausgeleuchtete Fundusansicht ohne dunkle Ecken. (2) Uniformierte Beleuchtung um die Papille ohne fokale dunkle Flecken oder Verzerrung. (3) Klare Lumenform der großen retinalen Gefäße mit der sichtbaren Bewegung des Blutflusses.
    4. Wechseln Sie in den FA-Modus (Abbildung 1H) mit einem blauen Festkörperlaser bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einem Barrierefilter bei 500 nm. Drehen Sie den Empfindlichkeitsregler (Abbildung 1D) im Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Fundusbildes auf 50 % bis 107 % zu erhöhen, um den Zielbereich der Netzhaut zu beleuchten.
    5. Stellen Sie den ART-Mittelwert (ein blauer Balken unten links auf der Softwareoberfläche) auf mindestens 15 ein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Diese Funktion mittelt eine Reihe von B-Scans, die am selben Ort aufgenommen wurden, und verbessert so die Bildqualität.
      HINWEIS: Ein höherer ART-Mittelwert verbessert zwar in der Regel die Bildqualität durch Mittelwertbildung, verlängert aber auch die Scandauer. Diese verlängerte Dauer könnte möglicherweise das Risiko einer Dehydrierung der Hornhaut und der Ermüdung der Tiere erhöhen, Faktoren, die insbesondere bei der Bildgebung von Wachtieren sorgfältig berücksichtigt werden müssen.
    6. Richten Sie sich wieder auf die innere Ebene der Netzhaut aus und zielen Sie speziell auf die GFP-exprimierenden RGCs oder die Müller-Gliazellen ab. Feinjustierungen werden vorgenommen, um eine scharfe Ausleuchtung der gewünschten Zellpopulation, wie z. B. RGC-Soma und Axone, oder des Müller-Zellkörpers zu gewährleisten. Die Bildempfindlichkeit ist ausgewogen, um eine optimale Visualisierung zu erreichen und eine Übersättigung der GFP-positiven Zellen zu verhindern.
      HINWEIS: Um Bilder mit vergleichbarer Klarheit und Helligkeit des GFP-Signals zu erhalten, sollte die Empfindlichkeitserfassung für alle Mäuse im Experiment konstant sein.
    7. Drücken Sie den Empfindlichkeitsknopf (Abbildung 1D), um den ART-Modus zu starten, der online ein Live-Mittelwertbild erzeugt. Warten Sie, bis der blaue Balken (der den ART-Mittelwert darstellt) unten links auf der Softwareoberfläche den eingestellten ART-Wert (≥ 20 Frames) erreicht hat, und tippen Sie auf die Schaltfläche Acquire auf der Bedienoberfläche, um die Fundusbilder aufzunehmen.
      HINWEIS: Im ART-Modus ist Eye-Tracking integriert, um kleinere Augenbewegungen während der In-vivo-Bildgebung automatisch zu kompensieren und so eine konsistente Fokussierung auf die ausgewählte Netzhautfokusebene zu ermöglichen.
    8. Sobald Sie die gewünschten Bilder aufgenommen haben, verlassen Sie den ART-Modus, indem Sie den Empfindlichkeitsknopf auf dem Touchpanel drücken.
      HINWEIS: Um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern und ein spontanes Blinzeln der Augen zu ermöglichen, wurden während des Bildgebungsprozesses alle 15 s 10 Sekunden Pausen eingelegt.
    9. Um durch den nasalen und temporalen Netzhautbereich zu navigieren, bewegen Sie den Kamerakopf horizontal, während Sie das Live-Bild auf dem Bildschirm betrachten. Sobald der Zielbereich erreicht ist, passen Sie den Fokus an und starten Sie den Bildgebungsprozess, wie in den Schritten 2.3.1 bis 2.3.8 beschrieben.
      HINWEIS: Behalten Sie langsame und kontrollierte Kamerabewegungen bei und sorgen Sie gleichzeitig für eine gleichmäßige und helle Ausleuchtung des Augenhintergrunds. Wenn dunkle Bereiche erscheinen, verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Kameraposition vertikal anzupassen und die Netzhaut neu zu zentrieren.
    10. Um die obere Netzhaut abzubilden, stellen Sie die Haltung des Mauskopfes vorsichtig in eine Position mit dem Gesicht nach oben ein. Neigen Sie den Kamerakopf moderat nach oben, um ihn an der oberen Netzhautregion auszurichten. Stellen Sie den Fokus nach Bedarf neu ein und fahren Sie mit der Bildgebung fort.
    11. Nach Abschluss der Bildgebung werden alle gewünschten Netzhautregionen aus dem Aufnahmefenster verlassen und die Bilder werden automatisch gespeichert. Tragen Sie topisches Gleitmittel auf das abgebildete Auge auf, um die Hydratation der Hornhaut aufrechtzuerhalten.
    12. Um die Untersuchung des kontralateralen Auges einzuleiten, positionieren Sie das Tier wieder auf die gegenüberliegende Seite der Plattform und wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.3.11.

