Profiling von mütterlichen Verhaltensreaktionen während der Ganzhirnbildgebung

Zusammenfassung

Hier wird eine Videoanalyse-Pipeline vorgestellt, die Herausforderungen bei der Verhaltensüberwachung in MRT-Umgebungen überwindet und die Erkennung von unangeleiteten Verhaltensreaktionen auf externe Signale ermöglicht. Diese Analyse wird ein umfassenderes Verständnis der evozierten internen Zustandsänderungen und der hirnweiten Aktivität ermöglichen.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte bei bildgebenden Verfahren für das gesamte Gehirn haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, zu untersuchen, wie koordinierte Gehirnaktivität externe Signale verarbeitet, interne Zustandsänderungen beeinflusst und Verhaltensreaktionen hervorruft. Zum Beispiel ist die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT) eine nicht-invasive Technik, die es ermöglicht, die Aktivität des gesamten Gehirns bei wachen, sich verhaltenden Mäusen anhand der blutsauerstoffabhängigen (BOLD) Reaktion zu messen. Um jedoch BOLD-Reaktionen, die durch externe Reize hervorgerufen werden, vollständig zu verstehen, ist es entscheidend, dass die Experimentatoren auch die Verhaltensreaktionen während der Scans bewerten. Die MRT-Umgebung stellt eine Herausforderung für dieses Ziel dar, so dass die gängigen Methoden der Verhaltensüberwachung nicht kompatibel sind. Zu diesen Herausforderungen gehören (1) ein eingeschränktes Sichtfeld und (2) die begrenzte Verfügbarkeit von Geräten ohne ferromagnetische Komponenten. Hier wird eine Verhaltensvideoanalyse-Pipeline vorgestellt, die diese Einschränkungen überwindet, indem sie wertvolle Informationen aus Videos extrahiert, die innerhalb dieser Umgebungsbedingungen aufgenommen wurden, und die Bewertung des Verhaltens während der Erfassung von neuronalen Daten des gesamten Gehirns ermöglicht. Mit Methoden wie der optischen Flussschätzung und der Dimensionalitätsreduktion können robuste Unterschiede in den Verhaltensreaktionen auf Reize während fMRT-Scans festgestellt werden. Zum Beispiel deuten repräsentative Ergebnisse darauf hin, dass die Lautäußerungen von Mäusewelpen, aber nicht reine Töne, signifikant unterschiedliche Verhaltensreaktionen bei mütterlichen und jungfräulichen weiblichen Mäusen hervorrufen. In Zukunft kann diese Verhaltensanalyse-Pipeline, die ursprünglich auf die Bewältigung von Herausforderungen in fMRT-Experimenten zugeschnitten war, auf verschiedene neuronale Aufzeichnungsmethoden erweitert werden, um eine vielseitige Verhaltensüberwachung in eingeschränkten Umgebungen zu ermöglichen. Die koordinierte Bewertung von Verhaltens- und neuronalen Reaktionen wird ein umfassenderes Verständnis dafür bieten, wie die Wahrnehmung von Reizen zur Koordination komplexer Verhaltensausgaben führt.

Einleitung

Die Überwachung von Verhaltensreaktionen während neuronaler Aufzeichnungen ist unerlässlich, um die durch Reize hervorgerufene koordinierte Aktivität im gesamten Gehirn zu verstehen. Für den Fall, dass nicht vorhergesagt wird, dass Tiere auf spezifische und zielgerichtete Weise auf Reize reagieren, kann die Beobachtung von unangeleiteten Verhaltensweisen Aufschluss darüber geben, wie externe Signale ihre inneren Zustände beeinflussen ^1,2. Jüngste Fortschritte bei bildgebenden Verfahren, wie z. B. die Weitfeld-Kalziumbildgebung und die funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT), haben es Neurowissenschaftlern ermöglicht, die Untersuchungen über einzelne Hirnregionen hinaus auszuweiten. Um jedoch ein umfassenderes Verständnis solcher hochdimensionalen neuronalen Daten zu erreichen, muss auch die Fähigkeit, die Verhaltensausgaben dieser komplexen Muster zu bewerten, entsprechend verbessert werden.

Modernste Methoden zur Charakterisierung von aufgabengesteuerten Verhaltensweisen werden in der neurowissenschaftlichen Forschung häufig eingesetzt, darunter Temperatur- und Drucksensoren zur Erkennung von Schnüffeln ^3,4, Lichtstrahlen zur Erkennung von Lecks⁵ und markerlose Posenschätzung zur Verfolgung vorgegebener Körperteile⁶. Die datengetriebene Bewertung von unangeleiteten Verhaltensmustern bleibt jedoch eine Herausforderung im Feld⁷. Während sich die Methoden zur datengesteuerten Verhaltensanalyse rasant weiterentwickeln, erfordern bestehende Methoden in der Regel erhebliche Rechenleistung, spezielle Ausrüstung oder eine besonders klare Sicht auf das Tier 2,6,8,9. Hier wird eine Verhaltensvideoanalyse-Pipeline vorgestellt, die leicht für alle Videografiedaten zugänglich ist und die Extraktion wertvoller Verhaltensmessungen aus Videos ermöglicht, die während der passiven Stimulation aufgenommen wurden.

Diese Verhaltensanalyse-Pipeline wurde so konzipiert, dass sie mit der koordinierten Erfassung von neuronalen und Videodaten bei Tieren mit festem Kopf kompatibel ist, die einer breiten Palette von externen Reizen und mehreren Aufzeichnungsumgebungen ausgesetzt sind, auch solchen mit erheblichen Einschränkungen. So stellt beispielsweise die MRT-Umgebung besondere Herausforderungen an die Verhaltensüberwachung, einschließlich eines eingeschränkten Sichtfelds und einer begrenzten Verfügbarkeit von Geräten ohne ferromagnetische Komponenten. Diese Einschränkungen machen die häufig verwendeten Methoden inkompatibel, so dass Messungen wie die Kopfbewegung (d. h. wie sich das Gehirn zwischen Volumenaufnahmen bewegt) zu den am leichtesten, aber nur begrenzt zugänglichen, aber begrenzten Methoden zur Bewertung von Körperreaktionen während der Scans gehören¹⁰. Durch die Überwindung dieser Einschränkungen erleichterte dieses Protokoll die Analyse von MRT-kompatiblen Videografiedaten und zeigte, dass weibliche Mäuse mit unterschiedlichen mütterlichen Erfahrungen unterschiedliche Verhaltensreaktionen auf auditive Reize zeigen. Müttern und Jungfrauen wurden während der fMRT-Scans auditive Reize präsentiert, darunter verzweifelte Lautäußerungen ("Welpenrufe") und reine Töne. Diese Reize wurden passiv präsentiert, d.h. ohne jegliche angewiesene Verhaltensausgaben. Während vorhergesagt wurde, dass Mütter im Vergleich zu Jungfrauen erhöhte Reaktionen auf Welpenrufe zeigten, gibt es nur wenig Literatur darüber, wie weibliche Mäuse auf Säuglingssignale in einer kopffixierten Umgebung reagieren. Daher gab es keine spezifische Verhaltensausgabe, die a priori verfolgt werden konnte, was dieses Experiment zum perfekten Test für die vorgeschlagenen datengesteuerten Verhaltensanalysen machte. Unter Verwendung von Methoden wie der optischen Flussschätzung und der Dimensionalitätsreduktion wurden Gruppenunterschiede in den Verhaltensreaktionen sowohl in der Größe als auch in der räumlichen Manifestation festgestellt.

