Strängspezifische Analyse von Proteinen bei der Replikation von DNA-Strängen durch Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten, entstehenden DNA-Methode

Zusammenfassung

Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

Zusammenfassung

Die Genomduplikation wird von Replisomproteinen, einschließlich Helikasen, orchestriert, die doppelsträngige DNA in einzelne antiparallele Einzelstränge umwickeln, die jeweils unterschiedliche Replikationsmodi erfordern: kontinuierlich (führend) und diskontinuierlich (verzögerend). Das Verständnis der Wechselwirkungen chromatinassoziierter Proteine mit replizierenden DNA-Strängen in vivo ist entscheidend, um die Mechanismen der Chromatinassemblage und DNA-Reparatur im Zusammenhang mit der DNA-Replikation zu klären. Dieses Protokoll umfasst die Anreicherung und Sequenzierung der proteinassoziierten nascent DNA (eSPAN)-Methode, die darauf ausgelegt ist, relative Proteinniveaus auf entstehenden führenden und hinterliegenden DNA-Strängen an Replikationsgabeln zu quantifizieren. Das eSPAN-Verfahren beginnt mit der Chromatin-Immunausfällung (ChIP, bei Hefe) oder der Spaltung unter Zielen und der Tagmentation (CUT&Tag; in Säugetierzellen) eines interessanten Proteins, gefolgt von der Anreicherung der proteinassoziierten entstehenden DNA durch Bromodeoxyuridin (BrdU)-Immunpräzipitation. Strengspezifische Next-Generation-Sequenzierung wird auf isolierte ssDNA angewendet. Diese Technik kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Protein an führenden oder verzögerten Replikationsgabeln angereichert ist. Das eSPAN bietet genomweite Strängpräferenz chromatinassoziierter Proteine, einschließlich Histonen an Replikationsgabeln.

Einleitung

Bei eukaryotischen Organismen wird die Genomduplikation von mehreren Stellen initiiert, die als Replikationsursprünge bezeichnet werden, wo der Ursprung-Erkennungskomplex (ORC) bindet und die Rekrutierungsprotein-Maschinerie, einschließlich der CMG-Helikase, initiiert, um DNA-Replikation¹ einzuleiten. Die Replisom-Maschinerie an jedem Replikationsursprung bildet zwei Replikationsgabeln, die bidirektional ^2,3 bewegen. Die Zwillings-Replikationsgabeln replizieren die beiden Elternstränge der DNA durch kontinuierliche Synthese des führenden Strangs und diskontinuierliche Synthese des nachliegenden Strangs. Aufgrund dieser asymmetrischen Natur jeder Replikationsgabel unterscheiden sich die Replikationskomponenten, einschließlich der DNA-Polymerasen auf den führenden und nachfolgenden Strängen. Frühere genetische Analysen basierend auf mutierten DNA-Polymerasen zeigen, dass DNA Pol ε und DNA Pol δ die Hauptpolymerasen sind, die für die führende bzw. nachzügende Strangreplikation verantwortlich sind ^4,5. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Strängpräferenz der DNA-Polymerase zu erkennen, darunter Pu-seq ^6,7, HydEn-seq⁸ und emRiboSeq oder RiboSeq ^9,10. Diese genetischen Methoden zur Analyse der Strängspezifität sind auf DNA-Polymerasen beschränkt und erfordern die Einführung von Mutationen an jedem Protein 4,5,11,12. Die Verfolgung der Assoziation eines beliebigen Zielproteins mit führenden und nachzüglichen Strängen von DNA-Replikationsgabeln liefert wertvolle Einblicke in die DNA-Replikation. In diesem Rahmen entwickelten wir zunächst die eSPAN-Technik (Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter naszenter DNA, Abbildung 1) in Hefezellen. Als Proof-of-Principal-Studie zeigten wir zunächst, dass Pol δ und Pol δ jeweils auf führenden und laggenden Strängen angereichert sind. Wir entdeckten außerdem die Strängpräferenz wichtiger DNA-Replikationskomponenten, darunter die replikative DNA-Helikase, das einsträngige DNA-Bindungsprotein (Replikationsprotein A) sowie die proliferatierende zellnukleare Antigenlampe (PCNA) und ihren Loader-Replikationsfaktor C (RFC)¹³. Wichtig ist, dass wir und andere diese Methode genutzt haben, um Mechanismen der elterlichen Histonübertragung aufzudecken, ein Prozess, der über vier Jahrzehnte lang unlösbar war⁽14,15,16,17).

Die eSPAN-Methode umfasst zwei aufeinanderfolgende Schritte: die Anreicherung des Zielproteins durch ChIP¹⁸ oder CUT&Tag¹⁹ und die Anreicherung der mit dem Protein assoziierten DNA durch BrdU-Immunpräzipitation. In einem Standard-Hefestamm (W303 oder S288C) kann extrazelluläres BrdU oder EdU nicht in Zellen eindringen und sich in Chromosomen integrieren. Diese Stämme haben keinen geeigneten Nukleosidtransporter für die Thymidinaufnahme sowie die Thymidinkinase, die zur Phosphorylierung von Thymidin zu TMP erforderlich ist, wodurch BrdU (oder EdU) in BrdUMP (EdUMP) umgewandelt wird. Die Expression des humanen Gleichgewichts-Nukleosidtransporters 1 (hENT1) und der Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) erhöht die Thymidinaufnahme und die Umwandlung von BrdU (oder EdU) in BrdUMP (EdUMP)²⁰. Daher mussten die Stämme, um das eSPAN-Experiment in Hefe durchzuführen, mit einer BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) Struktur (HSV-TK und hENT1)^13,21 eingefügt werden.

