Eine automatisierte Schielmethode zur zeitsynchronen Verhaltens- und Gehirndynamik in Schmerzstudien an Mäusen

Summary

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Verfolgung des automatisierten Augenschielens bei Nagetieren im Laufe der Zeit in einer Weise, die mit der Zeitbindung an neurophysiologische Messungen kompatibel ist. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für Forscher nützlich sein wird, die Mechanismen von Schmerzstörungen wie Migräne untersuchen.

Abstract

Es war eine Herausforderung, spontane Schmerzen in Echtzeit zu verfolgen und so zu quantifizieren, dass menschliche Verzerrungen vermieden werden. Dies gilt insbesondere für Metriken von Kopfschmerzen, wie z. B. bei Erkrankungen wie Migräne. Das Schielen der Augen hat sich als kontinuierliche variable Metrik herausgestellt, die über die Zeit gemessen werden kann und für die Vorhersage von Schmerzzuständen in solchen Assays wirksam ist. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Verwendung von DeepLabCut (DLC) zur Automatisierung und Quantifizierung des Augenschielens (euklidischer Abstand zwischen den Augenlidern) bei gefesselten Mäusen mit frei rotierenden Kopfbewegungen vorgestellt. Dieses Protokoll ermöglicht die unverzerrte Quantifizierung des Augenschielens, die mit mechanistischen Messgrößen wie der Neurophysiologie gekoppelt und direkt mit ihnen verglichen werden kann. Wir bieten eine Bewertung der KI-Trainingsparameter, die für das Erreichen des Erfolgs erforderlich sind, definiert durch die Unterscheidung von Schiel- und Nicht-Schielperioden. Wir zeigen die Fähigkeit, das Schielen in einem CGRP-induzierten migräneähnlichen Phänotyp mit einer Auflösung von weniger als einer Sekunde zuverlässig zu verfolgen und zu differenzieren.

Introduction

Migräne ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Erkrankungen des Gehirns, von der mehr als eine Milliarde Menschen betroffen^{sind 1}. Präklinische Mausmodelle der Migräne haben sich als informative Möglichkeit erwiesen, die Mechanismen der Migräne zu untersuchen, da diese Studien leichter kontrolliert werden können als Studien am Menschen, was eine kausale Untersuchung des migränebedingten Verhaltens ermöglicht². Solche Modelle haben eine starke und wiederholbare phänotypische Reaktion auf Migräne-induzierende Verbindungen wie Calcitonin-Gene-Related Peptide (CGRP) gezeigt. Der Bedarf an robusten Messungen von migränerelevanten Verhaltensweisen in Nagetiermodellen besteht weiterhin, insbesondere solche, die mit mechanistischen Metriken wie Bildgebung und elektrophysiologischen Ansätzen gekoppelt werden können.

Migräneähnliche Hirnzustände sind phänotypisch gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Lichtaversion, Pfotenallodynie, Gesichtshyperalgesie gegenüber schädlichen Reizen und Gesichtsgrimasse³. Solche Verhaltensweisen werden anhand der Gesamtzeit, die sie im Licht verbracht haben (Lichtaversion) und der Empfindlichkeitsschwellen für Pfoten- oder Gesichtsberührungen (Pfotenallodynie und Gesichtshyperalgesie) gemessen und sind auf eine einzige Messung über große Zeiträume (Minuten oder länger) beschränkt. Migräneähnliche Verhaltensweisen können bei Tieren durch die Verabreichung von Migräne-induzierenden Verbindungen wie CGRP hervorgerufen werden, die die Symptome menschlicher Patienten mit Migräne³ nachahmen (d. h. die Validität des Gesichts demonstrieren). Solche Verbindungen verursachen auch Migränesymptome, wenn sie beim Menschen verabreicht werden, was die Konstruktvalidität dieser Modelle demonstriert⁴. Studien, in denen Verhaltensphänotypen pharmakologisch abgeschwächt wurden, haben zu Entdeckungen im Zusammenhang mit der Behandlung von Migräne geführt und liefern eine weitere Untermauerung dieser Modelle (d. h. den Nachweis der prädiktiven Validität)^5,6.

Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ein monoklonaler Anti-CGRP-Antikörper (ALD405) bei Mäusen, die mit CGRP behandelt wurden, das lichtaversive Verhalten⁵ und die Gesichtsgrimasse⁶ reduziert, und andere Studien haben gezeigt, dass CGRP-Antagonisten das durch Distickstoffmonoxid induzierte migräneähnliche Verhaltensweisen bei Tieren reduzieren ^7,8. Jüngste klinische Studien haben Erfolge bei der Behandlung von Migräne durch Blockierung von CGRP ^9,10 gezeigt, was zu mehreren von der FDA zugelassenen Medikamenten führte, die auf CGRP oder seinen Rezeptor abzielen. Die präklinische Bewertung von Migräne-Phänotypen hat zu Durchbrüchen in den klinischen Erkenntnissen geführt und ist daher unerlässlich für das Verständnis einiger der komplexeren Aspekte der Migräne, die am Menschen nur schwer direkt getestet werden können.

