Methodenartikel

Vorbereitung der hochsensitiven cDNA-Bibliothek für die Next-Generation-Sequenzierung von microRNAs aus kleinen extrazellulären Vesikeln

DOI:

10.3791/67154

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13. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) enthalten zellspezifische microRNAs, die Empfängerzellen regulieren und deren Identifizierung Aufschluss über ihre Funktion und Rolle als Biomarker geben kann. Unser optimiertes Protokoll zur Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken führt einzigartige Barcodes ein, die das Probenmultiplexing und die verbesserte Verarbeitung von EVs mit geringer Eingabe ermöglichen, während für die Kompatibilität mit Illumina-Sequenzierern Dual-Index-Barcodes mit gepaarten Enden verwendet werden.

Zusammenfassung

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Jüngste Studien zeigen, dass kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die in allen Bioflüssigkeiten zu finden sind, eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation spielen, indem sie Proteine, DNA und RNAs kanalisieren. MicroRNAs (miRNAs), die in sEVs verpackt sind, haben sich als wichtige Regulatoren in Empfängerzellen herausgestellt. Da sEVs, die von normalen und kranken Zellen sezerniert werden, unterschiedliche miRNA-Frachten tragen, deuten neuere sEV-miRNA-Profiling-Studien darauf hin, dass sie dazu beitragen können, neue zirkulierende Biomarker zu identifizieren. Zell-/krankheitsspezifische sEVs, die in verschiedenen Bioflüssigkeiten zirkulieren, liefern jedoch nach der Isolierung geringe miRNA-Mengen, die mit herkömmlichen spektrometrischen Methoden im Allgemeinen schwer zu quantifizieren sind. Small non-coding RNA Next Generation Sequencing (NGS), das die Amplifikation klonierter miRNA-Sequenzen ermöglicht, bietet eine wertvolle Möglichkeit, die miRNA-Fracht von sEVs zu bewerten. Leider erfordern kommerzielle Verfahren zur Herstellung von cDNA-Bibliotheken oft RNA-Eingaben, die weit über den nicht quantifizierbaren Mengen liegen, die von isolierten sEVs zur Verfügung stehen.

Unter Berücksichtigung der Robustheit und Multiplexing-Fähigkeiten unseres bestehenden cDNA-Bibliotheksvorbereitungsverfahrens (d.h. das ursprünglich für die Analyse von niedrig inputierter, hochgradig abgebauter, formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) RNA optimiert wurde, haben wir daher versucht, seine Anwendbarkeit für die Analyse von sEV-miRNAs zu bewerten. Unter Berücksichtigung der jüngsten technischen Clustering-Verbesserungen von Sequenzierungschips haben wir versucht, unseren Transkript-Barcoding-Ansatz innerhalb eines Paired-End-Workflows zur Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken anzupassen, um unsere Sequenzierungs- und Multiplexing-Fähigkeiten zu verbessern. Unter Verwendung von RNA, die aus 8,4 × 109 sEVs in 16 Replikaten extrahiert wurde, und von der Verringerung der Mengen an sEVs von 10bis 10 sEVs auf nur 2,5 × 107 sEVs, untersuchten wir die Reproduzierbarkeit und Sensitivität dieser Methodik. Die Daten zeigen, dass die 16 3'-adenylierten DNA-Barcodes einen hochgradig reproduzierbaren und sensitiven Nachweis von sEV-miRNA-Profilen über Wiederholungen hinweg ermöglichen, wobei nur 3,15 pg an insgesamt kleinen nicht-kodierenden RNAs oder 1,35 pg an miRNAs verwendet werden.

Einleitung

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Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind zellabgeleitete Partikel in Nanogröße (~30-200 nm Durchmesser), die von einer Phospholipid-Doppelschichtmembran umhüllt sind, die von ihrer Ursprungszelle geerbt wird und ihre molekulare Fracht robust schützt 1,2. Es ist allgemein anerkannt, dass praktisch alle Zellen sEVs produzieren und in das interzelluläre Kompartiment abgeben, die wiederum in den meisten Bioflüssigkeiten (d. h. Blut, Urin, Speichel usw.) nachgewiesen werden können2,3,4. Neuere Studien haben gezeigt, dass die stabil verkapselten molekularen Frachten (d. h. DNA, RNA, Proteine, Lipide usw.)5,6,7 von sEVs, sobald sie in Kontakt kommen oder an Empfängerzellen abgegeben werden, die interzelluläre Kommunikation vermitteln8. Aktuelle Forschungsanstrengungen konzentrieren sich auf die Verbesserung der Isolierung zellspezifischer sEVs aus verschiedenen Bioflüssigkeiten, um diese molekularen Frachten genau zu identifizieren und zu überwachen 9,10. In Anbetracht der Tatsache, dass sEVs kleine nicht-kodierende RNAs und insbesondere microRNAs (miRNAs) enthalten, die ihre regulatorische Funktion bei zellulärer Abgabe behalten, haben sich viele Studien auf die Bewertung des Nutzens von miRNAs als Biomarker konzentriert, die den Zustand ihrer Ursprungszelle aufdecken können 11,12,13.

MicroRNAs (miRNAs) repräsentieren eine große Klasse (~2.000 beim Menschen bekannt) kleiner nicht-kodierender RNAs mit Größen zwischen 19 und 25 Nukleotiden (nt), die an unvollkommene komplementäre Stellen in den 3'-untranslatierten Regionen ihrer mRNA-Ziele binden und deren Abbau und/oder posttranskriptionelle Repression steuern14,15. Funktionell wurde beschrieben, dass miRNAs viele biologische Prozesse steuern, und die Deregulierung ihrer Expression wurde mit Veränderungen in molekularen, biochemischen und physiologischen Prozessen in Verbindung gebracht, die zur Entstehung und Entwicklung von Krankheiten, einschließlich Krebs, beitragen 16,17,18. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass erkrankte Zellen und insbesondere Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen nicht nur unterschiedlich miRNAs exprimieren18, sondern dass sich auch ihre Verpackung in sEVs unterscheidet19,20.