Zuvor stellten wir das eSPAN-Protokoll für DNA-Replikationsproteine in Hefe²² bereit. Kürzlich haben wir die CUT&Tag-Methode in das eSPAN-Protokoll in Säugetierzellen integriert, um technisch anspruchsvolle Schritte zu bewältigen, die Optimierung erfordern, wie Quervernetzung, Chromatinscherung und um die Anzahl der Startzellen zu minimieren.^17,23. Hier haben wir Histon-eSPAN zur Visualisierung mit Hefe-Zellen bereitgestellt (Abbildung 2). Diese Methode wird hauptsächlich verwendet, um die Verteilung modifizierter Formen von Histonen auf replizierenden DNA-Strängen zu analysieren. Während wir mehrere Histonmarkierungen testeten, nahmen wir H3K4me3, ein Zeichen auf dem elterlichen Histon H3, als Beispiel. Zur Analyse von replisomen Komponenten und Faktoren, die an der DNA-Reparatur an Replikationsgabeln beteiligt sind, empfehlen wir, Chromatin in kleine Fragmente mittels Sonikation zu zerschneiden, wie in unserer ersten Veröffentlichung^{beschrieben 22}. Für Säugetierzellen haben wir die modifizierten Cut&Tag-Verfahren übernommen, um den in^{Hefe 23} beschriebenen ChIP-Schritt zu ersetzen. Diese Modifikation reduziert die Menge an Ausgangsmaterial (Zellen) und ermöglicht vor allem die Erzeugung von eSPAN-Bibliotheken zur Sequenzierung ohne die Verwendung von Einzelsträng-DNA-Vorbereitungskits. Für das Hefeprotokoll entschieden wir uns gegen die Cut&Tag-Methode, da die Ausgangsmenge ausreichend war. Noch wichtiger ist, dass wir festgestellt haben, dass die Cut&Tag-Verfahren für Hefezellen in unseren Händen nicht durchgängig wirksam waren.

Protokoll

HINWEIS: Für Richtlinien zur Puffer- und Reagenzienvorbereitung siehe Richtlinien zur Puffer- und Reagenzienvorbereitung (Supplementary File 1).

1. Histon-eSPAN in Knospenhefe

HINWEIS: Die meisten Hefestämme haben keinen funktionellen Nukleosidtransporter für die Thymidinaufnahme. Um DNA effizient mit BrdU oder EdU für eSPAN zu labelen, ist ein thymidin-Kinaase-positiver (TK+) Stamm²¹ erforderlich. Zusätzlich können nur Pilzstämme des Paarungstyps 'A' für den Zellzyklusstopp unter Verwendung des Alpha-Faktors verwendet werden.

