Methodenartikel

Strukturgesteuertes Design und Entwicklung neuartiger Cyclophilin-A-Inhibitoren und Ganoderiol-F-Derivate: Ein In-Silico-Ansatz

DOI:

10.3791/67145

⸱

23. Juni 2026

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2BBR Pty Ltd

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll für das strukturgesteuerte Design der Protein-Ligand-Bindungsinteraktion zwischen Sanglifehrin A und Cyclophilin A/Ganoderiol-F vor, das für die Entdeckung neuer Medikamente unerlässlich ist. Die Stabilität des Ligandenrezeptorkomplexes wurde mittels molekularer Dynamiksimulation bewertet.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Achse des Cyclin Ds-CDK (Cyclophilin A (Cyp / Ganoderiol F)) spielt eine entscheidende Rolle bei Krebs durch verschiedene Prozesse, wie die Kontrolle der Proliferation und die Hemmung von Krebszellen. Ganoderiol F-Derivate können als onkogene Ziele für mehrere Krebsarten dienen. Diese Studie zeigte, dass das strukturgesteuerte Design und die Entwicklung neuartiger Cyp-A-Inhibitoren und Ganoderiol-F-Derivate genutzt werden können, um berechnete Positionen für eine erhöhte Wirksamkeit chemischer Inhibitoren und deren Interaktion mit den gewählten Rezeptoren auszuwählen. Für diesen Ansatz wurden zahlreiche Softwareanwendungen eingesetzt, um optimale molekulare Wechselwirkungen zu erreichen. Insgesamt wurden 117 neuartige Cyclophilininhibitor-Ligandmoleküle mit der Software Chemsketch konstruiert. Die konvertierten PDB-Dateien der neuartigen Cyp-A-Inhibitor-Liganden wurden für die Einführung in den Sanglifehrin-A-Enzymrezeptor vorbereitet. Liganden-Protein-Andock-Interaktionen wurden mit der AutoDock 4.2.6-Software durchgeführt, um die besten geometrischen Wechselwirkungen zu enthüllen. Die Andockbestätigungen wurden mit der Software PyMOL 2.5 durchgeführt. Schließlich wurden Wasserstoffbrücken mit Chimera- und Maestro-Software nachgewiesen. Der ausgewählte Ligandenrezeptor-angedockte Komplex wurde einer molekulardynamischen Simulation unterzogen. Der MD-Simulationsprozess demonstrierte die Stabilität des Komplexes und zeigte, dass der gewählte Ligand als Medikamentenhemmer für Krebszellen eingesetzt werden kann. In den Ergebnissen wurden die aktiven Aminosäuren in der Bindungsstelle als Arginin 55 identifiziert, das in Bewegung von 1,53 Å, Asparagin (Asn), Glycin (Gly), Threonin (Thr), Lysin (Lys), Isoleucine (Iso), Histidin (Hid), Phenylalanin (Phe) und Cystein (Cys) mit der höchsten Anzahl an Wasserstoffbrückenliganden mit 45 Hydroxymangiferonen besitzt. Das verband sich mit dem 1nmk-Rezeptor in der Gitterbox-Koordinate X 38,86, Y von 10,987 und Z von 40,734. Die Bewertung des 1nmk-Rezeptor-Ligandenkomplexes in der Molekulardynamik (MD) in Gromacs Version des CHARMM-36-Kraftfelds hat optimale Grade.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyclophilin A ist ein starker Inhibitor des humanen Cyp A. Cyclophilin ist ein robuster Inhibitor, der das Immunsystem nicht beeinträchtigt, bessere pharmakologische Eigenschaften besitzt und die Transporterhemmung reduziert. Eine schlechte Prognose wurde mit der Überexpression von Cyclophilinen in Verbindung gebracht, einer Familie von Proteinen mit Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität1. Cyclophiline wurden in zahlreichen Krebsarten, darunter auch hepatozelluläres Karzinom, als überexprimiert. Beim hepatozellulären Karzinom (HCC) sind Cyclophiline sowohl für die Krebsmedikamentenresistenz als auch für die Proliferation von entscheidenderBedeutung 2. Die Hemmung erhält wichtige Informationen, um neue Immunsuppressoren auf Basis von Quinoxalinderivaten zu identifizieren, indem atomare Molekulardockung und MD-Simulation eingesetzt werden, um die genaue Bindungsstelle von DC838 an Cyp A3 zu bestimmen.