Trotz zahlreicher Vorteile sind Experimente, bei denen diese Verhaltensdaten von Migräne bei Nagetieren verwendet werden, oft in ihren Fähigkeiten zur Abtastung zum Zeitpunkt eingeschränkt und können subjektiv und anfällig für experimentelle Fehler beim Menschen sein. Viele Verhaltensassays sind in der Fähigkeit, Aktivität mit feinerer zeitlicher Auflösung zu erfassen, eingeschränkt, was es oft schwierig macht, dynamischere Elemente zu erfassen, die auf einer Zeitskala von weniger als einer Sekunde auftreten, wie z. B. auf der Ebene der Gehirnaktivität. Es hat sich als schwierig erwiesen, die spontaneren, natürlich vorkommenden Elemente des Verhaltens im Laufe der Zeit mit einer sinnvollen zeitlichen Auflösung zu quantifizieren, um neurophysiologische Mechanismen zu untersuchen. Die Schaffung einer Möglichkeit, migräneähnliche Aktivität auf schnelleren Zeitskalen zu identifizieren, würde es ermöglichen, migräneähnliche Gehirnzustände extern zu validieren. Dies wiederum könnte mit der Gehirnaktivität synchronisiert werden, um robustere Gehirnaktivitätsprofile von Migräne zu erstellen.

Ein solcher migränebedingter Phänotyp, die Gesichtsgrimasse, wird in verschiedenen Kontexten als Schmerzmessung bei Tieren verwendet, die sofort gemessen und über die Zeit verfolgt werden kann¹¹. Die Grimasse im Gesicht wird oft als Indikator für spontane Schmerzen verwendet, basierend auf der Vorstellung, dass Menschen (insbesondere nonverbale Menschen) und andere Säugetierarten natürliche Veränderungen des Gesichtsausdrucks zeigen, wenn sie Schmerzen empfinden¹¹. Studien, in denen in den letzten zehn Jahren Gesichtsgrimassen als Hinweis auf Schmerzen bei Mäusen gemessen wurden, haben Skalen wie die Mouse Grimace Scale (MGS) verwendet, um die Charakterisierung von Schmerzen bei Nagetieren zu standardisieren¹². Zu den Variablen des Gesichtsausdrucks des MGS gehören die Orbitastraffung (Schielen), die Nasenwölbung, die Wangenwölbung, die Ohrposition und die Veränderung des Schnurrhaars. Obwohl gezeigt wurde, dass das MGS Schmerzen bei Tieren zuverlässig charakterisiert¹³, ist es notorisch subjektiv und beruht auf einer genauen Bewertung, die von Versuchsleiter zu Versuchsleiter variieren kann. Darüber hinaus ist das MGS insofern eingeschränkt, als es eine nicht-kontinuierliche Skala verwendet und nicht über die zeitliche Auflösung verfügt, die erforderlich ist, um natürlich auftretendes Verhalten über die Zeit hinweg zu verfolgen.

Eine Möglichkeit, dem entgegenzuwirken, besteht darin, ein konsistentes Gesichtsmerkmal objektiv zu quantifizieren. Schielen ist das am konsequentesten verfolgbare Gesichtsmerkmal⁶. Das Schielen macht den Großteil der Gesamtvariabilität in den Daten aus, wenn alle MGS-Variablen (Schielen, Nasenwölbung, Wangenwölbung, Ohrposition und Schnurrhaarveränderung) berücksichtigt ^werden6. Da das Schielen den größten Teil zur Gesamtbewertung beiträgt, die mit dem MGS erhalten wird, und das Ansprechen auf CGRP ^6,14 zuverlässig verfolgt, ist es die zuverlässigste Methode, um spontane Schmerzen in Migräne-Mausmodellen zu verfolgen. Dies macht das Schielen zu einem quantifizierbaren nicht-homöostatischen Verhalten, das durch CGRP induziert wird. Mehrere Labore haben Gesichtsausdrücke, einschließlich Schielen, verwendet, um potenzielle spontane Schmerzen im Zusammenhang mit Migräne darzustellen ^6,15.

Es blieben einige Herausforderungen bestehen, wenn es darum ging, automatisierte Schielen in einer Weise durchzuführen, die mit mechanistischen Studien der Migräne gekoppelt werden kann. Zum Beispiel war es schwierig, das Schielen zuverlässig zu verfolgen, ohne sich auf eine feste Position zu verlassen, die in allen Sitzungen auf die gleiche Weise kalibriert werden muss. Eine weitere Herausforderung besteht darin, diese Art der Analyse auf einer kontinuierlichen Skala durchführen zu können, anstatt auf diskreten Skalen wie der MGS. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben wir uns zum Ziel gesetzt, maschinelles Lernen in Form von DeepLabCut (DLC) in unsere Datenanalyse-Pipeline zu integrieren. DLC ist ein maschinelles Lernmodell zur Posenschätzung, das von Mathis und Kollegen entwickelt wurde und auf eine Vielzahl von Verhaltensweisen angewendet wurde¹⁶. Mit ihrer Software zur Posenschätzung waren wir in der Lage, Modelle zu trainieren, die Punkte auf einem Mausauge mit nahezu menschlicher Genauigkeit genau vorhersagen konnten. Dies löst die Probleme der sich wiederholenden manuellen Bewertung und erhöht gleichzeitig die zeitliche Auflösung drastisch. Darüber hinaus haben wir durch die Erstellung dieser Modelle ein wiederholbares Mittel entwickelt, um das Schielen und die Schätzung der migräneähnlichen Gehirnaktivität über größere Versuchsgruppen hinweg zu bewerten. Hier stellen wir die Entwicklung und Validierung dieser Methode zur Verfolgung von Schielverhalten auf eine Weise vor, die zeitlich an andere mechanistische Messungen wie die Neurophysiologie gebunden werden kann. Das übergeordnete Ziel ist es, mechanistische Studien zu katalysieren, die zeitlich fixiertes Schielenverhalten in Nagetiermodellen erfordern.

