Verwendung eines Thermal-Shift-Assays zur Untersuchung der Substratbindung an das Selenoprotein O

Summary

Hier stellen wir den Thermal Shift Assay vor, eine fluoreszenzbasierte Hochdurchsatztechnik, mit der die Bindung kleiner Moleküle an interessante Proteine untersucht wird.

Abstract

Die Definition der biologischen Bedeutung von Proteinen mit unbekannten Funktionen stellt ein erhebliches Hindernis für das Verständnis zellulärer Prozesse dar. Obwohl bioinformatische und strukturelle Vorhersagen zur Untersuchung unbekannter Proteine beigetragen haben, werden experimentelle In-vitro-Validierungen oft durch die optimalen Bedingungen und Cofaktoren erschwert, die für die biochemische Aktivität erforderlich sind. Die Cofaktorbindung ist nicht nur für die Aktivität einiger Enzyme unerlässlich, sondern kann auch die thermische Stabilität des Proteins verbessern. Eine praktische Anwendung dieses Phänomens besteht darin, die Änderung der thermischen Stabilität, die durch Änderungen der Schmelztemperatur des Proteins gemessen wird, zu nutzen, um die Ligandenbindung zu sondieren.

Der Thermoshift-Assay (TSA) kann verwendet werden, um die Bindung verschiedener Liganden an das interessierende Protein zu analysieren oder einen stabilisierenden Zustand für die Durchführung von Experimenten wie der Röntgenkristallographie zu finden. Hier werden wir ein Protokoll für TSA beschreiben, das die Pseudokinase Selenoprotein O (SelO) für eine einfache Hochdurchsatzmethode zum Testen der Metall- und Nukleotidbindung verwendet. Im Gegensatz zu kanonischen Kinasen bindet SelO ATP in umgekehrter Orientierung, um den Transfer von AMP auf die Hydroxylseitenketten von Proteinen in einer posttranslationalen Modifikation, der sogenannten Protein-AMPylierung, zu katalysieren. Indem wir die Verschiebung der Schmelztemperaturen nutzen, liefern wir entscheidende Einblicke in die molekularen Wechselwirkungen, die der SelO-Funktion zugrunde liegen.

Introduction

Ein Großteil des menschlichen Proteoms ist nach wie vor schlecht charakterisiert. Der von Dunham und Kustatscher et al. beschriebene "Straßenlaterneneffekt" bezieht sich auf das Phänomen, bei dem umfangreich erforschten Proteinen mehr Aufmerksamkeit geschenkt wird und wenig untersuchte Proteine übersehen werden ^1,2. Zu diesem Effekt tragen unter anderem die biologische Bedeutung und die Krankheitsrelevanz bestimmter Proteine bei. Darüber hinaus stimulieren frühere Forschungen, die grundlegendes Wissen bieten, sowie die Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Funktionsanalyse die Forschung an hoch untersuchten Proteinen^{weiter 1,2}. Projekte wie die Understudy Proteins Initiative, das Structural Genomics Consortium und die Enzyme Function Initiative zielen darauf ab, wenig untersuchte Proteine mit Hilfe der strukturellen und funktionellen Proteomik zu charakterisieren ^2,3,4. Ein komplementärer Ansatz zur Identifizierung der molekularen Funktionen von wenig untersuchten Proteinen besteht darin, die Wechselwirkungen dieser Proteine mit kleinen Molekülen zu untersuchen, um wertvolle Einblicke in die Regulation und Substratspezifität zu gewinnen.