Während sich mehrere Studien auf die Etablierung der molekularen Prozesse und Signalwege konzentrieren, die die Verpackung von sEVs in normalen und erkrankten Zellen steuern 19,21,22, konzentrieren sich Biomarker-Studien derzeit auf die Identifizierung unterscheidbarer kleiner nicht-kodierender RNA- und/oder miRNA-Signaturen, die von bestimmten kranken/Krebszellen über sEVs verpackt und sezerniert werden. Die gezielte Isolierung erkrankter zellspezifischer sEVs aus verschiedenen humanen Biofluiden und die Bewertung ihrer multi-omischen molekularen Frachten kann daher die Entwicklung diagnostischer und prognostischer Assays für den nicht-invasiven Nachweis verschiedener humaner Krankheiten und Krebsarten ermöglichen 23,24,25,26. Obwohl sEV-miRNAs die am besten untersuchten nicht-kodierenden Transkripte sind, werden auch andere kleine nicht-kodierende RNA-Spezies (d. h. miRNA-Isoformen (isomiRs), piwiRNAs, Transfer-RNA-Fragmente (tRFs), rRNAs, verwaiste nicht-kodierende RNAs (oncRNAs)) auf ihren potenziellen Nutzen als zirkulierende sEV-Biomarker untersucht, mit besonderem Schwerpunkt auf der Erkennung verschiedener Krebsarten 27,28,29,30,31,32.

Vorteilhaft ist, dass die Next-Generation-Sequencing-Analyse (NGS) von kleinen nicht-kodierenden RNA-Transkripten (einschließlich miRNAs) nach deren Barcoding und cDNA-Bibliotheksvorbereitung ideal für die Erforschung bekannter und/oder unbekannter kleiner nicht-kodierender RNA-Spezies ist, die in zirkulierenden sEVs enthalten sind und mit Krankheiten assoziiert sein können27. In der Tat bietet sEV small-RNA NGS einen Hochdurchsatzansatz für die Entdeckung zellspezifischer kleiner nicht-kodierender RNA-Transkripte, die sonst unbekannt bleiben würden, wenn sie global mit zielspezifischen Technologien (z. B. Multiplex-PCR, Microarrays, kundenspezifische Panels usw.) evaluiert würden. 32,33,34. In Anbetracht der Tatsache, dass wir zuvor ein hochsensitives, hochreproduzierbares cDNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll optimiert haben, das wir für die Analyse von stark degradierten und niedrig konzentrierten formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) RNAs35,36 entwickelt haben, versuchten wir, es für die Analyse kleiner nicht-kodierender RNAs und miRNAs, die in den sEVs 37,38,39,40 eingekapselt sind, anzupassen.

Mit der Abkündigung des Illumina HiSeq2500 Instruments, das uns jahrelange hochwertige Single-End-Dual-Index-miRNA-Analysen von sEV-Cargos37,40 lieferte, wollten wir die Reproduzierbarkeit und Sensitivität unseres Protokolls untersuchen, wenn es an aktualisierte Sequenzierungsinstrumente angepasst wird, die jetzt eine Paired-End-Dual-Index-Chemie verwenden. Mit der Absicht, die Multiplexing-Fähigkeiten des ursprünglichen Protokolls beizubehalten, haben wir die bestehenden 16 Barcodes für die Herstellung von kleinen RNA-cDNA-Transkripten beibehalten, bevor wir sie in die Dual-Index-Chemie mit gepaartem Ende integriert haben. Mit nur einem Paar i5- und i7-Barcodes ermöglichen wir die Herstellung einer robusten laborbasierten cDNA-Bibliothek, in der die gleichzeitige Verarbeitung und Analyse von bis zu 16 Einzelproben die analytische Reproduzierbarkeit von sEV-RNA mit geringem Input verbessert. Daher stellen wir die biochemischen Prozesse, die aktualisierten Barcodes, PCR- und Größenmarker-Primer sowie die Isolationsschritte vor, die zur Generierung hochreproduzierbarer cDNA-Bibliotheken mit extrem geringen Mengen an miRNAs aus humanen Plasma-sEVs erforderlich sind.

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Protokoll

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1. Alle Reagenzien und Oligonukleotide werden wie folgt hergestellt:

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Nukleotide sind in Abbildung 1 und in der ergänzenden Datei 1 in Konzentrationen aufgeführt, die für die Implementierung dieses Protokolls verwendet werden. Siehe Ergänzende Datei 2 für Primersequenzen.

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung aus Kalibratorcocktail vor, die in jeder einzelnen Ligation als Kontrolle für die verschiedenen enzymatischen Reaktionen verwendet wird:
    1. Resuspendieren Sie das Carrier-Oligonukleotid (0,5 μM) (Ergänzende Datei 1) mit RNase-freiem Wasser.
    2. Kombinieren Sie die 10 Kalibratoren (je 10 μl, Ergänzende Datei 1) in einem einzigen 1,5-ml-Röhrchen, um einen Stamm von 100 μM zu erreichen, verdünnen Sie es mit dem Trägeroligonukleotid, um die Lösung von 0,0052 nM zu erreichen, und lagern Sie es bei -20 °C.
  2. Resuspendieren Sie jeden der 17 einzigartigen (16 experimentellen und 1 Test-Barcode-Adapter) adenylierten 3'-Adapter (Abbildung 1A) mit nukleasefreiem Wasser in einer Konzentration von 50 μM.
    HINWEIS: Jeder Adapter ist in einzelne Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 2,5 μl aliquotiert, die bis zu 2 Jahre lang bei -80 °C gelagert werden können, um Frost-Tau-Zyklen des größeren Materials zu verhindern.
  3. Resuspendieren Sie die verschiedenen experimentellen RNA-Oligonukleotide, einschließlich des RNA-Extraktionsträgers (Ergänzende Datei 1), des RNA-3'-Ligationsträgers (Ergänzende Datei 1), des RNA-Ligationstests (Ergänzende Datei 1) und der 3'-Ligation (Ergänzende Datei 1; 19 nt-3'-Adapter und 24 nt-3'-Adapter) und der 5'-Ligation (Ergänzende Datei 1; 5'-Adapter-19 nt-3'-Adapter und 5'Adapter-24 nt-3'-Adapter) DNA-Größenmarker auf 250 ng/μL.
  4. Verdünnen Sie den HPLC-gereinigten 5'-Adapter auf 100 μM mit nukleasefreiem Wasser (Abbildung 1A).
  5. Resuspendieren Sie die RT und die ersten PCR 5' und 3' RT/PCR-Primer mit nukleasefreiem Wasser auf 100 μM (Abbildung 1B).
  6. Resuspendieren Sie die zweiten PCR 5'- und 3'-PCR-i7- und i5-Oligonukleotide mit nukleasefreiem Wasser auf 100 μM (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Aliquotieren Sie jeden DNA-Primer für bis zu 10 Experimente und lagern Sie ihn bei -80 °C.
  7. Bereiten Sie den Polyacrylamid DenAturing (PAA)-Gelladefarbstoff vor, mischen Sie ihn und aliquotieren Sie ihn in Röhrchen und lagern Sie ihn bei -80 °C.
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 0,5 M Na2H2 EDTA vor, indem Sie 18,6 g Na2H2 EDTA zu 50 ml nukleasefreiem Wasser hinzufügen. NaOH-Pellets langsam in die vorbereitete Na2H2 EDTA-Lösung geben, um einen pH-Wert von 8,0 zu erreichen. Füllen Sie das Volumen mit ddH2O auf bis zu 100 mL auf, um eine 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0) Stammlösung zu erhalten
    2. Wiegen Sie 15 mg Bromphenol Blue in ein 15-ml-Röhrchen ab, resuspendieren Sie das Pulver in 600 μl nukleasefreiem Wasser und fügen Sie 14,25 ml deionisiertes Formamid hinzu. Zum Schluss werden 150 μl einer 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 Lösung zugegeben. Die endgültige PAA-Lösung wird in 1-ml-Röhrchen aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
    3. Bereiten Sie den 5x Agarose-Gel-Ladefarbstoff vor.
      1. Wiegen und lösen Sie 1,86 g Na2H2-EDTA in 50 mL RNase-freiem Wasser auf und stellen Sie den pH-Wert durch Zugabe von NaOH-Pellets auf 8,0 ein. Fügen Sie RNase-freiem Wasser zu 100 mL hinzu, um eine 50 mM Na2H2 EDTA-Lösung zu erhalten.
      2. Zu 5 ml 50 mM Na2H2 EDTA fügen Sie 20 mg Bromphenolblau, 20 mg Xylolcyanol FF und 2 g Ficoll Typ-400 hinzu. Drehen Sie das Röhrchen mit den drei Farbstoffen zum Mischen ein und fügen Sie weitere 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA hinzu. Aliquotieren Sie einzelne 1-ml-Röhrchen mit 5x Agarosegel-Ladefarbstoff und lagern Sie ihn bei -80°C.

