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Methodenartikel

Eine umfassende Pipeline zur Bewertung der Effizienz der menschlichen Erythropoese in vitro und ex vivo

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DOI:

10.3791/67123

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10. Januar 2025

 ,  , 
1Centre de Lutte contre le cancer Eugène Marquis, INSERM U1242, University of Rennes, 2Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Modellierung der Erythropoese bietet eine wertvolle Möglichkeit, die biologische Bedeutung der Akteure in diesem Prozess zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu evaluieren, die Differenzierungsdefekte lindern können. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode, um CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo effizient zu differenzieren.

Zusammenfassung

Die Erythropoese, ein bemerkenswert dynamischer und effizienter Prozess, der für die Erzeugung der täglichen Quote an roten Blutkörperchen (ca. 280 ± 20 Milliarden Zellen pro Tag) verantwortlich ist, ist entscheidend für die Erhaltung der individuellen Gesundheit. Jede Störung dieses Signalwegs kann erhebliche Folgen haben und zu gesundheitlichen Problemen führen. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation leiden schätzungsweise 25 % der Weltbevölkerung an Symptomen einer Anämie. Dieses Protokoll beschreibt, wie humane erythroide Zellen sowohl in vitro unter Verwendung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aus Quellen wie Nabelschnurblut (UCB) oder Blut von gesunden Spendern als auch ex vivo mit HSPCs, die aus dem Knochenmark von Patienten isoliert wurden, erzeugt werden können. Mit Hilfe des genetischen Ansatzes können interessante Gene in HSPCs moduliert werden, und ihr Einfluss auf die Erythropoese kann in verschiedenen Stadien des Differenzierungsprozesses überwacht werden. Diese Methode ermöglicht das Screening von Verbindungen, die die Fähigkeit von HSPCs zur Differenzierung in reife erythroide Zellen stören, verbessern oder retten, und die Rolle von Genen von Interesse während des erythroiden Differenzierungsprozesses zu untersuchen.

Einleitung

Jeden Tag werden etwa 280 Milliarden rote Blutkörperchen (RBCs) im Knochenmark produziert, um den Sauerstofftransport durch den gesamten Körper zu gewährleisten1. Die Erythropoese ist ein fein abgestimmter Differenzierungsprozess, bei dem aus hämatopoetischen Stammzellen reife, funktionsfähige rote Blutkörperchen entstehen. Viele Krankheiten, sowohl erworbene als auch angeborene, können diesen Prozess beeinflussen, darunter das myelodysplastische Syndrom, die aplastische Anämie, die Thalassämie und die angeborene dyserythropoetische Anämie2.

Die klinische Manifestation einer gestörten Erythropoese ist die Anämie, eine der Hauptursachen für Morbidität weltweit. Die Symptome einer Anämie reichen von Müdigkeit, Kurzatmigkeit und Schwindel bis hin zu lebensbedrohlichen Zuständen wie Herzinsuffizienz und Herzstillstand3. Angesichts der Tatsache, dass weltweit 1,8 Milliarden Menschen von Anämie betroffensind 4, bleibt die Modellierung der Erythropoese ex vivo , um diese Erkrankungen und ihre zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, eine globale Priorität. Die hier beschriebene Methode zielt darauf ab, ein einfaches und robustes Modell für die Untersuchung sowohl der gesunden als auch der kranken erythroiden Differenzierung bereitzustellen. Dieses Modell ermöglicht die Aufschlüsselung der Rolle spezifischer Gene in diesem Prozess und die Erprobung von Verbindungen, die anämischen Patienten zugute kommen könnten. In der Vergangenheit war die Modellierung einer ineffektiven Erythropoese mit vielen Herausforderungen verbunden, darunter ein Mangel an Stammzellen in einigen erkrankten Knochensteinen und Schwierigkeiten, die Knochenmarknische nachzuahmen.