Die Bindung kleiner Moleküle kann die thermische Stabilität eines Proteins erhöhen⁵. Dieses Phänomen, das als ligandeninduzierte Konformationsstabilisierung bezeichnet wird, führt häufig zu einem Anstieg der Schmelztemperatur eines Proteins, was einen messbaren Hinweis auf die Ligandenbindung liefert⁶. Die thermische Stabilität eines Proteins kann mit der Differential Scanning Fluorimetrie (DSF), auch bekannt als Thermofluor, oder dem Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10 gemessen werden. Bei der TSA wird eine Proteinprobe in Gegenwart eines umweltempfindlichen Farbstoffs⁶ steigenden Temperaturen ausgesetzt. Während sich das Protein entfaltet und denaturiert, bindet der Farbstoff an die freiliegenden hydrophoben Bereiche des Proteins und emittiert Fluoreszenz. Extrinsische Fluoreszenzfarbstoffe oder umweltempfindliche Farbstoffe haben keine intrinsische Fluoreszenz und fluoreszieren stattdessen bei Wechselwirkung mit ihrem Zielmolekül ^9,11,12. Der am häufigsten verwendete Farbstoff, SYPRO Orange, bietet mehrere Vorteile wie erhöhte Stabilität und minimale Hintergrundfluoreszenz ^8,9,12. Insbesondere ist SYPRO Orange aufgrund seiner Anregungs- und Emissionswellenlängen um 470 nm bzw. 570 nm mit Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionssystemen (RT-PCR) kompatibel. Diese einzigartige Funktion ermöglicht genaue, und empfindliche Messungen mit hohem Durchsatz, die mit Fluoreszenzdetektionssystemen kompatibel sind, die üblicherweise in RT-PCR-Systemen verwendet^{werden 8}.

TSA ist ein vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung von Proteininteraktionen mit potenziellen Cofaktoren oder Medikamenten und zur Identifizierung stabilisierender Bedingungen für die Kristallographie. Zu den Vorteilen gegenüber anderen Screening-Methoden gehören die relativ einfache Einrichtung und der hohe Durchsatz mit 96- oder 384-Well-Platten 13,14,15. Die Entwicklung dieser Technik war für Studien zur Wirkstoffforschung transformativ, da sie Komfort bietet und die Untersuchung verschiedener Zusatzstoffe wie Ionen, Liganden und Arzneimittel ermöglicht ^6,16. Darüber hinaus hat die Anpassungsfähigkeit von TSA die Wissenschaftler dazu ermutigt, seinen Nutzen zu erweitern und die Messung von Bindungsaffinitäten neben den Screening-Assays zu erleichtern^17,18. TSA ist ein wirksames Werkzeug in strukturbiologischen Studien, um Bedingungen zu identifizieren, die die Stabilisierung des für die Kristallisation interessierenden Proteins fördern¹⁹. Daher haben seine Flexibilität und relative Leichtigkeit TSA als Eckpfeiler bei der Charakterisierung von Proteinen positioniert. Hier werden wir TSA verwenden, um die Bindung von Metallen und Nukleotiden an die wenig untersuchte Pseudokinase Selenoprotein O (SelO) als Beispiel zu analysieren.

Kinasen sind eine der am häufigsten angegriffenen Proteinfamilien in der Wirkstoffforschung²⁰. Es wird prognostiziert, dass etwa 10 % der menschlichen Kinasen inaktiv sind und als Pseudokinasen bezeichnet werden, da ihnen wichtige katalytische Rückstände fehlen, die für die Katalyse erforderlich sind^21,22. Selenoprotein O (SelO) ist eine evolutionär konservierte Pseudokinase, der das konservierte Aspartat im katalytischen HRD-Motiv fehlt²³. In Eukaryoten ist SelO in den Mitochondrien lokalisiert und schützt die Zellen vor oxidativem Stress ^24,25. Strukturelle und biochemische Analysen zeigen, dass SelO Adenosinmonophosphat (AMP) von ATP auf Proteinsubstrate in einer posttranslationalen Modifikation überträgt, die als AMPylierung²⁵ bekannt ist. Neuere Studien deuten darauf hin, dass Enzyme, die die AMPylierung katalysieren, alternative Nukleotide wie UTP in vitro binden können ^26,27. Insbesondere haben Studien gezeigt, dass das SelO-Homolog aus Salmonella typhimurium die Protein-UMPylierung oder den Transfer von UMP auf manganabhängige Weise katalysiert²⁸. Angesichts dieser faszinierenden Beobachtungen testen wir die Bindung von SelO an ATP und UTP in Gegenwart von Magnesium und Mangan, was als repräsentatives Beispiel für die Anwendungen von TSA dient. Das folgende Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Wechselwirkungen anderer Proteine und Zusatzstoffe von Interesse zu optimieren und zu untersuchen.

