Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.
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Methodenartikel
MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Myosin-7a ist ein auf Aktin basierendes Motorprotein, das für auditive und visuelle Prozesse unerlässlich ist. Mutationen in Myosin-7a führen zum Usher-Syndrom Typ 1, der häufigsten und schwersten Form der Taubblindheit beim Menschen. Es wird angenommen, dass Myosin-7a mit anderen Usher-Proteinen einen Transmembran-Adhäsionskomplex bildet, der für die strukturell-funktionelle Integrität von Photorezeptor- und Cochlea-Haarzellen essentiell ist. Aufgrund der Herausforderungen bei der Gewinnung von reinem, intaktem Protein sind die genauen Funktionsmechanismen von humanem Myosin-7a jedoch nach wie vor schwer fassbar, da nur begrenzte strukturelle und biomechanische Studien verfügbar sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass Myosin-7a bei Säugetieren ein multimerer Motorkomplex ist, der aus einer schweren Kette und drei Arten von leichten Ketten besteht: regulatorische leichte Kette (RLC), Calmodulin und Calmodulin-ähnliches Protein 4 (CALML4). Im Gegensatz zu Calmodulin bindet CALML4 nicht an Calciumionen. Sowohl die kalziumempfindlichen als auch die unempfindlichen Calmoduline sind für das Myosin-7a von Säugetieren entscheidend für die richtige Feinabstimmung seiner mechanischen Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Herstellung von rekombinanten humanen Myosin-7a-Holoenzymen unter Verwendung des MultiBac Baculovirus-Proteinexpressionssystems. Dies ergibt Milligrammmengen an hochreinem Protein in voller Länge, was seine biochemische und biophysikalische Charakterisierung ermöglicht. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Bewertung seiner mechanischen und beweglichen Eigenschaften mit Hilfe von maßgeschneiderten in vitro Motilitätsassays und Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Verfügbarkeit des intakten humanen Myosin-7a-Proteins sowie das hier beschriebene detaillierte funktionelle Charakterisierungsprotokoll ebnen den Weg für weitere Untersuchungen der molekularen Aspekte von Myosin-7a im Sehen und Hören.
Einleitung
Myosine sind molekulare Motorproteine, die mit Aktin interagieren, um zahlreiche zelluläre Prozesse anzutreiben 1,2,3,4. Der Mensch besitzt 12 Klassen und 39 Myosin-Gene5, die an einer Vielzahl physiologischer Funktionen beteiligt sind, wie z. B. der Muskelkontraktion6 und sensorischen Prozessen7. Jedes Myosinmolekül ist ein multimerer Komplex, der aus einer schweren Kette und leichten Ketten besteht. Die schwere Kette ist in Kopf-, Hal....
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Protokoll
HINWEIS: Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Synthese des intakten humanen Myosin-7a-Holoenzyms und zur Charakterisierung seiner Motilität in vitro. Dieses Protokoll ist in drei Abschnitte unterteilt: erstens die Expression des humanen Myosin-7a unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Proteinexpressionssystems; Zweitens, getrennte Reinigung von Myosin-7a-Leichtketten unter Verwendung des E.coli His6-SUMO-Systems; und schließlich die Untersuchung der Motilität von humanem Myosin-7a mit dem Aktin-Filament-Gleittest.
1. MultiBac-Systembasierte Myosin-7a-Komplexproduktion
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Ergebnisse
Der gereinigte Myosin-7a-Komplex und die Leichtkettenproteine können mittels SDS-PAGE-Gelelektrophorese ausgewertet werden, wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Bande oberhalb des 200 kDa-Markers entspricht der Myosin-7a-Schwerkette (255 kDa). Die drei Banden, die zwischen den 22- und 14-kDa-Markern von oben nach unten wandern, sind RLC (20 kDa), Calmodulin bzw. CALML4. Während Calmodulin und CALML4 ein ähnliches Molekulargewicht von etwa 17 kDa haben, können die beiden Proteine mit einem 16%igen.......