1. Hefezellsynchronisation und BrdU-Markierung (8 st.)
   1. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie geeigneten Hefestamms (TK+) in 10 ml YPD-Medium und wachsen Sie bei 30 °C in einem Schüttelinkubator über Nacht bei 220 U/min.
   2. Messen Sie die optische Dichte, OD600 nm, mit einem Spektrophotometer und verdünnen Sie die Kultur in frisches 200 mL YPD-Medium mit OD600 ~0,2-0,3.
   3. Wachsen Sie die Kultur auf OD600 ~0,4-0,5 (dauert normalerweise 3-4 Stunden) bei 30 °C in einem Schüttelinkubator bei 220 U/min.
   4. Fügen Sie 300 μL α-Faktor (5 mg/mL) hinzu und kultivieren Sie 1,5 Stunden bei 25 °C, 220 U/min.
   5. Fügen Sie eine weitere Dosis von 300 μL α-Faktor (5 mg/mL) hinzu und wachsen Sie weitere 1,5 Stunden bei 25 °C, 220 U/min.
   6. Bereiten Sie die 37,5%ige Paraformaldehydfixierungslösung vor und erwärmen Sie das Medium (200 mL YPD +HU (Hydroxyurea)+ BrdU) während der Zellsynchronisation auf 30 °C.
      VORSICHT: Behandle BrdU vorsichtig, da es ein potenzielles Mutagen und Teratogen ist. Bereiten Sie eine 37,5%ige Paraformaldehydlösung in einer chemischen Abzugshaube vor, um die Exposition gegenüber schädlichen Dämpfen zu vermeiden, da Paraformaldehyd potenziell krebserregend ist.
   7. Überprüfen Sie die Morphologie der Zellen (eine Stabform) mit einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass mindestens 90 % der Hefezellen 15 Minuten vor dem 3-Stunden-G1-Stillstand in der G1-Phase sind. Alternativ führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Analyse durch, um den G1-Arrest²⁴ zu bestätigen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellmorphologie und bestätigen Sie in diesem Schritt den G1-Arrest (zu 90 % mit Stabform).
   8. Sammeln Sie die Zellen (Pellet) durch Zentrifugation bei 1600 g für 5 Minuten bei 4 °C und waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 20 ml eiskaltem, doppelt destilliertem Wasser.
   9. Die Zellen in vorgewärmten (30 °C) 200 mL YPD +HU+ BrdU wieder suspendieren.
      HINWEIS: Der Zweck der HU-Freisetzung ist es, sicherzustellen, dass die meisten Hefezellen sich in der frühen Replikations-S-Phase befinden, was die Konsistenz verbessert und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherstellt. Das Weglassen von HU ist akzeptabel, wenn Arbeit mit logaritmischen Phasenzellen erforderlich ist.
   10. Kultivieren Sie die Zellen auf einem schüttelnden Inkubator bei 30 °C, 220 U/min für 45 Minuten.
       HINWEIS: Eine FACS-Analyse kann durchgeführt werden, um die frühe S-Phase zu bestätigen. Für die FACS-Analyse ist es wichtig, eine Log-Phasen-Probe als Kontrollgruppe einzubeziehen, um die G1-Zellpopulation genau zu definieren. Für eine effiziente Einbindung von BrdU ist es vorteilhaft, mit schnell wachsenden Zellen zu beginnen. Einige Mutanten mit langsamen Wachstumsdefekten zeigen tendenziell eine schlechte BrdU-Kennzeichnungseffizienz. Die Effizienz der BrdU-Einbindung und Leistung von BrdU-IP wird durch quantitative PCR bewertet, indem replizierte und nicht replizierte Regionen²² mit DNA aus Schritt 1.6.7 verglichen wird.
2. Probenfixierung und -entnahme (1 H)
   1. Frisch zubereitetes 6 ml 37 % Paraformaldehyd zu einer Endkonzentration von 1 % hinzufügen, gut mischen und bei 25 °C 20 Minuten mit sanftem Schütteln bei 90 U/min inkubieren.
   2. Löschen Sie die Fixierung ab, indem Sie 12 ml 2,5 M Glycin hinzufügen, gut mischen und bei 25 °C 5 Minuten mit sanftem Schütteln und 90 U/min inkubieren.
   3. Pellet die Zellen bei 1600 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Wasche dann die Zellen zweimal mit 20 ml kaltem Wasser, indem du sie bei 1600 g für 5 Minuten drehst.
   4. Sammeln Sie die Zellen in 2-mL Schraubverschlussröhrchen (50 mL Zellen/Röhre) und lagern Sie sie bei -80 °C.
      HINWEIS: Zellen können bis zu einem Jahr gelagert werden (Pausenpunkt).
3. Hefezelllyse und Chromatinfragmentierung (5 H)
   1. Die Zellpellets auftauen, durch sanftes Vortexen wieder suspendieren und mit 0,4 ml ChIP-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren und einer Antibiotikamischung waschen (um das Wachstum kontaminierender Bakterien zu verhindern) und 1 Minute bei 5.000 g schleudern.
   2. Fügen Sie 0,1 ml ChIP-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren und eine Antibiotikamischung hinzu, gefolgt von etwa 100 μL Glasperlen (0,5 mm).
   3. Lyse durch Perlenschlagen für 3 Zyklen (30 Sekunden Ein/Aus, 1 Minute Aus) in einem 4 °C kalten Raum.
   4. Stechen Sie Löcher in den Boden des Rohrs mit einer 16-G-Heißnadel.
      HINWEIS: Um die heiße Nadel zu halten, versuchen Sie, das Rohr nahe am Feuer zu halten.
   5. Sammeln Sie das Lysat, indem Sie das Röhrchen in ein 1,5 ml leeres DNA-Schwachbindungsrohr einbetten und bei 1600 g für 2 Minuten, RT, zentrifugieren.
   6. Aspirieren Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig, ohne das Pellet zu stören (Chromatin befindet sich in der Zellrestfraktion).
      VORSICHT: Seien Sie vorsichtig, das Zellpellet beim Vakuum nicht versehentlich zu aspirieren.
   7. Die Zellpellets werden durch Pipettieren in 0,35 mL MNase-Verdauungspuffer wieder suspendiert, ergänzt mit 0,5 mM Spermidin und 0,1 mM 2-Mercapptoethanol.
   8. Fügen Sie den Reaktionen 10 Einheiten MNase hinzu, mischen Sie sie vorsichtig 4-6 Mal sofort um, und inkubieren Sie bei 37 °C Wasserbad für 20 Minuten.
      HINWEIS: Die Verdauungsbedingungen sollten für jede Charge des MNase-Enzyms optimiert werden, um Mono-, Di- oder Trinukleosomenfraktionen anzureichern.
   9. Die MNase-Verdauung wird abgeschreckt, indem man 5 μL 0,5 M EDTA hinzufügt, um eine Endkonzentration von 10 mM EDTA zu erreichen. Mische sie vorsichtig durch Inversion und bewahre die Röhren sofort mindestens 30 Minuten in Eis.
      HINWEIS: Die Proben können in diesem Schritt bei 4 °C über Nacht gelagert werden. Die Verdauungsbedingungen von MNase sollten optimiert werden, um die Mehrheit der Mono-, Di- oder Trinukleosomenfraktionen (140–450 bp) zu erhalten
   10. Sonikieren Sie das Reaktionsgemisch mit Bioruptor-Mikroröhren (1,5 ml) für 3 Minuten (hohe Leistung, 30 s Ein/Aus). Bei 10.000 g für 5 Minuten bei 4 °C drehen.
       HINWEIS: Diese kurze Sonikation hilft, das Chromatin in den Puffer freizusetzen.
   11. Überfüllen Sie das Supernatant in neue Röhren und drehen Sie weitere 10 Minuten bei 10.000 g bei 4 °C.
   12. Sammeln Sie Supernatant (etwa 400 μL), bewahren Sie 30 μL der Probe als Eingabe-DNA auf und frieren Sie bei -20 °C ein. Verwenden Sie das verbleibende (~370 μL) Zelllysat für die nächste Chromatin-Immunausfällung (Schritt 1.4.1).
4. Histonchromatin-Immunausfällung (über Nacht)
   1. Gib 0,5 μg H3K4me3-Antikörper zum Lysat und Nutat auf der Rotor, 10 U/min bei 4 °C über Nacht.
      HINWEIS: Hier wird H3K4me3 als Beispiel verwendet. Die Antikörpermenge sollte experimentell getestet werden.
   2. Drehen Sie bei 15.800 × g für 10 Minuten bei 4 °C und übertragen Sie das Supernatant auf ein neues 1,5-mL-Rohr.