Frühere Studien haben ähnliche oder komplexere Protokolle verwendet; Zum Beispiel verwendeten Bondu et al. einen Cocktail von Zytokinen mit Erythropoietin (EPO), Stammzellfaktor (SCF) und Interleukin-6 (IL6) für 4 Tage, bevor sie IL6 aus dem Cocktail der erythroiden Differenzierung entfernten, im Gegensatz dazu fügten Yip et al. EPO erst nach 7 Tagen Flüssigkultur zu ihrem Zytokin-Cocktail hinzu. Elvarsdóttir et al. entwickelten ein dreidimensionales (3D) Kulturmodell für CD34+-Zellen, um die höchste Expansion und Reifung von erythroiden Zellen zu ermöglichen, einschließlich der Erzeugung von erythroblastischen Inseln und enukleierten Erythrozyten, die für die Untersuchung von Phänomenen wie Ringsideroblasten wichtig sind 5,6,7,8. Dieses Protokoll verwendet nur drei Zytokine bei der Expansion der Zellen (d. h. SCF, Thrombopoietin [TPO] und FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3 [FLT3]) und drei Zytokine, die während des gesamten Differenzierungsprozesses aufrechterhalten werden (d. h. EPO, IGF1 und SCF). Eines der Schlüsselkriterien, die diesen verschiedenen Studien gemeinsam sind, ist die Verwendung von CD34+-Zellen. Obwohl die Herkunft dieser Zellen unterschiedlich ist, werden sie in diesen verschiedenen Protokollen konsistent eingesetzt. Die Quellen können von der nicht-invasiven Entnahme von UCB bis hin zu invasiveren Verfahren zur Gewinnung von Knochenmarkproben bei Erwachsenen reichen, die entweder von Patienten mit Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) oder Knochenmarkpunktionen entnommen werden können. Im Allgemeinen werden Flüssigkulturmodelle über 14 Tage getragen, während 3D-Modelle Zellen über längere Zeiträume erhalten können. Diese Protokolle sind für die Modellierung genetischer Krankheiten und Störungen der Erythropoese unerlässlich. Genetische Ansätze, wie z. B. Knockdowns mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA), können eingesetzt werden, um interessante Gene zum Schweigen zu bringen und ihre Rolle bei der Erythropoese zu untersuchen. Die Auswirkungen des Gen-Silencing können dann in verschiedenen Stadien der Differenzierung überwacht werden, wodurch ein humanes Ex-vivo-Modell der Produktion roter Blutkörperchen zur Untersuchung von Anämie sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheit bereitgestellt wird. Dieses Protokoll umfasst die Transduktion von CD34+-Nabelschnurblutzellen mit shRNA, die konstitutiv ein Reportergen exprimiert, wie z. B. das verstärkte grüne Fluoreszenzprotein (EGFP), wodurch die Proben durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) sortiert werden können. Die Zellen werden dann 2 Wochen lang in Differenzierungsmedien inkubiert und durch Durchflusszytometrie und immunchemische Färbung überwacht.

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Protokoll

Die Forschung an Primärproben wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt (REC-Referenz: 21/EE/0133; IRAS-Projekt-ID: 283103).

1. Produktion von Lentiviren

HINWEIS: Lentiviren müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe L2 unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Alle für dieses Labor erforderlichen PSA müssen getragen werden, einschließlich Doppelhandschuhe. Kontaminiertes Material wird vor der Entsorgung in einem autoklavierten Behälter mit viruzidem Desinfektionsmittel dekontaminiert. Hier wird ein shRNA-Scramble (Kontrolle) verwendet, das ein EGFP-Reportergen beherbergt, um den Prozess zu veranschaulichen.

Tag 1

  1. Gelatine bei 37 °C im Wasserbad erwärmen, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Verdünnen Sie Gelatine mit 0,1 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Eine 150-mm-Schale mit 2 ml 0,1 % Gelatine bestreichen. Verwenden Sie 2 Schalen pro Virus. Die Schalen 30 min bei 37 °C inkubieren.
  3. 5 Millionen HEK293T Zellen pro gelatinebeschichteter Schale in 20 ml 10 % Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) säen und die Zellen in einen Inkubator bei 37 °C geben.

