Methodenartikel

Probenahme von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff-induzierten Netzhautschäden von Ratten und Multi-Index-Bewertung pathologischer Veränderungen

570 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/67159

⸱

13. September 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Probenahme der Netzhaut bei Ratten und unter Verwendung von Hämatoxylin-Eosin-Färbung, TUNEL-Assay und Western Blot zum Nachweis pathologischer Veränderungen und Apoptose in der Netzhaut nach intraperitonealer Injektion von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff.

Zusammenfassung

Die Retinopathie kann bei den meisten Augenerkrankungen und den Spätkomplikationen des Diabetes mellitus beobachtet werden. Die spezifischen Schädigung und Degeneration der Pigmentepithelzellen und der Sehzellen sind die Hauptmerkmale der Retinopathie. Viele traditionelle Arzneimittel haben eine erhebliche klinische Wirksamkeit bei der Behandlung von Retinopathie gezeigt. Die schnelle und vollständige Gewinnung einer Netzhaut ist ein wichtiger Schritt in der traditionellen Medizin zur Behandlung der Retinopathie. In dieser Studie wollen wir ein standardisiertes und ausführbares Verfahren für die Probenahme von N-Methyl-N-nitrosoharnstoff (MNU)-induzierten Netzhautschäden von Ratten und die Multi-Index-Bewertung pathologischer Veränderungen bereitstellen. Ratten wurden einmal intraperitoneal mit 60 mg/kg MNU injiziert, um eine Netzhautschädigung zu induzieren, und Netzhautproben wurden nach 7 Tagen entnommen. Zusätzlich führten wir Hämatoxylin-Eosin-Färbungen durch, um pathologische Veränderungen der Netzhaut zu beurteilen. Bestimmung der Apoptoserate und des Apoptoseproteins mittels TUNEL und Western Blot. Diese standardisierten Protokolle für die Probenahme der Netzhaut und die Bewertung pathologischer Veränderungen sind hilfreich, um die Erforschung des Mechanismus der Retinopathie und die Entdeckung neuer und wirksamer traditioneller Kräuter zu fördern.

Einleitung

Die Retinitis pigmentosa (RP) ist eine erbliche und erblindende Netzhauterkrankung1. Die Inzidenz von RP liegt zwischen 1/3500 und 1/5000 und beeinträchtigt die Sehfunktion von etwa 2,5 Millionen Menschen auf der Welt. Es ist eine der bekanntesten Krankheiten, die beim Menschen zu Sehbehinderungen führt und eine erhebliche Belastung für die gesamte Gesellschaft darstellt2. Die Krankheit ist gekennzeichnet durch den allmählichen Verlust der Funktion der retinalen Pigmentepithelzellen und die fortschreitende Apoptose der Photorezeptoren. Im Frühstadium kommt es bei den Patienten zu einer Nachtblindheit, die sich in peripheren Gesichtsfeldausfällen äußert und schließlich zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt3. Daher ist die Hemmung der retinalen Photorezeptor-Apoptose der Ausgangspunkt für die Prävention und Behandlung von RP.

Die Apoptose von Netzhautzellen ist ein gemeinsames Merkmal von menschlichem RP und Modelltieren4. Die intraperitoneale Injektion von 60 mg/kg N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU) bei Ratten über einen Zeitraum von 7 Tagen kann Apoptose und Verlust von retinalen Photorezeptorzellen induzieren und ist ein häufig verwendetes Tiermodell von RP 5,6. Die Analyse der Veränderungen der pathologischen Struktur, der spezifischen Zellapoptose und der Apoptose-bedingten Proteinexpression von Netzhautgewebe bei Modelltieren kann effektive experimentelle Daten und theoretische Unterstützung bei der Untersuchung der Pathogenese von humanem RP und Screening-Medikamenten liefern 7,8. Daher bestimmt die Qualität der Netzhautproben die Zuverlässigkeit der experimentellen Daten. Aufgrund der Besonderheit des Augengewebes gibt es jedoch nur sehr wenige Berichte darüber, wie man die Netzhaut der Rattebekommt 9.