In Zukunft kann die koordinierte Bewertung von Verhaltens- und neuronalen Reaktionen genutzt werden, um ein umfassenderes Verständnis dafür zu erlangen, wie externe Reize interne Zustände verändern und komplexe Verhaltensergebnisse beeinflussen. Dieses Verständnis sollte sich auf Reize erstrecken, die ohne auferlegte Aufgaben und anweisungsweise Verhaltensweisen präsentiert werden. Die hier vorgestellte Analyse-Pipeline kann auf verschiedene neuronale Aufzeichnungstechniken erweitert werden, die auch in eingeschränkten Umgebungen eine vielseitige Verhaltensüberwachung ermöglichen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigten Protokollen durchgeführt, und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Empfehlungen durchgeführt. Die Details der verwendeten Geräte und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Software

1. Laden Sie MATLAB von der Mathworks-Website herunter.
   HINWEIS: Der Code, aus dem diese Analyse-Pipeline besteht, kann ausschließlich über MATLAB ausgeführt werden und wurde speziell geschrieben, um mit MATLAB 2023a kompatibel zu sein.
2. Für diese Pipeline sind die Computer Vision Toolbox und die Image Processing Toolbox in MATLAB erforderlich. Fügen Sie die Toolboxen zu MATLAB-Add-ons hinzu, indem Sie auf Add-Ons verwalten, Add-Ons abrufen klicken und dann nach ihnen suchen und sie hinzufügen.
   HINWEIS: Fünf MATLAB-Skripte werden als ergänzende Dateien mit den folgenden Titeln bereitgestellt: script1_videocoreg.m (Ergänzende Codierungsdatei 1), script2_optflow_roiselect.m (Ergänzende Codierungsdatei 2), script3_optflow_analysis.m (Ergänzende Codierungsdatei 3), script4_optflow_pca.m (Ergänzende Codierungsdatei 4) und script5_optflow_pca_analysis.m (Ergänzende Codierungsdatei 5). Zwei Beispielvideos (Video 1 und Video 2) und die entsprechenden Event-Timing-Dateien (Ergänzende Datei 1 und Ergänzende Datei 2) werden ebenfalls bereitgestellt. Es wird empfohlen, die Pipeline zuerst mit den Beispieldaten auszuführen.
   VORSICHT: Achten Sie auf Kommentare im Code, die ein Ausrufezeichen enthalten, da es sich hierbei um Bereiche handelt, die vor der Ausführung eine Aktion erfordern. Zum Beispiel gibt es Kommentare wie "Bearbeiten Sie den Codeblock unten!", um hervorzuheben, wo Änderungen vorgenommen werden müssen, um Dateistrukturen, Experimentdetails oder Analyseanforderungen anzupassen. Diese Auswahlmöglichkeiten sind standardmäßig so eingestellt, dass sie zu den beiden bereitgestellten Beispielvideos passen, müssen jedoch angepasst werden, sobald man beginnt, die Pipeline mit seinen eigenen Daten auszuführen.
3. Um jeden Abschnitt jedes Skripts auszuführen, klicken Sie im Menü Editor auf Ausführen und Fortfahren.

2. Video-Koregistrierung

HINWEIS: Das erste bereitgestellte Skript in dieser Analyse-Pipeline ist script1_videocoreg.m (Supplementary Coding File 1), das alle Videos per Coregistrierung räumlich zueinander ausrichtet. Die Eingaben für dieses Skript sind die Rohvideos, und die Hauptausgaben sind die transformierten Videos.

1. Bearbeiten Sie die Abschnitte 1, 2, 3, 4, 5 und 6 des Skripts, wo dies angegeben ist, um sie an die Datenstrukturen anzupassen.
2. Führen Sie Abschnitt 1 aus.
3. Wählen Sie in jedem Video drei Punkte aus, die beschriftet werden sollen, wie in Abbildung 1A. Diese drei Punkte werden verwendet, um alle Frames miteinander zu co-registrieren. Führen Sie Abschnitt 2 des Skripts aus, um den ersten Frame jedes Videos aufzurufen, und klicken Sie mit der Maus einmal auf die ersten beiden Punkte, dann doppelklicken Sie auf den dritten Punkt. Nachdem Sie die Punkte des letzten Videos ausgewählt haben, drücken Sie die Eingabetaste.
4. Führen Sie Abschnitt 3 und Abschnitt 4 aus.
5. Legen Sie das Flag auf 0 fest, und führen Sie Abschnitt 5 aus. Legen Sie dann das Flag auf 1 ausgerichtet fest, und führen Sie Abschnitt 5 erneut aus.
6. Führen Sie Abschnitt 6 aus, und vergleichen Sie die resultierende Abbildung nebeneinander mit Abbildung 1B. Alle Aberrationen, die im nicht ausgerichteten Durchschnittsbild auf der linken Seite beobachtet werden, sollten im ausgerichteten Durchschnittsbild auf der rechten Seite verringert werden.

3. Schätzung des optischen Flusses: Volles Sichtfeld

HINWEIS: Um die Bewegung durch die Scanvideos zu beurteilen, muss der optische Fluss für jedes transformierte Video geschätzt werden. Dies kann für das volle Sichtfeld (FOV) jedes Videos mit dem bereitgestellten Skript script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) erfolgen. Die Eingaben für dieses Skript sind die transformierten Videos, und die Ausgaben sind 3D-Matrizen, die die Größe des optischen Flusses jedes Pixels im Zeitverlauf für jedes Video angeben. Abbildung 2A zeigt ein Beispielbild mit blau überlagerten optischen Flussvektoren, wobei die Länge jedes Vektors die relative Größe des optischen Flusses dieses Pixels darstellt. Es wurde festgestellt, dass das Speichern der Ausgaben als Videos effizienter ist als das Speichern als 3D-Matrizen.