Darüber hinaus zeigte in vivo Forschung, dass Cyclophilin DC838 die durch Konanavalin induzierte Mausmilzzellproliferation verhindert. Mehrere Studien haben eine Reihe makrozyklischer Cyclophilin-Inhibitoren berichtet, die auf Basis von Sanglifehrin A (SFA), einernatürlichen Substanz, synthetisiert wurden. Die anfängliche Verbindungsoptimierung zeigte, dass die Hydroxylgruppe des m5-Tyrosinrests, die Stereozentren bei C14 und C15 sowie das Valin5m5tyrosin5piperazinsäure-Tripeptid im Sanglifehrin-Kern wesentliche Faktoren für die Potentieder Verbindung 5 waren. Die C185C21 Dien-Einheit von SFA könnte durch eine Styrylgruppe ersetzt werden, um potente Verbindungen zu erzeugen, die einen neuartigen Bindungsmodus zeigen, bei dem die Styrengruppe über eine Stacking-Wechselwirkung mit Arginin (Arg)556 von Cyp A wechselwirkt. Nicht-immunsuppressive Cyclophilin-Inhibitoren sind wirksam bei der Behandlung des Hepatitis-C-Virus. CyclosporinA1, Alisporivir und die meisten anderen Cyclosporine sind starke Hemmer von MRP2, MDR1, OATP1B1 und anderen wichtigen Arzneimitteltransportern 7,8.

Andererseits bremst Ganoderiol F, gereinigt aus Ganoderma leucocontextum, den Zellzyklusfortschritt durch Hemmung von CDK4/CDK6-9-Cyclinen, und cyclinabhängige Kinasen (CDKs) sind entscheidend für die Kontrolle des Säugetierzellzyklus. Cyclin D-CDK4/CDK6 und Cyclin E-CDK2 sind die entscheidenden Akteure bei der Kontrolle des Zellzyklusverlaufs durch Ganoderiol F. Daher könnte Ganoderiol F als potenzieller CDK4/CDK6-Inhibitor in der Behandlung von Brustkrebs10,11 eingesetzt werden. FA hemmt die G1-Phase des Zellzyklus, was das Wachstum von M-CSF-abhängigen Makrophagen verhindert, ohne die Zellviabilität12 zu beeinträchtigen. Der Immunsuppressor hemmt die Proliferation, indem er die Aktivität von CDK2 deaktiviert. Im Zusammenhang mit Krebs ist die Rolle von Cyclin D-CDK4/6 zusammen mit anderen Cyclinen und CDKs gut belegt. Krebs ist gekennzeichnet durch die abnormale Deregulation des Cyclin-CDK-Weges. Konkret vermittelt CDK4, wenn die Zelle bereit ist, die DNA-Synthese zu initiieren, den Durchgang der G1-Phase in Verbindung mit den D-Typ-Cyclinen. Dieser Prozess ist entscheidend mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von Krebs verbunden9.

Die aktive Stelle von Cyp A ist charakterisiert durch das invariante katalytische Arginin (Arg55) und eine hochkonservierte Mischung hydrophober, aromatischer und polarer Rückstände wie Arg55, Glutamin (Gln), Glycin (Gly) und Threonin (Thr)1,13,14. Die aktive Stelle der Cyclophilin-Familie besteht ebenfalls aus Alanin (Ala) und Asparagin (Asn)1. Das aktive SFA-Zentrum besteht hingegen aus den Aminosäuren Arg5515, Gln, Gly, Thr, Ala und Asn, die eine hydrophobe Tasche bilden, die die Piperazinsäure-Gruppe von SFA umschließt. Im Gegensatz zum unligandierten Cyp A zwingt der Linker zwischen dem Makrozyklus und dem Spin-Fahrrad von SFA Trp121, seine Seitenketten16 neu auszurichten.

1nmk wird als spezifischer PDB-Code von Sanglifehrin A ausgewählt, wie in früheren Studien17 erwähnt. SFA, eine immunsuppressive natürliche Substanz, wurde erstmals in Streptomyces sp. A92-3081 5,18 entdeckt. SFA zeigt eine hohe Affinität zu Cyp A und hat eine eigenständige Struktur im Vergleich zu CsA, wobei eine einzigartige Methode zur Unterdrückung des Immunsystems verwendet wird. Die komplexe Molekularstruktur der SFA besteht aus einem 22-gliedrigen Makrozyklus mit einem neun-Kohlenstoff-Tether an Position 23, der in einer hochsubstituierten spiro-bicyclischen Gruppe endet. In-vitro-Studien mit fibrotischen humanen Lungenfibroblasten und Proben von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose zeigten, dass SFA die Produktion von Cyclophilin B erhöht und die Sekretion von Kollagen Typ I19,20 hemmt. Insgesamt wurden 20 verschiedene Sanglifehrins verwendet, um SFA (C16) zu isolieren. Seine Affinität zu Cyclophilinen ist etwa 60-mal höher als die der anderen Mitglieder der SFA-Gruppe in einem zellfreien kompetitiven Bindungsexperiment15. Zum Beispiel reduziert SFA die Menge des bioaktiven IL-12p70, der Hauptquelle von IL-12, die von dendritischen Zellen freigesetzt wird, erheblich, wodurch die Aktivität der dendritischen Zellen gehemmt wird. Diese Studie legt nahe, dass SFA ein starkes neues immunsuppressives Medikamentist.