Protocol

HINWEIS: Alle Tiere, die in diesen Versuchen verwendet wurden, wurden gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität von Iowa genehmigten Protokollen behandelt.

1. Bereiten Sie die Ausrüstung für die Datenerfassung vor

1. Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Geräte verfügbar sind: Stellen Sie sicher, dass die empfohlene Hardware zum Ausführen von DLC über mindestens 8 GB Arbeitsspeicher verfügt. In der Materialtabelle finden Sie Informationen zu Hardware und Software.
   HINWEIS: Daten können in jedem Format gesammelt werden, müssen aber vor der Analyse in ein Format konvertiert werden, das von DLC gelesen werden kann. Die gängigsten Formate sind AVI und MP4.
2. Konfigurieren Sie mindestens eine Kamera so, dass ein Auge eines Tieres erkannt werden kann. Wenn beide Augen sichtbar sind, führen Sie eine zusätzliche Filterung durch, da dies zu Interferenzen beim Tracking führen kann. In Abschnitt 10 finden Sie ein Beispiel für eine solche Filterung der hier bereitgestellten Daten.
3. Installieren Sie DLC mit dem Paket, das Sie unter Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation finden.
4. Fügen Sie in der Kamerakonfiguration eine einzelne Kamera in einem Seitenwinkel (~90°) zur Maus ein. Um diesem Beispiel zu folgen, nehmen Sie Proben bei 10 Hz, wobei die Mäuse gefesselt sind, aber frei auf ihre gesamte Bandbreite an Kopfbewegungen relativ zum Körper zugreifen können. Halten Sie zwischen 2 und 4 Zoll von der Kamera zum Tier entfernt.

2. DLC einrichten

1. Erstellen Sie nach der Installation von DLC die Umgebung, in der Sie arbeiten möchten. Navigieren Sie dazu zu dem Ordner, in den die DLC-Software heruntergeladen wurde, indem Sie das Verzeichnis mit dem folgenden Befehl ändern.
   CD folder_name
   HINWEIS: Hier befindet sich die Datei DEEPLABCUT.yaml.
2. Führen Sie den ersten Befehl aus, um die Umgebung zu erstellen, und aktivieren Sie sie, indem Sie den zweiten Befehl eingeben.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda activate Deeplabcut
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Umgebung vor jeder Verwendung des DLC aktiviert ist.
   Öffnen Sie nach dem Aktivieren der Umgebung die grafische Benutzeroberfläche (GUI) mit dem folgenden Befehl und beginnen Sie mit der Erstellung des Modells.
   python -m deeplabcut

3. Erstellen des Modells

1. Nachdem die GUI geöffnet wurde, beginnen Sie mit der Erstellung eines Modells, indem Sie unten auf Neues Projekt erstellen klicken.
2. Benennen Sie das Projekt mit etwas Aussagekräftigem und Einzigartigem, um es später zu identifizieren, und geben Sie einen Namen als Experimentator ein. Überprüfen Sie den Abschnitt Speicherort , um zu sehen, wo das Projekt gespeichert wird.
3. Wählen Sie Ordner durchsuchen aus, und suchen Sie die Videos zum Trainieren des Modells. Wählen Sie Videos in Projektordner kopieren , wenn die Videos nicht aus dem ursprünglichen Verzeichnis verschoben werden sollen.
4. Wählen Sie Erstellen aus, um ein neues Projekt auf dem Computer zu generieren.
   HINWEIS: Die Videos müssen die gesamte Bandbreite des Verhaltens abdecken, das Sie beobachten werden (d. h. Schielen, Nicht-Schielen und alle Verhaltensweisen dazwischen). Das Modell ist nur in der Lage, ein ähnliches Verhalten wie in den Trainingsdaten zu erkennen, und wenn einige Komponenten des Verhaltens fehlen, kann das Modell Schwierigkeiten haben, es zu erkennen.

4. Konfigurieren Sie die Einstellungen

HINWEIS: Hier können Details wie die zu verfolgenden Punkte, die Anzahl der aus jedem Trainingsvideo extrahierten Frames, die standardmäßige Beschriftungspunktgröße und Variablen in Bezug auf das Training des Modells definiert werden.

1. Bearbeiten Sie nach dem Erstellen des Modells die Konfigurationseinstellungen, indem Sie Edit config.yaml auswählen. Wählen Sie Bearbeiten aus, um die Konfigurationseinstellungsdatei zu öffnen und Schlüsseleinstellungen für das Modell festzulegen.
2. Ändern Sie Körperteile so, dass alle Teile des Auges verfolgt werden sollen, und ändern Sie dann numframes2pick auf die Anzahl der Frames, die pro Trainingsvideo benötigt werden, um insgesamt 400 Frames zu erhalten. Ändern Sie abschließend die Punktgröße in sechs , damit die Standardgröße beim Beschriften klein genug ist, um genau um die Ränder des Auges herum platziert zu werden.