Tag 2

  1. Vergewissern Sie sich, dass die Zellen eine Konfluenz von etwa 50 % erreicht haben. Wechseln Sie das Medium 2 h vor der Transfektion mit 22 mL 10% DMEM, ohne die Zellschicht zu stören.
  2. Bereiten Sie die Transfektionsmischung vor.
    HINWEIS: Pro Gericht wird eine Transfektionsmischung hergestellt, da ein größeres Volumen die Bildung von Calcium-Phosphat-Niederschlag beeinträchtigen kann.
    1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen wie folgt vor: 32 μg Plasmid, 20 μg PAX (pCMVdR8.74) Plasmid, 9 μg VSVG (pMD.G2) Plasmid und erhöhen Sie das Volumen mit H2O auf 1125 μl.
    2. 125 μl CaCl2 zur Reaktion geben und 5 min bei Raumtemperatur (RT) auf einer Walze inkubieren.
    3. Bereiten Sie 1,25 mL 2x HEPES in einem separaten 15 mL Zentrifugenröhrchen vor.
    4. 2x HEPES Tropfen für Tropfen unter sanftem Vortexen in das Reaktionsgemisch geben, dann das Gemisch für 10 min bei RT auf eine Rolle geben.
  3. Geben Sie die Reaktion Tropfen für Tropfen spiralförmig auf die Zellen und legen Sie die Zellen in einen Inkubator bei 37 °C, nachdem Sie die Platte vorsichtig kreuzförmig bewegt haben, um das Medium zu homogenisieren.

Tag 3

  1. Wechseln Sie das Medium mit 16 mL 10% DMEM, ohne die Zellschicht zu stören.

Tag 4

  1. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn über Nacht bei 4 °C. Geben Sie 16 ml frisches DMEM in jede Platte, ohne die Zellschicht zu stören.

Tag 5

  1. Sammle den Überstand ein und bevorzuge ihn mit dem Überstand von Tag 4. Filter zur Beseitigung von Schmutz mit einem 0,45 μM Filter.
  2. Überstand von jeweils 30 ml (Tag 4 + Tag 5) zur Ultrazentrifugation in ein konisches Röhrchen überführen. Geben Sie die Schläuche in einen Schwenkeimer, bei Bedarf mit Adaptern für den konischen Boden.
  3. Balancieren Sie die Röhrchen von Angesicht zu Angesicht mit einer Genauigkeit von 0,02 g und ultrazentrifugieren Sie bei 90.000 x g für 2 Stunden bei 4 °C.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl Stammzellmedium pro Röhrchen hinzu. Die Röhrchen mit Parafilm verschließen und in einem Kühlraum für 2-4 Stunden unter Rühren inkubieren.
  5. Machen Sie 20 μl aliquot von jedem Virus und lagern Sie die Fläschchen bei -80 °C. Bewahren Sie 2 μl jedes Virus auf und fügen Sie 400 μl DMEM hinzu.
    HINWEIS: Diese Verdünnung wird für die Titration verwendet.

2. Titration der Lentivirus-Titration

HINWEIS: Lentiviren müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe L2 unter sterilen Bedingungen gehandhabt werden. Alle für dieses Labor erforderlichen PSA müssen getragen werden, einschließlich Doppelhandschuhe. Kontaminiertes Material wird vor der Entsorgung in einem autoklavierten Behälter mit viruzidem Desinfektionsmittel dekontaminiert.