5. Bildverarbeitung und -analyse

  1. Bildexport und -aufbereitung
    1. Öffnen Sie die Software Heidelberg Eye Explorer und wählen Sie die gewünschte CSLO-Bildgebungssitzung in guter Qualität aus. Wählen Sie einzelne oder aufeinanderfolgende Bilder derselben Netzhautstelle mit konsistenten Empfindlichkeitseinstellungen im Zeitverlauf.
    2. Schließen Sie verschwommene Bilder mit schlechter Schärfe oder Hornhautklarheit aus und stellen Sie sicher, dass nur Bilder mit klarer Visualisierung der Netzhautstrukturen für die Analyse verwendet werden. Exportieren Sie diese Bilder im TIFF-Format zur weiteren Verarbeitung.
  2. Bildausrichtung und Zuschneiden
    1. Gruppieren Sie Bilder pro Mausauge basierend auf derselben Netzhautregion.
      HINWEIS: Die Originalbilder, die mit dem CSLO-System erfasst wurden, werden im folgenden Format gespeichert: TIFF mit einer Größe von 1536 x 1536 Pixeln, einer Auflösung von 5,69 μm/Pixel und einem ART-Wert von ≥15.
    2. Importieren Sie die Bilder für Nachuntersuchungen in eine geeignete Bildverarbeitungssoftware. Drehen und richten Sie die Bilder nach Bedarf aus, um sie an die Ausrichtung des Grundlinienbildes anzupassen. Verwenden Sie beim Speichern oder Exportieren der verarbeiteten Bilder Einstellungen, die die höchstmögliche Bildqualität beibehalten, um potenzielle Komprimierungsartefakte zu minimieren.
    3. Richten Sie die CSLO-Bilder aus einer Zeitreihe desselben Auges aus, indem Sie sie so drehen, dass sie mit dem jeweiligen Basislinienbild übereinstimmen, wobei das Gefäßsystem und die Sehnervenscheibe als Orientierungspunkte verwendet werden.
      HINWEIS: Untersuchen Sie jedes ausgerichtete Bild sorgfältig und stellen Sie vor dem Zuschneiden sicher, dass es die folgenden Kriterien erfüllt: (1) Vollständige Erfassung der Netzhautregion: Das Bild muss die beabsichtigte Netzhautregion von Interesse vollständig umfassen, einschließlich wichtiger Orientierungspunkte wie der Papille und der wichtigsten Blutgefäße; (2) Abwesenheit von Bewegungsartefakten: Das Bild sollte frei von Unschärfen, Schlieren oder Duplikaten von Strukturen sein, die durch Augenbewegungen während der Bildgebung verursacht werden. (3) Minimale Verzerrung: Das Bild sollte die Netzhautstruktur genau wiedergeben, ohne Verformungen, Dehnungen oder Kompressionsartefakte, die durch Bildwinkel oder Linseneffekte entstehen könnten. (4) Ausgewogenheit der Bildqualitätsmetriken: Bewertungen des Hintergrundrauschens (Standardabweichung der Pixelintensitäten in strukturfreien Bereichen < 5 (Skala 0-255)); Signal-Rausch-Verhältnis (SNR >20), Beleuchtungskonsistenz (Variationskoeffizient zwischen sechs Bildquadranten <10 %) und Bildgleichmäßigkeit (Variationskoeffizient in homogenen Bereichen <15 %).
    4. Wählen Sie das gedrehte Bild aus und exportieren Sie es im TIFF-Format. Verwenden Sie für jeden Zeitpunkt das Zuschneidewerkzeug, um 5-10 Bereiche (jeweils 300 x 300 Pixel) mit GFP-positiven Zellen aus den qualitätsgeprüften Bildern nach dem Zufallsprinzip auszuwählen und zuzuschneiden. Exportieren Sie jedes zugeschnittene Bild einzeln im TIFF-Format zur weiteren Analyse.
  3. Messung der Fluoreszenzintensität
    1. Öffnen Sie die zugeschnittenen CSLO-Bilder (8-Bit-Graustufen, 300 x 300 Pixel) in ImageJ/Fiji.
    2. Um die allgemeinen Änderungen der Fluoreszenzsignale zu untersuchen, messen Sie die Gesamtfluoreszenzintensität pro zugeschnittenem Bild mit der Option "Analysieren" > "Messen" (oder Strg + M). Notieren Sie den "Mittelwert", der die durchschnittliche GFP-Fluoreszenzintensität des gesamten zugeschnittenen Bildes darstellt.
  4. RGC-Quantifizierung
    1. Passen Sie in ImageJ/Fiji den Intensitätsschwellenwert der zugeschnittenen CSLO-Bilder mit Image > Adjust > Brightness/Contrast an, um eine optimale Visualisierung einzelner weißer Soma-Körper vor dem schwarzen Hintergrund zu erzielen.
      HINWEIS: Bestimmen Sie einen individuellen Schwellenwert, nachdem Sie den Stapel der zugeschnittenen Bilder überprüft haben, oder wenden Sie einen konsistenten Schwellenwertalgorithmus an (z. B. Huangs Methode5 in ImageJ/Fiji). Für Huangs Methode: (1) Konvertieren Sie Bilder in 8-Bit-Graustufen (Bild > Geben Sie > 8-Bit ein). (2) Greifen Sie auf das Schwellenwert-Tool zu (Abbildung > Anpassen > Schwellenwerts). (3) Wählen Sie Huang als Schwellenwertmethode aus. (4) Zeigen Sie eine Vorschau der Segmentierung an und klicken Sie auf Übernehmen. Der Schwellenwert wird automatisch berechnet und im Bildhistogramm angezeigt.
    2. Aktivieren Sie das Cell Counter Plugin und klicken Sie auf jedes GFP-positive RGC-Soma zur Zählung. Notieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, die im analysierten Bereich markiert sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zugeschnittenen Bilder ab jedem Folgezeitpunkt.
  5. Datenanalyse
    1. Exportieren Sie die Daten zur Zellzahl und Fluoreszenzintensität in eine Tabellenkalkulation oder eine Statistiksoftware (z. B. GraphPad Prism).
    2. Führen Sie geeignete statistische Tests auf der Grundlage des entsprechenden Versuchsdesigns und der entsprechenden Hypothesen durch. Interpretieren Sie die Ergebnisse und schließen Sie.