5. Extrahieren von Trainingsframes

1. Navigieren Sie nach der Konfiguration zur Registerkarte Frames extrahieren oben in der GUI und wählen Sie unten rechts auf der Seite Frames extrahieren aus.
2. Überwachen Sie den Fortschritt mithilfe der Ladeleiste am unteren Rand der GUI.

6. Trainingsrahmen beschriften

1. Navigieren Sie in der GUI zur Registerkarte Beschriftungsrahmen , und wählen Sie Beschriftungsrahmen aus. Suchen Sie das neue Fenster, in dem Ordner für jedes der ausgewählten Schulungsvideos angezeigt werden. Wählen Sie den ersten Ordner aus, und eine neue Bezeichnungs-GUI wird geöffnet.
2. Beschriften Sie die Punkte, die während der Konfiguration für jeden Frame des ausgewählten Videos definiert wurden. Nachdem alle Frames beschriftet sind, speichern Sie sie und wiederholen Sie den Vorgang für das nächste Video.
3. Um das Schielen angemessen zu beschriften, verwenden Sie zwei Punkte, die so nah wie möglich an der größten Spitze des Auges (Mitte) liegen, und geben Sie für jeden Punkt die Auf-/Ab-Positionen an. Nähern Sie sich dem Schielen als Durchschnitt dieser beiden Längen an.
   HINWEIS: Beim Beschriften speichert DLC den Fortschritt nicht automatisch. Es wird empfohlen, regelmäßig zu speichern, um den Verlust von beschrifteten Daten zu vermeiden.

7. Erstellen eines Trainingsdatensatzes

1. Navigieren Sie nach dem manuellen Beschriften zur Registerkarte Netzwerk trainieren , und wählen Sie Netzwerk trainieren aus, um die Software aufzufordern, mit dem Training des Modells zu beginnen.
2. Überwachen Sie den Fortschritt im Befehlsfenster.

8. Evaluieren Sie das Netzwerk

1. Navigieren Sie nach Abschluss des Netzwerktrainings zur Registerkarte Netzwerk auswerten , und wählen Sie Netzwerk auswerten aus. Warten Sie einen Moment, bis der blaue Ladekreis verschwindet und anzeigt, dass die Selbstbewertung abgeschlossen ist und das Modell einsatzbereit ist.

9. Analysieren Sie Daten/generieren Sie beschriftete Videos

1. Um Videos zu analysieren, navigieren Sie zur Registerkarte Videos analysieren . Wählen Sie Weitere Videos hinzufügen und wählen Sie die zu analysierenden Videos aus.
2. Wählen Sie Ergebnis(e) als csv speichern , wenn eine csv-Ausgabe der Daten ausreicht.
3. Wenn alle Videos erfasst wurden, wählen Sie unten Videos analysieren aus, um mit der Analyse der Videos zu beginnen.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss abgeschlossen sein, bevor in Schritt 9.5 beschriftete Videos generiert werden
4. Nachdem die Videos analysiert wurden, navigieren Sie zur Registerkarte Videos erstellen und wählen Sie die analysierten Videos aus.
5. Wählen Sie Videos erstellen aus, und die Software beginnt mit der Generierung von beschrifteten Videos, die die im entsprechenden .csv angezeigten Daten darstellen.

10. Verarbeiten Sie die Enddaten

1. Wenden Sie die bei https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc gefundenen Makros an, um Rohdaten in das für diese Analyse verwendete Format (d. h. euklidische Entfernung) zu konvertieren.
2. Importieren Sie Makros mit den Bezeichnungen Step1 und Step 2 in die CSV-Datei, und wenden Sie sie auf die CSV-Datei an, um alle suboptimalen Datenpunkte herauszufiltern und die Daten in einen gemittelten euklidischen Abstand für die zentriertesten Punkte am oberen und unteren Rand des Auges zu konvertieren.
3. Führen Sie das Makro mit dem Namen Step3 aus, um jeden Punkt basierend auf dem Schwellenwert im Skript, der auf 75 Pixel festgelegt ist, als 0 ohne Schielen und 1 Schielen zu markieren.
   HINWEIS: Die Parameter für diese Makros müssen je nach Versuchsaufbau möglicherweise angepasst werden (siehe Diskussion). Der Schwellenwert für das Schielen und der automatische Filter für den Maximalwert des Auges sind Parameter, die je nach Größe des Tieres und Entfernung von der Kamera geändert werden können. Sie können auch die Werte anpassen, die zum Entfernen suboptimaler Punkte verwendet werden, je nachdem, wie selektiv die Daten gefiltert werden müssen.

Results

Hier stellen wir eine Methode zur zuverlässigen Detektion von Schielen bei hoher zeitlicher Auflösung mit Hilfe von DeepLabCut zur Verfügung. Wir haben die Trainingsparameter optimiert und eine Bewertung der Stärken und Schwächen dieser Methode vorgenommen (Abbildung 1).

Nach dem Training unserer Modelle haben wir überprüft, ob sie in der Lage sind, die oberen und unteren Punkte des Augenlids korrekt zu schätzen (Abbildung 2), die als Koordinatenpunkte für das euklidische Entfernungsmaß dienen. Der euklidische Abstand ist definiert als die durchschnittliche Länge der Abstände zwischen den beiden oberen und unteren Punkten des Auges. Unser Modell war in der Lage, Fälle von Nicht-Schielen (Abbildung 2A) und Schielen (Abbildung 2B) zu erkennen. Die blauen Punkte zeigen Punkte an, die zur Bestimmung des euklidischen Abstands für jedes Bild verwendet werden. Die grünen, gelben, orangefarbenen und violetten Punkte wurden verwendet, um dem Modell zu helfen, den euklidischen Abstand korrekt einzuschätzen und den Wahrscheinlichkeitswert zu verringern, wenn sich der Kopf in einer suboptimalen Position befindet (d. h. unter Berücksichtigung von Kopfbewegungen und Positionsänderungen über Sitzungen hinweg). Anschließend validierten wir die Genauigkeit des Modells mit einer Reihe verschiedener Methoden.