In diesem Protokoll wurden neuartige Ligandenstrukturen für Ganoderiol F/Cyp A mit In-silico-Methoden und der Chemsketch-Software generiert und anschließend mit kompatibler Software in PDB-Dateien umgewandelt. Die Konzeption der Protein-Ligand-Bindung ist ein bedeutendes Thema im Prozess der Wirkstoffentdeckung und -gestaltung21,22. Die Liganden-Rezeptor-Interaktionen wurden mit der AutoDock 4.2.6-Software angedockt. Computational Docking-Systeme erzeugen typischerweise mehrere potenzielle Protein-Ligand-Komplexkonfigurationen. Ein oder mehrere Kandidaten mit der niedrigsten energetischen Bindung an den 1nmk-Rezeptor können für die nächste Phase des Wirkstoffdesigns ausgewählt werden, um eine Wirksamkeit in Silico-Wirkstoffdesignstudien sicherzustellen. Chimera-Software wurde verwendet, um den optimalen wasserstoffbindenden Liganden zu identifizieren. Schließlich wurden Molekulardynamik-(MD)-Simulationen am Ligandenrezeptorkomplex durchgeführt, um dessen Stabilität zu messen. Diese Methode wird im untenstehenden Protokoll beschrieben.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In silico Erzeugung von Liganden und Ligandpräparaten in der ChemSketch-Software

HINWEIS: Diese Software wird verwendet, um die Struktur eines Liganden/Moleküls zu zeichnen, also für molekulare Bearbeitung.

  1. Zeichne den Liganden/die Struktur wie im Zeichenprozess der Software angegeben, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 1) gezeigt.
  2. Drücke f9 , um die Struktur nach dem Zeichnen der vollständigen Struktur zu reinigen.
  3. Klicken Sie auf Datei und dann Speichern unter. (Navigiere zum Ordner, z. B. wird Molekül 1 im Ordner 1 gespeichert usw.).
  4. Ändere den Typ "Speichern als " zu mdl molfiles und klicke dann auf Speichern (kein Dateiname anzugeben; benutze den von der Software bereitgestellten Standard-Dateinamen, z. B. noname).
    HINWEIS: Eine Datei wird im Ordner erstellt, und jede Datei hat das mdl-Format eines 2D-Strukturliganden.
  5. Wiederhole die oben genannten Schritte für alle Moleküle.

2. Konvertierung des Dateiformats (Open-Babel-Software)

HINWEIS: Die Software konvertiert Dateiformate. Hier wird die .mol-Datei in das .pdb-Format umgewandelt, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 2) gezeigt.

  1. Auf der linken Seite, im Eingabeformat, wählen Sie bitte mol--mdl mol Format im Dropdown-Menü aus. Ebenso wählen Sie auf der rechten Seite im Ausgabeformat pdb – Protein Data Bank Format.
  2. Im Eingabeformat (links) klicken Sie auf ... (der Durchsucher-Button).
  3. Navigiere zum Ordner (z. B. Ordner 1), klicke auf die gerade gezeichnete Chemsketch-Datei und öffne sie.
  4. Klicken Sie unter dem Ausgabeformat auf ....
  5. Ein Standardfenster öffnet sich. Geben Sie hier 1.pdb ein, um die Datei zu benennen. Für Struktur 1 gib 1.pdb ein und klicke auf Speichern. Wiederhole diesen Schritt für Molekül/Struktur 2, tippe 2.pdb und so weiter.
  6. Schließlich klickt man in der Mitte der Softwareoberfläche auf Konvertieren. Dadurch werden die Koordinaten vom mdl-mol-Format in das PDB-Format umgewandelt.
    HINWEIS: Jetzt wird eine weitere Datei dem Ordner hinzugefügt. Jede Datei enthält eine Liganden-PDB-Datei, die in den nächsten Schritten verwendet wird.
  7. Rechtsklick auf die neu erstellte Datei, wähle Öffnen mit und wähle dann Notepad.
  8. Wiederhole die gleichen Schritte für alle Moleküle.
    HINWEIS: AutoDock 4.2.6 erscheint nach der Installation der MGL 1.5.7-Tools auf dem Desktop.
  9. Bereiten Sie die Eingabedatei 1nmk.pdb wie unten beschrieben vor.
  10. In der Datei 1nmk.pdb entfernen Sie alle externen Liganden durch Besuchen der pdb.org Website und Auswahl der 1nmk-Struktur. Suchen Sie nach den Liganden unter dem Titel des kleinen Moleküls auf der 1nmk-Struktur, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 3) gezeigt.
  11. Finden Sie den Liganden namens SFM, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 4) gezeigt, und öffnen Sie die 1nmk-Datei. Laden Sie die 1nmk PDB-Datei von der PDB-Website herunter. Lokalisieren Sie den Abschlussrest (TER.), wie in Supplementary File 1 (Screenshot 5) gezeigt.
  12. Löschen Sie die Reste der externen Liganden (SFM) in der 1nmk-Struktur, beginnend mit dem Rest nach TER und enden vor dem vor dem Ende aufgeführten Rest. Speichere die modifizierte 1nmk PDB-Datei im System.
    HINWEIS: Die 1nmk-PDB-Datei wird bereit sein, ebenso die Vorbereitung der Rezeptor-Aktivkoordinaten-Datei in Tabelle 1.
  13. Öffne die 1nmk-Datei und finde Arg bei Aminosäure Nummer 55.
  14. Finde die Koordinaten von x, y und z, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 6) gezeigt.