Ergebnisse

In Anlehnung an das vorgestellte Protokoll wurden verschiedene Netzhautzellen erfolgreich sichtbar gemacht und in vivo mit einer Kombination aus AAV-vermitteltem Gentransfer und CSLO verfolgt. AAV2-hSyn-eGFP transduzierte effektiv RGCs, was zu einer robusten eGFP-Expression in der gesamten Netzhaut führte, wie durch CSLO und eine Kolokalisation mit dem RGC-spezifischen Marker, dem RNA-Bindungsprotein mit multiplem Spleißen (RBPMS), das spezifisch in der Ganglienzellschicht vorkommt (Abbildung 2 und Abbildung 3). Das Protokoll bestätigte auch die Fähigkeit, Müller-Gliazellen mit AAV9-GfaABC1D-eGFP zu bekämpfen. Die CSLO-Visualisierung zeigte eine weit verbreitete eGFP-Expression, insbesondere innerhalb der inneren Netzhautschichten, die mit dem bekannten Hauptverteilungssegment der Müller-Gliazellen übereinstimmt. Das GFP-positive Signal kolokalisierte auch stark mit dem Müller-Glia-Marker Glutaminsynthetase (GS), was die Spezifität dieses Ansatzes weiter bestätigt (Abbildung 2E, F und Abbildung 3B). Diese Ergebnisse bestätigten erneut die Vielseitigkeit der AAV-gestützten Genverabreichung für die Untersuchung verschiedener retinaler Zelltypen. Um die Fähigkeit zu bestätigen, auf Müller-Gliazellen abzuzielen, wurde AAV9-GfaABC1D-eGFP verwendet. Die CSLO-Bildgebung zeigte eine weit verbreitete eGFP-Expression, insbesondere innerhalb der inneren Netzhautschichten, die mit der bekannten Verteilung der Müller-Gliazellen übereinstimmt (Abbildung 2E,F). Dieses selektive Expressionsmuster wurde durch den hohen Grad an Kolokalisation, der zwischen dem GFP-Signal und dem Müller-Gliamarker Glutaminsynthetase (GS) beobachtet wurde, weiter validiert (Abbildung 3B).

Um die Spezifität und Effizienz des viralen Targeting-Ansatzes sowohl für RGCs als auch für Müller-Gliazellen zu quantifizieren, wurde eine Kolokalisationsanalyse durchgeführt, um die GFP-Fluoreszenz mit Standard-Zelltypmarkern zu vergleichen (Abbildung 3B,D). Insgesamt wurden 6 Mausaugen analysiert. Bei RGCs, die mit AAV2-hSyn-GFP behandelt wurden, betrug die Transduktionseffizienz 64 % ± 3 %, während die Transduktionsspezifität 68 % ± 3 % betrug. Bei Müller-Glia, die mit AAV9-GfaABC1D-GFP behandelt wurde, betrug die Transduktionseffizienz 58 % ± 2 % und die Transduktionsspezifität 71 % ± 2 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieser AAV-vermittelte Gentransfer-Ansatz die selektive Markierung verschiedener retinaler Zelltypen ermöglicht, was seine Vielseitigkeit für die Untersuchung zellulärer und molekularer Prozesse in der Netzhaut unterstreicht.

