Methodenartikel

Standardisierung einer neuartigen halbautomatischen Software zur Messung des Neuritenwachstums

DOI:

10.3791/67163

⸱

9. August 2024

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1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Neurit-Outgrowth-Assays liefern einen quantitativen Wert über regenerative neuronale Prozesse. Der Vorteil dieser halbautomatischen Software besteht darin, dass sie Zellkörper und Neuriten getrennt segmentiert, indem sie eine Maske erstellt und verschiedene Parameter wie Neuritenlänge, Anzahl der Verzweigungspunkte, Zell-Körper-Clusterfläche und Anzahl der Zellcluster misst.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Effektive Live-Bildgebungsverfahren sind entscheidend, um die neuronale Morphologie zu beurteilen und das Wachstum von Neuriten in Echtzeit zu messen. Die korrekte Messung des Neuritenwachstums war im Laufe der Jahre eine langjährige Herausforderung im Bereich der neurowissenschaftlichen Forschung. Dieser Parameter dient als Eckpfeiler in zahlreichen in vitro Versuchsaufbauten, die von dissoziierten Kulturen über organotypische Kulturen bis hin zu Zelllinien reichen. Durch die Quantifizierung der Neuritenlänge kann festgestellt werden, ob eine bestimmte Behandlung funktioniert hat oder ob die axonale Regeneration in verschiedenen Versuchsgruppen verstärkt ist. In dieser Studie geht es darum, die Robustheit und Genauigkeit der Software zur Analyse des Neuritenwachstums von Incucyte Neurotrack zu demonstrieren. Diese halbautomatische Software ist in einem Zeitraffer-Mikroskopie-System erhältlich, das bei der Quantifizierung der Neuritenlänge in Phasenkontrastbildern mehrere Vorteile gegenüber den gängigen Methoden bietet. Der Algorithmus maskiert und quantifiziert mehrere Parameter in jedem Bild und gibt neuronale Zellmetriken zurück, einschließlich Neuritenlänge, Verzweigungspunkte, Zell-Körper-Cluster und Zell-Körper-Cluster-Flächen. Zunächst haben wir die Robustheit und Genauigkeit der Software validiert, indem wir ihre Werte mit denen des manuellen NeuronJ, einem Fiji-Plug-in, korreliert haben. Zweitens haben wir den Algorithmus verwendet, der sowohl mit Phasenkontrastbildern als auch mit immunzytochemischen Bildern arbeiten kann. Unter Verwendung spezifischer neuronaler Marker validierten wir die Machbarkeit der fluoreszenzbasierten Analyse des Neuritenwachstums an sensorischen Neuronen in vitro-Kulturen . Darüber hinaus kann diese Software die Länge von Neuriten über verschiedene Seeding-Bedingungen hinweg messen, die von einzelnen Zellen bis hin zu komplexen neuronalen Netzen reichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Software eine innovative und zeitsparende Plattform für Neuriten-Outgrowth-Assays bietet und den Weg für schnellere und zuverlässigere Quantifizierungen ebnet.