2. Vorbereitung der EV-RNA-Proben

  1. Nach der Isolierung von sEVs ist deren Morphologie mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; Abbildung 2), Konzentration mittels Nanoparticle Tracking Analysis (NTA; Abbildung 3) und die Verteilung von Oberflächenproteinen unter Verwendung von hochauflösendem Nanoimaging (Abbildung 4) oder einer gleichwertigen sEV-Quantifizierungstechnologie.
  2. Aliquotieren Sie eine äquivalente Anzahl von sEVs in verschiedenen Röhrchen, fügen Sie RNase-A (12,5 μg/ml) hinzu und inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C.
  3. Initiieren Sie die Extraktion kleiner nicht-kodierender RNAs, einschließlich miRNAs, aus sEVs mit dem Small-RNA-Extraktionskit und initiieren Sie die Isolierung der RNA-Phase.
  4. Trennen Sie die untere wässrige Phase des RNA-Lysepuffers, geben Sie ihn in ein neues Röhrchen und fügen Sie dann jeder RNA-Probe 4 ng RNA-Trägeroligonukleotid (Ergänzende Datei 1) hinzu, bevor Sie die Säulenisolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen.
  5. Vakuumieren Sie jede einzelne RNA-Probe auf 9,5 μl, um das Protokoll zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek zu starten.

3. Richten Sie Ligationen des 3'-Barcode-Adapters mit 16 RNA-Proben und 1 Testprobe ein

  1. Identifizieren Sie 16 einzelne sEV-RNA-Proben, aliquotieren Sie sie in 9,5 μl nukleasefreiem Wasser in 1,5 mL silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie mindestens 10 Minuten vor Beginn der Experimente auf Eis.
  2. Bereiten Sie den 10x RNA Ligase Puffer (ohne ATP) vor dem Experiment frisch vor.
    1. Kombinieren Sie in einem silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen 343 μl nukleasefreies doppelt destilliertes Wasser (ddH2O), 500 μl 1 M Tris pH 7,5, 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml Rinderserumalbumin und 7 μl 14 M 2-Mercaptoethanol.
    2. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen schnippen, zentrifugieren Sie sie 2 s lang bei 2.000 × g bei Raumtemperatur (RT) auf einer Tischzentrifuge und stellen Sie sie dann auf Eis.
      HINWEIS: Alle Schritte, die eine "Zentrifuge für 2 s" beschreiben, werden alle mit einer Mikrozentrifuge bei RT mit einer Drehzahl von nicht mehr als 2.000 × g durchgeführt.
  3. Tauen Sie den 0,0052 nM Kalibratorcocktail auf, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis legen.
  4. Bereiten Sie den Ligations-Mastermix für 18 Reaktionen in einem silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen vor, indem Sie 40 μl 10x RNA-Ligase-Puffer, 10 μl 0,0052 nM-Kalibratorcocktail und 40 μl nukleasefreies ddH2O kombinieren.
  5. Drehen und drehen Sie das 1,5-ml-Röhrchen und stellen Sie es auf Eis.
  6. Geben Sie 4,5 μl des Ligations-Mastermixes zu jeder der 16 einzeln aliquotierten sEV-RNA-Proben und die Testligationsreaktion enthält 100 ng RNA-Ligationstest-Oligonukleotid (Ergänzende Datei 1), das zuvor aliquotiert wurde, und ein Volumen von 9,5 μl. Drehen Sie die Röhren, um sie zu mischen und zu drehen, bevor Sie sie wieder auf Eis legen.
  7. Die 16 Proben und die Testreaktion für 1 min bei 90 °C in einen Heizblock geben und wieder auf Eis übertragen.
  8. Übertragen Sie einzeln 4 μl 50 % PEG auf jedes Röhrchen, schnippen Sie zum Mischen und drehen Sie die Röhrchen, bevor Sie sie wieder auf Eis legen.
  9. Tauen Sie 2,5 μl Aliquots von jedem der 17 3'-Barcode-Adapter (16 experimentelle (#1 bis #16) und Testadapter (#17)) auf und legen Sie sie zum Auftauen auf Eis.
  10. Übertragen Sie 1 μl jedes der 17 Adapter auf die entsprechenden 16 Proben, die sEV-RNA und eine Testprobe enthalten, mit Ligation Master Mix (d. h. 4,5 μl) und 50 % PEG (d. h. 4 μl).
    HINWEIS: Alle Lösungen und Reaktionen werden gemischt, indem die Röhrchen geschnippt und gedreht werden, anstatt die Lösungen auf und ab zu pipettieren, um Materialverlust zu vermeiden.
  11. Bereiten Sie das verdünnte T4-RNA-Ligase-2-verkürzte K227Q-Ligationsenzym vor, indem Sie 10 μl des Enzyms mit 10 μl nukleasefreiem ddH2O in ein neues silikonisiertes 1,5-ml-Röhrchen geben.
  12. Übertragen Sie 1 μl des verdünnten T4-RNA-Ligase-2-Ligationsenzyms trunkiert K227Q in jedes der 17 Röhrchen (16 experimentelle und 1 Test-RNA-Proben). Pipettieren Sie nicht auf und ab, wechseln Sie die Spitzen zwischen den einzelnen Röhrchen, halten Sie die Röhrchen auf Eis, schnippen Sie die Mischung, zentrifugieren Sie und legen Sie die Röhrchen auf Eis.
  13. Legen Sie die Ligaturen über Nacht bis zu 18 Stunden auf frisches Eis in einem Röhrchenhalter in einem Eiskübel im Kühlraum.