Protocol

1. Versuchsaufbau

1. Verwenden Sie einen Thermocycler, der Fluoreszenz nachweisen kann, z. B. ein RT-PCR-Gerät, um das beschriebene Protokoll durchzuführen. Wenn Sie SYPRO Orange verwenden, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwenden Sie einen Scan-Modus, der eine Anregung um 470 nm und eine Emissionsdetektion um 570 nm ermöglicht. Programmieren Sie den Thermocycler so, dass er die Probe 2 Minuten lang bei 20 °C hält, gefolgt von einem Temperaturanstieg von 0,5 °C/1 min auf 95 °C; Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle 1 °C.
   HINWEIS: Wir empfehlen einen optionalen Schritt am Ende des Zyklus, um den Probenblock wieder auf 20 °C zu bringen (Abbildung 1).
2. Jede Reaktion enthält vier Komponenten: Puffer, Protein of Interest, Additiv und extrinsischer Fluoreszenzfarbstoff. Gestalten Sie das Experiment so, dass es Kontrollen wie kein Protein, kein Farbstoff, Protein ohne Zusatzstoffe und nur Zusatzstoffe enthält, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, die die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen könnte. Falls verfügbar, fügen Sie eine Positivkontrolle hinzu, z. B. ein Additiv, von dem bekannt ist, dass es das interessierende Protein bindet und stabilisiert.
3. Verwenden Sie gereinigtes Protein für den Assay. Um diesem Beispiel zu folgen, verwenden Sie E. coli SelO, exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben^25,29. Kurz gesagt, exprimieren Sie His-Sumo-markiertes SelO (E. coli SelO ppSumo) in Rosetta DE3-Zellen und reinigen Sie es mit Ni²⁺-NTA-Affinität. Spalten Sie den His-Sumo-Tag mit Hilfe der Ulp-Protease und reinigen Sie SelO durch Gelfiltrationschromatographie weiter.
4. Die Fluoreszenz von SYPRO Orange hängt von seiner Wechselwirkung mit dem interessierenden Protein ab. Da diese Wechselwirkungen von Protein zu Protein unterschiedlich sind, optimieren Sie die Protein- und Farbstoffkonzentration, um das maximale Signal-Rausch-Verhältnis des Fluoreszenzsignals zu erhalten.
   HINWEIS: SYPRO Orange ist nicht kompatibel mit einigen Proteinen und Zusatzstoffen wie z.B. Reinigungsmitteln^11,30. Zusätzliche extrinsische Farbstoffe, die unter ^{Nummer 12} aufgeführt sind, können bei Bedarf gescreent werden.

2. Bestimmung der optimalen Farbstoffkonzentration (Abbildung 2A)

1. Bereiten Sie 20-μl-Verdünnungen von 50x, 40x, 30x, 20x und 10x SYPRO Orange aus der Stammlösung vor, die mit 5.000x in DMSO bereitgestellt wird.
2. Geben Sie 8 μl 6,25 μM Protein, verdünnt in TSA-Puffer, in sechs separate Vertiefungen einer 384-Well-PCR-Platte.
   HINWEIS: In unserem Beispiel haben wir den folgenden TSA-Puffer verwendet, um die Verdünnungen durchzuführen: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl und 1 mM DTT. Die Proben können in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu verbessern.
3. Geben Sie 1 μl TSA-Puffer in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Dieses Puffervolumen wird nach Optimierung der Farbstoff- und Proteinkonzentration durch die Zugabe kleiner Moleküle ersetzt.
4. Geben Sie 1 μl jeder seriellen Verdünnung der SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung. Geben Sie 1 μl Puffer ohne Farbstoff in die letzte Vertiefung, um die farbstofffreie Kontrolle zu gewährleisten.
5. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
6. Schleudern Sie die Platte 1 Minute lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
7. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