Um die Eignung von CSLO für die longitudinale Überwachung von retinalen Zellstörungen zu beurteilen, wurde ein transientes ONC-Modell an AAV2-hSyn-eGFP-infizierten Mäusen durchgeführt. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde ein fortschreitender Rückgang des eGFP-Signals und der RGC-Zahlen beobachtet (Abbildung 4). Das RGC-Überleben wurde mit drei Metriken quantifiziert: CSLO-Fluoreszenzintensität, in vivo Zellzahlen für CSLO-Bilder und ex vivo RGC-Zahlen von RBPMS-positiven Zellen. Nach der Bildverarbeitung, wie in Schritt 4 beschrieben, wurden mindestens 10 Regionen von Interesse (ROIs) aus jeder Netzhaut abgeschnitten (insgesamt 6 Augen), um sicherzustellen, dass jeder ROI dieselbe Netzhautposition umfasste und zu jedem Zeitpunkt klare Zellsignale aufwies. Die CSLO-Fluoreszenzintensität wurde dann quantifiziert, indem die mittlere Intensität innerhalb jedes beschnittenen ROI zu jedem Zeitpunkt gemessen wurde. In vivo wurden die Zellzahlen durch manuelle Zählung einzelner GFP-positiver RGCs innerhalb desselben geernteten ROI zu jedem Zeitpunkt erhalten. Schließlich wurden Netzhäute für die RBPMS-Immunfärbung entnommen, und RBPMS-positive Zellen wurden in 24 definierten Bereichen gezählt, die pro Netzhautsektor für jede Netzhaut abgebildet wurden. Es wurden signifikante negative Korrelationen zwischen allen drei RGC-Überlebensmetriken (CSLO-Fluoreszenzintensität, in vivo Zellzahlen und ex vivo RBPMS-positive Zellzahlen) und der Zeit nach der ONC (p < 0,001 für alle, Abbildung 4C) gefunden, was auf einen fortschreitenden RGC-Verlust und eine fortschreitende Degeneration von RGC hinweist. Wichtig ist, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen in Bezug auf die anfängliche RGC-Dichte oder die Abnahmerate beobachtet wurden, was auf eine grobe Konsistenz des ONC-Modells und des bildgebenden Ansatzes hinweist. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien zu RGC-Schäden nach ONC überein und bestätigen die Wirksamkeit dieses CSLO-basierten Protokolls als nicht-invasives und zuverlässiges Instrument zur Überwachung der RGC-Gesundheit.

Um die axonalen Projektionen von RGC innerhalb der visuellen Signalbahn weiter zu untersuchen, wurde ein dualer Markierungsansatz mit der Kombination von AAV-vermittelter eGFP-Markierung mit dem anterograden Tracer Choleratoxin Subunit B (CTB)24 verwendet. Die Mäuse erhielten eine intravitreale Injektion von CTB und wurden 2 Tage später für die histologische Analyse getötet. Die Kolokalisation von eGFP- und CTB-Signalen in den Sehnerven bestätigte die positive Verfolgung von RGC-Axonen (Abbildung 5A). Um die Veränderungen der Signale nach axonaler Verletzung weiter zu untersuchen, wurden Mäuse einer unilateralen Optikuszerquetschung (ONC) unterzogen, einem Modell für akute RGC-Schädigungen25. Kurz gesagt, die Mäuse wurden betäubt, und ein Sehnerv wurde freigelegt und etwa 1 mm hinter dem Globus mit einer feinen Pinzette für 5 s zerquetscht, was zu einer signifikanten RGC-Axotomie und anschließender Degeneration führte. Nach einer ONC-Verletzung wurde eine deutliche Verringerung der eGFP- und CTB-Intensität beobachtet, was auf einen erheblichen Nervenfaserverlust und eine Störung des axonalen Transports hinweist. Weitere Analysen von Hirnschnitten zeigten RGC-Projektionen auf den Colliculus superior (SC), eine Mittelhirnstruktur, die an der sensomotorischen Integration und den Augenbewegungen beteiligt ist, und den Nucleus geniculate lateralis (LGN), das primäre Relaiszentrum für visuelle Informationen zum visuellen Kortex. Nach ONC zeigte sich eine verminderte GFP-Intensität auf der kontralateralen Seite der Verletzung (Abbildung 5B-E). Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen dieser Methode für die Untersuchung der axonalen Degeneration von RGC und die Kartierung ihrer Projektionsmuster in vivo, was eine potenzielle Alternative zu herkömmlichen invasiven Tracing-Methoden darstellt.