  1. Säen Sie HEK293T in einer 24-Well-Platte. 50.000 Zellen/Well in 500 μl 10 % DMEM zugeben.
    HINWEIS: Verwenden Sie 6 Vertiefungen pro Virus und bewahren Sie eine Vertiefung für nicht transduzierte Zellen auf.
  2. Führen Sie die Transduktion durch. Fügen Sie die verschiedenen Vertiefungen hinzu: 2 μl, 4 μl, 8 μl, 16 μl, 32 μl und 64 μl des verdünnten Virus aus Schritt 1.13. Schonend homogenisieren.
  3. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden später, indem Sie 500 μl 10 % DMEM hinzufügen.
  4. Bereiten Sie die Zellen am Tag 4 nach der Transduktion für die Durchflusszytometrie vor.
    1. Bereiten Sie den FACS-Puffer mit PBS, 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1/2.000 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) vor.
    2. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 μl FACS-Puffer direkt mit EDTA in jede Vertiefung.
    3. Trennen Sie die Zellen, indem Sie auf und ab pipettieren.
  5. Die Zellen werden durch ein 40 μm Sieb filtriert und in FACS-Röhrchen überführt.
  6. Bestimmen Sie den Prozentsatz der EGFP-Zellen durch Durchflusszytometrie.
  7. Richten Sie die folgenden Tore ein:
    1. Richten Sie DAPI versus Side Scatter (SSC-A) ein, um tote Zellen auszuschließen.
    2. Richten Sie die SSC-Höhe (SSC-H) im Vergleich zur SSC-Fläche (SSC-A) ein, um Zellaggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen.
    3. Richten Sie eine Forward-Scatter-Area (FSC-A) im Vergleich zu SSC-A ein, um die Zellen zu begrenzen und die Ablagerungen basierend auf der Größe zu entfernen.
    4. Richten Sie grünes Fluoreszenzprotein (GFP) im Vergleich zu SSC-A ein, um GFP+ -Zellen auszuwählen.
  8. Titer das Virus.
    1. Berechnen Sie die Partikelkonzentration (Anzahl der Partikel/ml) für jede Bedingung:
    2. EGFP-Zellen x Verdünnungsfaktor Virus (200) x Anzahl der ausgesäten Zellen x 1000)/ Volumen des Virus.
      HINWEIS: Zum Beispiel wurden die Zellen mit 64 μl Virus behandelt, die bei 1/200 verdünnt waren. Nach der durchflusszytometrischen Analyse waren 54 % der Zellen EGFP+. Unter diesen Bedingungen beträgt der Titer (54 % x 200 x 50 000 x 1000)/64 = 8,44 x 107 Partikel/ml.

3. Transduzieren von CD34+ -Zellen, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden

HINWEIS Dieser Teil wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Hier werden CD34+ UCB-Zellen (Reinheit >85%) mit einer shRNA (Kontrolle) transduziert, die einen eGFP-Reporter beherbergt. Das Experiment wird mit drei technischen Replikaten durchgeführt. Der Anteil muss an die Anzahl der Proben angepasst werden.

Tag 1

  1. Bereiten Sie das folgende Medium und den Puffer vor:
    1. Auftaumedium vorbereiten: FBS ergänzt mit 1% P/S und 10 μg/mL DNAse
    2. Vorbereitung des FACS-Puffers: PBS ergänzt mit 1 % P/S und 2 % FBS (± 10 μg/mL DNAse)
    3. Bereiten Sie das Stimulationsmedium (in Stammzellmedium) vor, indem Sie 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT-3, 10 ng/ml IL-6, 25 ng/mL G-CSF, 20 ng/ml TPO und 1 % HEPES hinzufügen.
  2. Tauen Sie 100.000 CD34+ UCB-Zellen auf, indem Sie sie 30 s lang in das Wasserbad bei 37 °C tauchen. Geben Sie 1 ml Auftaumedium tropfenweise in jede Durchstechflasche und resuspendieren Sie es dann vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension Tropfen für Tropfen in insgesamt 5 mL Auftaumedium sanft.
    HINWEIS: Um Zellverluste zu vermeiden, legen Sie ein Aliquot von 2 ml Auftaumedium beiseite, das am Ende zum Waschen der Spitze und des Fläschchens verwendet wird.
  4. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Zellen in 10 mL FACS-Puffer + DNAse waschen.
  5. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Das Zellpellet in 2 mL Stimulationsmedium (Waschspitze und Röhrchen mit Stimulationsmedium) resuspendieren.
  6. Zählen Sie die Zellen mit 5 μl Zellsuspension und 5 μl Trypanblau.
    HINWEIS: Streben Sie ein Minimum von 75.000 Zellen insgesamt an (25.000 Zellen/Zustand).
  7. Die 2 ml Zellsuspension in eine 24-Well-Platte überführen und ≥4-6 h bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden alle Zellen (75.000-100.000) in einer Vertiefung ausgesät.
  8. Sammeln Sie die Zellen in FACS-Röhrchen und füllen Sie sie mit 1 ml Stammzellmedium auf. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren.
  9. Tauen Sie das Virus auf und fügen Sie den Stimulationsmedien das erforderliche Volumen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 30 hinzu.
  10. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in virushaltigen Medien mit 100.000 Zellen pro 100 μl Virus in 1 Vertiefung einer 96-Well-Platte. PBS in leere Vertiefungen geben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.