3. Bestimmung der optimalen Proteinkonzentration (Abbildung 2B)

1. Bereiten Sie 20 μl serielle Verdünnungen von 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM und 1,56 μM Protein unter Verwendung von TSA-Puffer (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl und 1 mM DTT) vor.
2. Geben Sie 8 μl serielle Verdünnungen des Proteins in fünf separate Vertiefungen einer 384-Well-Platte.
3. Geben Sie den Puffer nur in der 6^. Mulde gut ab, da keine Proteinkontrolle vorhanden ist.
4. Geben Sie 1 μl TSA-Puffer in jede Vertiefung.
   HINWEIS: Dieses Puffervolumen wird nach Optimierung der Farbstoff- und Proteinkonzentration durch die Zugabe kleiner Moleküle ersetzt.
5. Geben Sie 1 μl jeder 50x SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung.
6. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
7. Schleudern Sie die Platte 1 min lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
8. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

4. Einrichten eines TSA-Experiments (Abbildung 3A)

HINWEIS: Nach der Optimierung der Protein- und SYPRO Orange-Farbstoffkonzentrationen kann der Assay unter Zugabe der gewünschten kleinen Moleküle durchgeführt werden, um die Bindung zu analysieren.

1. Definieren Sie die Anzahl der Bedingungen unter Berücksichtigung der Replikate und der entsprechenden Kontrollen.
   HINWEIS: Zum Beispiel werden wir die Bindung von SelO an acht Bedingungen in dreifacher Ausfertigung testen. Einschließlich der Kontrollen (kein Zusatzstoff, kein Protein und kein Farbstoff) haben wir 11 Reaktionen x 3 (dreifach) = 33 Gesamtreaktionen.
2. Basierend auf der optimalen Konzentration von Protein und Farbstoff, die für SelO beobachtet wurde, stellen Sie sicher, dass jede Reaktion 8 μl 6,25 μM Protein, 1 μl Additiv und 1 μl 50x SYPRO Orange Farbstoff enthält, was einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μl entspricht. Die verwendete Endkonzentration beträgt also 5 μM Protein und 5x SYPRO Orange Farbstoff.
3. Bereiten Sie 288 μl 6,25 μM Proteinlösung mit TSA-Puffer vor. Dieses Volumen der Proteinarbeitslösung macht 36 Reaktionen aus (33 Reaktionen mit zusätzlichen 10 % für Variationen beim Pipettieren).
4. Geben Sie 8 μl 6,25 μM Protein in separate Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Dosieren Sie Puffer nur für die Null-Protein-Kontrolle.
5. Fügen Sie 1 μl kleine Moleküle in 10-facher Konzentration hinzu, um das endgültige 1-fache zu erreichen. Um diesem Beispiel zu folgen, fügen Sie 1 μl 20 mM MgCl₂ hinzu, um eine Endkonzentration von 2 mM zu erreichen. Dosierpuffer nur für die No-Additiv-Steuerung.
6. Geben Sie 1 μl jeder 50x SYPRO Orange Farbstofflösung in jede Vertiefung.
7. Decken Sie die Platte mit optisch klarer Klebefolie ab.
8. Schleudern Sie die Platte 1 min lang kurz bei 1.000 × g in einer Zentrifuge, die mit einem PCR-Plattenadapter ausgestattet ist.
9. Legen Sie die Platte in ein RT-PCR-Gerät und starten Sie das in Schritt 1.1 beschriebene Thermocycling-Protokoll.