   3. Fügen Sie 20 μL vorgewaschenes Protein G-Sepharoseperlen hinzu (3-mal gewaschen mit ChIP-Lysepuffer, jeweils 3 Minuten auf dem Rotor nutatieren, Perlen durch Zentrifugation bei 350 × g, 4 °C sammeln) und 2 Stunden bei 4 °C inkubieren.
   4. Drehen Sie mit 350 g × g bei RT und waschen Sie die Perlen gemäß folgender Reihenfolge.
      1. Waschen Sie zweimal mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer für jeweils 3 Minuten in Rotation bei 10 U/min auf einem Rotator bei RT.
      2. Waschen Sie einmal mit 1 ml eiskaltem Lysepuffer mit 0,5 M NaCl-Puffer für 3 Minuten bei 10 U/min auf einem Rotator bei RT.
      3. Wasche einmal mit 1 ml eiskaltem Tris/LiCl-Waschpuffer für 3 Minuten bei 10 U/min auf einem Rotator bei RT.
      4. Wasche eines mit 1 ml RT Tris/EDTA Waschpuffer (kein TE-Puffer, Supplementary File 1 für das Rezept). Strumpfen Sie die gesamte mögliche Flüssigkeit mit einer 16 G 1/2-Nadel aus dem Pellet heraus.
5. DNA-Extraktion (2 st.)
   1. Fügen Sie 0,1 ml gut gemischtes 10%iges Chelatharz zur DNA-Extraktion zu den gewaschenen Perlen (ab Schritt 1.4.4.4), der Eingabeprobe (ab Schritt 1.3.12) und dem Vortex hinzu.
   2. Koche 10 Minuten auf einem 100 °C Heizblock, dann kühle auf RT und vernetze die Querverbindung.
      HINWEIS: Stop-pop-Verriegelungsklammern für Zentrifugenröhren werden dringend empfohlen, um die Verschlussdichtung aufrechtzuerhalten.
   3. Fügen Sie den Perlen 5 μL 20 mg/mL Protease K hinzu und inkubieren Sie bei 55 °C für 30 Minuten beim Schütteln bei 400 U/min.
   4. Kochen Sie die Perlen auf einem 100 °C Heizblock weitere 10 Minuten, um die Protease-K-Aktivität zu deaktivieren.
      HINWEIS: Stop-pop-Verriegelungsklammern für Zentrifugenröhren werden dringend empfohlen, um die Verschlussdichtung aufrechtzuerhalten.
   5. Drehe die Perlen bei 6000 g für 2 Minuten bei RT ab und bewahre das Supernatant auf.
   6. Gib 100 μL 2XTE zum Pellet. Vortex und bei 6000 g für 2 Minuten bei RT abdrehen.
   7. Mische und bewahre die oben aufgenommenen Supernatanten (aus den Schritten 1.5.5 und 1.5.6) auf (etwa 180 μL).
   8. Reinigen Sie 30 μL-Proben in 18 μL Elutionspuffer (EB, geliefert mit dem PCR-Reinigungskit) mithilfe von DNA-Reinigungssäulen für die Vorbereitung der ssDNA-Bibliothek (ab Schritt 1.3.12 als Eingabe und Schritt 1.5.7 als H3K4me3 ChIP-seq-Proben).
      HINWEIS: DNA-Proben können bis zu einem Monat bei -20 °C gelagert werden (Pausenpunkt).
6. BrdU-Immunausfällung (5 st.)
   1. Koche die Proben (etwa 150 μL Eingang und H3K4me3 ChIP aus Schritt 1.5.7) 5 Minuten lang auf einem 100 °C Heizblock und kühle sie sofort 5 Minuten in Eis. Fügen Sie 15 μL 10x PBS und + 1,35 mL BrdU IP-Puffer + 0,5 μL Anti-BrdU Ab + 1 μL E.coli-tRNA (10 mg/mL) hinzu.
      HINWEIS: Dies ist ein entscheidender Schritt. Verwenden Sie die Zentrifugenröhren mit niedriger DNA-Bindung, um eine unspezifische DNA-Bindung zu vermeiden.
   2. Nutate 2 Stunden auf einem Rotor bei 4 °C bei 10 U/min.
   3. Übertragen Sie die Mischung in ein 1,5-mL-Rohr mit 20 μL Protein G Sepharoseperlen (dreimal mit 1 mL BrdU IP-Puffer gewaschen und jeweils 3 Minuten bei 10 U/min bei jeder Spülung bei RT rotieren) und nutieren Sie 1 Stunde bei 4 °C auf dem Rotor bei 10 U/min.
   4. Drehen Sie bei 800 g × g für 1 Minute bei RT und waschen Sie gemäß Folgendes: dreimal mit 1 ml kaltem BrdU IP-Puffer, 3 Minuten auf einem Rotor und einmal mit 1 ml TE-Puffer für 3 Minuten.
   5. Drehen Sie sich bei 800 × g für 1 Minute bei RT und aspirieren Sie das Supernatant.
   6. Fügen Sie 100 × μL TE + 1 % SDS-Puffer in die verbleibenden Perlen ein. Inkubieren Sie bei 65 °C für 5 Minuten. Dreh dich bei 800 × g für 1 Minute bei RT.
   7. Reinigen Sie den Überstandsstoff in 18 μL EB mit DNA-Reinigungssäulen (BrdU IP und H3K4me3 eSPAN-Probe).
      HINWEIS: Verwenden Sie die niedrigbindenden Zentrifugenröhren, um eine unspezifische DNA-Bindung zu vermeiden. DNA-Proben können bei -20 °C bis zu einem Monat (Pausenpunkt) gelagert werden.
7. ssDNA-Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung (3 H)
   1. Bereite die einzelsträngigen DNA-Bibliotheken mit 15 μL gereinigter Eingangsproben, BrdU IP, H3K4me3 ChIP und eSPAN Proben (Schritte 1.5.8 und 1.6.7) (einschließlich Adaptase, Erweiterung und Ligation) gemäß den Handbüchern von ssDNA und dem Low-Input-DNA-Bibliotheksvorbereitungskit vor, und reinige das gewonnene Ligationsprodukt in 20 μL Low-EDTA-Elutionspuffer (bereitgestellt durch das DNA Library Prep Kit).
      HINWEIS: Im Kit gibt es zwei Schritte zur Ligationsreinigung. Dieses Protokoll folgt dem 200-bp, <1-ng-Verfahren.
   2. Amplifizieren Sie die DNA-Bibliothek mit einer Gesamtreaktionsmischung von 50 μL (Reagenzien bereitgestellt durch das SS-DNA-Bibliotheksvorbereitungsset): 20 μL gereinigte DNA-Bibliothek, 4 μL Reagenz W2, 10 μL Reagenz W3, 1 μL Enzym W4, 1,5 μL Index-I7-Primer (10 μM, siehe Supplemental Oligo Sequence) und 1,5 μL Index-I5-Primer (10 μM, siehe Supplemental Oligo Sequence), 16 μL DNase-freie ddH₂O. Erhitze die PCR-Mischung bei 98 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 18 Zyklen mit 10 Sekunden bei 98 °C, 30 Sekunden bei 60 °C und 1 Minute bei 68 °C sowie einem Zyklus mit 10 Minuten bei 68 °C.
      HINWEIS: Jede Bibliothek sollte eine einzigartige Kombination aus i7- und i5-Primern verwenden. Die Anzahl der Amplifikationszyklen sollte je nach Menge der Bibliothek angepasst werden, um eine Überamplifikation zu vermeiden, die zu PCR-Artefakten führen kann. Angesichts der typischerweise geringen DNA-Menge in eSPAN-Proben sollte bis zu 18 Zyklen verwendet werden.
   3. Reinigen Sie die PCR-Produkte, indem Sie 60 μL (1,0-faches Volumen) Perlen (vorgewärmt auf 30 °C) einmischen (siehe Materialtabelle).
   4. Mische die PCR-Produkte und Perlen gründlich.
      1. Lass es 5 Minuten auf RT stehen. Perlen für 3 Minuten auf dem magnetischen Stand binden und die Perlen zweimal mit (jeweils 200 μL) frisch zubereitetem 80%-Ethanol waschen.
      2. Die Perlen 2 Minuten an der Luft trocknen lassen und in einen 20 μL Low-EDTA-Puffer (bereitgestellt im DNA Library Prep Kit) elutieren.
   5. Messen Sie die Bibliothekskonzentration und die Fragmentgrößenverteilung mit hochauflösenden Elektrophoresesystemen (siehe Materialtabelle).
   6. Bündeln Sie eine gleiche Anzahl einzelner Bibliotheken, einschließlich der Eingabe-, H3K4me3-, ChIP-, BrdU-IP- und eSPAN-Samples, und führen Sie parallele Paired-End-Sequenzierung mit der Illumina-Sequenzierungsplattform durch. Für den Datenanalyseprozess siehe Abschnitt 3.
      HINWEIS: Die Bewertungskriterien für Qualitätskontrollergebnisse sind: (i) Es werden keine Adapter-/Primer-Dimer-Peaks (unter 180 bp) nachgewiesen. (ii) Alle zu poolenden Bibliotheken haben eine ähnliche und enge Größenverteilung (~300 bp Breite). Ein Übertrocknung der Perlen kann zu geringem Ertrag führen; Verwenden Sie eine DNA-Arbeitsstation, um eine Kontamination zu vermeiden. Bibliotheken können unbegrenzt bei -20°C (Pausepunkt) gespeichert werden.

