U-förmige horizontale Schwimmtechnik zur Aufbereitung hochwertiger Spermien mit niedrigem DNA-Fragmentierungsindex

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Screening von qualitativ hochwertigen Spermien mit einem niedrigen DNA-Fragmentierungsindex unter Verwendung von Spermienmotilitätsmerkmalen und Thigmotaxis. Bei der Methode wird eine U-förmige horizontale Schwimmbahn verwendet, die es ermöglicht, dass hochwertige Spermien durch Puffertröpfchen auf die gegenüberliegende Seite gelangen, während abgestorbene Spermien, Zelltrümmer und Verunreinigungen ausgeschlossen werden.

Zusammenfassung

Menschliches Sperma ist ein komplexes Gemisch aus progressiv beweglichen Spermien, nicht progressiv beweglichen Spermien, unbeweglichen Spermien, Zelltrümmern und viskosem Samenplasma. Hochwertige Spermien beziehen sich auf zunehmend bewegliche Spermien mit normaler Morphologie, die oft einen niedrigeren DNA-Fragmentierungsindex (DFI) und ein höheres Befruchtungspotenzial aufweisen. Die Aufbereitung von hochwertigem Sperma ist ein entscheidender Schritt in der humanassistierten Reproduktionstechnologie. Die traditionelle Methode der Spermienaufbereitung, die diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (DGC), ist zeit- und arbeitsintensiv. Wiederholtes Zentrifugieren kann die DNA der Spermien schädigen und dadurch die spätere Befruchtung und Embryonalentwicklung beeinträchtigen. In dieser Studie wird eine U-förmige horizontale Schwimmmethode (UHS) zur Vorbereitung von Spermien für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) vorgestellt, die die nachteiligen Auswirkungen der Zentrifugation auf die Spermien-DNA deutlich eliminiert. Bei der UHS-Methode wird eine UHS-Spur unter Verwendung eines Düngemediums innerhalb einer ICSI-Betriebsschale erstellt. Ein 10 μl großes Mikrotröpfchen des Befruchtungsmediums wird am Startpunkt auf der linken Seite der UHS-Spur platziert, um das Sperma zu halten. Zwei weitere 10 μL Düngemittelpuffertröpfchen werden in Abständen entlang des linken mittleren Teils der Bahn positioniert, wobei alle Tröpfchen durch das Düngemedium verbunden sind. Die Schale wird dann mit Kulturöl bedeckt und über Nacht bei 37 °C mit 6 % CO₂ zum Ausgleich inkubiert. Anschließend werden dem Mikrotröpfchen am Startpunkt 3 μl Sperma zugesetzt. Hochwertige Spermien schwimmen auf die rechte Seite der UHS-Bahn und erleichtern so ihr Ansaugen in die ICSI-Injektionsnadel. Abgestorbenes Sperma, Zelltrümmer und andere viskose Verunreinigungen verbleiben größtenteils an der Ausgangsstelle oder in den Puffertröpfchen. Wir haben gleichzeitig 21 Samenproben sowohl mit UHS- als auch mit DGC-Techniken aufbereitet und deren DFI verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der DFI in der DGC-Gruppe 5,5 % ± 3,2 % betrug, während der DFI in der UHS-Gruppe 1,7 % ± 1,1 % betrug. Der Unterschied zwischen den beiden Gruppen war statistisch signifikant (P < 0,05).

Einleitung

Die Samenoptimierung und die Aufbereitung von Spermien spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewinnung von Zellfraktionen, die mit strukturell und funktionell überlegenen Spermien angereichert sind, was ein wichtiger Schritt in der humanassistierten Reproduktionstechnologie ist¹. Der Zweck der Samenoptimierung besteht darin: (1) Prostaglandine, immunaktive Zellen, Anti-Spermien-Antikörper, unbewegliche Spermien von geringer Qualität, Bakterien und Ablagerungen im Samenplasma zu reduzieren oder zu entfernen; (2) Reduzieren oder beseitigen Sie die Viskosität des Samens; und (3) die Spermienkapazitation fördern und die Befruchtungsfähigkeit verbessern. Eine ideale Technik zur Spermienaufbereitung sollte eine hochfunktionelle Spermienpopulation wiederherstellen, die die DNA-Integrität bewahrt und keine Funktionsstörungen durch die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Spermien und Leukozyten induziert².