5. Datenanalyse

1. Exportieren Sie Daten aus dem RT-PCR-Gerät für relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) in Bezug auf die Temperatur (°C).
2. Verwenden Sie die Software Ihrer Wahl, um Datenpunkte bis zur höchsten gemessenen Intensität für jede Schmelzkurve zu extrahieren und darzustellen. Wichtig ist, dass Sie bestätigen, dass die Kontrollen ohne Protein und ohne Farbstoff eine geringe Hintergrundfluoreszenz ohne temperaturabhängigen Anstieg der Fluoreszenz aufweisen (Abbildung 3A, B und ergänzende Tabelle S1). Führen Sie Datenanalysen mit frei zugänglicher Software wie MoltenProt³¹ oder DSFWorld³² durch.
3. Bestimmen Sie die Schmelztemperatur mit Boltzmann Sigmoidal Fit für die Daten. Die Schmelztemperatur (T_m) ist definiert als die Temperatur, bei der eine Denaturierung von 50 % oder die halbe maximale Intensität beobachtet wird (Abbildung 3C).
4. Eine thermische Verschiebung in der Schmelzkurve kann auf stabilisierende oder destabilisierende Additive hindeuten. Um die Änderung der Schmelztemperatur (T_m) zu berechnen, verwenden Sie die Formel: T_m = T_m additiv _- T_m Puffer. Ein positiver Wert beschreibt einen stabilisierenden Zustand oder ein wechselwirkendes Additiv; ein negativer Wert beschreibt einen destabilisierenden Zustand (Abbildung 3D).

Results

Eukaryotisches SelO besteht aus einer N-terminalen mitochondrialen Targeting-Sequenz, einer Kinase-ähnlichen Domäne und einem hochkonservierten Selenocystein am C-Terminus des Proteins²³. Dieses mitochondriale Enzym kodiert für eine Pseudokinase-Domäne, die von Bakterien auf den Menschen übertragen wurde²³. Die Strukturanalyse des SelO-Homologs aus Pseudomonas syringae ergab Aminosäureveränderungen im aktiven Zentrum, die die Bindung von ATP in umgekehrter Orientierung im Vergleich zu kanonischen Kinasen erleichtern²⁵. Dementsprechend katalysiert SelO die AMPylierung anstelle der Phosphorylierung mehrerer Proteine, die an der antioxidativen Signalübertragung beteiligt sind, um die Zellen vor oxidativen Schäden und Zelltod zu schützen²⁵. Zusätzlich zur AMPylierung wurde gezeigt, dass einige prokaryotische und eukaryotische AMPylasen die UMPylierung katalysieren^27,28.

Wir verwendeten gereinigtes rekombinantes E . coli SelO in TSA, um die Bindung von ATP- und UTP-Nukleotiden an SelO in Gegenwart von zweiwertigen Kationen zu untersuchen. Ähnlich wie kanonische Kinasen beherbergt SelO das DFG-Motiv, bei dem das Aspartat das Metallion an das koordinierende Nukleotid im aktiven Zentrum bindet. Zunächst optimierten wir die Konzentration von Protein und Farbstoff für robuste Fluoreszenzmessungen in TSA und stellten fest, dass 5 μM bis 10 μM E. coli SelO mit 5x SYPRO Orange optimal waren (Abbildung 2). Darüber hinaus zeigten wir, dass sowohl die No-Protein- als auch die No-Dye-Kontrollen ein niedriges Fluoreszenzsignal aufwiesen, das nicht auf den Temperaturanstieg reagierte. Wir stellten einen Anstieg der thermischen Stabilität von E. coli SelO um etwa +4 °C bzw. +12 °C in Gegenwart von ATP-Mg²⁺ bzw. ATP-Mn²⁺ fest (Abbildung 3). Wir beobachteten jedoch keine Verschiebung der thermischen Stabilität nach der Inkubation mit UTP, was darauf hindeutet, dass E. coli SelO möglicherweise keine nachweisbare Bindung an UTP zeigt.