Einleitung

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Bei Ischiasnerven ist es möglich, die axonale Regeneration zu messen1. Darüber hinaus haben In-vitro-Studien gezeigt, dass es machbar ist, das axonale Wachstum 2,3 zu überwachen, um seine verschiedenen Phasen, von der axonalen Keimung bis zur axonalen Degeneration, sowohl in gesunden als auch in verletzten Neuronen zu verstehen. Durch die Verfolgung dieser Prozesse ist es möglich, Parameter wie axonale Polarität, Initiierung, Stabilität und Verzweigung zu messen. Der letzte Parameter ist entscheidend für das Verständnis der neuropathischen Schmerzwahrnehmung 4,5,6. In ähnlicher Weise kann die axonale Degeneration in vivo7 oder in vitro 8,9 überwacht werden. Während des Auswachsens von Neuriten stabilisieren sich Aktin und Mikrotubuli Zytoskelett-Netzwerke oder verändern sich entsprechend den Bedürfnissen der Zelle10. Das Aktin-Zytoskelett reorganisiert sich, um die Bildung des axonalen Wachstumskegels zu ermöglichen, und die Mikrotubuli richten sich zu Bündeln neu aus, um den wachsenden Neuritzu stabilisieren 11. Um das Wachstum von Neuriten aus zentralen und peripheren Neuronen in vitro zu untersuchen, werden drei gängige Parameter quantifiziert: die Gesamtlänge des Axons, der maximale Abstand und die Verzweigungspunkte. Diese Parameter werden verwendet, um die Reaktion der Neuronen auf die Behandlung (d. h. Neurotrophine, Verbindungen, Inhibitoren, Retinsäure, siRNA, shRNA) oder bei genetisch veränderten Tieren zu untersuchen 12,13,14. Um beurteilen zu können, ob Neuronen länglichere Neuriten und/oder mehr Verzweigungen aufweisen, ermöglichen uns diese drei Parameter, die Morphologie eines Neurons zu beurteilen. Die Messung der Neuritlängen ist der wichtigste Parameter in mehreren in vitro Versuchsaufbauten. Aus Spinalganglien werden hauptsächlich zwei Arten von Kulturen durchgeführt: dissoziierte in vitro-Kulturen oder organotypische Kulturen ganzer DRG-Explantate. In beiden Fällen ist die Neuritenlänge ein Goldparameter, um das Ergebnis des Experiments zu beurteilen. In einer Motoneuron-ähnlichen Zelllinie (NSC-34) werden axonales Wachstum und Verzweigung nach Differenzierung durch Retinsäure gemessen15,16. Tatsächlich ist es durch die Messung des Neuritenauswuchses möglich zu bestimmen, ob eine bestimmte Behandlung gewirkt hat17, die Wachstumsrate18 oder die Regenerationsfähigkeit nach einem Verletzungseingriff19.

Die richtige Beurteilung des Neuritenwachstums hat im Laufe der Jahre eine Reihe von Herausforderungen im Forschungsbereich mit sich gebracht. Es gibt jedoch keine Standardisierung der Neuritenlängenmessungen. Einige der am häufigsten verwendeten Methoden für in vitro Zellkulturen sind z.B. das manuelle NeuronJ Plug-in auf Fiji18,20 oder MetaMorph21,23 und das halbautomatische Neurolucida23,24. Neben manuellen Methoden gibt es auch automatische Methoden, wie z. B. das NeuriteTracer-Plug-in auf Fiji25, die HCA Vision Software26,27 oder WIS-NeuroMath 2,28. Andere, weniger genaue Methoden beruhen auf der Messung der Gesamtdimension der Neuronen. Zu diesen Methoden gehören die Messung des Vektorabstands vom Zellkörper bis zur Spitze des längsten Axons29 oder die Sholl-Analyse30. Diese Messmethoden eignen sich jedoch für Kulturen mit sehr geringer Dichte oder einzelne Neuronen. Darüber hinaus werden alle diese Methoden hauptsächlich bei gefärbten Neuronen oder Neuronen angewendet, die genetisch kodierte Fluorophore exprimieren (z. B. GFP, Venus, mCherry). Die Art des Neurons und die Dichte der Zellkultur haben einen großen Einfluss auf die Wahl der Messmethode. Zum Beispiel kann die manuelle Segmentierung von Neuronen mit sehr komplizierten und komplizierten Morphologien, wie z. B. DRG-Neuronen, leicht zu einer unmöglichen Aufgabe werden. Wenn verschachtelte Neuronen bereits eine Herausforderung bei der Segmentierung darstellen, sind neuronale Netze aufgrund ihrer hochkomplexen Organisation für manuelle Ansätze völlig unerreichbar.