4. PAGE-Isolierung der 3'-Adapter-ligierten kleinen RNAs

  1. Legen Sie die 17 Röhrchen 1 Minute lang bei 90 °C auf einen Heizblock, um die T4-RNA-Ligase 2 zu deaktivieren, und legen Sie sie zum Abkühlen 2 Minuten lang auf Eis.
  2. Kombinieren Sie 1 μl GlycoBlue und 26 μl 5 M nukleasefreies NaCl in ein frisches Röhrchen und überführen Sie 1,2 μl dieser Fällungslösung in jedes der 17 Röhrchen.
  3. Geben Sie 63 μl 100 % Ethanol in jedes der 17 Röhrchen, schließen, schnippen Sie und drehen Sie es 2 s lang nach unten, bevor Sie es wieder auf Eis legen.
  4. Kombinieren Sie den Inhalt der 16 sEV-RNA-Röhrchen in einem einzigen silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen, während Sie das Test-RNA-Ligationsröhrchen getrennt halten.
  5. Das Röhrchen mit den kombinierten Proben 3x umdrehen, um es zu mischen, kurz 2 s zentrifugieren und 60 Minuten lang auf Eis stellen, um es auszufällen.
  6. Bereiten Sie ein großes (16 x 20 cm2) Gel aus 15 % Polyacrylamid (PAGE) wie folgt vor:
    1. Silikonisieren (d.h. mit Lösung auf Silikonbasis) und gießen Sie die kurzen und langen Glasplatten mit 0,1 cm Abstandhaltern zusammen.
    2. Bereiten Sie die 15%ige PAGE-Gelmischung vor, indem Sie 9 mL Systemverdünnungsmittel, 18 mL Systemkonzentrat, 3 mL Systempuffer, 240 μl APS (9%) und 12 μL TEMED in einem konischen 50 mL Röhrchen kombinieren.
    3. Übertragen Sie die Lösung schnell mit einer 30-ml-Pipette zwischen den Glasplatten. Bevor das Gel polymerisiert, fügen Sie einen 14-Well-Kamm (0,1 cm dick) hinzu und stellen Sie das Gel 30 Minuten lang bei RT aufrecht stehen.
  7. Das Röhrchen mit den kombinierten RNA-Proben aus dem Eis gewinnen und bei 16.000 × g für 60 min bei 4 °C zentrifugieren.
  8. In der Zwischenzeit beenden Sie die Einrichtung der 15%-PAGE, indem Sie den Kamm vorsichtig entfernen, die Vertiefungen mit nukleasefreiem H2O mit einer Spritzflasche über einer Spüle reinigen, bevor Sie trocknen und die 15%ige PAGE auf dem Gelgerät aufstellen, wo sowohl das obere als auch das untere Reservoir mit 0,5-facher Tris-Borat-EDTA-Lösung (FSME) gefüllt werden, bevor Sie einen 30-minütigen Vorlauf bei 450 V durchführen.
  9. Nehmen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge (Schritt 4.6) und trocknen Sie das RNA-Pellet vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette mit einer 10-μl-Spitze ohne Filter an seinem Ende, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist, ohne das Pellet zu stören.
  10. Resuspendieren Sie das RNA-Pellet mit den gefällten 16 RNA-Ligationen in 20 μl nukleasefreiem ddH2O und fügen Sie 20 μl PAA-Gelladelösung hinzu. Das Röhrchen zum Mischen schnippen, 2 s zentrifugieren und auf Eis legen.
  11. Ersetzen Sie 0,5x FSME des Gelgeräts durch frische 0,5x FSME.
  12. Richten Sie ein Röhrchen mit einer RNA-Leiter von 20 bp, zwei Röhrchen mit je einem der beiden 3'-Ligationsmarker für kurze DNA-Größen (Supplemental File 1) und ein Röhrchen mit dem RNA-Ligationstest-Oligonukleotid ein (d. h. ligiert mit Barcoded-Adapter #17).
  13. Zu jedem der Röhrchen (d. h. Leiter, 3'-Ligations-Kurz-DNA-Oligos und RNA-Ligationstest) fügen Sie 20 μl PAA-Gelladelösung hinzu.
  14. Stellen Sie das 16-ligierte RNA-Probenröhrchen und das 1 RNA-Ligatur-Reagenzglas 1 Minute lang auf 90 °C und stellen Sie es wieder auf Eis.
  15. Ersetzen Sie den 0,5-fachen FSME-Puffer sowohl aus dem unteren als auch aus dem oberen Reservoir (d. h. fügen Sie den Puffer unterhalb des Well-Niveaus hinzu, damit es während des Ladevorgangs zu keiner Kreuzkontamination zwischen den Wells kommt) und laden Sie die Leiter an die Enden des Gels, die RNA-Testligation, die beiden kurzen DNA-Größenmarker auf beiden Seiten des Wells, die die 16 kombinierten 3'-Barcode-RNA-Ligationen enthalten (siehe Abbildung 5).
  16. Lassen Sie das 15%ige PAGE-Gel mit allen Proben 90 Minuten lang bei 450 V (~35 mA) unter gekühlten Bedingungen (d. h. mit Lüftern, die Luft auf die Glasplatten blasen) laufen.
  17. Entfernen Sie 15% PAGE aus dem Glas und besprühen Sie es leicht mit SYBR Gold Lösung (10 μL SYBR Gold in 25 mL 0,5x TBE) und lassen Sie es 5 min im Dunkeln gekippt stehen.
  18. Setzen Sie das Gel auf einen Blaulicht-Transilluminator (Abbildung 5) und richten Sie sowohl den 19 nt-3'-Adapter als auch die beiden kurzen DNA-Oligonukleotide mit 24 nt-3'-Adaptergröße mit einem Lineal aus und entfernen Sie den Bereich des Gels, der die ligierten miRNA-Konstrukte enthält (Abbildung 6 zeigt die 3'-Ligation und das resultierende Konstrukt). Schneiden Sie separat die obere Bande der RNA-Testligation heraus, die auch für eine 5'-Ligatur am nächsten Tag verwendet wird.
  19. Legen Sie die beiden separaten exzidierten Gelstücke (d. h. für 16 RNA-Proben und für die Testligation) in verschiedene 0,5-ml-Gelbrecherröhrchen, die in silikonisierte 1,5-ml-Röhrchen eingesetzt sind, zentrifugieren Sie bei 16.000 × g für 3 min bei RT und resuspendieren Sie dann die beiden gesetzten fragmentierten Gelstücke mit 300 μl 400 mM NaCl-Lösung, schließen Sie die Röhrchen. und mit Parafilm versiegeln.
  20. Stellen Sie die Röhrchen über Nacht (16-17 h) bei 1.100 U/min bei 4 °C auf einen Schüttler.