Dieses Papier bietet ein einfaches, schnelles, standardisiertes und bedienbares Verfahren für die Netzhautprobenahme bei Ratten, um die oben genannten Mängel zu überwinden. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE), die terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridin-Triphosphat-Digoxigenin-Nick-End-Markierung (TUNEL) und der Western-Blot werden verwendet, um die pathologischen Veränderungen der retinalen Gewebeschädigung und Apoptose bei den Ratten zu analysieren. Alle Methoden leiten sich aus den Erfahrungen unserer Forschungsgruppe mit den spezifischen betrieblichen Prozessen ab.

Protokoll

Alle Protokolle und chirurgischen Eingriffe wurden von der Ethikkommission der Ningxia Medical University genehmigt (Ethiknummer: Nr. 2020-Q066). Männliche Ratten mit SPF Sprauge-Dawley (SD) im Alter von 7-8 Wochen und einem Gewicht von 200-220 g wurden von der Ningxia Medical University mit der Tierlizenznummer SCXK (Ning) 2020-0001 gekauft. Alle Tiere wurden im Labortierzentrum der Ningxia Medical University aufgezogen. Die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit waren angemessen, der Tag-Nacht-Lichtzyklus wurde beibehalten und das Essen und Wasser waren kostenlos und ausreichend.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. Vorbereitung der Materialien
    1. Bereiten Sie Rattenplatten, Inhalationsanästhesiegeräte, eingebettete Boxen, gefrorene Aufbewahrungsröhrchen, Einweg-OP-Handschuhe und -Masken, Weithalsflaschen, 4% Paraformaldehyd, Eisbeutel, Augenscheren, Augenpinzetten, chirurgische Klingen und Messergriffe, 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor und sterilisieren Sie sie im Voraus (siehe Materialtabelle).
  2. Zubereitung von Tieren
    1. Teilen Sie 20 männliche SD-Ratten nach dem Zufallsprinzip in eine Modellgruppe (n=10) und eine Kontrollgruppe (n=10) ein. Modellratten werden intraperitoneal mit 60 mg/kg MNU injiziert und Kontrollratten intraperitoneal mit dem gleichen Volumen Kochsalzlösung injiziert.
    2. Nach 7 Tagen Injektion fasten Sie die Ratten und lassen Sie sie in der Nacht vor der Probenahme frei trinken.
    3. Legen Sie am nächsten Tag die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch und verwenden Sie eine Maske, um eine Anästhesie mit 4% Isofluran und 2 l/min Sauerstoff zu verabreichen. Messen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Mitte des Fußes zusammendrücken, um die Reaktionen der Ratten zu beobachten.

2. Netzhautprobenahme zum Nachweis von Proteinfaktoren

  1. Fixieren Sie die Augenhöhle der Ratte mit der linken Hand und entfernen Sie das Auge mit mäßiger Kraft mit der rechten Hand mit einer ophthalmischen Biegezange. Lege den Augapfel in sagittaler Position in eine kalte Glasschale.
  2. Mit der linken Hand, die eine gerade Pinzette hält, um den Augapfel zu fixieren, und der rechten Hand, die die chirurgische Klinge hält, machen Sie einen 2 mm langen Längsschnitt in der Nähe der Linsenstelle.
  3. Schneiden Sie die Hornhaut mit der Augenschere entlang des Schnitts ab und ziehen Sie vorsichtig die Linse, den Glaskörper und die freiliegende Augenmuschel ab.
  4. Platzieren Sie die Unterseite der Augenmuschel an der Spitze des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens, drehen Sie die Augenmuschel über das Röhrchen und legen Sie die Netzhaut frei (die Netzhaut ist schwach gelb).
  5. Entfernen Sie die gesamte Netzhaut entlang der Sklerawand des Augapfels mit einer ophthalmischen Biegepinzette, legen Sie sie dann in ein gefrorenes Röhrchen und bewahren Sie sie für die zukünftige Verwendung in einem Flüssigstickstofftank auf (Abbildung 1).