Die derzeit am weitesten verbreitete Technologie zur Aufbereitung von Spermien ist die DGC-Methode. Die Vorteile dieser Methode sind die hohe Wiederfindungsrate³ und die einfache Standardisierung. In der Praxis kann sie flexibel anhand der Qualität der Probe für die Doppeldichtegradientenmethode⁴, die Mini-DGC-Methode oder die Einschichtgradientenzentrifugationsmethode⁵ ausgewählt werden. Mit dieser Methode können hochwertige Spermien mit guter Vitalität hergestellt werden, die frei von Zelltrümmern, kontaminierten weißen Blutkörperchen, Nichtkeimzellen und entarteten Keimzellen sind. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass sie eine Zentrifugation erfordert, die die DNA der Spermien^{schädigen kann 6}.

Die hier vorgestellte Methode wurde von der ursprünglichen Studie von Baldini et ^al.7 adaptiert, die sich auf die horizontale Spermienmigration in Injektionsschalen konzentrierte. Diese modifizierte Methode beinhaltet eine U-förmige horizontale Spur, um hochwertige Spermien mit starker Vitalität zu trennen. Es vermeidet DNA-Schäden, die durch Zentrifugation verursacht werden, und minimiert den Einfluss von toten Spermien, Zelltrümmern und anderen viskosen Verunreinigungen während der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI).

Der spezifische Ansatz besteht darin, mit Hilfe eines Düngemediums eine UHS-Spur in der ICSI-Operationsschüssel zu schaffen. Ein 10 μL Befruchtungsmedium Mikrotröpfchen wird am linken Startpunkt der UHS-Spur platziert, um das Sperma zu halten. Zwei weitere 10 μL Düngemittelpuffertröpfchen werden in Abständen im linken mittleren Bereich der UHS-Spur positioniert, und alle Tröpfchen sind durch das Düngemedium verbunden. Nachdem die Anlage mit Anbauöl bedeckt wurde, wird die Schale über Nacht bei 37 °C mit 6 % CO₂ zum Ausgleich inkubiert. Anschließend werden dem Mikrotröpfchen am Startpunkt auf der linken Seite der UHS-Spur 3 μl Sperma zugesetzt. Hochwertige Spermien schwimmen zur Spur auf der rechten Seite der UHS-Bahn und erleichtern so die Entnahme mit der ICSI-Injektionsnadel. Abgestorbenes Sperma, Zelltrümmer und andere viskose Verunreinigungen verbleiben primär am ursprünglichen Ort oder in den Puffertröpfchen.

Der mikrofluidische Chip simuliert den natürlichen Selektionsprozess im weiblichen Fortpflanzungstrakt und ermöglicht so die optimale Isolierung von hochwertigen Spermien aus dem Sperma ohne Zentrifugation. Dies ist entscheidend für die Verbesserung der Spermienmotilität⁸, die Verringerung des DNA-Fragmentierungsindex der Spermien⁹ und die Verbesserung der Schwangerschaftsergebnisse¹⁰. Die Herstellung solcher Geräte ist jedoch komplex, kostspielig und schwierig in der breiten Implementierung.

Das hierin beschriebene Protokoll bietet eine neuartige, einfache und praktikable Alternative. Durch die Ausnutzung der Eigenschaften der Spermienmotilität erzielt diese Methode Ergebnisse, die mit denen der Mikrofluidik-Technologie vergleichbar sind. Die aufbereiteten Spermien weisen eine hohe Vitalität und niedrige DNA-Fragmentierungsindizes auf und eignen sich gut für den Einsatz in der ICSI.