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Abbildung 1: Konfokales Scanning-Laser-Ophthalmoskop (CSLO) Bildgebungssystem und Bedienfeldschnittstelle für die Live-Bildgebung der Netzhaut. (A-D) Komponenten des Bildgebungssystems: Diese Bilder zeigen die Schlüsselkomponenten des HRA CSLO-Geräts. (A) Der Filterhebel ist auf Position "A" eingestellt, um eine kombinierte Infrarotreflexions- (IR) und Fluoreszenzangiographie (FA) zu ermöglichen. (B) Mit dem Fokusknopf lässt sich der Feinfokus des Objektivs einstellen. (C) Der Mikromanipulator ermöglicht eine präzise Positionierung, Ausrichtung und Beleuchtung des Lichtstrahls auf die Netzhaut durch mehrere Freiheitsgrade (z. B. X-, Y-, Z-Achse) und Rotation. (D) Der Empfindlichkeitsknopf steuert die Helligkeit von IR- und FA-Bildern, indem er die Verstärkung des erkannten Lichtsignals einstellt. Durch Drücken des Knopfes wird die Bildmittelung gestartet, bei der mehrere Frames kombiniert werden, um das Rauschen zu reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. (E-H) Benutzeroberfläche des Bedienfelds: Die Screenshots zeigen das CSLO-Bedienfeld mit den Einstellungen, die für die Live-Bildaufnahme und -visualisierung verwendet werden. (E) Das Bedienfeld für die Erfassung wird aktiviert. (F) Für eine optimale Bildqualität wird der Modus "Hohe Auflösung" empfohlen. (G) Die IR-Bildgebungseinstellungen sind hervorgehoben und ermöglichen die Visualisierung von Netzhautstrukturen und Blutgefäßen. (H) Die FA-Bildgebungseinstellungen zeigen Optionen für die Einzelpunkt- und Mehrpunkt-Fluoreszenzbildgebung an, die die Detektion von Fluoreszenzsignalen in Netzhautzellen ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: In vivo CSLO-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Netzhautzellen nach AAV-Transfektion in C57-Mäusen. (A) Der experimentelle Zeitverlauf der CSLO-gestützten longitudinalen Bildgebung nach AAV-Transfektion im Mausauge. (B) Repräsentative CSLO-Bilder der oberen und zentralen Regionen einer C57-Maus-Netzhaut nach 4-wöchiger AAV2-hSyn-eGFP-Expression. Maßstabsbalken: 500 μm. (C) Eine manuell zusammengesetzte Netzhautmontage aus (B) zeigt die Verteilung von eGFP-exprimierenden Netzhautzellen. Maßstabsbalken: 500 μm. (D) Ein vergrößertes CSLO-Bild des Boxed-Bereichs in (C) und das entsprechende konfokale Mikroskopiebild eines retinalen Flatmounts. Die Kolokalisation von eGFP (grün) mit dem RGC-Marker RBPMS (rot) bestätigt die AAV-vermittelte Expression in retinalen Ganglienzellen (Beispiele eingekreist). Maßstabsbalken: 50 μm. (E) Eine manuell zusammengesetzte Montage einer C57-Maus-Netzhaut 4 Wochen nach der Injektion mit AAV9-GfaABC1D-eGFP, die die Müller-Glia-spezifische eGFP-Expression zeigt. Maßstabsbalken: 500 μm. (F) Ein vergrößertes CSLO-Bild des Boxed-Bereichs in (E) und das entsprechende konfokale Mikroskopiebild eines retinalen Flatmounts. Die Kolokalisation von eGFP (grün) mit dem Müller-Gliamarker Glutaminsynthetase (GS, rot) bestätigt die AAV-vermittelte Expression in Müller-Gliazellen (Beispiele eingekreist). Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Zelltypspezifität der AAV-vermittelten Genverabreichung in der Netzhaut der Maus. (A) Immunhistochemie eines Netzhautschnitts und eines Flatmounts von C57-Mäusen nach 4-wöchiger AAV2-hSyn-eGFP-Infektion. Die Kolokalisation von GFP (grün) mit RBPMS (rot) bestätigt die RGC-spezifische Expression. Maßstabsbalken: 50 μm. (B) Quantifizierung der Effizienz und Spezifität der AAV2-hSyn-GFP-Transduktion in RGCs. Die Effizienz wird als Prozentsatz der RBPMS-positiven RGCs dargestellt, die auch GFP im retinalen Flatmount exprimieren. Die Spezifität wird als Prozentsatz der GFP-positiven Zellen dargestellt, die auch im Netzhautschnitt positiv für RBPMS sind (n = 6 Augen von 4 Mäusen). (C) Immunfluoreszenzfärbung eines Netzhautschnitts und eines Flatmounts von C57-Mäusen nach 4-wöchiger AAV9-GfaABC1D-eGFP-Infektion. Die Kolokalisation von GFP (grün) mit GS (rot) bestätigt die Müller-Glia-spezifische Expression. Maßstabsbalken: 50 μm. (D) Quantifizierung der Effizienz und Spezifität der AAV9-GfaABC1D-GFP-Transduktion in Müller-Glia. Die Effizienz wird als Prozentsatz der GS-positiven Müller-Gliazellen dargestellt, die auch GFP im retinalen Flatmount exprimieren. Die Spezifität wird als Prozentsatz der GFP-positiven Zellen dargestellt, die auch im Netzhautschnitt positiv für GS sind (n = 6 Augen von 3 Mäusen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Longitudinale CSLO-Überwachung des RGC-Überlebens nach akuter Sehnervenquetschung (ONC) bei AAV2-hSyn-eGFP-Mäusen. (A) Ein schematisches Diagramm der experimentellen Zeitleiste der akuten Sehnervenverletzung nach AAV-Infektion. (B) Längsschnitt-CSLO-Bildgebung derselben Netzhaut in einer AAV2-hSyn-eGFP-Maus zu Studienbeginn, 7 Tage und 14 Tage nach ONC, Visualisierung von RGCs, die GFP-Signale exprimieren. Auf der rechten Seite sind vergrößerte Bilder der Boxed-Bereiche zu sehen, zusammen mit repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern von retinalen Flatmounts, die die Morphologie und Verteilung von RGC zeigen. Skalenbalken: 100 μm. (C) Die Quantifizierung des RGC-Überlebens über zwei Wochen nach der ONC wurde durch Messung der prozentualen Veränderung sowohl der Zellzahl als auch der CSLO-Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangswert (mittlere ± SEM) bewertet. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt beobachtet (unidirektionale ANOVA). Die lineare Regressionsanalyse ergab signifikante negative Korrelationen zwischen der Zeit nach der Verletzung und den RGC-Überlebensmetriken basierend auf der GFP-Fluoreszenz (r² = 0,945, p < 0,001), der RBPMS-Färbung (r² = 0,888, p < 0,001), der CSLO-Zellzahl (r² = 0,511, p < 0,001) und der CSLO-Fluoreszenzintensität (r² = 0,7486, p < 0,001). n = 6 Mäuse/Gruppe/Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: AAV-gestützte Kartierung von RGC-Axonprojektionen entlang der Sehbahn. (A) Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder eines Sehnervenpaares aus einer AAV2-hSyn-eGFP-Maus, die GFP-markierte RGC-Axone (grün) und Kolokalisation mit dem anterograden axonalen Tracer Choleratoxin B (CTB, magenta) zeigen. Das obere Panel bietet einen Überblick über die gesamten Sehnerven (Maßstab: 1000 μm), während das untere Panel vergrößerte Ansichten der Boxed-Regionen bietet (Maßstab: 100 μm). Zwei Wochen nach der ONC-Verletzung zeigen sowohl die GFP- als auch die CTB-Signale eine deutliche Verringerung des gesamten Sehnervs (linke Seite), was auf einen axonalen RGC-Verlust und eine Störung entlang der Sehbahn hinweist. (B) RGC-Axonprojektionen zum Colliculus superior (SC). Koronale Hirnschnitte einer AAV2-hSyn-eGFP-Maus 2 Wochen nach der ONC zeigen GFP-markierte RGC-Axone (grün) und CTB-Färbung (magenta) innerhalb des SC. Links (L): kontralaterales SC; Rechts (R): ipsilateraler SC (ONC-verletzte Seite). Maßstabsbalken: 1000 μm. (C) Eine vergrößerte Ansicht der Boxed-Region in (B) zeigt die Kolokalisation von GFP- und CTB-Signalen (zusammengeführtes Bild), wobei die RGC-Axonbündel und ihre Projektionsmuster innerhalb des SC hervorgehoben werden. Maßstabsbalken: 100 μm. (D) RGC-Axonprojektionen zum lateralen Genikulatkern (LGN) nach ONC, wobei GFP-markierte RGC-Axone (grün) und CTB-Färbungen (magenta) innerhalb des LGN sichtbar sind. Links (L): kontralaterales LGN; Rechts (R): ipsilaterale LGN (ONC-verletzte Seite). Maßstabsbalken: 1000 μm. (E) Eine vergrößerte Ansicht der Boxed-Region in (D) zeigt die RGC-Axonbündel und ihre Projektionsmuster innerhalb des LGN. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine robuste und zugängliche Methode für die In-vivo-Überwachung spezifischer retinaler Zellpopulationen, die sowohl die Leistungsfähigkeit der AAV-vermittelten Genübertragung als auch der CSLO-Bildgebung nutzt. Dieser Ansatz bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, da er Längsschnittstudien der Zelldynamik der Netzhaut und ihrer Reaktionen auf Verletzungen oder Krankheiten unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Der Erfolg dieser Methode hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Erstens ist das Erreichen einer optimalen AAV-Transduktionseffizienz entscheidend für eine robuste und spezifische Expression des fluoreszierenden Reporters in der Zielzellpopulation. Dies kann durch Faktoren wie die Auswahl des AAV-Serotyps, den Virustiter und die Injektionstechnik beeinflusst werden 13,15,16. Zweitens sind der richtige Umgang mit den Tieren und die Fixierung während der CSLO-Bildgebung unerlässlich, um Bewegungsartefakte zu minimieren und die Bildqualität zu erhalten. Der Einsatz einer speziell angefertigten Bildgebungsplattform und der Verzicht auf Vollnarkose tragen dazu bei, eine klare und konsistente Visualisierung der Netzhautstrukturen zu erreichen. Drittens ist eine sorgfältige Optimierung der CSLO-Bildgebungsparameter, einschließlich Fokus, Empfindlichkeit und Mittelwertbildung, erforderlich, um hochauflösende Bilder mit minimalem Rauschen und optimalem Signal-Rausch-Verhältniszu erhalten 26. Um die potenziellen Einschränkungen zu beheben und die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten, haben wir strenge Maßnahmen zur Kontrolle der Bildqualität und eine Erhöhung der Tierzahlen in unserem Studiendesign eingeführt.