Abbildung 1: Aufbau des Thermocyclers. Ein Beispiel für das Thermocycler-Programm, das verwendet wird, um die Probentemperatur um +0,5 °C/min zu erhöhen, während die SYPRO Orange-Fluoreszenz über den FRET-Kanal gemessen wird. Die Empfehlung beinhaltet auch eine Inkubation bei Umgebungstemperatur zu Beginn und am Ende des Protokolls. Abkürzung: FRET = Förster Resonanz-Energie-Übertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Optimierung der Protein- und Farbstoffkonzentrationen. (A) Repräsentative Ergebnisse der Optimierung der SYPRO Orange Farbstoffkonzentration mit 5 μM Escherichia coli SelO. (B) Repräsentative Ergebnisse der Optimierung der E. coli SelO-Konzentration mit dem 5x SYPRO Orange Farbstoff. Die thermische Denaturierungskurve stellt die relativen Fluoreszenzeinheiten (y-Achse) in Bezug auf die Temperatur (x-Achse) dar. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Thermische Denaturierungskurven und ΔT_m-Analysen von SelO in Gegenwart von Nukleotiden und zweiwertigen Kationen. (A) Rohdaten der thermischen Denaturierungskurven von Proben (5 μM Escherichia coli SelO in Gegenwart von 200 μM ATP oder UTP und 2 mM zweiwertige Kationen, 5x SYPRO Orange), die von der RT-PCR-Maschine exportiert und aufgetragen wurden. SelO ATP-Mg repräsentiert Proben mit SelO, ATP und MgCl₂, SelO ATP-Mn repräsentiert Proben mit SelO, ATP und MnCl₂, SelO UTP-Mg repräsentiert Proben mit SelO, UTP und MgCl₂, SelO UTP-Mn repräsentiert Proben mit SelO, UTP und MnCl₂. Beachten Sie, dass die Kontrollen ohne Farbstoff und ohne Protein eine geringe Fluoreszenz aufweisen. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). (B) Thermische Denaturierungskurven, die bis zur höchsten Intensität aufgetragen wurden und mit der Boltzmann-Sigmoidalgleichung übereinstimmen. Obwohl die thermische Denaturierung von SelO nicht durch UTP beeinflusst wurde, beobachteten wir eine deutliche Verschiebung der thermischen Denaturierung in Gegenwart von ATP (violette Kurven). Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). (C) Histogramm mit Darstellung der _T-m-Werte, abgeleitet aus der sigmoidalen Boltzmann-Anpassung der in Abbildung 3B dargestellten Daten. Die Ergebnisse stellen den mittleren ± SD aus dreifachen Vertiefungen dar (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogramm, das die Änderung der Schmelztemperatur ΔT_m darstellt (T_m additiv _- T m Puffer). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle S1: Beispieldaten für TSA von SelO in Gegenwart von Metallen und Nukleotiden. Tabelle mit Rohdaten, die vom RT-PCR-Gerät exportiert wurden, und Daten, die verarbeitet wurden, um Werte nach maximaler RFU-Intensität zu löschen, wie in den Protokollschritten 5.1 und 5.2 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Der Thermal Shift Assay (TSA) dient als effiziente Methode zum Screening von Protein-Liganden-Wechselwirkungen, einschließlich solcher mit Cofaktoren und Inhibitoren. In diesem Protokoll haben wir TSA verwendet, um die Bindung der Pseudokinase SelO an Nukleotide und zweiwertige Kationen zu messen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass SelO in Gegenwart von ATP und Mg²⁺/Mn²⁺ eine erhöhte thermische Stabilität aufweist. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Berichten überein, die darauf hindeuten, dass SelO-Homologe von E. coli, S. cerevisiae und H. sapiens den Transfer von AMP von ATP auf die Hydroxylseitenkette von Proteinsubstraten katalysieren^25,29. Obwohl TSA wertvolle Einblicke in die Nukleotidbindung liefert, identifiziert es das In-vivo-Substrat möglicherweise nicht. Auch andere Moleküle, nicht nur das Substrat, können die thermische Stabilität eines Proteins beeinflussen. Um ein Substrat genau zu identifizieren, müssen Faktoren wie die zelluläre Konzentration und die Bindungsaffinität berücksichtigt werden. Nichtsdestotrotz ist TSA ein hervorragendes Werkzeug für das Screening einer Vielzahl von Bedingungen, wie z. B. die Bindung kleiner Moleküle, wobei die thermische Stabilisierung als Auslesung verwendet wird.