2. Histon-eSPAN mit Maus-ES-Zelle

HINWEIS: Das Histon-eSPAN mit Maus-ES-Zelle ist im Wesentlichen identisch mit einem zuvor veröffentlichten Protokoll²³.

1. BrdU-Markierung und Probenentnahme für Maus-ES-Zellen (3 H)
   1. Wachsen Sie die ES-Zellen der Maus in einem ES-Kulturmedium bei 37 °C mit einer befeuchteten_{CO2-Atmosphäre} von 5 %, um eine Konfluenz von 70 % bis 80 % zu erreichen. Im Allgemeinen waren etwa 1 Million Zellen für Histon-eSPAN erforderlich. Samen Zellen einen Tag vor den Experimenten verwenden, um sicherzustellen, dass die Zellen exponentiell wachsen.
   2. Wechselt das Medium und inkubiert die Zellen mit BrdU bei einer Endkonzentration von 50 μM für 30 Minuten bei 37 °C mit einer befeuchteten, 5%igen_{CO2-Atmosphäre} .
      HINWEIS: Die Effizienz der BrdU-Markierung kann durch quantitative PCR-Analyse überwacht werden. Alternativ kann die Immunfluoreszenz- oder FACS-Analyse verwendet werden, um die Effizienz der BrdU-Einbindung zu überwachen. Unmarkierte Zellen können als negative Kontrolle verwendet werden. Dies sind die Standard-Markierungsbedingungen für Maus-ES-Zellen. Es wird empfohlen, die Markierungsbedingungen für Zellen mit unterschiedlichen Proliferationsraten und S-Phasendauern entsprechend anzupassen.
   3. Spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit eiskalten PBS.
   4. Trypsinisiere und sammle die Zellen durch Pelleting bei 200 × g für 5 Minuten.
   5. Pipette die Zellen vorsichtig auf Medium, um sie wieder aufzuhängen, und zähle sie dann. Zentrifugiere die erforderliche Anzahl von Zellen bei 500 × g für 5 Minuten bei RT.
   6. Setzen Sie das Zellpellet in 4 ml Waschpuffer durch Pipettieren wieder auf und entsorgen Sie das Supernatant. Zentrifugiere mit 500 × g für 5 Minuten bei RT.
   7. Die Pellets erneut mit 4 ml Waschpuffer suspendieren und bei 500 × g für 5 Minuten bei RT zentrifugieren.
   8. Entsorge den Supernatant und suspendiere die Zellen wieder in einem Waschpuffer.
   9. Platzieren Sie die mit ConA beschichteten magnetischen Perlen (verwenden Sie 10 μL Perlen für 250.000 Zellen; skalieren Sie bei Verwendung von mehr Zellen) und suspendieren Sie sie in 1 mL Bindungspuffer. Nach mehreren Inversionen stellen Sie die Röhren auf den magnetischen Ständer, damit die Perlen absinken können.
   10. Mit einer Pipette oder einem Vakuum mit niedriger Geschwindigkeit entsorgen Sie die Überwasserstoffe. Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal und lassen Sie die Perlen im Bindungspuffer wieder aufhängen.
   11. Fügen Sie vorgewaschene, mit ConA beschichtete Magnetperlen zu den Proben hinzu. Gut mischen und 10-20 Minuten auf RT rotieren.
   12. Platziere die Röhren auf einen Magnethalter, um alle Überstandsstoffe zu entsorgen.
2. Tagmentation¹⁹ für Maus-ES-Zellen (2 Tage)
   1. Suspendiere die Perlen (ConA-beschichtete Magnetperlen, die ab Schritt 2.1.10 mit Zellen gebunden sind) in 200 μL Eiskalte Antikörperpuffer. Fügen Sie IgG als negative Kontrolle hinzu oder die entsprechenden Konzentrationen primärer Antikörper gegen die interessierten Proteine.
   2. Gut mischen und über Nacht bei 4 °C nutieren.
   3. Mischen Sie 2 μg des sekundären Antikörpers und eine angemessene Menge pA-Tn5 im Molarverhältnis von 1:2. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 8 μL pro Probe mit 50 % (v/v) Glycerol. Mehrmals pipetten, um gut zu mischen, und 1 Stunde bei RT inkubieren.
   4. Lege die CUT&Tag-Proben für 30 Sekunden auf einen Magnetständer und entsorge alle Supernatanten. Gib 1 ml Dig-Wash-Puffer zu den Kugeln und drehe mehrmals um.
      HINWEIS: Von diesem bis zu den folgenden Waschschritten (Schritte 2.2.5-2.2.6) wird empfohlen, die Perlen nach dem Umkehrschritt 3–5 Minuten in den Puffern zu inkubieren, um ein unspezifisches Binden zu vermeiden.
   5. Stelle die Röhren auf einen Magnethalter und entferne alle Überlagerungsmittel. Fügen Sie 200 μL Dig-300-Puffer hinzu, um die Perlen wieder aufzuhängen, und fügen Sie jede Probe die 8 μL der Mischung aus sekundärem Antikörper und pA-Tn5 hinzu. Nachdem du mehrmals gut mit Pipettieren gemischt hast, inkubiere 1 Stunde bei RT.
   6. Stelle die Röhren auf einen Magnethalter und entferne alle Überlagerungsmittel. Fügen Sie 1 ml Dig-300-Puffer hinzu, um die Perlen wieder aufzuhängen und mehrmals umzukehren.
   7. Stelle die Röhren auf einen Magnethalter und entferne alle Überlagerungsmittel. Wiederhole den Waschschritt noch dreimal.
   8. Entfernen Sie die Supernatanten vollständig und fügen Sie 250 μL Tagmentationspuffer hinzu, um die Perlen neu zu suspendieren, und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde.
      HINWEIS: Für den Reaktionsschritt an einem Thermomixer wird ein sanftes Schütteln empfohlen, da sich die Perlen auf den Boden der Röhren setzen können.
   9. Stelle die Röhren auf einen Magnethalter und entferne alle Überlagerungsmittel. Verwenden Sie 1 ml TAPS-Waschpuffer, um die Perlen wieder aufzuhängen und mehrmals umzukehren.
   10. Stelle die Röhren auf einen Magnethalter und entsorge alle Übernatalien.
   11. Fügen Sie 250 μL Dig-300-Puffer mit 15 mM EDTA, 0,1 % (w/v) SDS und 0,1 mg/mL Proteinase K in die verbleibenden Perlen ein. Vortex gut mischen und über Nacht bei 37 °C mit sanftem Schütteln ausbrüten.
3. Genomische DNA-Reinigung und In-vitro-Tagmentation in Maus-ES-Zellen (über Nacht)
   HINWEIS: Genomische DNA aus denselben Zellen wie eSPAN wird extrahiert und für die In-vitro-Tagmentation vorbereitet, die für BrdU-IP-ssSeq verwendet wird. Die genomische DNA-Tagmentation und die folgende BrdU-IP-ssSeq dienen der eSPAN-Normalisierung.
   1. Die Zellen in 300 μL genomischer DNA-Lysepuffer und Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit wieder suspendieren, bis keine Pellets mehr sichtbar sind.
   2. Für jede Probe fügen Sie RNase A mit 100 μg/mL hinzu. Nach der Kombination 10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