Das Spectralis HRA CSLO-System verfügt über automatisches Eye-Tracking, das die klinische Längsschnittbildgebung verbessert. Die automatische Echtzeit-Tracking-Funktion (ART) kann während der Bildgebung einen bestimmten Netzhautbereich erfassen und so Bewegungsartefakte reduzieren. Für die klinische Bildgebung beim Menschen umfasst das System auch einen Algorithmus zur Langzeitverfolgung derselben anatomischen Netzhautlokalisation27. Diese Technologien sind jedoch aufgrund erheblicher anatomischer Unterschiede zwischen menschlichen und Nagetieraugen nicht für Nagetierstudien optimiert. Nageraugen sind viel kleiner (3-4 mm Durchmesser im Vergleich zu 24 mm beim Menschen) und es fehlen bestimmte Orientierungspunkte wie die Makula, was eine einzigartige Herausforderung für die automatisierte Verfolgung darstellt28. Folglich verlassen sich Forscher, die Nagetiermodelle untersuchen, in erster Linie auf manuelle Methoden, indem sie anatomische Orientierungspunkte wie Gefäßmuster und den Sehnervenkopf verwenden, um bestimmte Netzhautregionen zu lokalisieren und konsistente Bildgebungsebenen über Sitzungen hinweg beizubehalten13,22. Dieser Ansatz ist nicht nur aufgrund begrenzter Orientierungspunkte in Nagetieraugen notwendig, sondern auch wegen möglicher erheblicher Veränderungen der Netzhaut, die durch experimentelle Manipulationen induziert werden und automatisierte Systeme verwirren könnten, die nicht für diese spezifischen Herausforderungen ausgelegt sind. Daher stellt die Entwicklung spezialisierter Eye-Tracking- und Alignment-Algorithmen für die Netzhautbildgebung von Nagetieren eine entscheidende Zukunftsrichtung dar. Insbesondere die Anpassung von Langzeit-Tracking-Algorithmen für den Einsatz bei Kleintieren könnte die Präzision und Reproduzierbarkeit von Längsschnittstudien erheblich verbessern.