3. Netzhautprobenahme zur pathologischen Untersuchung und spezifischen Zellfärbung

  1. Hebe mit der linken Hand mit der Augenzange den Augenwinkel der Ratte an. Schneiden Sie mit der rechten Hand mit einer chirurgischen Klinge eine 4 mm breite Öffnung entlang des Augenwinkels der Ratte.
  2. Klemmen Sie mit der Augenzange den Rand des Augapfels an der Öffnung in der linken Hand fest. Schneiden Sie mit einer Augenschere das umgebende Gewebe entlang des Randes des Augapfels ab, während Sie darauf achten, das umgebende Gewebe des Augapfels zu reinigen.
  3. Trennen Sie das Gewebe um den Sehnerv am hinteren Pol des Augapfels mit einer Augenzange, schneiden Sie den Sehnerv ab und achten Sie darauf, ihn zu erhalten. Entfernen Sie dann den Augapfel.
  4. Waschen Sie den entfernten Augapfel in Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen, rollen Sie ihn auf Filterpapier, um überschüssiges Wasser aufzunehmen, und legen Sie ihn auf kalte Alufolie.
  5. Fixieren Sie das Auge mit einer Augenpinzette. Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge einen 4 mm langen Längsschnitt entlang der Verbindung von Hornhaut und Netzhaut.
  6. Entfernen Sie die Hornhaut mit einer Augenschere, machen Sie einen kreisförmigen Schnitt entlang des Schnitts und entfernen Sie vorsichtig die Linse und den Glaskörper.
  7. Legen Sie die verbleibende Augenmuschel mit einem Sehnerv in eine Einbettbox und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd.
  8. Paraformaldehyd-fixierte Proben in Paraffin einbetten und in 4-μm-Scheiben schneiden für die HE-Färbung und die TUNEL-Färbung7.

4. HE-Verfärbung der Netzhaut von Ratten

  1. Entparaffinierung und Hydratation: Legen Sie die Scheiben 10 Minuten lang in Xylol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 10 Minuten, gefolgt von absolutem Ethanol für 5 Minuten, wiederholen Sie die Ethanolbehandlung für weitere 5 Minuten, gefolgt von einer Behandlung in 95 % Alkohol für 5 Minuten, dann in 85 % Alkohol für 5 Minuten und schließlich in 75 % Alkohol für 5 Minuten.
  2. Hämatoxylin-Färbung: Spülen Sie die Scheibe 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser ab. Verwenden Sie 100 μl Hämatoxylin-Färbelösung und färben Sie sie 5 Minuten lang, spülen Sie sie 5-10 s lang mit deionisiertem Wasser ab. 100 μl 1%iges Salzsäure-Ethanol für 30 s zugeben, 20 min lang mit entionisiertem Wasser spülen und 100 μl 0,2 %iges Ammoniakwasser 1 min lang hinzufügen. 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülen.
  3. Eosin-Färbung: Verwenden Sie 100 μl Eosin-Färbelösung, um 5 Minuten lang zu färben, und spülen Sie sie 30 s lang mit entionisiertem Wasser ab.
  4. Dehydrierung und Versiegelung: Tauchen Sie die Scheiben 5 Minuten lang in 70 % Alkohol, dann 5 Minuten lang in 85 % Alkohol, gefolgt von 90 % Alkohol für 5 Minuten und absolutem Ethanol für 5 Minuten. Wiederholen Sie die Behandlung mit absolutem Ethanol für weitere 5 Minuten, tauchen Sie sie dann für 5 Minuten in Xylol und wiederholen Sie den Vorgang für weitere 5 Minuten. Zum Schluss versiegeln Sie, indem Sie ca. 100 μl neutrales Harz auf die Oberfläche der Scheiben geben und dann mit einem Deckglas abdecken.
  5. Bildgebung der Objektträger: Positionieren Sie die gefärbten Schichten auf dem Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis das Bild deutlich sichtbar ist, stellen Sie die Vergrößerung auf 400x ein und nehmen Sie das Bild auf.
  6. Messen Sie die Gesamtdicke der Netzhaut und die äußere Netzhautdicke: Messen Sie die Gesamtdicke der Netzhaut und die äußere Netzhautdicke (Dicke der äußeren Kernschicht und der Photorezeptorschicht) und berechnen Sie den Prozentsatz der äußeren Netzhautdicke
    Äußere Netzhautdicke (%) = (äußere Netzhautdicke/Gesamtdicke der Netzhaut) x 100.