   3. Fügen Sie jeder Probe 100 μL Protein-Ausfällungslösung hinzu. Gut mischen durch Vortex und Zentrifuge bei 15.000 g bei RT für 3 Minuten.
   4. Bewahren Sie das Supernatant, indem Sie es in neue 1,5-mL-Röhren übertragen. Gib den Proben 1x Volumen Isopropanol zu und mische gut.
   5. Drehen Sie 3 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit bei RT, um die genomische DNA zu pelleten. Gießen Sie die Supernatanten vorsichtig ab.
   6. Gib 1 ml frisch vorbereitetes 70%iges (v/v) Ethanol zu jeder Probe und drehe mehrmals um. Zentrifugiere mit Höchstgeschwindigkeit bei RT für 3 Minuten.
   7. Zentrifugieren Sie bei 15.000 g für 1 Minute bei RT und entfernen Sie den restlichen Ethanol mit einer P20-Pipette. Lassen Sie sie 5-10 Minuten an der Luft trocknen.
   8. Fügen Sie 50 μL ddH₂O hinzu und Wirbel kurzzeitig, um die genomische DNA wieder zu suspendieren. 30 Minuten bei 65 °C auflösen.
   9. Zentrifugieren Sie kurz und übertragen Sie die Supernatanten auf neue 1,5-ml-Röhren. Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer.
   10. Richten Sie die In-vitro-Tagmentationsreaktion wie in Tabelle 1 auf.
   11. Gut mischen und 30 Minuten bei 37 °C mit sanftem Schütteln inkubieren.
   12. Fügen Sie 10 mM EDTA, 0,1 % (w/v) SDS und 0,1 mg/mL Proteinase K zu jeder Probe hinzu. Gut mischen durch Vortex und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln inkubieren.
4. DNA-Extraktion und Oligo-Ersatz (3 H)
   HINWEIS: Sowohl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI) als auch Säulenreinigung können für die DNA-Extraktion angewendet werden. Hier werden detaillierte Verfahren zur Säulenreinigung bereitgestellt.
   1. Fügen Sie den Proben 1,25 ml (5x Volumen) Bindungspuffer (geliefert mit dem PCR-Reinigungskit) hinzu (Schritte 2.2.11. und 2.3.12) und mischen Sie sie gut durch mehrmalige Inversion.
   2. Laden Sie das Gemisch in DNA-Reinigungssäulen (in 2-mL-Sammelröhren) und zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 10.000 × g bei RT. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   3. Fügen Sie 600 μL Elutionspuffer (im Kit enthalten) zu den Säulen hinzu und zentrifugieren Sie für 1 Minute bei 10.000 × g bei RT. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   4. Zentrifugiere mit maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten, um den verbleibenden Puffer vollständig zu entfernen. Setze die Säulen in neue 1,5-mL-Röhren mit offenen Deckeln und lasse sie 1 Minute an der Luft trocknen.
   5. Fügen Sie 32 μL DNase-freies ddH₂O (oder 10 mM Tris·HCl, pH = 8,0) in die Mitte der Membran hinzu und lassen Sie sie 1 Minute ruhen. Zentrifugiere mit maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten, und die CUT&Tag-DNA ist jetzt in Lösung.
   6. Fügen Sie 32 μL CUT&Tag-DNA-Probe in eine neue PCR-Röhre und dann 2 μL dNTP-Mischung (je 2,5 mM), 4 μL 10-fach-Ampligase-Puffer und 2 μL rep-B (10 μM) hinzu. Sanft anklopfen und durch Pipetteren mischen.
   7. Kurz abschalten und das folgende Programm für Oligo^{Replacement 23} ausführen.
      50 °C, 1 Minute
      45 °C, 10 min
      Rampe auf 37 °C, 0,1 °C/s
      37 °C, halten
   8. Im Thermocycler werden 1 μL T4-DNA-Polymerase und 1 μL Ampligase zu jedem Rohr (Endvolumen 40 μL/Probe) hinzugefügt. Mischen Sie durch sanftes Pipetteren.
   9. Setzen Sie die Reaktion bei 37 °C im Thermocycler für 30–60 Minuten fort.
      HINWEIS: DNA kann bei -20 °C gelagert werden, wenn nicht direkt nach diesem Schritt (sicherer Pausenpunkt) zu BrdU IP weitergeleitet wird.
5. BrdU-Immunpräzipitation (im Wesentlichen wie das Hefeprotokoll) (2 st.)
   1. Übertragen Sie die Proben in 1,5-mL DNA-Schwachbindungsröhren. Proben 5 Minuten auf einem 100 °C Hitzeblock kochen und sofort 5 Minuten in Eis abkühlen. Fügen Sie 15 μL 10x PBS und + 1,35 mL BrdU IP-Puffer + 0,5 μL Anti-BrdU Ab + 1 μL E.coli-tRNA (10 mg/mL) hinzu.
   2. Nutate 2 Stunden auf einem Rotor bei 4 °C.
   3. Übertragen Sie die Mischung in ein Rohr mit 20 μL Protein-G-Sepharoseperlen (dreimal mit 1 ml BrdU IP-Puffer, jeweils 3 Minuten gewaschen).
   4. Inkubiere bei 4 °C für 1 Stunde.
   5. Drehen Sie sich 1 Minute mit 800 × g und waschen gemäß folgenden: dreimal mit 1 ml kaltem BrdU IP-Puffer, 3 Minuten auf einem Rotor; einmal mit 1 ml TE-Puffer für 3 Minuten.
   6. Drehen Sie 1 Minute mit 800 × g und aspirieren Sie das Supernatant.
   7. Füge 100 μL TE + 1 % SDS-Puffer in die verbleibenden Perlen ein. Inkubieren Sie bei 65 °C für 15 Minuten. Drehen Sie 1 Minute lang bei 800 × g .
   8. Reinigen Sie den Überstandsstoff in 18 μL Elutionspuffer (geliefert mit dem Kit) mithilfe von DNA-Reinigungssäulen (BrdU IP und H3K4me3 eSPAN-Probe).
6. PCR-Verstärkung und Sequenzierung (1,5 H)
   1. Amplifizieren und markieren Sie Einzelsträng-DNA-Bibliotheksproben mit verschiedenen Indexkombinationen. Bereite die PCR-Reaktion vor, indem Sie folgende Komponenten hinzufügen ((gereinigte DNA [ChIP oder ESPAN], I5-Indexierungsprimer [1 μL], I7-Indexierungsprimer [1 μL], NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix (2x) [10 μL], ddH₂O bis 20 μL), die Proben durch Pipettieren mischen und kurz drehen.
   2. Erhitze die PCR-Mischung bei 98 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 12–14 Zyklen à 10 Sekunden bei 98 °C und 20 Sekunden bei 63 °C sowie einem Zyklus von 2 Minuten bei 72 °C.
   3. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit 18 μL paramagnetischen Perlen (0,8x Volumen) in 20 μL Puffer mit niedrigem EDTA.
   4. Messen Sie die Bibliothekskonzentration und die Fragmentgrößenverteilung mit hochauflösenden Elektrophoresesystemen.
   5. Bündeln Sie eine gleiche Anzahl einzelner Bibliotheken, einschließlich der Eingabe-, H3K4me3-, ChIP-, BrdU-IP- und eSPAN-Samples, und führen Sie parallele Paired-End-Sequenzierung mit der Illumina-Sequenzierungsplattform durch.