Um die ideale Anzahl von Frames zu validieren, die für das Modell verwendet wurden, haben wir vier Modelle mit unterschiedlicher Stichproben-Framegröße trainiert und getestet (Abbildung 3). Wir verglichen zunächst die RMSE-Werte (Mean Square Error) zwischen den Test- und Trainingsdaten, um zu validieren, wie gut die Modelle Testdaten, mit denen sie nicht trainiert wurden, genau vorhersagen konnten. Dieser Vergleich zeigte, dass sich die Variabilität zwischen den manuell beschrifteten Punkten und den modellbeschrifteten Punkten nach 300 Frames einpendelte. Dieser Trend korrelierte mit den berichteten Durchschnittswerten für die Wahrscheinlichkeit, die sich nach 300 beschrifteten Frames ebenfalls abzuflachen schienen. Wir haben diese berichteten Wahrscheinlichkeitswerte verwendet, um Punkte zu filtern, die kleiner als 0,92 waren. Diese Wahrscheinlichkeitswerte geben an, wie sicher das Modell ist, dass ein bestimmter Punkt auf der Grundlage der Trainingsdaten korrekt beschriftet wurde. Wir haben diese Werte für die Punkte gemittelt, die zur euklidischen Entfernungsmetrik beitragen, um zu untersuchen, wie gut die Modelle im Verhältnis zueinander abschneiden. Es gab zwar keinen signifikanten Unterschied zwischen 300 und 400 Frames, aber wir haben 400 Frames verwendet, weil sie im Durchschnitt über dem Wahrscheinlichkeitswert von 0,95 lagen, der sich unserem Schwellenwert für die manuelle Filterung nähert und mit dem Schwellenwert übereinstimmt, der in ähnlichen Modellen für die Posenschätzung verwendet wird¹⁶.

Eine weitere Möglichkeit, die Genauigkeit des Modells zu validieren, bestand darin, eine Konfusionsmatrix zu erstellen, die manuell annotierte Frames mit DLC-gekennzeichneten Frames verglich. Zwei verblindete Personen kommentierten manuell 300 Bilder desselben Auges in acht Videos. Wir verwendeten diese Daten, um eine Konfusionsmatrix zu erstellen, um Wahr- und Falsch-Positive und Negative zu bewerten (Abbildung 4), wobei manuell bewertete Daten als Grundwahrheit verwendet wurden. Für DLC wurde ein positiver Schielwert aufgezeichnet, wenn der euklidische Abstand weniger als 75 Pixel betrug (d. h. das Tier blinzelt), und ein negativer Wert wurde für Werte über 75 Pixel aufgezeichnet (d. h. das Tier schielen nicht). Wir fanden einen positiven prädiktiven Wert von 96,96 %, d. h. den Prozentsatz der Zeit, die das Modell das Schielen im Vergleich zu einem manuell annotierten Schielen genau vorhersagt. Wir fanden einen negativen Vorhersagewert von 99,66 %, was dem Prozentsatz der Zeit entspricht, in der das Modell kein Schielen im Vergleich zu manuell annotiertem Schielen genau vorhersagt. Diese zeigen den Anteil der negativen und positiven Werte, die korrekt beschriftet wurden. Wir fanden auch eine Richtig-Positiv-Rate von 98,1 % und eine Richtig-Negativ-Rate von 99,46 %, die die genaue Vorhersage des Modells von positiven und negativen Werten im Verhältnis zu allen positiven bzw. negativen Werten darstellen. Unser Matthews-Korrelationskoeffizient (MCC) betrug 93,8 %, was den Korrelationskoeffizienten zwischen beobachteten und vorhergesagten Werten angibt.

Nachdem wir sicher waren, dass unser Modell das Schielen zuverlässig verfolgt, verglichen wir diese DLC-Methode mit einer zuvor veröffentlichten Schiel-Tracking-Methode unter Verwendung eines präklinischen Migräne-Datensatzes¹⁴. Wir bezeichnen diese andere Methode als "Flächenschielmodell (ASM)", da sie unter Verwendung der offenen Augenpartie als kontinuierlicher Messvariabler Schielen¹⁴ entwickelt wurde. Das Flächenschielmodell verwendet eine trainierte Gesichtserkennungssoftware in Kombination mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript, um die mittlere Pixelfläche des Auges zu analysieren, während Frames mit einer Tracking-Fehlerrate von >15 %¹⁴ ausgeschlossen werden. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass das "ASM" nicht Open Source ist und daher nicht allgemein zugänglich ist. DLC ermöglicht eine erhöhte Optimierung und Anpassungsfähigkeit, ohne dass ein erheblicher Kauf von Software und Hardware erforderlich ist.