Tag 2

  1. Bereiten Sie das Expansionsmedium (in Stammzellmedium) vor, indem Sie 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L und 20 ng/ml TPO hinzufügen.
  2. Geben Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension aus der 96-Well-Plattenvertiefung in FACS-Röhrchen mit 1 ml Stammzellmedium. Waschen Sie die Vertiefung und die Spitze mit Stammzellmedium, was dazu führt, dass der Zellsuspension im FACS-Röhrchen 2 ml Stammzellmedium zugesetzt werden.
  3. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren.
  4. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml Expansionsmedium. Geben Sie die Zellsuspension in eine 24-Well-Plattenvertiefung (waschen Sie die Vertiefung und kippen Sie sie dabei, um insgesamt 2 ml zu erhalten). Inkubieren Sie die Zellen 4 Tage lang bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Zellsortierung wird dann an Tag 7 durchgeführt.

4. CD34+ EGFP+ Zellsortierung und erythroide Differenzierung

HINWEIS Dieser Teil wird unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

  1. Bereiten Sie das folgende Medium und den Puffer vor.
    HINWEIS: Medien mit Zytokinen müssen frisch vorbereitet werden:
    1. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie PBS mit 1 % P/S und 2 % FBS ergänzen.
    2. Bereiten Sie das Expansionsmedium (in Stammzellmedium) vor, indem Sie 150 ng/ml SCF, 150 ng/ml FLT3-L und 20 ng/ml TPO hinzufügen.
    3. Bereiten Sie das Erythrozytendifferenzierungsmedium (in Stammzellmedium) vor, indem Sie 25 ng/ml SCF, 3 μg/ml EPO und 50 ng/ml IGF1 hinzufügen.
    4. Bereiten Sie 2x Erythrozyten-Differenzierungsmedien (im Stammzellmedium) vor, indem Sie 50 ng/mL SCF, 6 U/mL EPO und 100 ng/mL IGF1 hinzufügen.
  2. Geben Sie das gesamte Zellvolumen in ein separates FACS-Röhrchen (waschen Sie die Vertiefung und kippen Sie sie dabei mit Stammzellmedium ab). 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Die pelletierten Zellen in 100 μl FACS-Puffer resuspendieren.
  3. 5 μl CD34 Ab/Röhrchen zugeben und im Dunkeln bei 4 °C für 20 min inkubieren.
  4. Die Zellen werden in 1 ml FACS-Puffer mit DAPI resuspendiert (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer) und 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugiert.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer mit DAPI (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer) und filtrieren Sie die Zellen vor der Sortierung durch ein 40 μM-Sieb.
  6. Bereiten Sie die Kügelchen für die Kontrolle vor:
    1. 0,5 μl CD34-Antikörper (Ab) zu 1 Tropfen Kügelchen in 100 μl PBS geben und 20 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
    2. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl PBS resuspendieren.
  7. Bereiten Sie leukämische Zelllinien für die GFP-Kontrolle vor.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine beliebige verfügbare GFP+ -Zelllinie als Kontrolle; Stattdessen können Perlen verwendet werden.
    1. Geben Sie GFP-Zellen (2 FACS-Röhrchen mit 100.000 Zellen) und GFP+ (1 FACS-Röhrchen mit 100.000 Zellen) in das FACS-Röhrchen.
      HINWEIS: Insgesamt 3 Röhren.
    2. Waschen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren.
    3. Resuspendieren Sie 100.000 GFP+- Zellen in 500 μl FACS-Puffer (ungefärbt), 100.000 GFP-Zellen in 500 μl FACS-Puffer mit DAPI (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer) (DAPI-gefärbt) und 100.000 GFP+ -Zellen in 500 μl FACS-Puffer (GFP+ -Zellen).
      HINWEIS: Kontrollrohre werden für die Anschnitt- und Kompensationseinstellungen am Durchflusszytometer verwendet. Wenn die verwendeten Zellen zu 100% GFP sind, können GFP-Zellen in das Röhrchen gegeben werden (50.000 GFP-Zellen und 50.000 GFP+ Zellen).
    4. Filtern Sie die Zellen vor der Sortierung durch ein 40 μm Sieb.
  8. Richten Sie die folgenden Tore ein:
    1. Richten Sie DAPI versus Side Scatter (SSC-A) ein, um tote Zellen auszuschließen.
    2. Richten Sie SSC-Höhe gegen SSC-Bereich (SSC-A) ein, um Zellaggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen.
    3. Richten Sie den Forward-Scatter-Bereich (FSC-A) im Vergleich zu SSC-A ein, um den Schmutz basierend auf der Größe zu entfernen.
    4. Richten Sie GFP im Vergleich zu SSC-A ein, um GFP+ -Zellen auszuwählen.
    5. Richten Sie CD34 (PerCP-Cy5.5) im Vergleich zu SSC-A ein, um CD34+ -Zellen auszuwählen.
  9. Drehen Sie das FACS-Sammelröhrchen vor der Zellentnahme um, um die Wände des Rohrs mit FBS zu beschichten.
  10. Sammeln Sie Zellen im Stammzellmedium.
    HINWEIS: Streben Sie 75.000-80.000 Zellen an (25.000 Zellen x 3)
  11. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren und die Zellen in 3 mL erythroidem Differenzierungsmedium resuspendieren.
  12. Resuspendieren und dann 1 ml pro Vertiefung in 3 Vertiefungen einer 24-Well-Platte abgeben. Füllen Sie alle äußeren Vertiefungen mit PBS.
  13. Führen Sie alle zwei Tage eine halbe Erschöpfung des Mediums durch und ersetzen Sie es durch ein 2x Erythrozytendifferenzierungsmedium.
    1. Um das Medium aufzufrischen, stellen Sie sicher, dass sich die Zellen am unteren Rand der Platte abgesetzt haben. Lehnen Sie die Platte vorsichtig an und entnehmen Sie 500 μl Medium.
    2. Auffrischung durch Zugabe von 500 μl mit einem 2x Zytokin erythroiden Differenzierungsmedium.
    3. Übertragen Sie die Zellen an Tag 6 auf eine 12-Well-Platte und fügen Sie 1 ml Medium hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml zu erhalten.