3. Vorbereitung der Andockparameter mit der AutoDock 4.2.6-Software.

  1. Öffnen Sie die AutoDock 4.2.6 Tools-Software vom Desktop aus.
  2. Wählen Sie AutoDock 4.2.6 4.0 für die 1nmk-Rezeptorvorbereitung, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 7) gezeigt.
  3. Öffnen Sie das Dateimenü , wählen Sie Moleküle lesen, navigieren Sie zum Ordner, wählen Sie 1nmk und drücken Sie auf Öffnen.
  4. Drücken Sie auf Bearbeiten, wählen Sie Wasserstoff und klicken Sie auf Hinzufügen. Wählen Sie nur Polar und drücken Sie OK. (Ergänzungsakte 1, Screenshot 8).
  5. Drücken Sie auf Bearbeiten, wählen Sie Anklagen und wählen Sie dann Kollman-Anklagen.
  6. Drücke Bearbeiten, wähle Atome aus und wähle dann ad4-Typ zuweisen (wähle einen davon).
  7. Öffne das Dateimenü , wähle Speichern und tippe pdbqt ein. Ein Fenster öffnet sich. Durchsuchen Sie Ordner 1, geben Sie den Dateinamen 1nmk.pdbqt ein und klicken Sie auf Speichern.
  8. Wähle aus Atom aus und füge dann wie in Supplementary File 1 (Screenshot 9) gezeigt hinzu. Kreuze die Kästchen für Sortierknoten an, speichere Transformationskoordinaten, schreibe alle Datensätze und klicke dann auf OK.
  9. Ligand öffnen, Eingabe auswählen und dann öffnen. Navigiere zu Ordner 1, ändere den Dateityp auf alle Dateien, wähle 1.pdb aus und klicke auf Öffnen. Ein kleines Fenster erscheint, das Informationen über den ausgewählten Ligand liefert, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 10) gezeigt.
  10. Öffnen Sie den Liganden, dann den Torsionsbaum und dann die Wurzel erkennen, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 11) gezeigt.
  11. Öffne Ligand, dann Ausgabe und speichere dann als pdbqt. Navigiere zu Ordner 1, gib den Dateinamen 1. pdbqt ein und klicke auf Speichern, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 12) gezeigt.
    HINWEIS: Alle Liganden-PDBQT-Dateien werden vorbereitet.
  12. Grid öffnen, Makromolekül auswählen, 1nmk auswählen und dann Molekül auswählen. Eine Warnung wird erscheinen; Klicken Sie auf OK, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 13) gezeigt. Navigiere zu Ordner 1, gib den Dateinamen 1nmk.pdbqt ein, klicke auf Speichern und klicke, wenn ein Ersetzen-Fenster geöffnet wird, auf Ja, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 14) gezeigt.
  13. Öffnen Sie Raster und legen Sie dann Kartentypen ein, wählen Sie Ligand, klicken Sie auf 1 und wählen Sie Ligand, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 15) gezeigt.
  14. Bereiten Sie die GPF-Rezeptor-Datei für aktive Koordinatenstellen wie in Tabelle 1 dargestellt vor.
    HINWEIS: Die Datei GPF stellt die aktive Koordinatenstelle des Rezeptors dar (Tabelle 1).
  15. Klicken Sie auf Raster, gehen Sie dann zum Rasterbox, wählen Sie Zentrum, wählen Sie ein Atom und geben Sie das Rasterfeld Mitte ein (Ergänzungsdatei 1, Screenshot 16).
    1. Wähle Datei, dann Schließen und speichere die aktuellen Einstellungen.
    2. Wähle Raster, dann Ausgabe und speichere als GPF. Gehe zu Ordner 1 und gib den Dateinamen 1nmk.gpf ein.
    3. Wählen Sie Andocken > Makromolekül > Stellen Sie starren Dateinamen ein, gehen Sie zu Ordner 1 und klicken Sie auf 1nmk.pdbqt und dann auf Öffnen, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 17) gezeigt.
    4. Wählen Sie Andocken, finden Sie 1 und wählen Sie Ligand (Ergänzungsdatei 1, Screenshot 18). Ein Fenster mit Standardparametern öffnet sich. Akzeptieren Sie die Standardparameter, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 19) gezeigt.
    5. Wählen Sie dann Docking, gehen Sie zu Suchparameter, wählen Sie Genetic Algorithm, das ein Fenster mit Standardparametern öffnet, und wählen Sie dann Akzeptieren, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 20) gezeigt.
    6. Wählen Sie Andocken, dann Ausgabe, Lamarckian GA, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 21) gezeigt.
    7. Gehe zu Ordner 1, gib den Dateinamen " 1nmk.dpf" ein und klicke auf Speichern, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 22) gezeigt.
      HINWEIS: Schließen Sie das AutoDock 4.2.6 Softwarefenster, öffnen Sie es erneut und wiederholen Sie den Vorgang für das nächste Molekül. Außerdem sind die 1nmk.pdbqt, 1nmk.gpf und 1nmk.dpf für den Andockprozess bereit.