5. Bestimmung der Apoptoserate von retinalen Photorezeptorzellen mit der TUNEL-Methode

  1. Entparaffinierung und Hydratation: Legen Sie die Scheiben für 10 Minuten in Xylol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 10 Minuten, legen Sie sie dann für 5 Minuten in absolutes Ethanol und wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 5 Minuten. Führen Sie eine Dehydrierung durch, indem Sie 5 Minuten lang 95 % Alkohol, 5 Minuten lang 90 % Alkohol, 5 Minuten lang 80 % Alkohol und 5 Minuten lang 70 % Alkohol einfüllen und 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser abspülen.
  2. 5 min mit 0,85%iger Natriumchloridlösung und 5 min mit PBS spülen. Mit Paraformaldehyd unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd für 15 min fixieren. 5 Minuten lang mit PBS spülen und den Vorgang weitere 5 Minuten wiederholen.
  3. Inkubation und Äquilibrierung7: 15 min lang mit 20 μg/ml Proteinase K-Lösung zum Aufschluss inkubieren, 10 min im Gleichgewichtspuffer äquilibrieren und 60 min mit rekombinantem terminalem Desoxynukleotidyltransferase (rTdT)-Puffer bei 37 °C inkubieren.
  4. Stoppreaktion: 100 μL die Standard-Citratlösung (2x SSC-Lösung) für 15 min zugeben. 5 Minuten lang mit PBS spülen und den Vorgang weitere 5 Minuten wiederholen.
  5. Kernfarbstoff: 100 μL 4 ′, 6-Diamidin-2-phenindl (DAPI) Reagenz für 5 min hinzufügen. Waschen Sie den Vorgang 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser und wiederholen Sie den Vorgang für weitere 5 Minuten.
  6. Versiegeln: Wischen Sie überschüssiges Xylol um die Scheiben herum und versiegeln Sie, indem Sie ca. 100 μl neutrales Harz auf die Oberfläche der Scheiben geben und dann mit einem Deckglas abdecken.
  7. Mikroskopie: Legen Sie die gefärbten Scheiben auf das Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops für eine klare Sicht ein, stellen Sie die Vergrößerung auf 400x ein und nehmen Sie das Bild auf. Beobachten Sie die grüne Fluoreszenz bei 520 ± 20 nm mit einem Standard-Fluoreszenzfilter. Beobachten Sie den blauen DAPI bei 460 nm.
  8. Berechnen Sie die Apoptose-Rate: Messen Sie die grünen Fluoreszenzwerte und die blauen Fluoreszenzwerte der äußeren retinalen Kernschicht. Berechnen Sie die Apoptoserate als
    Apoptose-Zellrate = grüner Fluoreszenzwert/blauer Fluoreszenzwert x 100.