Protokoll

Diese Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an First People's Hospital der Nanjing Medical University genehmigt (Zulassungsnummer: KY-2024-181-01). Die Einverständniserklärung wurde von den Patienten eingeholt, deren Proben in dieser Studie verwendet wurden. Das Verfahren sollte von erfahrenem Personal in Übereinstimmung mit der guten Laborpraxis und den klinischen Leitlinien durchgeführt werden^11,12. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zubereitung einer ICSI-Operationsschale

1. Verwenden Sie 20 μl Düngemedium, um U-förmige Spuren in der ICSI-Operationsschale zu erzeugen (Abbildung 1). Die Länge der linken Spur der U-förmigen Spur sollte etwa 30 mm betragen, und die Länge der rechten Spur sollte ebenfalls etwa 30 mm betragen.
2. Saugen Sie mit einer Pipette 10 μl Düngemedium an und erzeugen Sie ein kreisförmiges Tröpfchen am linken Startpunkt der U-förmigen Spur. Verbinden Sie es mit dem linken Startpunkt der U-förmigen Spur, um die Samenstammlösung hinzuzufügen.
3. Erstellen Sie zwei 10-μl-Düngemittelpuffertröpfchen in Abständen im linken mittleren Bereich der UHS-Spur. Verbinden Sie alle Tröpfchen mit dem Düngemedium.
4. Erstellen Sie einen langen Streifen aus Flüssigkeitströpfchen auf der rechten Seite der U-förmigen Spur mit 2,5 μl Polyvinylpyrrolidon (PVP). Stellen Sie sicher, dass der PVP-Streifen parallel zur rechten Fahrspur der U-förmigen Fahrspur verläuft.
5. Herstellen Sie sechs Mikrotröpfchen mit dem Eizellverarbeitungsmedium auf der rechten Seite des PVP-Streifens mit 20 μl pro Tröpfchen.
6. Geben Sie 7 ml Kulturöl in die Schale und stellen Sie sicher, dass das Öl den höchsten Punkt des Tröpfchens bedeckt. Stellen Sie es über Nacht in einen 37 °C heißen Inkubator mit 6 % CO₂ , um das Gleichgewicht zu halten.

2. Entnahme von Samenproben

1. Geben Sie den Patienten klare schriftliche und mündliche Anweisungen zur Entnahme der Samenprobe. Stellen Sie sicher, dass die Probenentnahme vollständig ist, und weisen Sie die Patienten an, vor der Entnahme 3-7 Tage lang auf die Ejakulation zu verzichten.
2. Sammle Sperma durch Masturbation in einen sterilen und ungiftigen Einweg-Samenentnahmebecher. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Ejakulat gesammelt wird, und weisen Sie die Person an, jeden Verlust eines Teils der Probe zu melden.
3. Überprüfen Sie die Namen, gültigen Ausweisdokumente und Fingerabdrücke des Ehepartners des Patienten. Markieren Sie den Namen und die Krankenaktennummer des Ehepartners des Patienten auf dem Körper und dem Deckel des Samenentnahmebechers.
4. Nachdem der männliche Patient Sperma entnommen hat, übergeben Sie die Probe von Angesicht zu Angesicht zwischen dem Personal und dem Patienten. Entnehmen Sie eine kleine Menge der Samenprobe zum Verpacken und Lagern. Stellen Sie sicher, dass der Patient im Verpackungsbereich unterschreibt.
5. Nummerieren Sie die verkapselten Proben und lagern Sie sie 2 Jahre lang. Erfassen Sie Patienteninformationen, Identifikationsnummer und Unterschriften des Empfängers und der Zeugen im Logbuch der Samenverarbeitung.
6. Wenn ein Mitarbeiter des Reproduktionszentrums die Identität eines verdächtigen Patienten entdeckt, hören Sie auf, die Probe zu erhalten, und überprüfen Sie die Identität des Patienten erneut. Empfangen Sie nicht zwei oder mehr Proben gleichzeitig. Wenn der Verdacht auf Verwechslungen bei den Proben besteht, hören Sie auf, sie zu erhalten.