Wir verwendeten einen Datensatz von 10 weiblichen und 10 männlichen CD1-Mäusen. Experimentell wurden alle Tiere über insgesamt 3 Tage vor Beginn der Aufnahmen 30 min lang in sanften Fesseln akklimatisiert. Jedes Tier wurde für 5 Minuten zu Studienbeginn und dann 5 Minuten für Behandlungsaufzeichnungen aufgezeichnet. Während der Behandlungssitzungen wurden die Tiere entweder mit PBS (Vehikel) oder 0,1 mg/kg CGRP (Behandlung) intraperitoneal behandelt, um einen migräneähnlichen Zustand herbeizuführen. Die Daten wurden in einem gut beleuchteten Raum mit Kameras gesammelt, die mit Infrarotlicht ausgestattet waren, um das Gesicht zu beleuchten und eine genaue Erkennung von Sehenswürdigkeiten zu gewährleisten. Die Infrarotkamera enthielt ein Kowa LM35JC 2/3" 35 mm F1,6 C-Mount-Objektiv mit manueller Blende mit einer Brennweite von 254 mm und einer entsprechend eingestellten Blende. Nachdem wir die Daten gesammelt hatten, nutzten wir ASM und DLC, um die Daten zu analysieren. Da die manuelle Bewertung im Feld üblicherweise zur Quantifizierung von Gesichtsgrimassen verwendet wird, wobei das Schielen eine Komponente der Gesichtsgrimasse¹⁴ ist, haben wir unsere Daten auch mit manuell bewerteten Daten verglichen.

Basierend auf früheren Befunden, dass die periphere Injektion von CGRP bei Mäusen eine Schielreaktion induziert, erwarteten wir, signifikante Unterschiede in der Schielreaktion zwischen Vehikel und CGRP-Behandlung zu beobachten ^6,14. Wir verglichen ASM-, manuelle und DLC-Methoden und stellten fest, dass unser Modell einen Schiel-Phänotyp robust erkannte, ebenso wie die manuelle und die ASM-Methode (Abbildung 5). Es ist wichtig zu beachten, dass das ASM-Modell zur Beurteilung von CGRP-induzierten Schmerzen und Schielen verwendet wurde. In dieser Studie verglichen Rea et al. die Schielreaktion nach CGRP mit der Schielreaktion nach Formalininjektion der Hinterpfote als "traditionelleren" Schmerzinduktionstest¹⁴. Darüber hinaus ist gut dokumentiert, dass CGRP durch die Verwendung von von Frey ^3,17 eine Berührungsüberempfindlichkeit bei Mäusen induziert. In Übereinstimmung mit dem Feld normalisierten wir das durchschnittliche Schielen während der Behandlungssitzung auf einen Ausgangswert von 5 Minuten vor der Behandlung für jedes Tier und verglichen PBS (n = 10) mit CGRP-behandelten (n = 11) Tieren. Die statistischen Analysen der PBS- und der CGRP-behandelten Gruppen sind wie folgt. Wir fanden heraus, dass CGRP-behandelte Tiere eine verringerte mittlere Pixelfläche aufwiesen, indem wir die Flächenschielmethode der Nachverfolgung (p = 0,012, Abbildung 5A) verwendeten und eine verringerte euklidische Distanz aufwiesen, wenn sie manuell bewertet wurden (p = 0,0007, Abbildung 5B) und unser DLC-Modell verwendeten (p = 0,007, Abbildung 5C). Als wir jede Methode im Laufe der Zeit an einem einzigen repräsentativen Tier verglichen, wurde das gleiche Muster beobachtet (Abbildung 5). Dieses Tier zeigte einen sehr deutlichen Schiel-Phänotyp als Reaktion auf die CGRP-Behandlung, aber nicht auf PBS. Alle Modelle waren in der Lage, diese Unterschiede zu erkennen, aber die Daten waren in unserem DLC-Modell am deutlichsten dargestellt (Abbildung 5). Präzise und genaue Metriken sind besonders wichtig, wenn Daten mit feineren Auflösungen analysiert werden müssen, bei denen die Mittelwertbildung nicht auf die vollständige Verhaltensauslesung (z. B. Gehirnaktivität) hinweist. Die DLC-Methode zur Erkennung von Schielen bei Mäusen ermöglicht es uns, Daten auf einer Zeitskala von Millisekunden zu sammeln und sie an Messungen der Gehirnaktivität (z. B. lokale Feldpotentiale) zu binden, die auf einer Zeitskala von Millisekunden auftritt. Wir können diese Technik dann nutzen, um ein robusteres Profil eines Gehirnzustands zu erstellen, der auf spontane Schmerzen im Zusammenhang mit Migräne und anderen komplexen Hirnerkrankungen hinweist.