Während traditionelle histologische Techniken Tieropfer erfordern und Längsschnittstudien ausschließen, bietet diese AAV-gestützte CSLO-Bildgebungsmethode einen nicht-invasiven Ansatz zur Überwachung der Zelldynamik der Netzhaut in vivo. Dieser Ansatz baut auf früheren Arbeiten auf, die den Nutzen der cSLO-Bildgebung für die Verfolgung von longitudinalen Veränderungen in spezifischen Netzhautzellen nach Verletzungen demonstrieren, insbesondere in Tiermodellen, die transgene fluoreszierende Proteinmarkierung verwenden 19,21,22,29. Diese Studien haben die Fähigkeit von CSLO hervorgehoben, eine Reihe von retinalen Zellereignissen in vivo zu visualisieren, einschließlich Zelltod, Überleben und möglicherweise sogar Migration oder Prozesswachstum. Dieses Protokoll erweitert die Anwendung dieser Technik zur Untersuchung der AAV-vermittelten Transduktion spezifischer retinaler Zellpopulationen und ermöglicht es uns, die Langzeiteffekte der AAV-Verabreichung und der Transgenexpression in der Netzhaut zu überwachen und wichtige Einblicke in das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu liefern. Aktuelle klinische Beurteilungen mit OCT konzentrieren sich hauptsächlich auf den RGC-Axonverlust durch Messung der Schichtdicke der retinalen Nervenfaser9, aber es fehlt ihnen die Auflösung, um die individuelle RGC-Morphologie oder die Beteiligung von Gliazellen zu beurteilen. Obwohl AO-SLO die Bildgebung auf zellulärer Ebene in der lebenden menschlichen Netzhautermöglicht 10, schränken seine Komplexität und begrenzte Verfügbarkeit seinen Einsatz vor allem in Forschungsumgebungen ein. Darüber hinaus erfordert die Differenzierung von Gliazelltypen innerhalb der AO-SLO häufig zusätzliche Markierungsmethoden30. Diese Methode überwindet diese Einschränkungen, indem sie einen umfassenderen und zugänglicheren Ansatz zur Visualisierung und Verfolgung einzelner RGCs und anderer fluoreszenzmarkierter retinaler Zellpopulationen im Laufe der Zeit bietet. Dies eröffnet Möglichkeiten zur Untersuchung zellulärer Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen und hilft bei der Entwicklung zielgerichteter Therapien. Darüber hinaus kann die Kombination der AAV-gestützten CSLO-Bildgebung mit der Optogenetik31 oder der Kalzium-Bildgebung32 das Verständnis der Funktion von retinalen Zellen und ihrer Rolle bei der visuellen Verarbeitung, der Entwicklung von Schaltkreisen und der Regeneration weiter vertiefen.