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Diskussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von rekombinantem humanem Myosin-7a-Protein aus Insektenzellen vorgestellt. Obwohl das Sf9/Baculovirus-System zur Herstellung einer Vielzahl von Myosinen verwendet wurde 40,41,42,43, wurde das Säugetier-Myosin-7a erst vor kurzem erfolgreich mit dem MultiBac-Baculovirus-System gereinigt .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken der Microscopy Imaging Facility und dem Visual Function and Morphology Core an der West Virginia University für die Diskussion und Hilfe bei der Bildanalyse. Diese Arbeit wird durch die Tenure-Track-Startup-Fonds der West Virginia University School of Medicine bis R.L. unterstützt. Diese Arbeit wird auch vom Visual Sciences Center of Biomedical Research Excellence (Vs-CoBRE) des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (P20GM144230) und dem NIGMS West Virginia Network of Biomedical Research Excellence (WV-INBRE) (P20GM103434) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen | VWR | 87003-294 | |
| 1X FLAG Peptide | GenScript | N/A | Custom Peptide Synthese |
| 22x22mm Nr. 1,5 Deckgläser | VWR | 48366-227 | |
| 250 mL Konische Zentrifugenröhrchen | Nunc | 376814 | |
| 250 mL Belüftete Erlenmyer Shaker Flask | IntelixBio | DBJ-SF250VP | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | |
| 75x25x1 mm Vistavision Objektträger | VWR | 16004-42 | |
| Aktin-Protein (>99% rein) | Zytoskelett | AKL99 | |
| Amicon Ultra-0,5 Zentrifugalfiltereinheit | Millipore Sigma | UFC510024 | |
| Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Millipore Sigma | A2220 | |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| Bio-Spin Einweg-Chromatographiesäule | Bio-Rad | 732-6008 | |
| BL21 Kompetente E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Bluo-Gal | Thermo Fisher | ||
| Rinderserumalbumin | Millipore Sigma | 5470 | |
| BstXI Enzym | New England Biolabs | R0113S | |
| Calmodulin | Millipore | Sigma 208694 | |
| Katalase | Millipore Sigma | C40 | |
| Champion pET-SUMO Expression System | Thermo Fisher | K30001 | |
| cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail | Roche Diagnostics | 5056489001 | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | DO632 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | DO632 | |
| DNase I, Spectrum Chemical | Fisher Scientific | 18-610-304 | |
| Doppelseitiges Klebeband | Office Depot | 909955 | |
| EGTA, | Molekularbiologie Millipore Sigma | 324626-25GM | |
| EGTA, Molekularbiologie | Millipore Sigma | 324626-25GM | |
| Ethanol | Thermo Fisher | BP2818 | |
| ExpiFectamine Sf Transfection Reagenz | Gibco | A38915 | |
| FAST Programm | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements; | ||
| Fisherbrand Modell 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB505110 | |
| Gentamicin Reagenz Lösung | Gibco | 15710-064 | 10 mg/ml in destilliertem Wasser |
| Glukose | Millipore Sigma | G5767 | |
| Glukoseoxidase | Millipore Sigma | G2133 | |
| Glycerin | Invitrogen | 15514-011 | |
| HisPur Kobaltharz | Thermo Fisher | 89966 | |
| I-CeuI Enzym | New England Biolabs | R0699S Bildstabilisator | |
| Plugin | https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | ||
| ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
| Imidazol | Millipore Sigma | I2399 | |
| In-Fusion Snap Assembly Master Mix | TaKaRa | 638948 | |
| IPTG | Thermo Fisher | 15529019 | |
| Isopropanol | Fisher | Scientific A451SK | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | AAJ67354AD | |
| Pipettenspitzen mit großer Öffnung | Fisher | Scientific 02-707-134 | 1-200uL |
| LB Agar, fertiges Pulver | Thermo Fisher | J75851-A1 | |
| Leupeptin-Protease-Inhibitor | Thermo Fisher | 78435 | |
| Magnesiumchlorid | Thermo Fisher | J61014.=E | 1M |
| Magnesiumchlorid | Thermo Fisher | J61014.=E | 1M |
| Max. Wirkungsgrad DH10Bac Kompetente Zellen | Gibco | 10361012 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Mikroskop | Nikon Modell: Eclipse Ti mit H-TIRF-System mit 100X TIRF Objektiv | ||
| Mikroskop Kamera | ORCA-Fusion BT | ||
| Mikroskop Lasereinheit | Andor iXon Ultra | ||
| Miller' s LB Bouillon | Corning | 46-050-CM | |
| MOPS | Millipore Sigma | M3183 | |
| MOPS | Millipore Sigma | M3183 | |
| NanoDrop One/OneC Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| NanoDrop One/OneC Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| NEB 5-alpha Kompetente E.coli (hohe Effizienz) | New England Biolabs | C2987H | |
| NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B6003S | |
| NIS Elements | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | ||
| Nitrocellulose | LADD Research Industries | 53152 | |
| Opti-MEM I Reduziertes Serummedium | Gibco | 31985070 | |
| pACEBac1 Vector | Geneva Biotech | ||
| Parafilm | Millipore Sigma | P7793 | |
| PMSF | Millipore Sigma | 78830 | |
| PureLink RNase A (20 mg/ml) | Invitrogen | 12091021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAquick Gel-Extraktionskit (50) | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit (50) | QIAGEN | 28104 | |
| Quick CIP | New England Biolabs | M0525S | |
| Rhodamin-Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| S.O.C. Medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SENP2-Protease | PMID:17591783 | Im Labor gereinigt | |
| Sf9 Zellen | Thermo Fisher | 11496015 | |
| Sf-900 III SFM (1X) - Serum Free Media Complete | Gibco | 12658-027 | |
| Slide-A-Lyzer G3 Dialysekassetten, 10K MWCO, 3 mL | Thermo Fisher | A52971 | |
| Natriumchlorid | Millipore Sigma | S7653 | |
| Natriumchlorid | Millipore Sigma | S7653 | |
| Stericup Schnellwechsel-Vakuum-Einweg-Filtrationssystem | Millipore Sigma | S2GPU01RE | |
| Superdex 75 Erhöhung 10/300 GL | Cytiva | DNA-Ligase | |
| New England Biolabs | M0202S | ||
| T4 DNA-Ligase-Puffer - 10X mit 10 mM ATP | New England Biolabs | B0202A | |
| Tetracyclinhydrochlorid | Millipore Sigma | T7660-5G | |
| Tris | Millipore Sigma | 10708976001 | |
| Triton X | American Bioanalytical | 9002-93-1 |
Referenzen
- Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. J Cell Sci. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
- Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. Biochim Biophys Acta. 1496 (1), 3-22 (2000).
- Titus, M. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