Abbildung 1: Überblick über die Vorgehensweise zur Generierung eines trainierten Netzwerks mit DLC. Allgemeines Schema des Prozesses, mit dem Augenmerkmale eines Tieres verfolgt und dann mit Hilfe von maschinellem Lernen analysiert werden. Abkürzung: DLC = DeepLabCut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für automatisiertes Schielen-Tracking in einer repräsentativen CD1-Maus. (A) Beispiel für einen Rahmen, der das DLC-Tracking-Schielen (farbige Punkte) auf dem Umriss des Auges während des Behandlungstages zeigt, wenn die Maus nicht blinzelt. (B) Beispiel für einen Rahmen, der die automatische Erkennung von Schielen am Behandlungstag unter Verwendung unseres DLC-Modells zeigt. Die euklidische Distanz wurde anhand des durchschnittlichen Abstands zwischen B und C, den blauen Punkten, am oberen und unteren Rand des Auges gemessen. Die blauen Punkte am oberen und unteren Rand des Auges werden bei der Verfolgung der euklidischen Entfernung verwendet. Die anderen Punkte (grün, gelb, orange, violett) sind einrahmende Orientierungspunkte, die sowohl dem Modell helfen, die euklidischen Entfernungspunkte zu schätzen, als auch die suboptimale Kopfpositionierung nach der Datenerfassung herauszufiltern. Abkürzung: DLC = DeepLabCut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Begründung für die Anzahl der Frames, die zum Trainieren des Modells verwendet werden. (A) Die Analyse des mittleren quadratischen Fehlers gibt den durchschnittlichen Abstand zwischen vorhergesagten und beobachteten Werten für Test- und Trainingsdatensätze an. Der Trainingsdatensatz stellt die Frames dar, die beim Trainieren des Modells abgetastet wurden, und der Testdatensatz stellt die Nicht-Trainingsframes dar, die verwendet werden, um zu überprüfen, wie gut das Modell ähnliche, aber unterschiedliche Bilder identifizieren kann. Wir verwendeten fünf Sätze von Trainings- und Testdaten und stellten fest, dass sich die RMSE-Werte in der Testgruppe bei etwa 300 Frames einpendelten. (B) Die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmter Punkt korrekt beschriftet ist (Mittelwert + SEM). Dabei zeigte sich, dass 400 manuell beschriftete Frames ideal waren, da die Rohdatensätze im Durchschnitt eine Wahrscheinlichkeit von über 0,95 aufwiesen, während sie einen RMSE-Wert aufwiesen, der dem der Trainingsdaten am nächsten kam. Dies bedeutete, dass das Modell in der Lage war, die Punkte, an denen es trainiert worden war, genau zu approximieren und gleichzeitig die meisten Frames mit hoher Wahrscheinlichkeit zu melden. Abkürzung: RMSE = Root-Mean Squared Error. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Konfusionsmatrix für DLC-Schielmessungen. Wir haben 300 s von acht Videos (fünf CGRP und drei PBS) abgetastet und diese Punkte mit einem manuell beschrifteten binären Ja- oder Nein-Wert für Schielen verglichen. Wir quantifizierten die vorhergesagten Werte als diejenigen, die durch DLCs identifiziert wurden, und die tatsächlichen Werte als diejenigen, die manuell von einem Menschen bewertet wurden. Wir haben dies dann mit den manuell bewerteten Daten verglichen, um zu sehen, wie oft das Schielen im Verhältnis zu dem manuell bewerteten binären Ja oder Nein des Schielens korrekt identifiziert wurde. Abkürzungen: DLC = DeepLabCut; CGRP = Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; TP = richtig positiv; FP = falsch positive Ergebnisse; FN = falsch negative Ergebnisse; TN = wahre Negative; PPV = positiver prädiktiver Wert; NPV = negativer prädiktiver Wert; TPR = True-Positive-Rate; TNR = wahre negative Rate; MCC = Matthäus-Korrelationskoeffizient. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Schielen-Phänotyp über drei verschiedene Modelle zur Erkennung von Schielen. Die oberen beiden Zeilen enthalten das gleiche repräsentative Tier mit jeder Erkrankung (PBS oder CGRP) in drei verschiedenen Modellen zur Erkennung von Schielen. Die untere Zeile zeigt die Durchschnittswerte aller Tiere. (A) Es gab eine Abnahme der mittleren Pixelfläche (mittlere Gesamtpixelfläche/Baseline) bei CGRP-behandelten im Vergleich zu PBS-behandelten Mäusen (t(18) = 2,805, p = 0,012) nach Verarbeitung aller Daten unter Verwendung des zuvor veröffentlichten und validierten Flächenschielmodells¹⁴. (B) Eine ähnliche Reaktion gab es bei manuell bewerteten Daten (t(18) = 4,064, p = 0,0007). (C) CGRP-behandelte Mäuse zeigten einen verringerten durchschnittlichen Abstand zwischen Augenlid (euklidischer Abstand der Behandlung/euklidischer Abstand vor der Behandlung, Ausgangswert) als mit PBS behandelte Mäuse (t(18) = 3,040, p = 0,007, wenn DLC zur Verarbeitung aller Daten verwendet wurde. N = 20 (10 Weibchen, 10 Männchen). Fehlerbalken zeigen die mittlere ± SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine leicht zugängliche, detaillierte Methode für die Verwendung von auf maschinellem Lernen basierenden Werkzeugen, die das Schielen mit nahezu menschlicher Genauigkeit differenzieren und gleichzeitig die gleiche (oder bessere) zeitliche Auflösung früherer Ansätze beibehalten können. In erster Linie macht es die Bewertung des automatisierten Schielens einem breiteren Publikum zugänglich. Unsere neue Methode zur Bewertung des automatisierten Schielens weist im Vergleich zu früheren Modellen mehrere Verbesserungen auf. Erstens bietet es eine robustere Metrik als ASM, indem es weniger Punkte verwendet, die tatsächlich zur Quantifizierung des Schielens beitragen. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit von falsch positiven und negativen Ergebnissen verringert, da sich die Analyse bei der Generierung der Werte, die auf Schielen hinweisen, auf weniger Punkte stützt. Mit anderen Worten, das DLC-Modell macht jeden Punkt um das Auge notwendig, aber nicht ausreichend für die Einbeziehung eines Zeitpunkts. Auf diese Weise können wir suboptimale Daten mit der gleichen Anzahl von Punkten wie bei ASM filtern, ohne uns auf die größere Variabilität verlassen zu müssen, die sich aus der Abhängigkeit von so vielen konstituierenden Punkten ergibt. Darüber hinaus haben wir potenzielle menschliche Fehler reduziert, indem wir Modelle entwickelt haben, die sich nicht vollständig auf die Genauigkeit geschulter Personen verlassen.