4. Cygwin-I (Andockverfahren)

HINWEIS: Um GLG- und DLG-Dateien zu erstellen, führen Sie den Algorithmus aus. Der Algorithmus (AutoGrid) läuft in diesem Cygwin-Terminal. In Cygwin navigiere zum Ordner. Wenn sich zum Beispiel Ordner 1 auf dem Laufwerk C befindet, sollte er einen Ordner namens "project" enthalten, gefolgt von einem weiteren Ordner namens "molecules" und dann alle darin enthaltenen Ordner. Befolgen Sie diese Schritte.

  1. Öffnen Sie das Cygwin-Terminal .
  2. Gib cd c:/ ein und drücke Enter. Gib dann cd project ein und drück Enter.
  3. Geben Sie cd-Moleküle ein und drücken Sie Enter, dann CD 1 und drücken Sie Enter. Jetzt befindet sich Ordner 1 im Cygwin-Terminal.
  4. Geben Sie ./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg & ein und drücken Sie Enter, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 23) gezeigt.
    HINWEIS: In "./autogrid4.exe -p 1nmk.gpf -l 1nmk.glg &" ist -l ein minus kleines l.
  5. Geben Sie tail -f 1nmk.glg ein und drücken Sie Enter, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 4) gezeigt.
  6. Wenn AutoGrid erfolgreich abgeschlossen ist, schließen Sie dieses Cygwin-Fenster, öffnen Sie ein neues Cygwin-Fenster und wiederholen Sie den oben genannten Prozess für Molekül 2.
  7. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Moleküle und führen Sie den Algorithmus aus (AutoDock 4.2.6).
    HINWEIS: Für AutoDock 4.2.6 wiederholen Sie den Navigationsprozess zum Ordner, und wenn der Ordner geöffnet wird, tippen Sie die und drücken Sie Enter für AutoDock 4.2.6.
  8. Geben Sie ./autodock4.exe -p 1nmk.dpf -l 1nmk.dlg & ein und drücken Sie Enter, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 24) gezeigt.
    HINWEIS: Im obigen Schritt ist "-l" ein kleiner Buchstabe "L" mit negativem Vorzeichen.
  9. Type Tail -f 1nmk.dlg
    HINWEIS: Wenn AutoDock 4.2.6 abgeschlossen ist, schließen Sie das Cygwin-Fenster und wiederholen Sie den Vorgang für Molekül 2.
  10. Folgen Sie diesem Cygwin-Verfahren für alle Moleküle.
  11. Nachdem du DLG-Dateien für Moleküle erstellt hast, gehe in Ordner 1 und öffne die DLG-Datei in WordPad. Drücke Strg + F, tippe und drücke dreimal Enter, um zur RMSD-Tabelle zu gelangen, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 25) gezeigt.
  12. Öffnen Sie ein Microsoft-Excel-Fenster oder notieren Sie die Seite und erstellen Sie drei Spalten: Nr., Min. Bindende Energie und Ausführen.
  13. Schreiben Sie die Daten gemäß der RMSD-Tabelle in der Logdatei auf. Die Bindungsenergie liegt an der Spitze der Tabelle, zusammen mit dem Lauf, in dem sie beobachtet wurde. Mach das bei allen Molekülen.
    HINWEIS: Das Molekül mit der niedrigeren Bindungsenergie gilt als besser als die anderen.
  14. Erstelle eine weitere Tabelle mit den Details (Seriennummer, minimale Bindungsenergie und Durchlauf) der 20 wichtigsten Moleküle.
    HINWEIS: Das folgende Verfahren wird nur für die obersten 20 Moleküle durchgeführt.

5. Cygwin-ii

  1. Öffnen Sie das Cygwin-Terminal, tippen Sie cd c:/ ein und drücken Sie Enter.
  2. Geben Sie CD-Projekt ein und drücken Sie Enter, tippen Sie CD-Moleküle ein und drücken Sie Enter.
  3. Geben Sie cd (Ordnernummer des obersten ausgewählten Moleküls) ein und drücken Sie Enter.
    HINWEIS: Die Nummer sollte dem Ordner im Cygwin-Terminal entsprechen.
  4. Geben Sie grep '^docked' ein, 1nmk.dlg |cut -c9- > 1nmk_run.pdbqt, und drücken Sie Enter. Im Gegensatz zu AutoGrid und AutoDock erscheint keine Meldung zum erfolgreichen Abschluss für dieses Formular, und man drückt Enter, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 26) gezeigt.
  5. Drücken Sie Enter, und die Datei wird erstellt.
  6. Gib cut -c-66 1nmk_run.pdbqt > 1nmk_run.pdb ein und drücke Enter. Die Datei wird erstellt, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 27) gezeigt.
  7. Schließe das Cygwin-Fenster.
    HINWEIS: Zur Visualisierung der Interaktion von Liganden und Rezeptoren nach dem Andocken mit der PyMOL 2.5-Software
    1. Öffne die PyMOL 2.5-Software, dann öffne die Datei und wähle dann Rezeptor.
    2. Öffnen Sie die Datei und wählen Sie dann die gewählte Ligandenkonfiguration aus, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 28) gezeigt.
    3. In PyMOL 2.5 wählen Sie Hide Molecule und Hide Receptor. Im Rezeptormenü wählen Sie Oberfläche zeigen, wie in Abbildung 1A dargestellt.
      HINWEIS: Zur Visualisierung der Wasserstoffbrücke im Liganden-1nmk-Rezeptorkomplex wird die UCSF Chimera-Software in 20 Liganden mit der niedrigsten Bindungsenergie verwendet.