6. Western-Blot-Analyse 10

  1. Behandlung mit Lysepuffer: Zerkleinern und homogenisieren Sie eine gefrorene Netzhaut mit 50 μl kaltem Lysepuffer (1 ml Lysepuffer mit 5 μl Phosphatase-Inhibitor, 1 μl Protease-Inhibitor und 5 μl 100 mM PMSF).
  2. Unterliegt einer 28 kHz Beschallung für 5 s in einem Eisbad; 3x wiederholen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 10.000 x g , um Zelltrümmer zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand auf.
  3. em>6.3Quantifizierung des Proteins: Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Reagenzkit.
  4. em>6.4Elektrophorese: 50 μg Proteinprobe laden und auf 12 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) abtrennen.
  5. Übertragung auf Membran: Elektrophoretische Übertragung auf PVDF-Membranen mit einem elektrophoretischen Transfersystem.
  6. Membranen unterteilen: Unterteilen Sie die Membranen und analysieren Sie jedes Protein von Interesse, β-Aktin und GAPDH aus einem einzigen Transfer.
  7. Blockieren: Blockieren Sie die Membranen für 1 h in TBST mit 5 % fettfreier Milch bei Raumtemperatur.
  8. Primärantikörper inkubieren: Mit dem Primärantikörper aus gespaltener Caspase-9 (1:200 Verdünnung), gespaltener Caspase-3 (1:200 Verdünnung), gespaltener Caspase-7 (1:200 Verdünnung) und β-Aktin (1:1000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Membranen 5 min mit TBST waschen, 3x wiederholen.
  9. Zweiten Antikörper inkubieren: Mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern (1:2000) 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Die Membranen 5 min mit TBST waschen, 3x wiederholen.
  10. Belichtung: Visualisieren Sie die markierten Proteine mit Western-Blot-Substrat und belichten Sie schließlich die Membranen, um die Proteinbanden in einem automatischen Belichtungsmodus zu visualisieren.
  11. Berechnen Sie den Proteingehalt7 , indem Sie die Proteinbandendichte messen.

7. Statistische Auswertung

  1. Analysieren Sie die Daten mit der SPSS 19.0-Software und stellen Sie sie als Mittelwert ± Standardabweichung dar. Führen Sie statistische Analysen der beobachteten Werte mit einer unidirektionalen Varianzanalyse durch. Nehmen Sie p< 0,05 als statistisch signifikant an.

Ergebnisse

Nach der HE-Färbung wiesen alle Netzhautschichten von Ratten in der Kontrollgruppe eine klare Gewebestruktur, eine geordnete Zellanordnung und eine gleichmäßige Färbung auf, während die Netzhautstruktur der Ratten in der Modellgruppe signifikant geschädigt war, die äußere Netzhautschicht dünner war, die äußere Kernschicht fast vollständig mit der inneren Kernschicht integriert war, die Anordnung der Zellen in der Schicht extrem ungeordnet war, Die Anzahl der Zellschichten wurde signifikant reduziert, und die Dicke der lichtempfindlichen Zellschicht und der äußeren Kernschicht war signifikant dünner. Die Dicke der äußeren Netzhautschicht betrug in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe 48 % bzw. 23 % (p < 0,01; Abbildung 2).

Die TUNEL-Methode zeigte, dass in der Kontrollgruppe keine apoptotischen Zellen nachgewiesen wurden, aber in der Modellgruppe einige apoptotische Zellen in der äußeren Kernschicht von Ratten (p < 0,01), und das TUNEL-positive Verhältnis betrug 9,6% (Abbildung 3).

Die Caspase-Proteinfamilie ist eine der Hauptfamilien, die Apoptose ausführen. Unter ihnen sind gespaltene Caspase 3, gespaltene Caspase 7 und gespaltene Caspase 9 klassische Indikatoren, die zur Bewertung der Zellapoptose7 verwendet werden. Die Ergebnisse des Western Blots zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Expression von gespaltener Caspase 3, gespaltener Caspase 7 und gespaltener Caspase 9 in der Netzhaut der Modellgruppe signifikant erhöht war (p<0,01; Abbildung 4). Dies deutet darauf hin, dass MNU eindeutig eine zelluläre Apoptose in der Netzhaut verursachen kann.