3. Analyse der Samenprobe

1. Beobachte die Farbe der Samenproben.
   HINWEIS: Normaler Samen erscheint nach der Verflüssigung homogen und grauweiß. Sperma mit sehr geringer Spermienkonzentration kann transparent erscheinen. Wenn rote Blutkörperchen vorhanden sind, kann der Samen rötlich-braun erscheinen. Wenn der Patient Gelbsucht hat oder bestimmte Vitamine einnimmt, kann das Sperma gelb erscheinen.
2. Messen Sie das Samenvolumen mit der Wiegemethode mit einer Genauigkeit von 0,1 ml.
3. Legen Sie die Samenprobe für 15-30 Minuten bei 37 °C. Aspirieren Sie es in eine Einwegpipette aus Kunststoff mit breiter Öffnung (ca. 1,5 mm Durchmesser), so dass der Samen durch die Schwerkraft fallen kann. Achte auf die Länge eines Fadens.
   HINWEIS: Ein normales verflüssigtes Ejakulat bildet kleine, diskrete Tropfen. Wenn die Viskosität abnormal ist, bildet der Tropfen einen Faden, der länger als 2 cm ist.
4. Wenn sich das Sperma innerhalb von 60 Minuten immer noch nicht verflüssigt, fügen Sie die gleiche Menge Befruchtungsmedium hinzu. Atme dann die Mischung mit einer Einweg-Transferpipette aus Kunststoff wiederholt ein und aus, bis sie sich vollständig verflüssigt hat.
5. Messen Sie den pH-Wert des Samens mit Präzisions-pH-Testpapier (pH 6,0-10,0).
6. Nehmen Sie 10 μl voll verflüssigtes Sperma und tropfen Sie es in eine Makler-Zählkammer. Beurteilen Sie die Beweglichkeit der Spermien unter einem 200-fachen Feld mit einem optischen Mikroskop. Beobachten Sie das Vorhandensein von Spermienagglutination und Nicht-Spermien.
7. Bewerten Sie die Spermienkonzentration unter einem 200-fachen Feld mit einem optischen Mikroskop.

4. Entnahme von Eizellen

1. Bereiten Sie am Tag vor der Eizellentnahme ein Gericht für die Eizellentnahme (OPD) vor. Geben Sie 2,5 ml Eizellverarbeitungsmedium in eine sterile 35-mm-Kulturschale. Fügen Sie dann 1,5 ml Öl hinzu und stellen Sie die Schale über Nacht zum Ausgleich in einen 37 °C heißen Inkubator.
2. Bereiten Sie am Tag vor der Eizellentnahme zwei Gerichte für die Eizellkultur (OCD) vor. Geben Sie 1 ml Düngemedium in den Innenring einer sterilen zentralen Brunnenkulturschale und fügen Sie dann 1 ml Öl hinzu. Geben Sie 4 ml Düngemedium in den äußeren Ring. Stellen Sie die Schale in einen 37 °C heißen Inkubator mit 6 % CO₂ -Gefrierschrank, um sie über Nacht auszugleichen.
3. Schalten Sie alle Heizungen und Heizplatten ein und messen Sie die Temperatur 30 Minuten vor der Eizellentnahme.
4. Waschen Sie sich die Hände mit Handdesinfektionsmittel und spülen Sie sie gründlich mit fließendem Wasser ab. Tragen Sie saubere, sterile und staubfreie Handschuhe.
5. Heizen Sie die sterile Kulturschale auf einer 37 °C heißen Heizplattform vor.
6. Überprüfen Sie streng die Identität der Patientin, bevor Sie die Eizelle entnehmen.
7. Atmen Sie Follikelflüssigkeit durch Unterdruck in sterile Reagenzgläser ein und übergeben Sie sie sofort den Embryologen im Labor.
8. Gießen Sie die gesamte Follikelflüssigkeit in sterile Kulturschalen und suchen Sie unter einem Stereomikroskop mit geringer Vergrößerung nach Oozyten-Corona-Kumulus-Komplexen (OCCCs). Nehmen Sie die OCCCs mit einer Pipette auf und legen Sie sie zur vorübergehenden Lagerung bei 37 °C in ein OPD.
9. Notieren Sie die Menge, Farbe, Anzahl der Follikel und die Anzahl der OCCCs in der Follikelflüssigkeit.
10. Nach der Eizellentnahme übertragen Sie die OCCCs mit einer sterilen Pasteurpipette auf OCD. Legen Sie sie schnell für 2 Stunden in einen Kulturinkubator (37 °C, 6 % CO₂, 5 % O₂ und gesättigte Luftfeuchtigkeit).
11. Bereiten Sie eine Vier-Well-Schale zu, geben Sie 0,5 ml Hyaluronidase-Lösung in die erste Vertiefung und 1 ml Eizellverarbeitungsmedium in jede der verbleibenden drei Vertiefungen. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
12. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um OCCCs aus Schritt 4.10 für 30 s in eine gut enthaltende Hyaluronidase zu übertragen. Übertragen Sie dann die OCCCs in ein gut enthaltendes Eizellverarbeitungsmedium.
13. Verwenden Sie ein Oozytenstripping-Röhrchen mit einem Durchmesser von 150 μm, um die OCCCs zu blasen und zu aspirieren, um Granulosazellen zu entfernen. Verwenden Sie dann eine neue Pasteur-Pipette, um die Eizellen zum Waschen in das Eizellverarbeitungsmedium zu übertragen. Übertragen Sie sie auf eine andere voräquilibrierte Zwangsstörung und legen Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator mit 6 % CO₂ .