3. eSPAN-Datenanalyse für Hefezellen (1 Tag)

HINWEIS: Dieser Datenanalyseprozess gilt nur für die Hefedaten; Die eSPAN-Datenanalyse für ES-Zellen kann wie in einer aktuellen Veröffentlichung²³ dargelegt werden.

1. Rohsequenzdateien extrahieren, Adaptersequenzen mit Trim Galore Tools trimmen und Lesearten kleiner als 10 bp entfernen, um die Ausgabedatei zu reduzieren und Abstürze von Ausrichtungsprogrammen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Dateien im Format file1_1.fq, file1_2.fq für gepaarte Lesungen vorliegen:
   /TrimGalore-0.6.10/trim_galore file.fq-o trim --Länge 10 - gepaart
2. Generiere Fliege-Indexdateien für das Referenzgenom:
   bowtie2-build genome.fa
3. Die Reads werden mit Bowtie 2 auf das entsprechende Referenzgenom (Saccharomyces-Genom (sacCer3) für Hefepilze abgebildet:
   bowtie2 -x Genom -1 trim_1.fq -2 trim_2.fq --lokal --kein Schwalbenschwanz --kein-dissonant --maxins 1000 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0,50
4. Entfernen Sie Multimap-Reads mit SAMtools und duplizieren Sie Reads mit Sambamba-Tools:
   samtools view -bhs - q 40 input.bam -o output.bam
   sambamba-1.0.1.1-linux-amd64-static markdup output.bam filtered.bam -r
5. Verwenden Sie DeepTools, um die großen Lesedateien auf Watson- und Crick-Strängen separat für jede Probe aus sauberen BAM-Dateien zu generieren:
   bamCoverage -b filtered.bam -o watson.bw --filterRNAstrand reverse -bs 1 - extendReads
   bamCoverage -b filter.bam -o crick.bw --filterRNAstrand forward -bs 1 - extendReads
6. Berechnen Sie die durchschnittliche Verspannung an jeder Nukleosomenposition²⁵ für jede Probe basierend auf der Formel: log2 – die vorderen (Watson-Strang)/umgekehrten (Crick-Strang)-Werte nach der Referenz-Nukleosompositionierung waren^{getrennt 25}. R-Skripte für diese Berechnungen sind bei https://github.com/clouds-drift/eSPAN-bias verfügbar. Für eine Standardberechnung verwenden Sie die folgenden Befehle.
   HINWEIS: Dieser Schritt gilt nur für die Hefedaten; Die Verzerrungsberechnung für ES-Zellen kann wie in einer aktuellen Veröffentlichung²³ beschrieben werden.
   Skript cal_bias. R -w watson.bw -c crick.bw r replication_origins.bed
7. Falls nötig, passe die Strängvorrichtung durch die BrdU-Vorspannung an:
   Skript normalize_bias. R -i matrix_files -c classes_list -C condition_list --Ziel target_list --kontrollieren control_list
   HINWEIS: "matrix_files" ist eine Liste der vom cal_bias generierten Dateien. R-Schrift durch Kommas getrennt. z. B. 'Datei1', 'Datei2', Datei3'. "classes_list" ist eine Liste von Beispielklassen, die zu jeder Datei gehören, getrennt durch Kommas (z. B. 'brdu', 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "condition_list" ist eine Liste von Beispielbedingungen, die jeder Datei entsprechen und durch Kommas getrennt sind. Jede Datei wird nach Klasse und Zustand gepaart, um die Verspannung anzupassen. "target_list" ist eine Liste von Kursen, die aus dem classes_list genommen wurden. Sie definiert die Klassen, die als die von den Kontrollen angepassten Daten fungieren sollen (z. B. 'H3K4me3_eSPAN', 'H3K56ac_eSPAN'). "control_list" ist eine Liste der Kurse, die aus der Kursliste stammen. Es wird die Klassen definieren, die als Daten fungieren, die von den Kontrollen angepasst werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die Listenlänge der target_list entspricht (z. B. 'brdu').
8. Nach Berechnung und Anpassung gruppieren Sie Stichproben und erstellen Sie Visualisierungen der Daten.
   Skript draw_bias. R -s' bias_matrix/file1.txt, bias_matrix/file2.txt' -o 'bias.pdf' -g Gruppe 1,Gruppe 2 --interval=T
   -s benötigt eine Liste von Bias-Dateien, die von den oben genannten Skripten generiert wurden
   -o ist die Ausgabedatei
   -g definiert die experimentellen Gruppen, um zu berechnen, d. h. biologische Replikate, um den durchschnittlichen Bias darzustellen.
   --Intervall T oder F, um Standardfehler auf den Diagrammen innerhalb experimenteller Gruppen darzustellen.
   HINWEIS: Die Informationen über Replikationsursprünge wurden durch BrdU IP-Daten definiert. Die Informationen zur Position eines einzelnen Nukleosoms stammen aus einem zuvor veröffentlichten Artikel²⁵. Für die Analyse der Maus-ES-Zelldaten wurden die Ursprungsinformationen aus dem OK-seq-Datensatz²⁶ gewonnen, und die Berechnung des durchschnittlichen Bias sollte dem in vorherigen Arbeiten^{beschriebenen Protokoll 23} folgen.