figure-results-1
Abbildung 1: Der experimentelle Arbeitsablauf. Nach intraperitonealer Injektion von MNU für 7 Tage (7d) wurde die Netzhaut von anästhesierten Ratten für die HE- und TUNEL-Färbung gewonnen. Abkürzungen: MNU = N-Methyl-N-nitrosoharnstoff; HE = Hämatoxylin-Eosin; TUNEL = terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Digoxigenin-Nick-End-Markierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Repräsentative histopathologische HE-Färbebilder am Tag 7 nach MNU-Injektion. (A) HE-Färbung an 7 Tagen (7d) nach MNU-Verabreichung. (B) Äußeres Netzhautverhältnis. Die Daten werden als mittlere ± SD (n=6) dargestellt. Statistische Analysen der beobachteten Werte wurden mit Hilfe einer unidirektionalen Varianzanalyse durchgeführt. ** p < 0,01 vs. Kontrolle. Abkürzungen: GCL = Ganglienzellschicht; IPL = innere plexiforme Schicht; INL = die Kernel-Schicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; PRL = Photorezeptorschicht; MNU = N-Methyl-N-nitrosoharnstoff; HE = Hämatoxylin-Eosin. n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Der TUNEL-Assay zeigt die durch MNU induzierte Apoptose der Photorezeptoren bei Ratten. (A) 7 Tage (7d) nach der MNU-Injektion wurden TUNEL-positive Zellen (grün) in der ONL bei mit MNU behandelten Ratten präsentiert. (B) TUNEL-positives Verhältnis. Die Daten werden als mittlere ± SD (n=6) dargestellt. Statistische Analysen der beobachteten Werte wurden mit Hilfe einer unidirektionalen Varianzanalyse durchgeführt. ** p < 0,01 vs. Kontrolle. Abkürzungen: GCL = Ganglienzellschicht; IPL = innere plexiforme Schicht; INL = die Kernel-Schicht; OPL = äußere plexiforme Schicht; ONL = äußere Kernschicht; PRL = Photorezeptorschicht; MNU = N-Methyl-N-nitrosoharnstoff; TUNEL = terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Digoxigenin-Nick-End-Markierung. n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Expression von gespaltener Caspase 3, gespaltener Caspase 7 und gespaltener Caspase 9 in der Netzhaut von Ratten am Tag 7 nach der MNU-Injektion. (A) Repräsentative Daten für die Expression von gespaltener Caspase. (B) Verhältnis von gespaltener Caspase 3/β-Aktin. (C) Verhältnis von gespaltener Caspase 7/β-Aktin. (D) Verhältnis von gespaltener Caspase 9/β-Aktin. Die Daten werden als mittlere ± SD (n=6) dargestellt. Statistische Analysen der beobachteten Werte wurden mit Hilfe einer unidirektionalen Varianzanalyse durchgeführt. ** p < 0,01 vs. Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

RP ist eine häufige Netzhauterkrankung in Kliniken. Der Beginn, der Schweregrad und das Fortschreiten der RP hängen mit Genen und genetischen Modi zusammen und werden von der Umwelt beeinflusst 8,11. RP umfasst familiäre RP und gelegentliche RP, von denen familiäre RP etwa 60% der Patienten ausmacht. Durch die Rückverfolgung der genetischen Anamnese der Familie wurden bisher 83 Gene identifiziert, die mit RP in Verbindung stehen, während gelegentliche RP etwa 40 % ausmacht, was bedeutet, dass diese Art von Patienten keine Familienanamnese hat und ein unregelmäßiges genetisches Muster aufweist2. Obwohl die Apoptose von retinalen Photorezeptorzellen, die den Verlust der Sehfunktion bei RP-Patienten verursacht, eine allgemeine Anerkennung ist, bleibt der zugrunde liegende Mechanismus des Photorezeptortods bei RP unklar 12,13,14. Aufgrund des eingeschränkten Zugangs zu humanem Netzhautgewebe, das hauptsächlich im Rahmen der Vitrektomie gewonnen wird, ist die Extraktion von Netzhautgewebe von Modelltieren nach wie vor eine gängige Methode in der Grundlagenforschung von RP14,15.