Einerseits ist die manuelle Segmentierung sehr präzise, da sie vom menschlichen Auge und der Intelligenz durchgeführt wird; Auf der anderen Seite ist es wirklich zeitaufwändig. Der erhöhte Zeitaufwand, der durch manuelle Methoden erforderlich ist, ist der größte Nachteil. Aus diesem Grund werden nur wenige Neuronen für die Analyse gewonnen, was sie ungenauer und zeitsparender macht. Automatische oder halbautomatische Ansätze reduzieren hingegen teilweise den Zeitaufwand. Sie haben jedoch auch einige Nachteile. Automatische Methoden müssen trainiert werden, um richtig zu funktionieren, und wenn die Software nicht interaktiv genug mit dem Benutzer ist, kann die Segmentierung falsch sein.

Neben der Messung des Neuritenwachstums ist auch die Anzahl der Verzweigungspunkte eine wertvolle Information. Bei der manuellen Segmentierung kann die Anzahl der Verzweigungspunkte berechnet werden, während dies bei einem Vektorabstand nicht möglich ist. Bei automatischen Verfahren wird in der Regel die Anzahl der Verzweigungspunkte angegeben, während sie bei der Sholl-Analyse mit einer mathematischen Formel berechnet werden muss.

In diesem Methodenpapier wollen wir die Funktionalität und Effektivität dieser halbautomatischen Software bei der Messung der Gesamtaxonlänge und anderer Parameter beschreiben. Das Gerät ermöglicht die automatische Aufnahme von Bildern zu definierten Zeitpunkten oder die Durchführung von Langzeitstudien (Tage, Wochen, Monate), wobei eine physiologische Umgebung für lebende Zellen erhalten bleibt. Die Messung des Neuritenwachstums mittels Phasenkontrast-Zeitraffer-Bildgebung hat den Vorteil, dass sie eine kontinuierliche Überwachung der Neuritenkinetik und des Neuritenwachstums ermöglicht. Darüber hinaus ist es auch möglich, den Zelltod durch Zugabe von spezifischen Farbstoffen in den Medien zu überwachen, die auf tote Zellen abzielen 31,32,33. Obwohl die Software bereits im Jahr 2012 veröffentlicht wurde, sind wir die ersten, die diese Methodik auf reproduzierbare und unvoreingenommene Weise für die genaue Quantifizierung des Neuritenwachstums standardisiert haben. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Software nicht beim Kauf der Maschine enthalten ist. Trotz dieses zusätzlichen Aufwands bietet seine Verwendung erhebliche Vorteile bei der Messung der Gesamtaxonlänge und anderer Parameter und trägt damit zur Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften bei.

Protokoll

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1. Scannen des Behälters an der Maschine

HINWEIS: Die Erkennung erfolgt durch die eingebaute Basler Ace 1920-155 μm Kamera.

  1. Öffnen Sie das Programm, indem Sie auf Mit Gerät verbinden klicken und Zeitplan - Erwerben auswählen. Klicken Sie dann auf das + -Zeichen.
  2. Legen Sie fest, ob das Schiff wiederholt oder nur 1x gescannt werden soll, indem Sie die Option "Nach Zeitplan scannen " bzw. " Einmal jetzt scannen" auswählen.
  3. Wählen Sie Neu aus, um ein brandneues Gefäß zum Scannen zu erstellen. Wenn kein neues Gefäß hinzugefügt wird, erstellen Sie einen neuen Scan mit einer der unten beschriebenen Optionen.
    1. Wählen Sie Aktuell kopieren aus, um ein neues Schiff zu erstellen, indem Sie ein Schiff aus dem aktuellen Fahrplan kopieren. Wählen Sie Vorherige kopieren , um ein neues Gefäß zu erstellen, indem Sie ein zuvor gescanntes Gefäß kopieren.
    2. Wählen Sie Scan hinzufügen , um ein zuvor gescanntes Gefäß für weitere Scans wiederherzustellen.
  4. Wählen Sie den Scan-Typ basierend auf dem Assay und der Anwendung aus. Wählen Sie für die Analyse Standard aus.
  5. Legen Sie die Scan-Einstellungen fest. Wählen Sie eine der Optionen "Zelle für Zelle", "Keine", "Adhärente Zelle für Zelle" oder "Nicht adhärente Zelle" und geben Sie die Bildkanäle in Abhängigkeit von den verwendeten fluoreszierenden Molekülen an. Wählen Sie die Option Keine für adulte und embryonale sensorische Neuronenkulturen. Wählen Sie für Zelllinien die Optionen "Keine" oder "Zelle für Zelle haften " aus.
  6. Wählen Sie das Mikroskopobjektiv (4x, 10x, 20x). Erfassen Sie mit der höheren Vergrößerung (20x) in Primärkulturen, während in Zelllinien 10x ausreichend ist.
  7. Wählen Sie den zu scannenden Gefäßtyp aus den bereitgestellten Optionen aus. Geben Sie die Position des Gefäßes in der Schublade an, indem Sie seine Position auf der virtuellen Karte der Schublade auswählen.
  8. Geben Sie das Scanmuster für die Bildaufnahme an, indem Sie die zu scannenden Vertiefungen auswählen. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Bildern pro Vertiefung aus. Eine Schätzung der Scandauer wird angezeigt.
  9. Geben Sie Informationen über das Schiff an, indem Sie den Namen eingeben, und geben Sie die Tafelkarte an, indem Sie auf das + -Zeichen klicken.
  10. Klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den Analysetyp aus, und klicken Sie auf Weiter. Es wird eine Zusammenfassung der ausgewählten Optionen angezeigt. Wenn korrekt, klicken Sie auf Jetzt scannen und der Scan wird gestartet.