Trotz der Stärke dieses Ansatzes sollten einige Einschränkungen und mögliche Überlegungen zur Problembehandlung berücksichtigt werden. Es kann zu einer Variabilität der AAV-Transduktionseffizienz kommen, die eine Optimierung der Injektionsparameter oder des Virustiters für bestimmte Zelltypen oder experimentelle Bedingungen erforderlich macht. Die CSLO-Bildgebung kann durch Faktoren wie Hornhauttrübungen, Instabilität des Tränenfilms und Augenbewegungen beeinflusst werden, die eine sorgfältige Überwachung und Anpassung während der Bildaufnahme erfordern. Darüber hinaus schränkt die begrenzte Eindringtiefe von CSLO die Visualisierung auf die inneren Netzhautschichten ein, wodurch tiefere Strukturen wie Photorezeptoren möglicherweise ausgeschlossenwerden 33. Das Spectralis cSLO-System ermöglicht eine klare Visualisierung unterschiedlicher zellulärer Merkmale und Muster innerhalb der Netzhaut34. Während diese Bildgebungsmodalität unter bestimmten Bedingungen die Einzelzellbeobachtung erleichtern kann, wie in einer früheren Arbeit zur Visualisierung einzelner RGCs in spärlich markierten Thy1-YFP-Mäusengezeigt wurde 22, kann sie für die Quantifizierung einzelner Zellen in dicht markierten Szenarien eine Herausforderung darstellen. In dieser Studie kann beispielsweise die massenhafte Markierung von RGCs mit eGFP nach einer AAV-vermittelten Netzhautinfektion manchmal die klare Visualisierung einzelner Zellen behindern, insbesondere in Bereichen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus und Zellüberlappung. Diese Herausforderung wird bei der Bildgebung von Müller-Gliazellen noch verschärft, da ihre längliche Morphologie, die sich über die gesamte Netzhautdicke35 erstreckt, es schwierig macht, eine einzelne Zelle innerhalb einer einzigen Fokalebene mit cSLO zu erfassen. Die Beurteilung der Wirksamkeit der AAV9-vermittelten Müller-Glia-Infektion beruht daher in erster Linie auf der Bewertung der gesamten Transduktionsmuster und -verteilung mittels CSLO-Bildgebung.

Darüber hinaus verbessert die ART-Mittelwertbildung im HRA-System zwar die Bildqualität, die erhöhte Scandauer weist jedoch praktische Einschränkungen auf, insbesondere bei der Bildgebung von Tieren im Wachzustand. Der gewählte ART-Mittelwert von 15 dient dazu, die Bildqualität mit der Scanzeit in Einklang zu bringen und eine ausreichende Rauschunterdrückung bei gleichzeitiger Beibehaltung einer angemessenen Scandauer zu gewährleisten. Um das Unbehagen und den Stress der Tiere zu minimieren, müssen die bildgebenden Verfahren auf Effizienz optimiert werden, geschultes Personal eingesetzt werden, das in der Handhabung und Bildgebung wacher Tiere geschult ist, und die Tiere während der gesamten Bildgebungssitzungen sorgfältig auf Anzeichen von Unbehagen oder Hornhauttrockenheit überwachen. Diese Maßnahmen waren entscheidend für die Sicherstellung sowohl der Datenqualität als auch des Tierschutzes und unterstreichen, wie wichtig es ist, beide Faktoren bei der Anwendung der ART-Mittelwertbildung für die In-vivo-Netzhautbildgebung in wachen Tiermodellen zu berücksichtigen.

Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen und potenzieller Variabilitätsquellen können Forscher geeignete Schritte unternehmen, um Bildgebungsprotokolle zu optimieren, Artefakte zu minimieren und die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit ihrer Daten sicherzustellen.

Insgesamt bietet diese zugängliche und leicht implementierbare Methode ein leistungsfähiges Mittel, um das komplexe Zusammenspiel zwischen RGCs und Müller-Gliazellen zu untersuchen, insbesondere als Reaktion auf Verletzungen oder Krankheiten. Indem er es Forschern ermöglicht, diese dynamischen Wechselwirkungen zu visualisieren und zu quantifizieren, erleichtert dieser Ansatz die Entdeckung neuartiger zellulärer und molekularer Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Dies wiederum gibt Aufschluss über die Entwicklung zielgerichteter Therapiestrategien und verbesserter Gegenmaßnahmen gegen Krankheiten.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (82130029) unterstützt. Abbildung 2A und Abbildung 4A wurden mit BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
33 Gauge NadelHamilton Corp., Reno, NV, USA7803-05Für die intravitreale Injektion
0,5% Proparacain Verifizierter Lieferant - Santen Pharmaceutical Co., Ltd.Topische Aneasthetika
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., ChinaVirustiter: 2,7 x 1012 virale Genome (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., ChinaVirustiter: 4,5 x 1012 virale Genome (vg)/ml 
BetadineGesundes medizinisches Unternehmen001651Topische Antiseptika
Hornhautzange (gezahnt)Mingren Eye Instruments, ChinaMR-F301AFür die Sicherung des Augenlids während der intravitrealen Injektion
Dumont 05# PinzetteFST51-AGT5385Für die Quetschung des Sehnervs
Graphpad Prisma GraphPadPrisma, USAGrafikzeichnung und statistische Analyse
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Deutschland"IR"- und "FA"-Modus für CSLO-Bildgebung
Bild J/FijiNational Institutes of Health, USABildverarbeitung
Maxitrol antibiotische SalbeAlcon Laboratories, INC. USA0065-0631Topische Antibiotika
MikroliterspritzeHamilton Corp., Reno, NV, USA7633-01Für die intravitreale Injektion
Mydrin-P Ophthalmische LösungSanten Pharmaceutical Co., Ltd, JapanPupillenerweiterung
Ophthalmologisches Operationsmikroskop Leica AG, Heerbrugg, SchweizM220Für chirurgische Eingriffe
Pentorbarbitol SodiumSigma Aldrich, USA57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, USABildausrichtung und Zuschneiden
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, DeutschlandTopisches Schmiermittel 

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