6. UCSF Chimera-Software zur Visualisierung der H-Bindung und Analyse von Ergebnissen

  1. Öffne UCSF Chimera, dann Select File und Open und navigiere zu Laufwerk c:/, dann Project, Molecules), wähle 1nmk.pdb und öffne es.
  2. Wählen Sie das Laufwerk aus, auf dem sich die Moleküle befinden, und öffnen Sie dann das Protein im UCSF-Programm.
  3. Wähle Residue und dann UNL Zoom.
  4. Wähle Zone, dann OK, dann Aktion, dann Beschriftung, Residue und Name + Spezifizierer.
  5. Wähle Werkzeuge, dann Strukturanalyse und dann H-Bindung finden, wie in ergänzender Datei 1 (Screenshot 29) gezeigt.
  6. Öffnen Sie das Standardfenster und aktivieren Sie die Kästchen für Farb-H-Bonds, die nicht den genauen Kriterien entsprechen, und finden Sie nur H-Bonds mit ausgewählt.
  7. Wählen Sie Auswahl löschen , um eine neue Umfrage zu starten, zoomen Sie dann heran und suchen Sie nach den blauen/orangefarbenen Farblinien, die H-Bindungen darstellen, wie in Abbildung 3 dargestellt.
  8. Überprüfe, wie viele Anleihen gezählt werden sollen.
    HINWEIS: Der Zoom sollte die H-Bindungswechselwirkungen mit Arg55, Asn149, Gly150, Lys151, Thr 152, Lys54, Lys155, Isoleucin 15623, Histidin 5424, Phenylalanin (Phe)53, Cystein (Cys)52, Gly72, Asn71 und Hid70 zeigen und anzeigen, ob sie sich innerhalb der aktiven Stelle des Proteins befinden, wie in Abbildung 3A - D dargestellt.
  9. Beachten Sie die Anzahl der H-Bindungen und die Molekülzahl.
  10. Halte die Maus über die Linie, die die H-Bindung zeigt, was auf Wechselwirkungen mit Arg55 und Methionin, Gln, Gly und Thr hinweist.
  11. Drücken Sie die Druckbildschirm-Taste .
  12. Öffnen Sie die Paint-Anwendung , fügen Sie die ergänzende Abbildung ein und speichern Sie sie im benannten Ordner.
    HINWEIS: Um H-Bindungen und Aminosäuren der aktiven Stellen klar darzustellen, sollte die 2D-Struktur der gewählten Liganden und Rezeptoren wie folgt aussehen:

7. Erstellung des Ligand-Interaktionsdiagramms zur Andockbestätigung und Darstellung der H-Bindung

  1. Öffne die AutoDock 4.2.6-Software.
    1. Wählen Sie Analyse und öffnen Sie Makromolekül, dann wählen Sie 1nmk, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 30) gezeigt.
    2. Wählen Sie Analyse und öffnen Sie Docking, wählen Sie dann Öffnen, navigieren Sie zur dlg.pdb-Datei und wählen Sie sie aus, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 31) gezeigt.
    3. Wählen Sie Analyse und öffnen Sie Docking, dann wählen Sie AutoDock Virtual Screening Ligand und speichern Sie ihn als PDB-Datei, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 32) gezeigt.
  2. Öffnen Sie die PyMOL 2.5-Software, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 33) gezeigt.
    1. Öffne die gespeicherte dlg.pdb-Datei und dann die 1nmk.pdb-Datei.
    2. Datei öffnen, Molekül exportieren und dann speichern, wie in ergänzender Datei 1 (Screenshot 34) gezeigt.
    3. Öffnen Sie Maestro-Software, öffnen Sie Datei und wählen Sie dann Import Structure aus, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 35) gezeigt.
    4. Importiere das Liganden-Interaktionsdiagramm, speichere die 2D-Struktur, wie in Supplementary File 2 gezeigt.