1. Bearbeiten Sie Abschnitt 1 des Skripts, wo angegeben, um die Datenstrukturen anzupassen.
2. Führen Sie Abschnitt 1 aus.

4. ROI-Auswahl

HINWEIS: Die folgenden Analyseschritte werden in Bezug auf die Rechenlast und den Datenspeicherbedarf erheblich überschaubarer, indem Sie einen Bereich von Interesse (ROI) innerhalb des vollständigen Sichtfelds auswählen, auf den sich die Analyse konzentrieren soll. Der ROI kann je nach Experiment und interessierenden Verhaltensweisen oder durch einen stärker datengesteuerten Ansatz ausgewählt werden. Für die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse wurde die Standardabweichung der optischen Flussgröße jedes Pixels im vollen FOV mit dem Skript script2_optflow_roiselect.m, Section 2 (Supplementary Coding File 2) berechnet. Die Eingaben für diesen Teil des Skripts sind die Ausgaben von Abschnitt 1, und die Hauptausgabe ist eine Visualisierung der Standardabweichung der Größe des optischen Flusses über alle Pixel in allen Videos. In den repräsentativen Ergebnissen zeigte das Spiegelfeld eine relativ hohe Standardabweichung des optischen Flusses, was die Wahl des ROI ausschlaggebend machte.

1. Bearbeiten Sie Abschnitt 2 des Skripts, wo angegeben, um die Datenstrukturen anzupassen.
2. Führen Sie Abschnitt 2 aus und verwenden Sie das resultierende Bild, um zu sehen, wo der optische Fluss in den analysierten Videos am stärksten schwankt. Ein Beispiel für dieses Bild ist in Abbildung 2B dargestellt.

5. Quantifizierung des optischen Flusses: ROI

HINWEIS: Abschnitt 3 des Skripts script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) ermöglicht es dem Benutzer, mit einem Zeichenwerkzeug einen ROI auszuwählen und die Grenzkoordinaten zu speichern. Die Eingaben für diesen Teil des Skripts sind die Ausgaben von Abschnitt 1, und die Ausgaben sind 1D-Vektoren, die die durchschnittliche Größe des optischen Flusses des ROI im Laufe der Zeit für jedes Video angeben.

1. Bearbeiten Sie Abschnitt 3 des Skripts, wo angegeben, um den Datenstrukturen und Analyseanforderungen zu entsprechen.
   HINWEIS: Es gibt einige Optionen, wie Sie mit der ROI-Auswahl fortfahren können. Wählen Sie eine Option aus:
   1. Option 1: Analysieren Sie das gesamte Video-FOV.
      1. Legen Sie das Flag selectROI auf 0 fest, und legen Sie provideROI auf 0 fest.
   2. Option 2: Analysieren Sie einen neuen ROI.
      1. Legen Sie das Flag selectROI auf 1 fest, und legen Sie provideROI auf 0 fest. Bearbeiten Sie dann newCoordsName.
   3. Option 3: Analysieren Sie einen zuvor erzielten ROI.
      HINWEIS: Wählen Sie diese Option nur aus, wenn Sie diesen Code zuvor ausgeführt und einen ROI erstellt haben.
      1. Legen Sie das Flag selectROI auf 0 fest, und legen Sie provideROI auf 1 fest. Bearbeiten Sie dann inputCoords , um einen vordefinierten Satz von Koordinaten bereitzustellen.
2. Führen Sie Abschnitt 3 aus.

6. Vergleich der Größe des optischen Flusses

HINWEIS: Das bereitgestellte Skript script3_optflow_analysis.m (Supplementary Coding File 3) erfordert die größte Spezialisierung, um die Daten des Benutzers anzupassen. Die Haupteingaben sind die 1D-Vektoren, die die durchschnittliche Größe des optischen Flusses des ROI im Laufe der Zeit für jedes Video anzeigen, und wenn sie angemessen mit Ereignisausbrüchen und Gruppen-/Bedingungsinformationen kombiniert werden, sind die Hauptausgaben statistische Vergleiche, die auf Analyseinteressen zugeschnitten werden können.

1. Bearbeiten Sie die Abschnitte 1 bis 3 des Skripts , um sie an die Datenstrukturen und Analyseanforderungen anzupassen.
2. Setzen Sie die Flags für die Analyseoptionen zsc, blrm, blzsc, demeanPerTrial und applyLPfilter auf 0 oder 1 , wie in Abschnitt 1 gewünscht. In den dargestellten repräsentativen Ergebnissen wurden zsc, blrm und applyLPfilter auf 1 und alle anderen Optionen auf 0 gesetzt.
3. Stellen Sie LPfilter auf eine Zahl ein, die den gewünschten Tiefpassfilter in Hertz (Hz) darstellt. In den repräsentativen Ergebnissen wurde ein 5-Hz-Tiefpassfilter verwendet, da nicht erwartet wurde, dass die Verhaltensreaktionen schneller als 5 Hz schwanken.
4. Führen Sie die Abschnitte 1-3 aus. In Abschnitt 3 sollten Diagramme für die Zeitreihen des durchschnittlichen optischen Flusses in Gruppen, den durchschnittlichen kumulativen optischen Fluss in Gruppen und den kumulativen optischen Fluss erstellt werden, einschließlich Diagramme wie die in Abbildung 3 dargestellten. Abschnitt 3 kann für jede Kombination von Gruppen-/Bedingungsvergleichen ausgeführt werden.

7. Optischer Fluss PCA

HINWEIS: Aufbauend auf der Schätzung der Größe des optischen Flusses enthalten die Ausgaben von script2_optflow_roiselect.m (Supplementary Coding File 2) auch Informationen über die räumliche Verteilung des optischen Flusses Bild für Bild pro Video. Um die Dimensionalität dieser räumlichen Informationen zu reduzieren, führt das bereitgestellte Skript script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4)  eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) für den geschätzten optischen Fluss durch. Die Haupteingaben sind die optischen 3D-Flussmatrizen, die zuvor als Videos für jedes Verhaltensvideo gespeichert wurden, und die Hauptausgabe ist eine .mat-Datei pro Video, die PC- und erläuterte Varianzinformationen enthält.

1. Bearbeiten Sie Abschnitt 1 des Skripts, um es an die Datenstrukturen und Analyseanforderungen anzupassen.
2. Legen Sie die Flags für die Analyseoptionen stimnum, dsfactor und fnfactor wie in Abschnitt 1 gewünscht fest. In den vorgestellten repräsentativen Ergebnissen wurde jeder Stimulustyp separat analysiert und der Standardwert von 1 für dsfactor und fnfactor beibehalten, was zu keinem räumlichen oder zeitlichen Downsampling führte.
3. Führen Sie Abschnitt 1 aus.