Der Nutzen von TSA geht über seine Anwendung bei der Analyse der Bindung kleiner Moleküle an aktive oder regulatorische Stellen von Proteinen hinaus. Die TSA hat wesentlich zur biophysikalischen Charakterisierung von Proteinen beigetragen, indem sie stabilisierende Bedingungen geschaffen hat, die das Protein für Kristallographie-Experimente förderlicher machen. Insbesondere bietet TSA mehrere Vorteile, darunter die einfache Einrichtung und den hohen Durchsatz mit allgemein verfügbaren Labormaterialien wie PCR-Platten und RT-PCR-Geräten. Diese Vorteile ermöglichen das Testen zahlreicher Bedingungen, die mit anderen Techniken möglicherweise nicht realisierbar oder nicht so einfach sind. In mehreren Studien wurde TSA verwendet, um die thermische Stabilität rekombinanter Proteine mit einer Bibliothek von Verbindungen zu messen, um die optimalen Bedingungen für die Proteinkristallisation zu bestimmen^19,33.

Die Einbeziehung geeigneter Kontrollen ist notwendig, um eine Fehlinterpretation der Schmelzkurven zu vermeiden, wobei die Autofluoreszenz von den Platten oder Additiven ein häufiges Problem darstellt. TSA ist möglicherweise nicht für Verbindungen geeignet, die eine Autofluoreszenz aufweisen oder die Fluoreszenz von SYPRO-Orange unterdrücken. Eine mögliche Lösung besteht darin, alternative Farbstoffe, die unter ^{Nummer 12} beschrieben sind, zu screenen. Das hier skizzierte TSA-Protokoll kann leicht für andere Proteine und Zusatzstoffe von Interesse angepasst werden. Die Additive sind nicht nur auf wasserlösliche Verbindungen beschränkt, wie unser Protokoll mit Nukleotiden und zweiwertigen Kationen zeigt. Stattdessen können Additive eine breite Palette von Bedingungen umfassen, wie z. B. unterschiedliche pH-Werte, Liganden oder in DMSO⁸ solubilisierte Medikamente. Darüber hinaus kann die Vorinkubation des Liganden mit dem Protein reproduzierbarere Ergebnisse liefern, indem Interferenzen und Artefakte durch den Farbstoff reduziert werden. Zusatzstoffe wie Lipide und Detergenzien können aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit SYPRO Orange zu einer hohen Fluoreszenz führen. Ein Beispiel für eine Denaturierungskurve ist in Abbildung 3A dargestellt, die eine niedrige Hintergrundfluoreszenz gepaart mit einem signifikanten Anstieg der Fluoreszenz bei thermischer Denaturierung des Proteins darstellt. Die optimale Konzentration von Farbstoff und Protein ergibt das maximale Signal-Rausch-Verhältnis bei gleichzeitiger Beibehaltung eines konsistenten Fluoreszenzsignals über alle Replikate hinweg.