5. Ligatur des 5'-Adapters

  1. Übertragen Sie zwei separate fragmentierte Gele und ihre Lösungen (16 x 3' barcodierte Proben (Barcodes #1 bis #16) und 3' barcodierte Test-RNA (Barcode #17)) auf zwei separate 5-μm-Filterröhrchen, die jeweils in silikonisierte 1,5-ml-Röhrchen eingesetzt werden, versiegeln Sie sie mit Parafilm und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 2.300 × g bei RT.
  2. Geben Sie 950 μl 100%iges Ethanol zu jeder gefilterten Lösung, schließen Sie die Röhrchen, invertieren Sie zum Mischen, schleudern Sie sie 2 s lang herunter, verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und legen Sie sie 1 h lang auf Eis.
  3. Bereiten Sie eine 50%ige wässrige DMSO-Brühe frisch vor, indem Sie 1 ml nukleasefreies Wasser mit 1 ml DMSO kombinieren, das Röhrchen in Aluminiumfolie einwickeln und bei RT im Dunkeln lagern.
  4. Bereiten Sie ein 15%iges PAGE-Gel vor und führen Sie es vor, indem Sie die in Abschnitt 4.6 beschriebenen Schritte befolgen.
  5. Die Röhrchen mit den 3'-ligierten 16 RNA-Proben und die Test-RNA-Ligation bei 16.000 × g für 60 min bei 4 °C zentrifugieren, um die ligierten RNAs auszufällen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die RNA-Pellets zu berühren, und trocknen Sie ihn vakuum.
  7. Resuspendieren Sie das 3'-ligierte Pellet von 16 RNA-Proben und testen Sie die RNA in jeweils 8 μl nukleasefreiem ddH2O, ohne auf und ab zu pipettieren. Drehen Sie die Röhrchen leicht zum Mischen, zentrifugieren Sie 2 s (2.000 × g) bei RT und stellen Sie die Röhrchen auf Eis.
  8. Bereiten Sie den 10x RNA-Ligase-Puffer (mit ATP) vor, indem Sie 500 μl 1 M Tris (pH 7,5), 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml acetyliertes BSA, 200 μl 10 mM ATP, 7 μl 2-Mercaptoethanol 14 M und 143 μl RNasefreies Wasser in ein 1,5 ml-Röhrchen mischen.
  9. Geben Sie 2 μl 10x RNA-Ligase-Puffer (d. h. mit ATP), 1 μl 100 μM 5'-Adapter und 4 μl 50 % wässriges DMSO in jedes Röhrchen. Zum Mischen schnippen, 2 s bei RT drehen, dann das Röhrchen 1 min lang bei 90 °C aufstellen, um die RNA zu denaturieren, und wieder auf Eis legen.
  10. 3 μl 50 % DMSO hinzufügen, zum Mischen schnippen, zu Pellet schleudern, 3 μl T4 RNA-Ligase in jedes Röhrchen geben, die Röhrchen schnippen, 2 s bei RT zentrifugieren und die Röhrchen für 75 min auf 37 °C stellen.
    HINWEIS: Pipettieren Sie nicht nach oben und unten.
  11. Bereiten Sie die 20-nt-DNA-Leiter und zwei separate Röhrchen vor, die die langen DNA-Oligonukleotide mit dem Marker für die Ligationsgröße (Ergänzende Datei 1; 5'-Adapter-19 nt-3'-Adapter und 5'-Adapter-24 nt-3'-Adapter) enthalten, und fügen Sie 20 μl PAA zu jedem der Röhrchen hinzu.
  12. Sobald die 5'-Adapterligation abgeschlossen ist, fügen Sie jeder der beiden Ligationen (d. h. 16 RNA-Proben und Test-RNA) 20 μl PAA hinzu, mischen Sie durch Schnippen, schleudern Sie nach unten und stellen Sie sie für 1 Minute auf 90 °C ein, wonach Sie die Röhrchen wieder auf Eis legen.
  13. Leeren Sie das obere und untere Reservoir des Gelapparats und fügen Sie frische 0,5-fache FSME-Lösung unterhalb des Niveaus der Vertiefungen des oberen Reservoirs hinzu.
  14. Laden Sie die Leiter am Ende des Gels, die 5'-ligierte Test-RNA-Probe, die beiden Größenmarker-Long-DNA-Oligonukleotide (d. h. 5'-Adapter-19 nt-3'-Adapter und 5'-Adapter-24 nt-3'-Adapter) in die Vertiefungen, die die Vertiefung umgeben, in die die 5'-ligierten 16 RNA-Proben geladen werden (Abbildung 6 zeigt die 5'-Ligation und das resultierende Konstrukt). Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 450 Volt laufen.
  15. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, nehmen Sie das Gel aus dem Gerät und dem Glas und besprühen Sie es mit einer SYBR Gold-Lösung (d. h. 10 μl SYBR Gold in 25 mL 0,5x TBE) und lassen Sie es 5 Minuten lang im Dunkeln einwirken.
  16. Unter Verwendung des 5'-Adapter-19 nt-3'-Adapters und der beiden 5'-Adapter-24 nt-3'-Adaptergrößenmarker für lange DNA-Oligonukleotide als Größenrichtwerte wird der Abschnitt des Gels, der die 5'-ligierten 16-RNA-Proben enthält, direkt herausgeschnitten (Abbildung 7).
    HINWEIS: Die Test-RNA-Ligation wird auf dem Gel ausgewertet, um zu zeigen, dass die Ligation des 5'-Adapters eine Größenverschiebung ermöglicht, die den Größenmarkern entspricht. Die Test-RNA-Ligation wird nicht aus dem Gel herausgeschnitten; nur die ligierten 16 kombinierten RNA-Proben.
  17. Übertragen Sie das exzidierte Gelstück mit den 16 ligierten RNA-Proben in ein 0,5-ml-Gelbrecherröhrchen, das in ein 1,5-ml-Röhrchen eingesetzt wird, drehen Sie es 3 Minuten lang bei RT bei 16.000 × g und fügen Sie dann 300 μl 300 mM NaCl und 1 μl 100 μM 3' RT/PCR-Primer (Abbildung 1B) zu den zerkleinerten Gelstücken im Röhrchen hinzu.
  18. Verschließen Sie das Rohr mit Parafilm und stellen Sie es über Nacht (17-18 h) in einem Kühlraum auf einen Schüttler, der bei 1.100 U/min bei 4 °C bewegt wird.