5. Analyse der erythroiden Differenzierung durch Durchflusszytometrie zweimal pro Woche von Tag 6 bis Tag 14

  1. Bereiten Sie das folgende Medium und den Puffer vor.
    1. Bereiten Sie FACS-Puffer vor, indem Sie PBS mit 1 % P/S und 2 % FBS ergänzen
    2. Bereiten Sie das Erythrozytendifferenzierungsmedium (in Stammzellmedium) vor, indem Sie 25 ng/ml SCF, 3 μg/ml EPO und 50 ng/ml IGF1 hinzufügen.
  2. Sammeln Sie 200 μl Zellen aus jeder Vertiefung der 12-Well-Platte und ersetzen Sie sie durch 250 μl 2x erythroide Differenzierungsmedien. Geben Sie 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen.
  3. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Die pelletierten Zellen in 100 μl FACS-Puffer resuspendieren.
  4. 1 μl CD71 Ab (1/100), 1 μl CD34 Ab (1/100) und 1 μl CD235a Ab (1/100) zugeben und 20 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer mit DAPI (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer). 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer mit DAPI (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer).
  7. Bereiten Sie die Kügelchen für die Kontrolle vor:
    1. Geben Sie 1 Tropfen Kompensationskügelchen in zwei Röhrchen mit 100 μl PBS und geben Sie dann 0,55 μl eines einzelnen Antikörpers in jedes Röhrchen, um einzelne Färbekontrollen durchzuführen (eine für CD34, eine für CD71 und eine für CD235a).
      HINWEIS: 1 Tropfen ist für beide Bedienelemente ausreichend.
    2. Im Dunkeln bei 4 °C für 20 min inkubieren. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu.
    3. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 500 μl PBS resuspendieren.
  8. Bereiten Sie eine leukämische Zelllinie für die Kontrolle vor.
    HINWEIS: K562-Zellen exprimieren den CD71-Marker und können als Positivkontrolle zum Einrichten des FACS verwendet werden.
    1. Geben Sie GFP-Zellen (2 FACS-Röhrchen mit 100.000 Zellen) und GFP+ (1 FACS-Röhrchen mit 100.000 Zellen) Zellen in das FACS-Röhrchen.
    2. Waschen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer. 8 min bei 320 x g bei RT zentrifugieren.
    3. Resuspendieren Sie 100.000 GFP+- Zellen in FACS-Puffer (ungefärbt), 100.000 GFP+- Zellen in FACS-Puffer mit DAPI (1/2000 Verdünnung in FACS-Puffer) (DAPI-gefärbt) und 100.000 GFP+ -Zellen in FACS-Puffer (GFP+ -Zellen).
  9. Richten Sie die folgenden Tore ein:
    1. Richten Sie DAPI versus Side Scatter (SSC-A) ein, um tote Zellen auszuschließen.
    2. Richten Sie SSC-Höhe gegen SSC-Bereich (SSC-A) ein, um Zellaggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen.