Die Netzhaut ist eine transparente Membran, die sich in der inneren Schicht des Augenbulbus befindet, wobei sich die Glaskörperhöhle im Inneren und die Aderhaut nahe der Außenseite befindet. Die Netzhaut beginnt am gezackten Rand vorne und endet an der optischen Scheibe im Hintergrund. Es ist der erste Teil der Sehbildung16. Netzhautproben von Modelltieren werden hauptsächlich für die retinale PCR-Analyse, den Western-Blot-Nachweis, die Beobachtung pathologischer Gewebestrukturen, immunhistochemische Färbungen, Immunfluoreszenzuntersuchungen, die Bewertung der mikrovaskulären Dichte, die Zellisolierung und -kultur usw. verwendet.17,18. Die Anforderungen an die Netzhautprobenahme für verschiedene Testindizes sind unterschiedlich. Die Probenahme von Netzhautproben zum Nachweis von Proteinfaktoren bei Modelltieren und die Probenahme von Netzhautproben für in Paraffin eingebettete Schnitte sind gängige Operationstechniken für das Screening von Medikamenten auf RP8. Aufgrund der sehr feinen und komplexen Struktur des Augapfels des Modelltieres gestaltet sich der Prozess der Entfernung von störendem Gewebe im Auge und der Gewinnung von Netzhautpräparaten jedoch kompliziert. Während des Probenahmeprozesses kann es zu einem Verlust von Netzhautgewebe, einer Kontamination, einem Proteinabbau und einer Netzhautablösung kommen. Diese Faktoren haben einen Einfluss auf die Qualität und Quantität der Extraktion von retinalen Proteinen sowie auf den Einfluss der Schnittfärbung und die Nachweisergebnisse experimenteller Indikatoren. Daher ist ein geeignetes Verfahren zur Probenahme der Netzhaut erforderlich.

Es ist von entscheidender Bedeutung, den Komplex zu vereinfachen und den Schlüsselzusammenhang der Entnahme zu verstehen, um die Technik der Netzhautentnahme bei Modelltieren zu verbessern. Eine schnelle Freilegung der Netzhaut und eine weitestgehende vollständige Entfernung der Netzhaut sind die wichtigsten Schritte der Netzhautprobenahme zum Nachweis von Proteinfaktoren bei Modellratten. In dieser Studie wurden die Augäpfel direkt nach der Anästhesie extrahiert, um Zeit für die Probenahme zu sparen. Ein Trick, um die Netzhaut freizulegen, besteht darin, die Augenmuschel über ein 1,5-ml-Röhrchen zu drehen, was kostengünstig und praktisch war und die Netzhaut vollständig von der Skleralwand ablösen konnte. Dieses Operationsverfahren ist einfach, schnell, kostensparend und förderlich für die Praxis der experimentellen Personaloperation, so dass es in 5 Minuten abgeschlossen werden kann. Bei der Probenahme der Netzhaut für die pathologische Untersuchung und die spezifische Zellfärbung ist die Erhaltung der Frische und strukturellen Integrität der Netzhaut ein wichtiger Schritt auf dem Weg zu einer qualitativ hochwertigen Färbung. Die Perfusion mit Formaldehyd aus dem linken Vorhof und die anschließende Gewinnung der Netzhaut ist eine der Methoden, die Forscher häufig anwenden, aber sie ist zeitaufwändig, und Formaldehyd riecht schlecht und bringt dem Bediener Unbehagen19. In dieser Studie wird das Gewebe um den Augapfel nach der Anästhesie in einen Ring getrennt, um seine Integrität zu erhalten. Nachdem der Sehnerv durchtrennt und erhalten wurde, trennen Sie das Gewebe um ihn herum am hinteren Pol des Augapfels und entfernen Sie den Augapfel. Verschiedene Teile des Augapfels wurden genau mit dem Sehnerv lokalisiert. Schließlich wurde mit Unterstützung des Augeninhalts der Schnitt gemacht, die Hornhaut in einem Ring abgeschnitten, die Linse und der Glaskörper abgezogen und die Augenmuschel erhalten, die den Sehnerv verbindet (die Netzhaut befindet sich an der Sklerawand im Inneren der Augenmuschel). Dabei sollte die Operation schonend erfolgen, um die Integrität der Netzhaut zu erhalten. Das Operationsverfahren verbessert nicht nur die Geschwindigkeit des Sammelns von Materialien erheblich, sondern kann auch die vollständige normale Struktur und Form des Augapfels beibehalten und kann nach dem Herausnehmen des Augapfels genau in den verschiedenen Teilen des Augapfels lokalisiert werden. Nach einer geschickten Operation kann die Operation in 8 Minuten abgeschlossen werden. Durch die Verwendung der oben genannten retinalen Probenahmemethoden erhielt unsere Forschungsgruppe relativ ideale Ergebnisse zum Nachweis von Proteinfaktoren, HE-Färbungen und TUNEL-Färbeergebnissen.