Ergebnisse

eSPAN kann verwendet werden, um strengspezifische Informationen über ein Zielprotein zu erhalten, wie Histone und Histonmodifikationen. In diesem repräsentativen Ergebnis wurden Probenentnahme und eSPAN-Prozesse nach dem in Abbildung 2 dargestellten Schema mit dem Knospenhefesystem durchgeführt. Die Probenbehandlung und -entnahme folgt dem mit Hydroxyurea behandelten frühen S-Phasen-Zustand als dieses Protokoll. Zwei Hefestämme, WT (Wildtyp) und mcm2-3A-Mutant, wurden eingesetzt. Di...

Diskussion

Der Nachweis von Proteinen, die mit führenden und verzögerten Replikationssträngen assoziiert sind, ist wichtig, um die Mechanismen der Chromatinreplikation und den damit verbundenen Prozess zu verstehen, die direkt für die humane Krebsforschung und die Mechanismen der Arzneimittelresistenz relevant sind. Mehrere Methoden, wie 2D-Gel, native Chromatin-Immunpräzipitation (nChIP), iPOND und der entstehende Chromatin-Capture 29,30,31, wurden eingesetzt, um DNA-Replikation und verwandte Pro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	15575020
1,5 ml DNA-Schwachbindungsröhren	Eppendorf	22431021
10x Ampligase-Puffer	Lucigen	A1905B
10x PBS	Corning	21-040-CV
10x TBS	BioRad	1706435
16 G x 1-1/2 Zoll. BD PrecisionGlid Nadel	BD Biosciences	305198
ACCEL-NGS 1S PLUS DNA-BIBLIOTHEKSSET	Integrierte DNA-Technologien	10009817	ssDNA und Low-Input-DNA-Bibliotheksvorbereitungskit
Agilent 2100 bioanalyzer	Agilent	Bioanalyse 2100
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5607-1504
Ampligase	Lucigen	A0110K	Behandeln Sie Paraformaldehyd mit Vorsicht, es ist brennbar, fest und gefährlich.
AMPure XP	Beckman	A63881
AMPure XP SPRI Reagenz	Beckman Coulter	A63882
Anti-BrdU-Antikörper	BD Biosciences	555627
Anti-H3K4me3-Antikörper	abcam	ab8580
Automatisierter Zellzähler, Modell TC10	BioRad	145-0001
Bacitracin	Sigma	11702
Bacto Peptone	Thermo Fisher Scientific	211830
Benzamidinhydrochlorid	Sigma	B2417	Brennbare Feststoffe
BrdU	Sigma	B5002	Behandle BrdU mit Vorsicht, da es ein potenzielles Mutagen und Teratogen ist.
BSA	New England Biolabs	B9000S
CaCl2	Sigma	C4901
Zellkulturinkubator	Thermo Fisher Scientific  Modell Forma Serie II Wassermantel-CO2-Inkubator	3140
Zellkulturmedium
Zelllinie ES-E14
Chelex-100	BioRad	1422842	200– 400 Trockenmaskengröße
Chloroform	Sigma	366919
Concanavalin A (ConA)-beschichtete magnetische Perlen	Polywissenschaften	86057-10
Digitonin	Millipore	300410-5MG
DMSO	Sigma	D8418
E. coli  tRNA	Sigma	10109541001
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	BP2818100	Führen Sie Ethanol vorsichtig, es ist entflammbar
Glukose	Sigma	G7021
Glycerol	Sigma	G5516
HCl	Sigma	H1758
HEPES	Sigma	H3375
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	BP26324	Behandle Isoproponol vorsichtig, es ist entflammbar
KAPA HiFi HotStart Ready Mix	Roche	7958889001
KCl	Sigma	P9541
KOH	Sigma	221473	Behandle KOH mit Vorsicht, es ist korrosiv
Niedriggeschwindigkeitsvakuum
Magnet-Ständer	Millipore	LSKMAGS08
Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler	Eppendorf	5331
MgCl2	Sigma	M8266
Mikrokokkale Nuklease  (MNase)	Worthington	LS004798
MinElute PCR-Reinigungskit	Qiagen	28006
Mini-Perlenklopfer	Mini BeadBeater 24 Disruptor	607
Mini-Zentrifuge	Eppendorf	5424R
MnCl2	Sigma	244589
Multiplattform-Shaker	Fisherbrand	02-217-765
Multiplattform-Shaker-Inkubator	Benchmark	INCU-SHAKER 10L
Multithermischer Wärmeblock	Eppendorf	Thermomixer C
N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-Aminopropansulfonsäure  (KLOPFEN)	Sigma	T5130	200– 400 Trockenmaskengröße
NaCl	Sigma	S9888
NaOH	Sigma	S8045	Behandle NaOH mit Vorsicht, es ist korrosiv
NEBNext HiFi 2× PCR-Mastermix	New England Biolabs	M0541
NP-40 Igepal CA-630	Thermowissenschaftlich	J61055. AP
Paraformaldhyd	Sigma	158127	Behandeln Sie Paraformaldehyd mit Vorsicht, es ist brennbar, fest und gefährlich.
pA-Tn5 Enzym	Addgene	121137
Pefabloc	Sigma	11429868001
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol	Invitrogen	15593049
Pipette P1000, P200, P20 und P2	Eppendorf	2231300004
PMSF	Sigma	10837091001
Proteaseinhibitor-Cocktailtablette	Sigma	S8830
Proteaseinhibitor-Cocktailtablett	Sigma	S8830
Protein G-Sepharoseperlen	GE Healthcare	17-0618-02
Protein-Ausfällungslösung	Qiagen	848023
Protein-Ausfällungslösung	Qiagen	848023	Behandle KOH mit Vorsicht, es ist korrosiv
Protein-Ausfällungslösung	Qiagen	848023
Proteinase K	Sigma	311584401
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
RNase A	Sigma	10109169001
SDS	Sigma	L3771
Spektrophotometer	Thermowissenschaftlich.	2000/2000c
Spermidin	Sigma	S2626
T4-DNA-Pol	New England Biolabs,	M0203
Tischzentrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-5
Tris	Sigma	11814273001
Triton X-100	Sigma	T8787
Hefeextrakt	Thermo Fisher Scientific	212730