5. Spermienauswahl und ICSI-Operation

1. Geben Sie 5 μl Sperma in das Mikrotröpfchen des Befruchtungsmediums am linken Startpunkt der U-förmigen Spur in der ICSI-Operationsschale, die von Schritt 1.1 bis Schritt 1.6 vorbereitet wurde.
2. Stellen Sie die ICSI-Operationsschale für 30-60 min bei 37 °C, 6 % CO₂ in einen Inkubator.
3. Öffnen Sie das inverse Mikroskop, das Mikroskopbetriebssystem und den Heiztisch des Tisches, um sicherzustellen, dass alle Bedienelemente wieder in ihren ursprünglichen steuerbaren Bereich zurückversetzt werden, was einen reibungslosen und komfortablen Betrieb ermöglicht.
4. Setzen Sie die ICSI-Nadel in den Nadelhalter ein. Befestigen Sie den Nadelhalter am Mikromanipulator, stellen Sie die Haltenadel und die Injektionsnadel in der 4-fach-Objektivlinse ein und stellen Sie nacheinander ihre Winkel und Positionen so ein, dass die beiden Nadeln relativ und parallel zum Tisch sind. Überprüfen Sie den Bewegungsbereich der Operationsnadel unter der × 20 Objektivlinse.
5. Stellen Sie den Winkel und die Position der Eizellhaltenadel und der Injektionsnadel unter der 4-fach-Objektivlinse so ein, dass die beiden Nadelköpfe relativ und parallel zum Tisch stehen. Bewegen Sie die Betätigungsnadel nach vorne, hinten, links und rechts. Überprüfen Sie den Bewegungsbereich der Operationsnadel unter den 10x- und 20x-Objektiven.
6. Heben Sie die Eizellhaltenadel und die Injektionsnadel an, um sicherzustellen, dass die Höhe zwischen dem Operationstisch und dem Heiztisch eine einfache Platzierung des Operationsgefäßes ermöglicht, ohne die Operationsnadel zu berühren.
7. Nach der doppelten Überprüfung werden die ausgewählten Eizellen aus Schritt 4.12 in Mikrotröpfchen des Eizellverarbeitungsmediums in der ICSI-Operationsschale überführt, eine pro Tröpfchen.
8. Stellen Sie die Operationsschale mit der Eizelle auf den heißen Tisch des vorbereiteten Mikroskopbedieners.
9. Stellen Sie die Brennweite des Mikroskops unter der 10-fach-Objektivlinse ein, um die Ränder der Mikrotröpfchen im Inneren der Operationsschale klar und sichtbar zu machen.
10. Senken Sie die Injektionsnadel in den PVP-Streifen der ICSI-Operationsschale ab. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass die Injektionsnadel gut sichtbar ist, und inhalieren Sie gleichzeitig eine kleine Menge PVP in die Injektionsnadel.
11. Schieben Sie die Injektionsnadel in den langen Streifen auf der rechten Seite der U-förmigen Spur und extrahieren Sie hochwertige Spermien mit guter Morphologie und fortschreitender Beweglichkeit.
12. Übertragen Sie das Sperma in den PVP-Streifen auf der rechten Seite und legen Sie das Sperma auf den Boden der Operationsschale.
13. Drücken Sie die Injektionsnadel vorsichtig in den mittleren oder unteren Bereich des Spermienschwanzes, ziehen Sie die Injektionsnadel schnell zurück und kratzen Sie das Sperma an, damit es stoppt.
14. Inhalieren Sie das Sperma vom Schwanz bis zum Kopf in die Injektionsnadel.
15. Übertragen Sie die Injektionsnadel in das Tröpfchen des Eizellverarbeitungsmediums, das die Eizelle auf der rechten Seite enthält.
16. Senken Sie die Eizellhaltenadel und bewegen Sie die Eizelle vorsichtig, um den ersten Polkörper bei 12 Uhr zu positionieren und die Eizelle zu sichern.
17. Stellen Sie die mikrochirurgische Nadel und die Eizellmembran auf dieselbe horizontale Ebene ein. Schiebe das Sperma zur Spitze der Injektionsnadel.
18. Führen Sie vertikal durch die Zona pellucida bei 3 Uhr auf der Eizelle und injizieren Sie die Nadel weiter, bis sie die Mitte der Eizelle erreicht oder die Mittelposition leicht kreuzt, mit einem leichten Rückzug der Injektionsnadel.
    HINWEIS: Wenn ein schneller Reflux im Zytoplasma und im Sperma auftritt, deutet dies darauf hin, dass die Eizellmembran gebrochen und die Aspiration gestoppt wurde.
19. Injizieren Sie langsam Spermien in das Zytoplasma der Eizelle und verlassen Sie die Injektionsnadel. Die Tiefe der Spermieninjektion in das Zytoplasma sollte etwa 50 % bis 75 % des Eizellendurchmessers betragen.
20. Stellen Sie nach dem Zurückziehen der Injektionsnadel den Unterdruck der Eizellhaltenadel ein, um die Eizellen freizugeben.
21. Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle reifen Eizellen injiziert wurden.
22. Übertragen Sie die ICSI-Schüssel von der Mikroskop-Heizplatte in das Präpariermikroskop.
23. Nehmen Sie die Spaltkulturschale aus dem Inkubator.
24. Übertragen Sie die injizierte Samen-Eizelle in einen Mikrotröpfchen in einer Spaltkulturschale.
25. Stellen Sie die Spaltkulturschale wieder in einen 37 °C heißen Inkubator mit 6 % CO₂ und 5 % O₂ .