TSA bietet mit seinen minimalen Komponenten den Vorteil der Einfachheit, wodurch die Anzahl der Variablen für die Optimierung reduziert wird. Zu den entscheidenden Schritten gehört die Bestimmung der optimalen Konzentrationen sowohl des Farbstoffs als auch des Proteins. Es ist wichtig zu beachten, dass TSA gereinigtes, "wohlerzogenes" Protein benötigt. Das Protein und der Zusatzstoff müssen im Puffer bei den in TSA verwendeten Konzentrationen stabil sein. Proteine oder Bedingungen, die zur Aggregation oder Oligomerisierung neigen, können zu fehlerhaften Fluoreszenzmesswerten führen. Aggregierte oder ungefaltete Proteine können anfangs eine hohe Fluoreszenz aufweisen, die bei der Denaturierung nur geringfügig ansteigt. Die Oligomerisierung von Proteinen kann auch zu mehreren Übergangszuständen führen, was die Analyse^{erschwert 10}. Die Proteinkonzentration kann fein abgestimmt werden, um eine Aggregation zu verhindern.

TSA ist mit einer Vielzahl von Puffern und Salzen kompatibel, was eine Optimierung der stabilisierenden Bedingungen für das Protein und das Additiv^{ermöglicht 11}. Die Volumina des Proteins und der Additivlösungen können angepasst werden, um die Einschränkungen der Protein- und Additivkonzentrationen zu überwinden. Zum Beispiel könnten niedrigere Konzentrationen des Additivs wie 5x anstelle der 10x-Lösung verwendet werden, die in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wurde. Insbesondere ist die relative Menge an Protein und Additiv, die für die Durchführung des Assays erforderlich ist, gering, da die 384-Well-PCR-Platten Volumina von nur 10 μl der Gesamtprobe aufnehmen können.

Aufgrund der Stärken von TSA ist es ideal für die Untersuchung von wenig untersuchten Proteinen wie Pseudokinasen. Pseudoenzyme sind katalytisch inaktive Proteine, die strukturell homolog zu aktiven Enzymen sind³⁴. Neuere strukturelle und biochemische Studien haben gezeigt, dass einige wenige Pseudoenzyme aktive Enzyme sind, während die meisten nicht-katalytische Funktionen haben^35,36. Obwohl sie katalytisch inaktiv sind, sind Pseudoenzyme an verschiedenen Krankheiten beteiligt und spielen eine wichtige Rolle, einschließlich Gerüstbau und allosterischer Modulation³⁷. Der Wirkmechanismus und die funktionelle Bedeutung vieler Pseudoenzyme sind jedoch unbekannt. Die Aktivitäten einiger Pseudoenzyme werden durch Ligandenbindung reguliert, was zu einer erhöhten thermischen Stabilität führt, die mit Konformationsänderungen des Proteins¹⁴ verbunden ist. Wir schlagen vor, dass TSA ein wertvolles Werkzeug ist, um die Bindung von Liganden an Pseudoenzyme zu untersuchen, um den optimalen Liganden für die funktionelle Aktivität zu bestimmen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosin-5′-triphosphat-Dinatriumsalzhydrat	Sigma Aldrich	A2383-10G	wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist aber für die Durchführung nicht erforderlich TSA
Avanti J-15R mit Mikroplatten-Trägerbaugruppe	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 Real-time PCR System	Bio-Rad	12011452
Hartschale 384-Well PCR Platten, dünnwandig, umrandet, klar/weiß	Bio-Rad	HSP3805
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266-100G	wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist jedoch nicht erforderlich, um TSA
Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat	Sigma Aldrich	M3634-500G	wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist jedoch nicht erforderlich, um TSA
Microseal 'B' PCR-Plattenversiegelungsfolie, selbstklebend, optisch	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Orange Protein Gel Färbung	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Uridin 5′-Triphosphat Trinatriumsalzhydrat	Sigma Aldrich	U6625-100MG	wird für repräsentative Ergebnisse verwendet, ist aber für die Durchführung von TSA nicht erforderlich