6. Reverse Transkription der barcodierten 5'- und 3'-ligierten kleinen nicht-kodierenden RNAs und miRNAs

  1. Pipettieren Sie die Lösung aus dem Röhrchen mit dem zerkleinerten Gel in ein 5-μm-Filterröhrchen, das in ein silikonisiertes, RNasefreies 1,5-ml-Röhrchen eingeführt wird, und drehen Sie es kurz, damit die Lösung durch den Filter gelangen kann.
  2. Geben Sie 950 μl 100%iges Ethanol zu dieser gefilterten Lösung, drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um, drehen Sie es 2 s lang und stellen Sie es 60 Minuten lang auf Eis.
  3. Das RNA-Pellet wird durch Zentrifugation des Röhrchens bei 16.000 × g bei 4 °C für 1 h ausgefällt.
  4. Nehmen Sie das Röhrchen, entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu berühren, und trocknen Sie das Pellet vakuum, bevor Sie es in 5,6 μl nukleasefreiem H2O resuspendieren.
  5. Richten Sie die RT-Reaktion ein, indem Sie 3 μl 5x Erststrangpuffer, 4,2 μl 10x dNTPs (jeweils bei 2 mM) und 1,5 μl Dithiothreitol (DTT) in das Röhrchen geben. Zum Mischen streichen und 2 s lang drehen.
  6. Richten Sie die Reaktion bei 90 °C für genau 30 s ein und übertragen Sie das Röhrchen dann für 2 min auf einen Block bei 50 °C.
  7. Initiieren Sie die RT-Reaktion, indem Sie 0,75 μl Reverse-Transkriptase-Enzym in die Lösung geben, zum Mischen wechseln und 35 Minuten lang auf 50 °C einstellen.
  8. Übertragen Sie das Röhrchen 1 Minute lang bei 95 °C, um das Enzym und die cDNA/RNA-Stränge zu denaturieren, fügen Sie dann 95 μl RNase-freies H2O hinzu, schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen und stellen Sie es für 2 Minuten auf Eis. Dieses Röhrchen enthält cDNA, die aus den 16 RNA-Proben generiert wurde, die jeweils separat in 3' barcodiert sind.

7. Führen Sie die Test-PCR und die großflächige Amplifikation durch

  1. Bereiten Sie frischen 10x PCR-Puffer vor, indem Sie 304 μl nukleasefreies H2O, 125 μl 2 M KCl, 50 μl 1 M Tris pH 8,0, 10 μl 1 M MgCl2, 5 μl 1 % Triton X-100 und 6 μl 1 M 2-Mercaptoethanol in ein Röhrchen mischen, das auf Eis gelagert werden kann.
  2. Assemblieren einer Pilot-/Test-PCR-Reaktion für die in Schritt 6.8 (oben) hergestellte cDNA durch Kombination von 67 μl nukleasefreiem H2O mit 10 μl 10x PCR-Puffer, 10 μl 10x dNTPs, 0,5 μl 100 μM 5' PCR-Primer, 0,5 μl 100 μM 3' PCR-Primer, 10 μl cDNA Stock Library, und 2 μl 50x Taq-Polymerase in ein frisches PCR-Röhrchen.
    HINWEIS: Richten Sie das Gerät vor der Durchführung der PCR-Amplifikationen ein, indem Sie zwei verschiedene Dateien wie folgt erstellen: Für Datei #1: 94 °C für 45 s, 50 °C für 85 s und 72 °C für 60 s für 12 Zyklen und 4 °C; und für Datei#2: 94 °C für 45 s, 50 °C für 85 s und 72 °C für 60 s für 2 Zyklen und 4 °C.
  3. Legen Sie für die Pilot-/Test-PCR-Reaktion das PCR-Röhrchen mit den 100 μl der PCR-Reaktion in den Thermocycler und führen Sie Datei#1 aus.
  4. Sobald Datei#1 fertig ist, öffnen Sie das PCR-Röhrchen und überführen Sie 12 μl der Reaktion in eine 1,5-ml-Mikrozentrifuge, die 3 μl 5x Gelladefarbstoff enthält. Schließen Sie die Tube und schreiben Sie "12 Zyklen" auf die Kappe.
  5. Nehmen Sie das PCR-Röhrchen, setzen Sie es in den Thermocycler ein und starten Sie Datei#2.
  6. Sobald Datei#2 fertig ist, übertragen Sie 12 μl der PCR-Reaktion in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 3 μl 5x Gel-Ladefarbstoff und schreiben Sie "14 Zyklen" auf die Kappe.
  7. Wiederholen Sie die PCR-Amplifikationen vier weitere Male hintereinander (d. h. jeweils zwei PCR-Zyklen), während Sie am Ende jeder Amplifikation 12 μl PCR-Produkt übertragen, und erhalten Sie wiederum vier verschiedene Röhrchen mit den Bezeichnungen 16, 18, 20 und 22 Zyklen.
  8. Laden Sie die Leiter der Größe 20 nt und jedes der PCR-amplifizierten Produkte auf eine 2,5%ige Agarose und lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 120 V in 0,5x TBE laufen.
  9. Identifizieren Sie den optimalen PCR-Amplifikationszyklus (Abbildung 8A), basierend auf dem Verhältnis und Vorhandensein von Primer-Dimeren (untere Bande) und der amplifizierten cDNA (obere Bande).
    HINWEIS In Anbetracht der Tatsache, dass der Gesamt-RNA-Input bei 16 Proben weniger als 1 ng betragen kann, ist zu erwarten, dass Primer-Dimere ein Produkt schneller und in größeren Mengen erzeugen als die gereinigte cDNA. So wird der adäquate PCR-Zyklus in der Regel zwischen 18 und 22 Zyklen gewählt. In Abbildung 8A beträgt der adäquate PCR-Zyklus für diese Bibliothek 20. In Abbildung 8B ist die Größe des PCR-Konstrukts detailliert dargestellt.
  10. Sobald der geeignete PCR-Amplifikationszyklus identifiziert ist, legen Sie eine negative PCR (keine cDNA) und vier positive PCR-Reaktionen mit 100 μl (d. h. jeweils 12 μl cDNA) fest.
    1. Um die Vorbereitung der PCR-Reaktionen zu vereinfachen, richten Sie einen PCR-Mastermix (d. h. für 4,5 Reaktionen) in einem 1,5-ml-Röhrchen ein, indem Sie 292,5 μl nukleasefreies H2O, 45 μl 10x PCR-Puffer, 45 μl 10x dNTPs, 3,25 μl 3' RT/PCR-Primer (Abbildung 1B) und 2,25 μl 5' PCR-Primer (Abbildung 1B) kombinieren. Drehen Sie dieses Rohr um, um es zu mischen, und drehen Sie es, um es am Boden des Rohrs zu sammeln.
    2. Übertragen Sie 86 μl des PCR-Mastermixes in jedes der vier 0,5-ml-PCR-Röhrchen.
    3. Geben Sie 12 μl cDNA-Bibliothek (auf Eis gelagert), dann 2 μl 50x Titan-Taq-Polymerase in jedes der 4 PCR-Röhrchen und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren.
    4. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsröhrchen ohne Vorlage vor, indem Sie 77 μl nukleasefreies H2O, 10 μl 10x PCR-Puffer, 10 μl 10x dNTPs, 0,5 μl 5'-PCR-Primer, 0,5 μl 3'-PCR-Primer und 2 μl 50x Taq-Polymerase in ein separates PCR-Röhrchen geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
    5. Richten Sie die PCR-Röhrchen im Thermocycler unter Verwendung des in Schritt 7.9 beschriebenen PCR-Zyklus ein und stellen Sie ein neues Programm auf dem Thermocycler ein, um bei Bedarf zu amplifizieren.
  11. Bereiten Sie ein 2,5%iges Agarosegel mit 0,5x FSME und Ethidiumbromid vor und überführen Sie 12 μl aus jedem PCR-Röhrchen in einzelne Röhrchen mit 3 μl 5x Gelbeladungsfarbstoff.
  12. Bereiten Sie die 20-nt-Leiter vor, indem Sie 3 μl Leiter mit 9 μl nukleasefreiem H2O und 3 μl Gelladefarbstoff kombinieren.
  13. Laden Sie das Gel, lassen Sie es 30 Minuten lang bei 120 V laufen und stellen Sie sicher, dass die PCR-Amplifikation zwischen den vier verschiedenen Reaktionen ähnlich ist und dass die No-Template-Kontrolle leer ist (Abbildung 8C).
  14. Kombinieren Sie die vier PCR-Reaktionen zwischen zwei silikonisierten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (d. h. zwei Röhrchen mit jeweils 90 μl Produkt) und fügen Sie 18 μl 5 M NaCl und 800 μl 100 % Ethanol in jedes der beiden Röhrchen hinzu.
    1. Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um und lagern Sie sie bei -20 °C, um sie über Nacht auszufällen.