8. Optischer Fluss PCA Vergleich

HINWEIS: Das bereitgestellte Skript script5_optflow_pca_analysis.m (Supplementary Coding File 5) führt explorative Vergleiche der PCA-Ergebnisse über Gruppen hinweg durch. Die Haupteingaben sind die stimulusspezifischen PC- und erklärten Varianzinformationen, die aus script4_optflow_pca.m (Supplementary Coding File 4) erhalten wurden, und die Hauptausgaben sind statistisch bedingte Heatmaps, die die Auslastungen des ersten PCs darstellen, obwohl auch andere PCs mit diesem Skript analysiert werden können.

1. Bearbeiten Sie Abschnitt 1 des Skripts, um Datenstrukturen und Analysen anzupassen.
2. Führen Sie Abschnitt 1 und Abschnitt 2 aus.
3. Bearbeiten Sie die Eingaben in Abschnitt 3, insbesondere die Variablen group und myTitle, um die gewünschte Gruppenanalyse sowie threshT widerzuspiegeln. threshT stellt den T-statistischen Schwellenwert dar, ab dem Ergebnisse als signifikant angesehen werden, der auf der Grundlage öffentlich zugänglicher T-Statistik zu p-Wert-Tabellen und der Freiheitsgrade berechnet werden kann.
4. Führen Sie Abschnitt 3 für jede Interessengruppe aus. Der Code sollte eine Statistikkarte mit Gruppenzusammenfassung erstellen, wie sie in Abbildung 4 im linken und mittleren Bereich dargestellt ist. Passen Sie den Bereich der Caxis und damit die Grenzen der Farbbalken für die Visualisierung wie gewünscht an.
5. Bearbeiten Sie die Eingaben von Abschnitt 4, insbesondere die Variablen mag und myTitle, um den gewünschten Gruppenvergleich widerzuspiegeln, sowie threshT. threshT stellt den T-statistischen Schwellenwert dar, ab dem Ergebnisse als signifikant angesehen werden, der auf der Grundlage öffentlich zugänglicher T-Statistik zu p-Wert-Tabellen und der Freiheitsgrade berechnet werden kann.
6. Führen Sie Abschnitt 4 für jeden interessierenden Gruppenvergleich aus. Der Code sollte eine Statistikkarte für den Gruppenvergleich erstellen, wie im rechten Bereich von Abbildung 4 dargestellt. Passen Sie den Bereich der Caxis und damit die Grenzen der Farbbalken für die Visualisierung wie gewünscht an.

Ergebnisse

Um das Potenzial dieser Analysepipeline zu demonstrieren, wurden Verhaltensvideos von weiblichen Mäusen mit festem Kopf - insbesondere von Müttern und Jungfrauen - aufgenommen, während den Mäusen während funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRT)-Scans auditive Reize präsentiert wurden. Die Reize bestanden aus Welpenrufen und reinen Tönen, die passiv präsentiert wurden, also ohne jegliche angewiesene Verhaltensausgaben. Bei den Jungtierrufen handelte es sich um Aufzeichnungen von Ultraschalllauten, die von 6 Tage alten Mäusewelpen ausgestoßen wurden, die vorübergehend von ihrem Nest isoliert waren. Diese Jungtierrufe lösen in der Regel den mütterlichen Akt des Welpenappierens aus, bei dem die Mutter das Jungtier lokalisiert, sich auf es zubewegt, es untersucht, dann aufhebt und in die Sicherheit des Nestes zurückbringt – ein Verhalten, das jungfräuliche Weibchen normalerweise nicht zeigen¹¹. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Welpenrufe eine robuste evozierte Aktivität im primären auditorischen Kortex von Müttern, aber nicht von Jungfrauen, hervorrufen, während reine Tonreaktionen keine Gruppenunterschiede zeigen¹². Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass Gruppenunterschiede in den Verhaltensreaktionen auf Welpenrufe, nicht aber in reinen Tönen, identifiziert werden könnten. Es gibt jedoch nur wenig Literatur über das spezifische Verhalten weiblicher Mäuse als Reaktion auf Jungtiersignale in einer kopfstarren Umgebung. Daher wurde kein spezifischer Verhaltensoutput erwartet, was dieses Experiment zum perfekten Test für die vorgeschlagenen datengetriebenen Verhaltensanalysen macht.

Im Laufe von acht Tagen wurden alle Tiere allmählich an den Umgang mit dem Versuchsator, die Kopffixierung und die MRT-Umgebung gewöhnt. Die Gewöhnung an die Kopffixierung und die experimentelle Umgebung ist entscheidend für die Beurteilung von Verhaltensreaktionen auf präsentierte Reize. Wenn Tiere nicht richtig an die Umwelt gewöhnt sind, können sie nur Stressreaktionen zeigen und alle reizgesteuerten Effekte austrocknen, die sonst durch Videografie analysiert werden könnten.

Während die Einrichtung des Verhaltensapparates im Allgemeinen bei jeder Datenerfassungssitzung gleich war, ist es möglich, dass sich das Sichtfeld (FOV) der Kamera jedes Mal leicht verschoben hat, wenn ein Tier für fMRT-Scans auf den Kopf gerichtet wurde (siehe Beispiel-FOVs in Abbildung 1A). Dies war wahrscheinlich auf geringfügige Änderungen in der Positionierung der Kamerahalterung sowie auf individuelle Variationen in der Schädelbefestigung zwischen Kopf und Pfosten für jedes Tier zurückzuführen. Daher mussten die Videos aus den Scans über eine lineare Koregistrierung miteinander abgeglichen werden, um einen Vergleich der räumlichen Informationen zu ermöglichen, die sie über die Scans und die Tiere hinweg enthielten. Die Koregistrierung wurde auf die repräsentativen Daten zugeschnitten. An einem Standard-Scan-Tag wurden beispielsweise 3-4 Scans pro Tier aufgenommen, was zu 3-4 Videos pro Tier und Tag führte. Zwischen den einzelnen Scans gab es keine Bewegung der Halterungskomponenten, einschließlich der Kamera- und Kopffixierungskomponenten. Sobald also die Koregistrierungstransformation für ein Video pro Tier und Tag bestimmt war, konnte sie auf die anderen 2-3 Videos dieses Tieres am selben Tag angewendet werden. Während dies im Coregistrierungsschritt dieser Pipeline Zeit sparte, können räumliche Transformationen bei Bedarf auch für jedes Video einzeln berechnet werden. Drei Merkmale, die in jedem Video vorhanden sind, wurden als Punkte für die Beschriftung und Berechnung der räumlichen Transformation ausgewählt. In den gezeigten repräsentativen Daten waren diese drei Punkte die Mitte des Kopfpfostens, die Frontalansicht des rechten Auges des Tieres und die Profilansicht des rechten Auges des Tieres (sichtbar in einem Spiegel, der in einem 45-Grad-Winkel platziert ist). Beispiele für die Video-Koregistrierung sind in Abbildung 1A, B dargestellt und zeigen den durchschnittlichen Frame, der aus allen Videos berechnet wurde, die während dieses Experiments sowohl vor als auch nach der Koregistrierung aufgenommen wurden, um die Wirkung dieses Schritts zu demonstrieren.