Obwohl die derzeitige Methode der Netzhautprobenahme einige Vorteile hat, muss sie noch verbessert werden. Bei der Entnahme von Netzhautproben zum Nachweis von Proteinfaktoren besteht nach Freilegung der Netzhaut auch das Risiko einer unvollständigen Netzhautdissektion oder eines Verlusts bei der Entnahme der Netzhaut durch Biegen einer Pinzette aufgrund des begrenzten Stützpunkts der Biegepinzette. Daher ist es notwendig, die Werkzeuge für die Netzhautdissektion zu verbessern. Auf der anderen Seite kollabiert bei der Netzhautextraktion für die pathologische Untersuchung und spezifische Zellfärbung nach der Isolierung des Augapfels, während des Prozesses des Streifens der Linse und des Glaskörpers, die Augapfelwand aufgrund des Verlusts der Unterstützung durch das Auge, was leicht zu einem Netzhautstripping führen kann. Daher muss die Operation schnell, sanft und von angemessener Kraft sein, und der Bediener muss häufig üben. Daher müssen unsere Verfahren zur Probenahme der Netzhaut noch verbessert werden, um die Erforschung der Schutzwirkung und des Schutzmechanismus der Schulmedizin gegen RP stärker zu fördern.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Wissenschaftliche Forschungsprojekt des Higher Education Department von Ningxia (NYG2022029) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amersham ImagerGE680
Ammoniumpersulfat  Boster Biological Technology Co.,LtdA8090
AnalysenwaageMettler ToledoME104E
BCA-Proteinquantisierungskit  Ken Gen, Biotech. Co. LtdKGP902
gespaltener Caspase-3-AntikörperCell Signaling Technology#9664
gespaltener Caspase-7-AntikörperCell Signaling Technology#8438
gespaltener Caspase-9-AntikörperCell Signaling Technology#9507
DeadEnd Fluorometrisches TUNEL-SystemPromegaG3250
Glycin  Boster Biological Technology Co.,LtdAR1200
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (HRP)Bioss Antikörperbs-80295G-HRP
ZiegenserumBiosharpBL210A
HochgeschwindigkeitszerkleinererThermo Fisher WissenschaftlicheAG22331
Immobilon-P SQ Transfermembranen,Merck Millipore. LtdISEQ00010
IsofluranRWD Life ScienceR510-22-10
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Mikroplatten-ReaderThermo Fisher  Scientific1510
MikroskopOlympusIX73
ObjektträgerCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Methyl-N-Nitrosoharnstoffsigma-AldrichN4766– 100G
OfenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Seite Vorlösung (30%) )Doublehelix Biology Science and Technology Co., LtdL3202A
PageRuler Vorgefärbte ProteinleiterThermo Fisher Scientific26617
PBS PufferBiosharpG4202
SDS-PAGE Proteinladepuffer (5& mal;)Beyotime BiotechnologyP0015
MagermilchpulverBioFroxx1172GR500
Sprague Dawley RattenNingxia Medical UniversitySCXK (Ning) 2020-0001
TEMED  Boster Biological Technology Co., LtdAR1165
Gesamtprotein-Extraktionskit  Ken Gen, Biotech. Co. LtdKGP2100
Trans-Blot-ModulBIO-RAD1703935 Tris-Basis
  Boster Biological Technology Co., LtdAR1162
Pinzette Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-Aktin-Zellsignaltechnologie#4970

Referenzen

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Evaluierung der RetinopathieRattenretinaH matoxylin Eosin F rbungApoptoserateTUNEL AssayWestern BlotRetinopathie in der traditionellen Medizin
Video demnächst verfügbar

Verwandte Artikel