8. Aufreinigung der PCR-amplifizierten Bibliothek

  1. Die beiden Röhrchen mit den gemischten positiven PCR-Reaktionen werden 60 Minuten lang bei 4 °C bei 16.000 × g zentrifugiert.
  2. Entfernen Sie nach 60 Minuten den Überstand, trocknen Sie die DNA-Pellets vakuumtrocken und resuspendieren Sie sie in 19,5 μl 1x-Puffer und fügen Sie dann 0,5 μl PmeI-Enzym hinzu.
  3. Richten Sie die PmeI-Verdaue 2 Stunden lang bei 37 °C ein, um alle DNA-Größenmarker zu entfernen, die in den angrenzenden Wells (d. h. 19 nt-3'-Adapter, 24 nt-3'-Adapter) oder RNA-Träger (d. h. RNA-Extraktionsträger, RNA-Post-3'-Ligationsträger) und potenzielle Kontaminanten (d. h. PmeI-Stellen, die in RNA- und DNA-Primern in der ergänzenden Datei 1 enthalten sind)
  4. Führen Sie die beiden Aufschlüsse in drei verschiedenen Vertiefungen eines 2,5%igen Agarosegels mit 0,5x FSME durch, um zu vermeiden, dass sich ein Überschuss an Primer-Dimeren in einer einzigen Vertiefung ansammelt und ein Abstrich entsteht.
    1. Geben Sie 3 μl 5x Gel-Ladefarbstoff in jeden der Aufschläge, kombinieren Sie die beiden Aufschlüsse und laden Sie dann 16,5 μl in drei separate benachbarte Vertiefungen.
    2. Laden Sie die Leiter mit einer DNA-Größe von 20 nt in die Endvertiefungen des Gels und lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 150 V laufen (Abbildung 8D).
  5. Um die DNA-Bibliotheken zu reinigen, entfernen Sie die oberen PCR-Banden aus den drei benachbarten Spuren des Gels und überführen Sie sie in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.
  6. Reinigen Sie die PCR-amplifizierte Bibliothek mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren Sie das gereinigte DNA-Produkt mit einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