Diese Pipeline stützt sich stark auf den optischen Fluss, ein Computer-Vision-Verfahren, das verwendet wird, um die Bewegung von Objekten in einem Video zu schätzen, indem ihre scheinbaren Geschwindigkeiten zwischen aufeinanderfolgenden Bildern¹³ geschätzt werden. Der optische Fluss wurde gewählt, weil er die Quantifizierung von Bewegung ermöglicht – ein Proxy für Verhaltensreaktionen – ohne vorgegebene Körperteile oder Aktionen, die von Interesse sind. Darüber hinaus war diese Methode für die eingeschränkte Bildqualität der repräsentativen Videos geeignet, die mit der einzigen MR-kompatiblen Kamera aufgenommen wurden, die zum Zeitpunkt des Experiments verfügbar war. In dieser Pipeline wird der Horn-Schunck-Algorithmus zur globalen, dichten optischen Flussschätzung verwendet; Andere Algorithmen, wie z.B. der Lucas-Kanade-Algorithmus, können jedoch mit geringfügigen Änderungen an den bereitgestellten MATLAB-Skripten 14,15,16 problemlos eingesetzt werden. Abbildung 2A zeigt ein Beispiel-Videobild mit relativen Vektoren der optischen Flussgeschwindigkeit, die für jedes Pixel überlagert sind. Beachten Sie, dass die größeren Vektoren in Bereichen erscheinen, in denen man Bewegung erwarten würde, wie z. B. die Schnauze und die Pfoten des Tieres.

Während die Pipeline den optischen Fluss für alle Videos über das gesamte Sichtfeld schätzte, wurden die verbleibenden Analyseschritte in Bezug auf die Rechenlast und den Datenspeicherbedarf durch die Auswahl einer Region of Interest (ROI) innerhalb des Sichtfelds viel einfacher überschaubar gemacht. Der ROI kann je nach Experiment und vorgegebenen Verhaltensweisen von Interesse oder durch einen stärker datengesteuerten Ansatz ausgewählt werden. Da die repräsentativen Daten keine spezifischen Verhaltensergebnisse enthielten, die a priori verfolgt werden konnten, wurde ein datengesteuerter Ansatz verfolgt. Die Standardabweichung der Größe des optischen Flusses wurde für alle Videos an jedem Pixel berechnet, wie in Abbildung 2B dargestellt. Zu den Bereichen mit der höchsten Standardabweichung gehörten die Konturen des Tieres, wie z. B. um das Auge und die Schnauze, die die Gewissheit vermitteln, dass die beobachteten Schwankungen des optischen Flusses durch die Bewegung der Tiere und nicht durch das Rauschen in den Videos gesteuert wurden. Zu den Bereichen mit geringerer Standardabweichung gehörten die Konturen der Halterung, die das Ergebnis kleiner Vibrationen in der Kamera und der Halterung sein könnten, die während des Scannens auftraten. Die MRT-Umgebung ist während der Datenerfassung aufgrund des Schaltens von Gradienten unweigerlich von Vibrationen geprägt, die sich in optischen Flussschwankungen äußern können, die in reflektierenden Komponenten der Halterung beobachtet werden. Glücklicherweise sind diese Schwingungen während der gesamten Datenerfassung konstant, also unabhängig von den Reizbedingungen und es ist nicht zu erwarten, dass sie die Ergebnisse der Verhaltensanalyse beeinflussen. Besonders erhöhte Standardabweichungen des optischen Flusses wurden in den Pixeln des Spiegels beobachtet, die der Profilansicht des Gesichts des Tieres entsprechen und die Auswahl des ROI für die repräsentativen Daten leiteten. Dies war auch eine Region, in der Verhaltensreaktionen wie Quirlen und Schnüffeln als Teil des typischen Verhaltensrepertoires weiblicher Mäuse erwartet werden konnten, die ein isoliertes Jungtier suchten, das Welpenrufe ausstieß¹⁷.

Nach der Auswahl eines ROI und der Extraktion der durchschnittlichen frameweisen Größe des optischen Flusses für alle Videos konnte der optische Fluss während der interessierenden Epochen über Gruppen und Bedingungen hinweg verglichen werden. Beachten Sie, dass die ersten 20 Sekunden (s) des optischen Flussvektors jedes Videos zur Helligkeitsstabilisierung maskiert wurden. Dies kann jedoch an experimentelle Bedürfnisse angepasst werden. Für jedes Video wurde der bildweise optische Flussvektor für den gewählten ROI mit Z bewertet, dann wurde er nach früheren Arbeiten zur Klassifizierung von Gesichtsausdrücken bei 5 Hertz (Hz) tiefpassgefiltert, um zu berücksichtigen, dass die 30-Hz-Bildrate der Kamera schneller ist als alle erwarteten Verhaltensschwankungen². Schließlich wurden die Z-bewerteten und gefilterten Vektoren in Stimuluspräsentationsepochen unterteilt, um den Effekt der Stimuluspräsentation auf den optischen Fluss zu bewerten. Für jede Epoche wurde das mittlere Ausgangssignal vor dem Stimulus subtrahiert, um den optischen Fluss auf die Vor-Stimulus-Periode zu normalisieren. Abbildung 3A zeigt beispielhafte Zeitreihen des optischen Flusses für zwei Videos, eine Mutter und eine Jungfrau, mit zusammenfassenden Gruppendaten in Abbildung 3B-E. Abbildung 3B und Abbildung 3D zeigen den kumulativen optischen Fluss über die Zeit während der Stimuluspräsentation im Vergleich zum Ausgangswert, während Abbildung 3C und Abbildung 3E den kumulativen optischen Fluss 2,5 s nach Stimulusbeginn zusammenfassen. Der kumulative optische Fluss wurde so berechnet, dass er die Gesamtbewegung über die Zeit erfasst, ohne davon auszugehen, dass spontane Verhaltensreaktionen zeitgebunden auftreten würden. Insgesamt zeigen diese repräsentativen Ergebnisse, dass die Rufe der Jungen, aber nicht die reinen Töne, signifikant unterschiedliche Verhaltensreaktionen bei mütterlichen und jungfräulichen weiblichen Mäusen hervorriefen, wie vorhergesagt (Mann-Whitney U-Test zwischen den Gruppen: Jungenrufe: p = 0,026; reine Töne: p = 0,093). Dieser Stimuluseffekt überlebte jedoch eine 2-Wege-ANOVA nicht, während der Gruppeneffekt dies tat (Stimulus: F(1,10) = 0,19, p = 0,67; Gruppe: F(1,10) = 8,61, p = 0,015). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Mütter im Vergleich zu Jungfrauen eine höhere reizevozierte Bewegung zeigten, wobei die mütterliche Reaktion auf Welpenrufe konsistenter war als auf reine Töne. Dies könnte eine erhöhte Aufmerksamkeit oder Stress bei Müttern widerspiegeln, sowie die Verhaltensrelevanz von Welpenrufen, die im Gegensatz zu reinen Tönen die Reaktion des Welpenappholens bei Müttern in naturalistischen Umgebungen hervorrufen. Zusammengenommen deuten diese repräsentativen Ergebnisse darauf hin, dass die Schätzung des optischen Flusses während der externen Reizpräsentation Informationen über nuancierte, spontane Verhaltensreaktionen extrahieren kann.