8. MD-Simulation

HINWEIS: Um GROMACS unter Linux zu öffnen, folgen Sie diesen Schritten

  1. Lade Ubuntu 20.04.6 herunter.
    1. Aktiviere die Windows-Funktionsanwendung auf dem PC. Und dann wähle Windows Subsystem für Linux und drücke OK.
    2. Folgen Sie diese und drücken Sie Enter, um GROMACS zu installieren:
      1. Geben Sie sudo apt-get update ein und drücken Sie Enter, dann sudo apt-get upgrade und drücken Sie Enter.
      2. Geben Sie sudo apt-get install gcc ein und drücken Sie Enter, geben Sie sudo apt-get install cmake ein und drücken Sie Enter.
      3. Gib sudo apt-get install built-essential ein und drück Enter, dann sudo apt-get install liDevfftw3-d und drück Enter.
      4. Gib sudo apt-get install GROMACS ein und drücke Enter, dann Shift + Strg + T.
    3. Öffnen Sie den Ordner auf dem PC-PC und nennen Sie ihn GROMACS, wie in Supplementary File 1 (Screenshot 36) gezeigt.
    4. Öffne den GROMACS-Ordner und drücke Shift + Strg + Rechts, um Linux zu betreten.
      HINWEIS: Die Simulationen verwendeten das Wassermodell und GROMACS Version 4.0, Win64-Multicore-Version, die das CHARMM-36-Kraftfeld integrierte. Der Zeitschritt wurde auf 2 fs gesetzt, die Grenzdistanz von 1,0 bis 1,2 nm wurde gewählt.

9. Erstellung von Ligandentopologie mit GROMACS pdb2gmx-Modulen (Ergänzungsdatei 1, Screenshot 37)

  1. Erstellen Sie eine lig.gro-Datei, extrahieren Sie den Liganden aus der Proteinstruktur, indem Sie grep UNL 135_clean.pdb > lig.pdb tippen und Enter drücken, dann "UNL" in der Datei in "LIG" umbenennen.
  2. Öffne lig.pdb in PyMOL 2.5 und entferne unerwünschte Atome, indem du die Atome auswählen und das Atom löschen drückst. Klicken Sie auf speichern, um die bereinigte Version als lig_clean.pdb zu speichern.
  3. Öffne die bereinigte Datei in Avogadro , um Wasserstoff mit dem Build-Tool hinzuzufügen, und speichere sie als lig.mol2. Bearbeiten Sie den oberen Teil der Datei in einem Texteditor, um sicherzustellen, dass der Residuenname auf LIG gesetzt ist.
  4. Geben Sie perl sort_mol2_bonds.pl lig.mol2 lig_fix. mol2 ein und drücken Sie Enter.
  5. Erzeugen Sie die Ligandentopologie mit CGenFF: Laden Sie lig_fix. mol2 hoch, verarbeiten Sie die Eingabe und laden Sie lig_fix.pdb herunter. Aktiviere die Python-Umgebung und führe Python cgenff_charmm2gmx_py3_nx1.py LIG lig_fix. mol2 lig.str charmm36-jul2022.ff aus und drücke Enter.
    HINWEIS: Dieser Schritt erzeugt vier Ligandendateien (lig.prm, lig.itp, lig.top und lig_ini.pdb).
  6. Generiere die Datei ligand.gro , tippe gmx editconf -f lig_ini.pdb -o lig.gro ein und drücke Enter.
  7. Trennen Sie das Protein, indem Sie nur die nicht-ligandischen Atome in prot_clean.pdb speichern, und stellen Sie sicher, dass UNL-Atome oben im kombinierten Komplex aufgeführt sind.