Bei der Verarbeitung der Daten stellten wir fest, dass unsere Methode suboptimale Punkte und Ausreißerpunkte, die größer waren, als es bei maximaler Größe des Mausauges möglich war, genau filterte (Protokollabschnitt 10). Wir verwendeten Makros, die überprüften, ob jeder der 10 Punkte, die das Auge umgeben, einzeln einen Wahrscheinlichkeitswert von mehr als 0,92 hatten, und filterten alle unterhalb dieses Werts. In Zukunft kann dies angepasst werden, um die verarbeiteten Daten mehr oder weniger selektiv zu machen. Die Makros filterten auch alle euklidischen Entfernungswerte von mehr als 200 Pixeln, da wir festgestellt haben, dass der größtmögliche Abstand zwischen dem oberen und unteren Rand des Auges 150 Pixel beträgt. Dies kann sich je nach Versuchsaufbau ändern müssen. Wenn die Kamera nicht den gleichen Abstand zum Auge hat, kann der Maximalwert deutlich mehr oder weniger betragen. Die Stärke dieser Makros besteht darin, dass sie es uns ermöglichten, Messungen zwischen der Ober- und Unterseite des Auges auf eine Weise zu extrahieren, die davon abhing, dass das Modell eine höhere Wahrscheinlichkeit für alle konstituierenden Punkte um das Auge herum meldete.

DLC und ASM sind beide insofern eingeschränkt, als sie darauf angewiesen sind, dass sich die Maus in einer festen Position in einem vorgegebenen Abstand zur Kamera befindet, um eine konsistente Vergrößerungsskalierung zwischen Ausgangswert und Behandlungsbedingungen zu ermöglichen. Eine Bewegung vom Tier selbst, eine falsche Positionierung innerhalb der Apparatur oder eine Änderung des experimentellen Verfahrens würden also die Fähigkeit des Modells beeinträchtigen, die gesamte Fläche des Auges zu erfassen. Unser Modell verbessert diese Einschränkungen etwas, indem es die euklidische Distanz verwendet, d.h. die Auf- und Ab-Distanz der Augenlänge, die eine verbesserte Nachführung trotz unterschiedlicher Kamerawinkel, Bewegungen vom Tier und experimenteller Variation über verschiedene Sitzungen hinweg ermöglicht, ohne dass eine zusätzliche Neukalibrierung erforderlich ist. Wir erkennen jedoch an, dass Verbesserungen in der Normalisierung zur Berücksichtigung von Kopfbewegungen zu einer noch besseren Verfolgung des Schielens bei sich bewegenden Tieren führen könnten.

Eine weitere Einschränkung unserer Methode besteht darin, dass sie Punkte herausfiltert, an denen der euklidische Abstand gegen Null geht, was das Schließen des Auges bedeutet. Trotz der Filterung dieser signifikanten Faktoren, die zum Schielen beitragen, waren wir immer noch in der Lage, eine CGRP-induzierte Schielantwort robuster zu detektieren als frühere Methoden (p = 0,007). Das Entfernen dieser Komponente des Schielens wird besonders einschränkend, wenn man versucht, mit zusätzlichen interessanten Punkten, wie z. B. der Gehirnaktivität, zu vergleichen. Wir sind der Meinung, dass das Finden von Signifikanz beim Entfernen dieser Punkte die Robustheit dieser Methode zeigt, aber wir erkennen an, dass das Entfernen dieser Komponenten des Schielens nicht ideal ist. Zukünftige Studien, die diese Methode verwenden, sollten eine größere Anzahl von Ausreißer-Frames einbeziehen, um die Modelle besser in der Erkennung von Schielen zu trainieren, wenn es sich Null nähert. Insgesamt könnte die Entwicklung einer Methode zur zuverlässigen Verfolgung des automatisierten Schielens Studien ermöglichen, die darauf abzielen, wichtige Merkmale des natürlich vorkommenden Verhaltens mit seinem Gehirnzustand in Verbindung zu bringen, was eine robuste Untersuchung von Hirnaktivitätsprofilen, z. B. im Zusammenhang mit Migräne, ermöglicht.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CUDA Toolkit 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
Intel-Computer mit Windows 11, 13. Generation
LabFaceX 2D Eyelid Tracker Add-on-Modul für eine frei bewegliche Maus:	FaceX LLC	NA	Jede Kamera, die das Auge eines Tieres aufzeichnen kann, ist ausreichend, aber dies ist unsere Eye-Tracking-Hardware.
NVIDIA GPU-Treiber der Version 450.80.02 oder höher
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA[	490-BHXV]	Jede GPU, die die für Ihre DLC-Version angegebenen Mindestanforderungen erfüllt, derzeit 8 GB, ist ausreichend. Wir haben NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow Version 2.10