Schließlich wurde eine explorativere Analyse durchgeführt, um die räumlichen Eigenschaften des in den repräsentativen Daten erfassten Verhaltens aufzudecken. Um zu untersuchen, welche Pixel im ROI während der Stimuluspräsentation koordiniert schwankten, wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) der räumlichen optischen Flussinformationen über die Zeit durchgeführt. Diese Analyse ergab Pixel, die am meisten zum ersten PC beitrugen, sowie Pixel, die Gruppenunterschiede für jede Stimulusbedingung zeigten, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Felder ganz rechts in Abbildung 4A,B deuten darauf hin, dass Mütter im Vergleich zu Jungfrauen während der Präsentation beider Stimulustypen mehr Bewegung in der Nase zeigten. Über die beiden Gruppen und zwei Stimulusbedingungen hinweg erklärte der erste PC 5,41 % ± 0,59 % der Gesamtvarianz in der optischen Flussanalyse. Während der Spiegel-ROI für diesen Teil unserer Analyse beibehalten wurde, könnten zukünftige Analysen auf einen breiteren Teil des FOV ausgeweitet werden, um koordinierte Bewegungen jenseits des Gesichts als Reaktion auf Reize zu charakterisieren. Zum Beispiel kann der Vergleich der Pfotenbewegung signifikantere Gruppenunterschiede aufdecken, da die Rufe der Jungtiere in der Regel bei Müttern, aber nicht bei Jungfrauen das Apportieren der Jungen auslösen und dass sich die Pfoten freier bewegen können als der Kopf des Tieres.

Während die bisherigen repräsentativen Ergebnisse darauf hindeuteten, dass diese Pipeline ungerichtete Verhaltensreaktionen auf äußere Reize in eingeschränkten Videografieumgebungen bewerten kann, blieb die Frage, ob die beobachteten Fluktuationen des optischen Flusses wirklich bedeutungsvolles Verhalten der Tiere widerspiegeln. Um diese Frage zu beantworten, wurde ein separater Validierungsdatensatz mit derselben Pipeline analysiert. In einem separaten Experiment wurden männliche Mäuse mit eingeschränktem Wassermangel so trainiert, dass sie einen Lichtreiz entweder mit der Abgabe einer Wasserbelohnung von 6 μl ("hohe Belohnung") oder 1 μl ("niedrige Belohnung") assoziierten. Bemerkenswert ist, dass dieses Experiment im Gegensatz zum Experiment zur auditiven Stimulation eine a priori Verhaltensanzeige hatte: die Leckrate. Es wurde ein Lickometer über eine videobasierte Erkennung von Lecks etabliert, die durch die Analyse der Pixelhelligkeit in der Nähe des Wasserspeiers erleichtert wurde. Die vom Lickometer gelieferte Verhaltensanzeige könnte daher verwendet werden, um die Verhaltensanzeige dieser Pipeline zu vergleichen, die durch die optische Flussschätzung geliefert wird, was ihre Gültigkeit bei der Erkennung spontaner Verhaltensweisen unterstützt. Nach der Video-Koregistrierung, der Schätzung des optischen Flusses, der ROI-Auswahl (wieder mit dem Spiegel-FOV) und der Quantifizierung des optischen Flusses zeigte der Vergleich der Größe des optischen Flusses einen signifikanten Unterschied zwischen den Verhaltensreaktionen auf hohe und niedrige Belohnungen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Abbildung 5A,B dargestellt, wobei Abbildung 5A die gemittelte Zeitreihe der Gruppe zeigt und Abbildung 5B den kumulativen optischen Fluss 2,5 s nach Stimulusbeginn zusammenfasst (zwischen den Bedingungen gepaarter Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test: p = 0,031). Es ist zu beachten, dass die Werte des optischen Flusses im Vergleich zu dem in den repräsentativen Daten aufgezeichneten spontanen Verhalten größer waren, was die Herausforderung der Bewertung unangewiesener, nuancierter Verhaltensreaktionen weiter unterstreicht. Abbildung 5C zeigt die tatsächliche Leckrate, die vom Lickometer für jede der beiden Belohnungsbedingungen aufgezeichnet wird, während Abbildung 5D zeigt, dass innerhalb von 2,5 s nach der Belohnungsabgabe mehr Licks während der Bedingung mit hoher Belohnung im Vergleich zu einer Bedingung mit niedriger Belohnung aufgezeichnet werden (Wilcoxon-Test mit Vorzeichenrang zwischen den Bedingungen: p = 0,031). Insgesamt zeigten beide Analysen einen ähnlichen Trend beim Vergleich von Reaktionen mit hohen und niedrigen Belohnungen, was die vorgestellte Videoanalyse-Pipeline für die Erfassung signifikanter Unterschiede im Verhalten der Tiere unter verschiedenen Bedingungen validiert.