6. Aufbereitung der Spermien nach der DGC-Methode

1. Geben Sie 1,5 ml Gradientenzentrifugationslösung mit 45 % Dichte in ein steriles 15-ml-Reagenzglas mit konischem Boden.
2. Geben Sie langsam 1,5 ml Gradientenzentrifugationslösung mit 90 % Dichte auf den Boden der Gradientenzentrifugationslösung mit 45 % Dichte, wobei die Grenzfläche zwischen den beiden Flüssigkeiten beibehalten wird.
3. Geben Sie das verflüssigte Sperma vorsichtig auf die Gradientenzentrifugationslösung und zentrifugieren Sie es bei 300 x g für 15 min (bei Raumtemperatur).
4. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie etwa 0,5 ml des restlichen Spermiensediments zu 3 ml Befruchtungsmedium. Blasen und gut mischen.
5. Bei Raumtemperatur bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
6. Pipettieren Sie den Überstand und lassen Sie etwa 0,2 ml Sediment übrig.
7. Fügen Sie eine angemessene Menge Düngemedium hinzu, um das Sediment zu resuspendieren, die Spermienkonzentration und -vitalität zu zählen und aufzuzeichnen. Für die spätere Verwendung in einen 37 °C heißen Inkubator mit 6 % CO2 stellen.