    3. Richten Sie den Forward-Scatter-Bereich (FSC-A) im Vergleich zu SSC-A ein, um den Schmutz basierend auf der Größe zu entfernen.
    4. Richten Sie CD235a (APC-Cy7) im Vergleich zu CD71 (PE) ein.
    5. Richten Sie CD34 (PerCP-Cy5.5) im Vergleich zu SSC-A ein.
  10. Führen Sie eine Probe von ungefärbten GFP-Zellen und vollständig gefärbten Zellen durch, um die Spannungen so einzustellen, dass die Zellen an der richtigen Stelle sitzen.
  11. Führen Sie Beads, GFP+ -Zellen und DAPI-gefärbte Zellen durch. Kompensieren Sie die Zytometereinstellungen und wenden Sie eine Kompensation an.
  12. Führen Sie die Beispiele aus, und zeichnen Sie die Ereignisse auf.

6. Analyse der erythroiden Differenzierung durch Giemsa-Färbung

  1. Bereiten Sie 5 Objektträger-Färbegläser vor:
    1. Bereiten Sie ein Objektträger-Färbeglas mit May-Grünwalds Eosin-Methylenblau-Lösung 1:1 Brühe und PBS vor.
    2. Bereiten Sie ein Objektträger-Färbeglas mit 2,5 mL Giemsa-Stamm + 50 mL PBS vor.
    3. Bereiten Sie ein Objektträger-Färbeglas mit destilliertem Wasser vor.
    4. Bereiten Sie ein Objektträger-Färbeglas mit PBS vor.
    5. Bereiten Sie ein Objektträger-Färbeglas mit eiskaltem Methanol vor.
  2. Sammeln Sie 100.000 Zellen für eine optimale Färbung, fügen Sie 1 ml PBS hinzu und zentrifugieren Sie 300 x g für 5 Minuten.
  3. Das Medium verwerfen und in 150 μl PBS resuspendieren.
  4. Bereiten Sie Objektträger, Filterpapier und konischen Adapter in eine Zytozentrifuge vor und lassen Sie die Zellvorbereitung langsam in den konischen Adapter fallen.
  5. Bei 800 x g 3 min schleudern. Nehmen Sie die Objektträger heraus und legen Sie sie für 15 Minuten in das Methanol-Objektträgerglas in Eis.
  6. Tauchen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in die May-Grünwald-Lösung und rühren Sie gelegentlich um, um eine ordnungsgemäße Färbung zu gewährleisten.
  7. Tauchen Sie dann die Objektträger in das PBS-Glas, bis kein Fleck mehr abläuft.
  8. Tauchen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in die Giemsa-Lösung und rühren Sie gelegentlich um, um eine ordnungsgemäße Färbung zu gewährleisten.
  9. Tauchen Sie die Objektträger vorsichtig mit PBS ein, bis kein Fleck mehr abläuft.
  10. Lassen Sie die Objektträger weitere 3 Minuten in PBS verbleiben.
  11. Tauchen Sie die Objektträger schnell in destilliertes Wasser und trocknen Sie sie an der Luft bei RT.
  12. Geben Sie einen Tropfen Kunstharz auf jede Stelle der Zellen und fügen Sie vorsichtig ein Deckglas darauf auf.
  13. Lassen Sie die Objektträger 1 h bei RT trocknen und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack, um ein Austrocknen des Rutschens zu verhindern.