Zusammengenommen deuten die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse darauf hin, dass die Präsentation von Welpenrufen signifikant unterschiedliche Reaktionen bei mütterlichen und jungfräulichen weiblichen Mäusen hervorrief, während dies bei reinen Tönen nicht der Fall war. Die Analyse eines Validierungsdatensatzes gibt die Zuversicht, dass die beobachteten Unterschiede im optischen Fluss signifikante Unterschiede in den Verhaltensreaktionen auf externe Reize widerspiegeln.

Abbildung 1: Video-Koregistrierung. (A) Beispiele für Video-Koregistrierungen, die vorgegebene Merkmale darstellen (Mitte des Kopfpfostens, Frontalansicht des rechten Auges, Profilansicht des rechten Auges), beschriftet in drei Frames, die jeweils aus verschiedenen Videos verschiedener Tiere stammen. Beachten Sie im Overlay, wie die drei Punkte nicht ausgerichtet waren, und zeigen Sie, wie sich das Verhalten zwischen den Datenerfassungssitzungen leicht änderte. (B) Der durchschnittliche Frame über die letzten 10 s jedes Videos vor (links) und nach (rechts) der Video-Coregistrierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schätzung des optischen Flusses. (A) Beispielrahmen mit relativ optischen Flussvektoren, die blau überlagert sind. (B) Die durchschnittliche pixelweise Standardabweichung des optischen Flusses über alle Videos hinweg. Der gewählte ROI um die Profilansicht des Gesichts des Tieres über den Spiegel ist magenta umrandet. Der Farbbalken entspricht der Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Visualisierung und Vergleich des optischen Flusses über Gruppen und Bedingungen hinweg. (A) Beispielhafte Z-bewertete und 5 Hz tiefpassgefilterte Zeitreihen des optischen Flusses für ein Video einer Mutter und ein Video einer Jungfrau. (B) und (D) Kumulativer optischer Fluss, gemessen während der Stimulusperiode von Welpenrufen (B) und reinen Tönen (D). Die Schattierung stellt den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar. (C) und (E) Kumulativer optischer Fluss während der ersten 2,5 s der Stimuluspräsentation für Welpenrufe (C) und reine Töne (E). * Zeigt p < 0,05 an, Mann-Whitney-U-Test zwischen den Gruppen (pup-Rufe: p = 0,026; reine Töne: p = 0,093), N = 6 pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich von PC₁ über Gruppen hinweg. (A,B) Karten, die die Ladungen der ersten Hauptkomponente (PC₁) des optischen Flusses während der Pup-Rufe (A) und der reinen Töne (B) über Gruppen hinweg darstellen, statistisch mit einem Schwellenwert von p < 0,05 ohne Korrektur für Mehrfachvergleiche. Die Heatmap gibt an, wie stark die Fluktuation des optischen Flusses jedes Pixels im Verhältnis zu anderen Pixeln zu PC₁ beigetragen hat. Kleiner schwarzer Text zeigt den prozentualen Prozentsatz der Varianz an, der durch PC₁ erklärt wird (Mütter rufen: 4,95 % ± 0,72 %; jungfräuliche Jungtiere rufen: 4,44 % ± 0,59 %; reine Töne der Mütter: 4,95 % ± 0,39 %; reine Töne von Jungfrauen: 4,72 % ± 1,24 % (mittlere ± Standardabweichung)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Validierung der Verhaltensanalyse-Pipeline. (A) Durchschnittlicher Z-Score, subtrahierte Basislinie vor dem Stimulus und 5 Hz tiefpassgefilterte Zeitreihen des optischen Flusses während der Abgabe hoher und niedriger Belohnungen. Die Schattierung stellt das REM dar, die weiße vertikale Linie zeigt die Belohnung an und die roten Sternchen zeigen temporäre optische Flussartefakte aufgrund des Beginns und der Verschiebung des Lichthinweises an. (B) Zusammenfassung des kumulativen optischen Flusses während der ersten 2,5 s nach der Belohnungsabgabe. * Zeigt p < 0,05 an, Wilcoxon-Test mit vorzeichenbehaftetem Rang zwischen den Bedingungen (p = 0,031). (C) Durchschnittliche Leckrate, ermittelt durch das Lickometer, während der Lieferung mit hoher und niedriger Belohnung. Die Schattierung steht für SEM, und die weiße vertikale Linie zeigt die Belohnungslieferung an. (D) Anzahl der Licks, die in den ersten 2,5 s nach der Belohnung aufgezeichnet wurden. * Zeigt p < 0,05 an, Wilcoxon-Test mit vorzeichenbehaftetem Rang zwischen Bedingungen (p = 0,031), N = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Beispielvideo 1. PCR_Br011_20231015_1842_output.avi. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Beispielvideo 2. PCR_Br014_20231015_1722_output.avi. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Event-Timing-Datei für Video 1. PCR_Br011_20231015_1842_output_videoTimestamps.mat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Event-Timing-Datei für Video 2. PCR_Br014_20231015_1722_output_videoTimestamps.mat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: script1_videocoreg.m. Dieses Skript richtet alle Videos über die Coregistrierung räumlich zueinander aus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: script2_optflow_roiselect.m. Dieses Skript schätzt den optischen Fluss für das gesamte Sichtfeld jedes transformierten Videos und ermöglicht die Auswahl eines ROI für den Rest der Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 3: script3_optflow_analysis.m. Dieses Skript vergleicht die Größe des optischen Flusses über verschiedene Gruppen/Bedingungen für den ausgewählten ROI. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 4: script4_optflow_pca.m. Dieses Skript führt eine PCA für den geschätzten optischen Fluss des ausgewählten ROI durch. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 5: script5_optflow_pca_analysis.m. Dieses Skript vergleicht die PCA-Ergebnisse über Gruppen/Bedingungen hinweg für den ausgewählten ROI. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die vorgestellte Verhaltensanalyse-Pipeline ermöglicht die Extraktion wertvoller Informationen aus Videos von Tieren, die als Reaktion auf passiv präsentierte Reize ungeschulte Verhaltensweisen zeigen. Diese repräsentativen Verhaltensvideos wurden in Verbindung mit Daten der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT) des gesamten Gehirns aufgenommen, für die mehrere Einschränkungen überwunden wurden, um Verhaltensreaktionen in der MRT-Umgebung zu erfassen. Unter Verwendung der Methode der optischen Flussschätzung wurden Unterschiede in der Reaktion von Müttern und Jungfrauen auf Welpenrufe – aber nicht reine Töne – aufgedeckt, was die ursprüngliche Hypothese stützt 13,14,15,16. Unter Ausnutzung der Dimensionalitätsreduktion der optischen Flussinformationen wurde diese Erkenntnis auf eine explorative Analyse der räumlichen Verteilung dieser Verhaltensweisen ausgeweitet.