9. Abschließende PCR-Amplifikation zum Hinzufügen von Barcodes, die mit dem Sequenzierer kompatibel sind

  1. Bereiten Sie eine frische 10x PCR-Puffermischung vor, wie in Schritt 7.1 beschrieben.
  2. Richten Sie PCR-Reaktionen ein, indem Sie eine Negativkontrolle (keine Amplikone) und drei PCR-Reaktionen mit 0,75 ng des aus der ersten PCR-Amplifikation gereinigten PCR-Produkts in jedem der drei Röhrchen wie folgt einschließen:
    1. Richten Sie drei individuelle PCR-Reaktionen ein, indem Sie 75 μl ddH2O, 10 μl 10x PCR-Puffer, 10 μl 10x dNTPs, 1 μl 5' 2nd PCR-Primer (d. h. Primer i503 (Abbildung 1B)), 1 μl 3' PCR 2nd Primer (d. h. Primer i702 (Abbildung 1B)) und 1 μl PCR-Produkt (d. h. 0,75 ng aus gelgereinigtem 1. PCR-Produkt ) und 2 μl Titan-Taq-Polymerase.
    2. Richten Sie die negative PCR-Kontrolle (d. h. kein DNA-Template) ein, indem Sie 76 μl ddH2O, 10 μl 10x PCR-Puffer, 10 μl 10x dNTPs, 1 μl 5' 2nd PCR Primer (d. h. Primer i503 (Abbildung 1B)) und 1 μl 3' PCR 2nd Primer (d. h. Primer i702 (Abbildung 1B)) mischen. und 2 μl Taq-Polymerase.
    3. Richten Sie die vier PCR-Reaktionen (d. h. eine Negativkontrolle, drei positive) auf einem Thermocycler ein, der wie folgt programmiert ist: 72 °C für 3 Minuten, 95 °C für 30 s und 95 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 30 s für 9 Zyklen und dann 72 °C für 5 Minuten und eine abschließende Haltung bei 10 ΰC.
  3. Sobald die PCR-Zyklen abgeschlossen sind, nehmen Sie 10 μl des Reaktionsgemisches und fügen Sie 3 μl Ladefarbstoff hinzu und bewerten Sie die Produkte auf einem 2,5%igen Agarosegel, wie in Abbildung 9A gezeigt, zusammen mit der 20-nt-Leiter.
  4. Nach Validierung der Größe des PCR-Produkts (d. h. der oberen PCR-Bande bei 164 bp, wie in Abbildung 9B und Abbildung 6 für Größe und Details zum endgültigen Konstrukt gezeigt) und der Bandenverteilung kombinieren Sie die PCR-Produkte in zwei Röhrchen, indem Sie zu jedem 135 μl PCR-Produkt (d. h. 90 μl + 45 μl) 13,5 μl 5 M NaCl hinzufügen. und 650 μl 100 % Ethanol und fallen über Nacht bei -20 °C aus.
  5. Am nächsten Tag schleudern Sie die beiden PCR-Röhrchen bei 16.000 × g für 60 min bei 4 °C herunter.
  6. Trocknen Sie jedes Pellet, resuspendieren Sie es mit 19,5 μl 1x PmeI-Puffer und fügen Sie 0,5 μl PmeI für 2 Stunden bei 37 °C auf einem Schüttler hinzu, um alle Größenmarker, die in den angrenzenden Vertiefungen (d. h. 19 nt-3'-Adapter, 24 nt-3'-Adapter) liefen, oder RNA-Träger (d. h. RNA-Extraktionsträger, RNA-Post-3'-Ligationsträger) Verunreinigungen weiter zu entfernen.
  7. Die aufgeschlossenen Produkte werden in drei Vertiefungen mit einem 2,5%igen Agarosegel aufgestellt und 90 Minuten lang bei 150 V getrennt.
  8. Die obere Bande, die bei 164 bp verläuft, wird exzidiert (Abbildung 9C), das DNA-Produkt mit einem DNA-Isolationskit aufgereinigt und mit einem Fluorometer quantifiziert.
  9. Führen Sie das PCR-Endprodukt auf einem DNA-Chip aus, um Größe, Konzentration und Reinheit der Bibliothek vor der Verdünnung und Analyse mit einem Sequenzierer zu validieren.
  10. Übertragen Sie die FASTQ-Datendatei in die RNAworld-Pipeline für das Adaptertrimming, Demultiplexing und die Ausrichtung an das menschliche Genom vor miRNA-Analysen, wie zuvor beschrieben41. Alternativ können Sie mit dem in der Ergänzungsdatei 3 vorgestellten Skript die Reads aus der FASTQ-Datei demultiplexen und mit einer Small-RNA-Analysepipeline Ihrer Wahl weiterverarbeiten.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wie im obigen Protokoll beschrieben, beschreiben wir die gleichzeitige Verarbeitung von bis zu 16 einzelnen kleinen extrazellulären Vesikel (sEV) RNA-Proben (d.h. für die Analyse von kleinen nicht-kodierenden RNAs und miRNAs), die zusammen in einer einzigen Bibliothek analysiert werden, nachdem sie einem 3'-Barcoding unterzogen wurden. Die sEVs, die für unsere Analysen ausgewählt wurden, wurden, wie zuvor beschrieben37,40, durch Ultrazentrifugation aus 45 ml Plas...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben ein Protokoll zur Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken für die reproduzierbare und empfindliche Next-Generation-Sequencing (NGS) von nicht-kodierenden RNAs entwickelt, einschließlich microRNAs (miRNAs), die effizient aus kleinen extrazellulären Vesikeln (sEVs) isoliert wurden. In Anbetracht der Tatsache, dass eine begrenzte Menge kleiner nicht-kodierender RNAs und miRNAs aus global oder selektiv isolierten sEVs gewonnen werden kann, haben wir versucht, unser Verfahren zur Erstell...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. ist ein nicht beschäftigter Gründer von EValuate Diagnostics, Inc. mit einem kleinen Prozentsatz des Eigenkapitals des Unternehmens. Die anderen Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Labor von Dr. Thomas Tuschl für die Unterstützung und den Zugang zu der in ihrem Labor entwickelten Originaltechnologie sowie den Zugang zur RNAworld-Pipeline.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MercaptoethanolSigmaO3445I-100 
20 nt Leiter Jena BioscienceM-232S
20 mg/ml RinderserumalbuminSigmaB8894-5ML 
50x Titan Taq Clontech Laboratorien 
AmmoniumpersulfatFisher Scientsp;7727-54-0
Blaulicht-Transilluminator - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Vertikales Gelelektrophorese-System mit Glasplatten und KämmenGIBCOV16
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf Mikrozentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Filterrohr mit 5mm FilterIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention 1,5 mLFisher Scientific02-681-320
Gelbrecherröhrchen 0,5 mLIST Engineering Inc.3388-100
Gelelektrophoresegerät 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT mit Gel-Trays und KämmenBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 Sequenzer Illumina20047256
Jersey-Cote (Lösung auf Silikonbasis)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge Doppelrotor-PersonenzentrifugeUSA wissenschaftlich2641-0016
Modell V16 Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gerät, Gläser, Kämme und AbstandshalterCiore Life Science21070010
OligonukleotideIDTBei der Bestellung
Eule EasyCast B2 Mini-Elektrophoresesystem - mit Geltabletts und KämmenThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel-Extraktionskit Qiagen28704
Qubit FluorometerThermofisher ScientificQ33238
Restriktionsenzym PmeI und 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Reverse Transkriptase - Superscript IIIThermoFisher12574026
RNasefreies Wasser AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE agarose Lonza50002
Superscript III Reverse Transkriptionskit Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Titan-Taq-PolymeraseTakara639208
T4-RNA-Ligase 1 NEBM0204S
T4 RNA-Ligase 2 verkürzt K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Scientific O3446I-100
Themocycler mit beheiztem DeckelApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7,5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8,0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel Systemkonzentrat, Verdünnungsmittel und PufferNational DiagnosticsEC-833
639208definiert

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

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MicroRNA SequenzierungsEV miRNA ProfilierungRNA BarcodingDual Index SequenzierungRNA mit geringem Inputzirkulierende Biomarkerinterzellul re Kommunikation
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