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Ergebnisse

CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut oder Knochenmark werden zunächst aufgetaut, stimuliert und mit einer GFP-exprimierenden shRNA transduziert (Abbildung 1A). CD34+GFP+-Zellen werden 4 Tage nach der Transduktion gemäß der in Abbildung 1B dargestellten Gating-Strategie sortiert. Repräsentative Ergebnisse zeigten die Reifung von CD34+-Zellen nach Transduktion und FACS-Sortierung. Die Zellen werden (1) mittels Durchflusszyto...

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Diskussion

In dieser Arbeit haben wir eine effiziente und zuverlässige Methode zur Induktion der erythroiden Differenzierung von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSPCs) beschrieben, die entweder aus adultem Knochenmark (BM) oder aus Nabelschnurblut (UCB) isoliert wurden. Diese Pipeline umfasst die Bearbeitung/Modifikation von Primärzellen, um die Funktion jedes Gens von Interesse während des erythroiden Differenzierungsprozesses zu untersuchen. Diese Methode wurde erfolgreich eingeset...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

C.P., S.B. und K.RP. wurden unterstützt durch das HARP-Programm, die Barts Charity (G-002167), den Kay Kendall Leukaemia Fund (KKL1149) und die Academy of Medical Sciences (SBF004\1099). Wir danken Dr. Pantelitsa Protopapa für die MGG-Färbung und den Erwerb der Mikroskopie. Wir danken auch den Durchflusszytometrie- und Mikroskopieeinrichtungen des Barts Cancer Institute der Queen Mary University of London. Wir danken der britischen Wohltätigkeitsorganisation Anthony Nolan für die Bereitstellung der Nabelschnurblutgeräte, die in diesem Manuskript verwendet werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2x HEPESMerck51558
BeadsThermo Scientific01-2222-42
CD235a APC Cy7Biolegend349115
CD34 PerCP Cy5.5 AntikörperBD Biosciences347222
CD71 PE AntikörperBiolegend334106
DAPIMerckD9542
DMEMThermo Scientific41966-029
DNAseMerckD4527-200KU
DPX Eindeckmedium VWR1.00579.0500
FACSAria Fusion BD BiosciencesNA
FBSMerckF9665
GelatineMerckG1393
Giemsa LösungAbcamab150670
HEPESMerckH0887-100mL
Humanes EPOPeproTech100-64
Humaner Flt-3-LigandPeproTech300-19
Mensch G-CSFPeproTech300-23
Mensch IGF1PeproTech100-11
Mensch IL-6PeproTech200-06
Mensch SCFPeproTech300-07
Mensch TPOPeproTechAF-300-18
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesNA
May-Grunwald Lösung Generon26250-01
Pannoramic 250 Scanner mit hohem Durchsatz3DHISTECHNA
Penicillin/StreptomycinThermo Scientific15140-122
Shandon Cytospin 3 Thermo ScientificNA
Stammzellen Medium MediumStammzelltechnologien9655

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

erythroide Differenzierungh matopoetische StammzellenEx vivo ErythropoeseIn vitro ErythropoeseDurchflusszytometrieCD34 Antik rpererythroide LinieMedien f r die erythroide DifferenzierungAnnexin V F rbung
Eine umfassende Pipeline zur Bewertung der Effizienz der menschlichen Erythropoese in vitro und ex vivo
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