Diese Analysepipeline ist weitgehend offen für verschiedene experimentelle Paradigmen. Es ist völlig unabhängig von der Art der erfassten neuronalen Daten und erfordert keine übermäßige Rechenleistung oder spezielle Ausrüstung. Die wichtigste experimentelle Anforderung besteht darin, dass die Videodaten mit den relevanten Zeitstempeln des Beginns der Stimuluspräsentation aufgezeichnet werden. Darüber hinaus sollte durch die Bereitstellung der MATLAB-Skripte, die zum Durchführen der demonstrierten Analysen verwendet werden, die Implementierung dieser Pipeline relativ einfach sein, selbst für diejenigen mit minimaler MATLAB-Erfahrung. Die allgemeinen Schritte, wie im Protokoll beschrieben, bestehen aus der Video-Koregistrierung, der Schätzung des optischen Flusses, der Auswahl der Region of Interest (ROI), der ROI-spezifischen Quantifizierung des optischen Flusses, dem Vergleich der Größe des optischen Flusses, der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und dem PCA-Vergleich. Bei jedem Schritt kann die Pipeline an experimentelle und analytische Anforderungen angepasst werden, wie im Protokoll angegeben und mit Kommentaren im gesamten Code hervorgehoben.

Es gibt mehrere Einschränkungen, die bei der Verwendung der vorgestellten Videoanalyse-Pipeline zu beachten sind. Zunächst sollte die Gestaltung des Verhaltensapparates sorgfältig überlegt werden. Wenn unklar ist, welche Verhaltensreaktionen zu erwarten sind, kann es für zukünftige Analysen von Vorteil sein, so viele Blickwinkel wie möglich auf das Tier zu haben. Daher wird empfohlen, einen oder mehrere Spiegel zu installieren, um gleichzeitig die Frontal- und Profilansichten des Tieres zu erfassen, wie in den Beispielvideobildern in Abbildung 1A gezeigt. Zweitens wird empfohlen, dass die für die Videoaufnahme bereitgestellte Beleuchtung hell genug ist, um alle relevanten Merkmale des Sichtfeldes (FOV) zu sehen, aber nicht so hell, dass sie eine Sättigung erreicht. In Abbildung 1A ist zu sehen, dass sich die Frontalansicht der Mausnase an einem Punkt nahe der Sättigung befindet, was es schwierig macht, Helligkeitsschwankungen zu erfassen, die auf eine Bewegung hinweisen würden. Dies könnte dazu beigetragen haben, dass in diesem Teil des Sichtfelds keine Variation des optischen Flusses beobachtet wurde, wie in Abbildung 2B gezeigt. Glücklicherweise trat die Profilansicht der Nase nicht vor dieses Problem, so dass der ROI des Spiegels analysiert werden konnte. Zusätzlich sollte die Möglichkeit einer Sättigung in Betracht gezogen werden, wenn visuelle Reize in das Experiment einbezogen werden. Im Experiment mit dem Validierungsdatensatz führte ein Lichthinweis, der zur Signalisierung der Abgabe einer Wasserbelohnung verwendet wurde, zu einer vorübergehenden Sättigung in den aufgenommenen Videos, was ein vorübergehendes Artefakt in der optischen Flussschätzung darstellte. Dieses Artefakt kann in Abbildung 5A beobachtet werden, wo die beiden scharfen Spitzen in den optischen Flussspuren für beide Belohnungsbedingungen genau mit dem Zeitpunkt übereinstimmen, zu dem der Lichthinweis ein- und ausgeschaltet wurde. Dieses Artefakt erschwerte die Analyse dieser kurzen Zeitfenster mit der vorgestellten Pipeline, und wenn es nicht vorhanden gewesen wäre, wären die in Abbildung 5B dargestellten Ergebnisse möglicherweise noch aussagekräftiger gewesen. Eine konstante Szenenbeleuchtung ist eine notwendige Voraussetzung für die meisten optischen Flussalgorithmen^14,16. Daher wird diese Videoanalyse-Pipeline nicht für Experimente empfohlen, bei denen sich die Beleuchtung der Umgebung sowohl innerhalb als auch zwischen den Versuchen drastisch ändert. Drittens und letztens ist die ausreichende Gewöhnung der Tiere an die Aufzeichnungsumgebung eine Schlüsselkomponente jedes Experiments, das die Vorteile dieser Pipeline nutzt. Wenn sie nicht richtig gewöhnt sind, können Tiere signifikante Stressreaktionen zeigen und alle subtilen reizgesteuerten Effekte auslöschen, die sonst durch Videoanalyse analysiert werden könnten.

In Zukunft kann diese Verhaltensanalyse-Pipeline eingesetzt werden, um die koordinierte Bewertung von gleichzeitig aufgezeichneten Verhaltens- und neuronalen Reaktionen zu erleichtern. Wie gezeigt, ermöglicht die quantitative Bewertung von unangeleiteten Verhaltensweisen die Bewertung der Salienz von Reizen in einer komplexen Aufzeichnungsumgebung sowie das Testen auf unterschiedliche Verhaltensreaktionen in experimentellen Gruppen und Bedingungen. Weitere Analysen können durchgeführt werden, um individuelle Unterschiede oder Trends in Verhaltensreaktionen von Versuch zu Versuch zu untersuchen, so dass die entsprechende neuronale Aktivität untersucht werden kann. Darüber hinaus kann die Einbeziehung von PCA zur Gewinnung räumlicher Informationen über reizevozierte Bewegungen verwendet werden, um weiter zu untersuchen, ob sich bestimmte Arten von Verhaltenssequenzen, die während der Reizpräsentation beobachtet werden, zwischen Gruppen und Bedingungen unterscheiden. Diese Analysepipeline kann leicht auf verschiedene neuronale Aufzeichnungsmethoden erweitert werden und bietet eine vielseitige Verhaltensüberwachung in eingeschränkten Umgebungen. Durch die Untersuchung, wie äußere Reize sowohl im Gehirn als auch im Verhalten dargestellt werden, sind die Forscher in der Lage, ein umfassenderes Verständnis dafür zu erlangen, wie die Wahrnehmung von Reizen innere Zustände und ihre äußeren Manifestationen beeinflusst.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MATLAB Computer Vision Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/computer-vision.html
MATLAB Image Processing Toolbox	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/image-processing.html
MATLAB-Software	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MR-kompatible Kamera " 12M-i" mit integrierter LED-Leuchte	MRC Systems GmbH	12M-i	https://www.mrc-systems.de/downloads/en/mri-compatible-cameras/manual_mrcam_12m-i.pdf