7. Nachweis der Integrität der Kern-DNA der Spermien (Sperm Chromatin Dispersion Method, SCD)

1. Stellen Sie die Innentemperatur auf 20-28 °C ein, bevor Sie das Experiment durchführen. Entfernen Sie das Reagenzkit und lassen Sie es 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibrieren.
2. Bereiten Sie die Denaturierungslösung vor: Nehmen Sie 0,8 mL konzentrierte Denaturierungslösung und geben Sie sie zu 100 mL destilliertem Wasser.
3. Bereiten Sie die 70%ige Ethanollösung vor: Nehmen Sie 26,65 ml destilliertes Wasser und 70,35 ml wasserfreies Ethanol, um die 70%ige Ethanollösung herzustellen.
4. Bereiten Sie die 90%ige Ethanollösung vor: Nehmen Sie 9,55 ml destilliertes Wasser und 90,45 ml wasserfreies Ethanol, um die 90%ige Ethanollösung herzustellen.
5. Legen Sie das Agaroseröhrchen mit niedrigem Schmelzpunkt (mit 25 μl Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt) für 1-2 Minuten in ein 90-100 °C heißes Wasserbad, bis das Agarosegel vollständig geschmolzen ist. Legen Sie dann den Schlauch für 5 Minuten in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis die Temperatur konstant ist.
6. Nehmen Sie 3-10 μl Sperma vor der Optimierungsbehandlung und Spermiensuspension nach der Optimierungsbehandlung. Geben Sie sie in verschiedene Agaroseröhrchen mit niedrigem Schmelzpunkt und mischen Sie sie gründlich.
7. Nehmen Sie 30 μl der Agarosesuspension mit niedrigem Schmelzpunkt mit Spermien und tropfen Sie sie in horizontaler Position auf einen vorbehandelten Objektträger.
8. Decken Sie das Deckglas (22 mm x 11 mm groß) vorsichtig mit dem Objektträger ab und vermeiden Sie dabei die Bildung von Blasen so weit wie möglich.
9. Legen Sie den vorbehandelten Objektträger für 4 Minuten bei 2-8 °C in einen Kühlschrank und halten Sie den Objektträger während des gesamten Prozesses in horizontaler Position. Nehmen Sie den Glasschieber aus dem Kühlschrank und schieben Sie ihn vorsichtig, um das Abdeckglas zu entfernen.
10. Tauchen Sie den vorbehandelten Objektträger schnell für 7 min in die Denaturierungslösung.
11. Entfernen Sie den vorbehandelten Objektträger und weichen Sie ihn 5 s lang in destilliertem Wasser ein.
12. Nehmen Sie den vorbehandelten Glasschieber heraus und stellen Sie ihn aufrecht hin. Verwenden Sie Filterpapier, um Wassertropfen auf der Oberfläche des Objektträgers aufzusaugen, und vermeiden Sie es, den Probenbereich zu berühren.
13. Tauchen Sie den vorbehandelten Objektträger in den Lysepuffer und reagieren Sie 20 Minuten lang genau.
14. Tauchen Sie die vorbehandelten Fragmente 3 Minuten lang in die Waschlösung, um die Lyselösung abzuwaschen.
15. Entfernen Sie den vorbehandelten Objektträger und tauchen Sie ihn für 2 Minuten in eine 70%ige Ethanollösung.
16. Nehmen Sie den vorbehandelten Objektträger heraus und tauchen Sie ihn für 2 Minuten in eine 90%ige Ethanollösung.
17. Entfernen Sie den vorbehandelten Objektträger und tauchen Sie ihn 2 Minuten lang in wasserfreie Ethanollösung.
18. Nehmen Sie den vorbehandelten Objektträger heraus und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.
19. Bereiten Sie die Wright-Fleckenlösung A und Lösung B in einer braunen, leeren Flasche im Verhältnis 1:1 vor.
20. Legen Sie den vorbehandelten Objektträger waagerecht auf und geben Sie die gemischte Farbstofflösung auf den Objektträger, wobei Sie sicherstellen, dass die Farbstofflösung den gesamten Objektträger bedeckt (ca. 0,5-1 ml Farbstofflösung).
21. Nachdem Sie 5 Minuten lang gebeizt haben, spülen Sie den Objektträger vorsichtig 10-15 Mal vorsichtig mit destilliertem Wasser ab, um überschüssiges Färbemittel zu entfernen.
22. Lassen Sie den Glasschieber natürlich trocknen und betrachten Sie ihn unter einem Lichtmikroskop bei 400×. Zählen Sie mehr als 200 Spermien und bestimmen Sie den Prozentsatz abnormaler Spermien mit kleinen Halo-Ringen, ohne Halo-Ringe und Degeneration.

8. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit kommerziell erhältlicher Software durch.
2. Vergleichen Sie den DFI (%) zwischen ursprünglichem Sperma, DGC und UHS mit dem Friedman-Test.
   HINWEIS: Verwenden Sie für paarweise Vergleiche zweier Methoden den Wilcoxon-Test mit Vorzeichenrang. Betrachten Sie einen p-Wert ≤ 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Die UHS- und DGC-Methoden wurden verwendet, um die Behandlung von 21 Proben zu optimieren und den DNA-Fragmentierungsindex der Spermien zwischen den beiden Methoden zu vergleichen. Die Methode, bei der die UHS-Spur in der ICSI-Schüssel verwendet wird, kann DGC ersetzen, was zu Schäden an den Spermien führen kann. Hochwertige Spermien mit guter progressiver Beweglichkeit schwimmen sanft am Rand der U-förmigen Spur entlang (Abbildung 2), was es der ICSI-Nadel erleichtert, sie einzeln zu greife...

Diskussion

Der wichtigste Schritt bei der Trennung von qualitativ hochwertigem Sperma mit der in diesem Artikel beschriebenen UHS-Methode ist die Einrichtung einer UHS-Spur mit Puffertröpfchen. Sowohl die UHS-Spur als auch die Puffertröpfchen werden aus gewaschenem und empfangenem Sperma hergestellt. Die UHS-Bahn leitet hochwertiges Sperma frei zum Schwimmen und sammeln sich am Rand der Bahn an, wodurch es leicht zu sammeln ist. Die Puffertröpfchen reduzieren die Viskosität des Samens und filtern a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
7% Polyvinylpyrrolidon Lösung	Vitrolife Schweden AB	10111	ICSI
Aspirator	LABOTECT-Aspirator
Biologische saubere Werkbank	Suzhou Antai	-	Biologische Reinwerkbank
Blastozysten-Kulturmedium	Vitrolife Schweden AB	10132	Blastozysten-Kulturmedium
Spaltkulturmedium	Vitrolife Schweden AB	10128	Nährmedium für die Spaltung
CO2 Inkubator	Thermo Scientific-CO2Inkubator
Kulturöl	Vitrolife Schweden AB	10029	OVOIL
Einweg-Transferpipette aus Kunststoff	BD Falcon	357575	Einweg-Transferpipette aus Kunststoff
Befruchtungsmedium	Vitrolife Schweden AB	10136	G-IVF PLUS
ICSI Operationsschale	BD Falcon	351006	Petrischale
Instant-Hyaluronidase	Vitrolife Schweden AB	10017	Instant-Hyaluronidase
Inverses Mikroskop	NIKON	-	Inverses Mikroskop
IVF Workstation	Dänemark K-SYSTEM-IVF		Workstation
Makler Zählkammer	Sefi Medical Instruments		Makler Zählkammer
Mikro-Betriebssystem	NIKON	-	Mikrobetriebssystem
Eizellverarbeitungsmedium	Vitrolife Schweden AB	10130	G-MOPS PLUS
Optisches Mikroskop	OLYMPUS-Optisches		Mikroskop
Phasenkontrastmikroskop	NIKON-Phasenkontrastmikroskop
Spermien-Zähltafel		Markler-Spermien-Zähltafel
Lösung zur Trennung von Spermiengradienten	Vitrolife Schweden AB	10138	SpermGrad
DNA-Integritätskit für den Spermienkern	Shenzhen HuaKang	-	Spermienkern-DNA-Integritätskit (SCD)
Stereoskopisches Mikroskop		NIKON-Stereoskopisches	Mikroskop
Tischzentrifuge	HETTICH-Tischzentrifuge
Thermostatisches Reagenzglasgestell			GRANT-Thermostatisches Reagenzglasgestell
Tri-Gas-Inkubator	ASTEC-Tri-Gas-Inkubator