10. Erstellung von Proteintopologie in GROMACS pdb2gmx-Modulen (Ergänzungsdatei 1, Screenshot 38).

  1. Bereite die Proteintopologie vor, typiere gmx pdb2gmx -f prot_clean.pdb -o pro.gro -ter und drücke Enter .
  2. Erstelle den Komplex aus Protein und Ligand, nachdem du die lig.gro-Datei am Ende der pro.gro-Datei hinzugefügt hast. Dann gib gmx editconf -f complex.gro -o box.gro -c -d 1.0 -bt cubic ein und drücke Enter (Enter).
  3. Generiere Solvate mit dem spezifischen Punktladungs-Wassermodell, um das Gleichgewicht aufrechtzuerhalten, tippe gmx solvate -cp box.gro -cs spc216.gro -o solv.gro -p topol.top und drücke Enter.
  4. Erstellen Sie Ionen-Dateien, tippen Sie gmx grompp -f ions.mdp -c solv.gro -p topol.top -o ions.tpr ein und drücken Sie Enter. Geben Sie gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral ein und drücken Sie Enter, wählen Sie dann Gruppe 15, um Ionen hinzuzufügen.
  5. Erzeugen Sie Energieminimierung em.gro.
  6. Geben Sie gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr ein und drücken Sie Enter, geben Sie gmx mdrun -v -deffnm em ein und drücken Sie Enter.
    HINWEIS: Das solvierte System wird mit maximal 50.000 Schritten und einem Kraftkonvergenzkriterium von 1.000,0 kJ/mol/nm energieminimiert.
  7. Erstellen Sie die Indexdateien, tippen Sie gmx make_ndx -f lig.gro -o index_lig.ndx, drücken Sie Enter.
  8. Geben Sie gmx genrestr -f lig.gro -n index_lig.ndx -o posre_lig.itp -fc 1000 1000 1000 ein und drücken Sie Enter.
  9. Generiere die index.ndx-Datei, tippe gmx make_ndx -f em.gro -o index.ndx ein und drücke Enter.
  10. Generiere die NVT-Equilibrierungsdatei nvt.gro, tippe gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr und drücke Enter. Gib dann gmx mdrun -deffnm nvt ein und drücke Enter.
    HINWEIS: Das Gleichgewicht des Systems erfolgte bei einer Temperatur von 27,35 °C (300,5 K) für das Ensemble der Anzahl der Atome (N), des Volumens (V) und der Temperatur (V) (NVT) für 100 ps.
  11. Aktualisieren Sie die Topologiedatei topol.top , um Ligandentopologie und Parameter einzuschließen, um NPT zu erstellen.
  12. NPT-Gleichgewicht erzeugen.
  13. Erstellen Sie die NPT-Gleichgewicht der zweiten Phase, tippen Sie gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -t nvt.cpt -r nvt.gro -p topol.top -n index.ndx -o npt.tpr und drücken Sie Enter, tippen Sie gmx mdrun -deffnm npt und drücken Sie Enter.
    HINWEIS: Ausgeglichte NVT bezieht sich auf die Anzahl der Teilchen, das Volumen und die Temperatur, während die ausgeglichene NPT die Stabilität der Teilchenanzahl, des Drucks und der Temperatur beschreibt. Die NVT.mdp- und NPT.mdp-Dateien werden benötigt, um die Ergebnisse der MD-Simulation wie folgt zu erzeugen.

11. Lösen der Positionsbeschränkungen und Durchführung der Produktionssimulation der molekularen Dynamik zur Datenerhebung

  1. Geben Sie gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -n index.ndx -o md_0_10.tpr ein und drücken Sie Enter. Gib dann gmx mdrun -deffnm md_0_10 ein und drücke Enter.
  2. Unterziehen Sie das System einer 1-ns-MD-Simulation, um die Stabilität des Komplexes zu testen.
    HINWEIS: Die Wurzelmittlere Quadratabweichung (RMSD) quantifiziert die durchschnittliche strukturelle Abweichung von Atomen im Vergleich zu einer Referenzstruktur, und die Fluktuationsmittelquadratabweichung (FMSD) misst die zeitlich gemittelten atomaren Fluktuationen um ihre mittleren Positionen. Die beiden Werte werden benötigt, um die MD-Simulationsläufe abzuschließen.
  3. Führen Sie strukturelle Analysen durch, einschließlich RMSD, FMSD, Wasserstoffbrücken und freier Energie.
  4. Zeichne die Analysediagramme mit qtgrace_v026_win7 Software und md_0_10.gro-Datei, um das Flugfeld mit VMD-Software anzuzeigen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie in der Einleitung erwähnt, zeigen in-vivo- und in-vitro-Studien die Bedeutung von Cyclophilin-Inhibitoren für die Vereinfachung der Struktur von Sanglifehrin und reduzieren so die Proliferation der Mausmilz, indem sie denMauszellzyklus 5 stören. Darüber hinaus spielt Cyclophilin A zusammen mit Ganoderiol-F-Derivaten eine wichtige Rolle bei der Proteinfaltung, Immunantworten und der Zellsignalübertragung durch seine PPIASE-Aktivität. Seine Hoc...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine neue immunsuppressive natürliche Substanz namens SFA oder 1nmk Molekularrezeptor wurde aus Streptomyces extrahiert. Die molekulare Andockungsanalyse wurde verwendet, um die Bindungsenergien der konstruierten Liganden mit dem Zielprotein zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass SFA von allen entworfenen Liganden strukturell von CsA abweicht und eine beträchtliche Affinität zu Cyp A16 aufweist. Cyp A, das Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase-Aktivität...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Autodock Autodock v4.2.6http://autodock.scripps.edu/downloads/autodock-registration/autodock-4-2-download-page/
CGenFFCGenFFv2024https://cgenff.umaryland.edu
Chemsketch Chemsketch v2024http://www.acdlabs.com/resources/freeware/
Cygwin terminal Cygwin terminal v3.6.3http://www.cygwin.com/
Gromacs tutorialGromacs tutorialv25.04 (Plucky Puffin)http://www.mdtutorials.com/gmx/complex/index.html
MGL tools MGL tools v1.5.7mgl tools 1.5.6 rc3
Open babelOpen babelv3.1.1http://openbabel.org/wiki/main_page
PyMOLPyMOLv3.1.6.1PyMOL | pymol.org
UbuntuUbuntuv25.04lhttps://ubuntu.com/download/desktop
UCSF chimeraUCSF chimerav1.19chimera-1.17.3-win64.exe

Referenzen

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