Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.
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Methodenartikel
Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Sphäroidkultur ist ein 3D-Modell, das im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen eine verbesserte Replikation der in vivo-Mikroumgebung ermöglicht. Die Invasion ist ein zelluläres Ergebnis, das für die Krebsbiologie von größtem Interesse ist. In diesem Protokoll haben wir eine alternative Strategie zur Bewertung der Invasion von Krebszellen in vitro entwickelt, bei der Heterosphäroide verwendet werden, die aus dem oralen Plattenepithelkarzinom (OSCC), krebsassoziierten Fibroblasten (CAF) und Monozyten bestehen. Diese Heterosphäroide zielen darauf ab, die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen, einschließlich zweier relevanter nicht-neoplastischer Zelltypen neben den Krebszellen. Jeder Zelltyp wurde mit lebenswichtigen Fluoreszenzmarkern markiert, die vor der Sphäroidbildung in unterschiedlichen Wellenlängen emittierten. Nach ihrer Bildung wurden Heterosphäroide auf eine Schicht aus humaner Leiomyom-abgeleiteter extrazellulärer Matrix im oberen Kompartiment einer mikroporösen Membran ausgesät. Die Invasion wurde in der z-Achse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beurteilt. Digitale Bilder wurden in den entsprechenden Fluoreszenzkanälen im Abstand von 10 μm aufgenommen, die eine Tiefe von 90 μm in der z-Achse abdecken. Die Analyse wurde mit Hilfe einer Freeware-Bildsoftware durchgeführt, indem die integrierte Fluoreszenzintensität in jedem Bild und Fluoreszenzkanal berechnet wurde. Dieser Ansatz ermöglicht eine dynamischere Analyse von Zellinvasionsmustern in einem mehrschichtigen Kontext sowie die Untersuchung der räumlichen Kolokalisation verschiedener Zelltypen während der Invasion.
Einleitung
Die Invasion ist ein Prozess, bei dem neoplastische Zellen durch die extrazelluläre Matrix in das umgebende Gewebe wandern 1,2. Mit fortschreitendem Tumor werden neoplastische Zellen immer komplexeren Mikroumgebungen ausgesetzt. Die Mikroumgebung des Tumors umfasst verschiedene Bestandteile der extrazellulären Matrix und nicht-neoplastische Zelltypen. Stromazellen, einschließlich Fibroblasten und ansässiger Makrophagen, gestalten die Mikroumgebung um, indem sie extrazelluläre Matrixkomponenten und Wachstumsfaktoren sowie Zytokine sezernieren, die wiederum die neoplastischen Zellfunktionen beeinflussen
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Protokoll
Die Verwendung von primären menschlichen Zellen wurde von der Institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung (CAAE 57895822.0.0000.5416) der Fakultät für Zahnmedizin in Araraquara - UNESP genehmigt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Zellen für die 3D-Zellkultur
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt müssen innerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Erhalten Sie einzellige Suspensionen der Zellen, die das Heterosphäroid bilden.
HINWEIS: I....
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Ergebnisse
In dieser Studie wird eine alternative Methode zur Beurteilung der Zellinvasion in vitro mit Hilfe von Sphäroiden vorgestellt, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen. Es ermöglicht die Analyse von Zellinvasionsmustern in einem vielschichtigen Kontext und die Untersuchung der Zellkolokalisationsdynamik während der Invasion (Abbildung 1).
Die Hellfeldbilder stellen die Lokalisierung von Sphäroiden und Zellen dar, die durch dunkle/schwarze Agglomerate geke.......
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Diskussion
Dreidimensionale Sphäroidkulturen sind ein leistungsfähiger Ansatz, um verschiedene Aspekte der Zellbiologie zu untersuchen. In dieser Studie berichten wir über ein Protokoll zur Bewertung der neoplastischen Zellinvasion mit Heterospheroiden, die die Tumormikroumgebung in einem mehrschichtigen und dynamischeren Ansatz nachahmen. Diese Methode ermöglicht die Beurteilung der Kolokalisation und der Invasionsmuster in Gegenwart von nicht-neoplastischen Stromazellen.
Es gibt einige kritische Schrit.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der São Paulo Research Foundation unterstützt (FAPESP 20/10544-1 und 20/10664-7). Einige Bilder wurden mit BioRender.com erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96 Well Bioprinting Kit | Greiner Bio-one | 655840 | Magnetfeld des Sphäroidantriebs. Laufwerk halten. 96-Well-Mikrotiterplatte, zellabweisende Oberfläche |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| CellTracker Red CMTPX | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | C34552 | |
| CellTracker Violet BMQC Dye | Invitrogen, Thermo Fisher | C10094 | |
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31600-034 | |
| DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12400-024 | |
| Extrazelluläre Matrix mit Myogel | doi: 10.1186/s12885-015-1944-z | Mix bestehend aus Myogel (2,4 mg/ml), Kollagen (0,8 mg/ml) und nicht supplementiertem Medium aus neoplastischen Zellen | |
| FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12657-029 | |
| Hydrocortison | Sigma | H088 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Software | |
| Nanoshuttle-PL | Greiner Bio-one | 657841 | Magnetische Nanopartikel |
| Nadel 23 G | Medix | AHMD004 | 25 x 0,60 mm (23 G x 1) |
| PBS pH 7,2 (1x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 2012-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Pipettenspitzen | Axygen, Corning Inc. | TF-200-L-R-S | Pipettenspitze mit Barriere (Filter), 200 & Mikro; L Low Retention Filter, kurz, maximale Rückgewinnung |
| RPMI | Gibco, ThermoFisher Scientific | 31800-022 | |
| TransWell 24 Well | Costar, Corning Inc. | 3422 | Transwell Permeable Stützen 6,5 mm Einsatz, 24-Well-Platte; 0,8 & Mikro; m Polycarbonat-Membran |
| Zen 3.4 (blaue Ausgabe) | Zeiss Group | Software |
Referenzen
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges. Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Friedl, P., A....
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Nachdrucke und Genehmigungen