2. Aufbau für die Phasenkontrast-Bildanalyse

HINWEIS: Die Neurotrack-Analyse kann nur an Bildern durchgeführt werden, die zuvor vom Gerät aufgenommen wurden.

  1. Wählen Sie das gescannte Gefäß aus, das analysiert werden soll. Wählen Sie Analyse starten aus. Wählen Sie Neue Analysedefinition erstellen aus.
  2. Wählen Sie Neurotrack aus. Wählen Sie Bildkanäle aus. Wählen Sie einen repräsentativen Satz von Bildern aus, für den die Analyse durchgeführt werden soll. Wählen Sie alle Bilder für jedes Well aus, um den Algorithmus zu trainieren.
  3. Verfeinern Sie die Einstellungen für die Analysedefinition, indem Sie die folgenden Parameter anpassen.
    HINWEIS: Standardmäßig sind Neuriten in Magenta segmentiert, während Zellkörper gelb sind. Es ist möglich, die Farben nach Belieben zu ändern.
    1. Passen Sie für die Segmentierung von Zell-Körper-Clustern die folgenden Schritte wie unten beschrieben an.
      1. Segmentierungsmodus: Die Segmentierung der Bilder erfolgt zur Unterscheidung von Zellkörpern von Hintergrund und Neuriten. Wählen Sie zwischen Helligkeit und Textur. Wählen Sie für Primärkulturen und Zelllinien den Helligkeitsmodus.
      2. Segmentierungsanpassung: Verwenden Sie den Schieberegler, um die Segmentierungsempfindlichkeit in Richtung mehr Hintergrund oder mehr Zellen anzupassen. Er reicht von 0 (Hintergrund) bis 2 (Zellen). Sie vergrößert oder verkleinert die gelbe Maske. Verschieben Sie den Schieberegler in Richtung 0 (Hintergrund), damit die Größe der gelben Maske allmählich verringert wird und Platz für die magentafarbene Maske bleibt. Das Gegenteil ist der Fall, wenn der Schieberegler in Richtung 2 (Zellen) verschoben wird.
    2. Passen Sie für die Bereinigung Folgendes wie unten beschrieben an.
      1. Lochfüllung (μm2): Passen Sie diese Option an, um Löcher in der Zellkörpermaske zu entfernen, die kleiner sind als der vom Benutzer angegebene Bereich.
      2. Größe anpassen (Pixel): Vergrößern (wenn positiv) oder verkleinern (wenn negativ) die gelbe Maske um die angegebene Anzahl von Pixeln. Sie reicht von -10 bis +10. Passen Sie diese Option an, um die gelbe Segmentierung bei Objekten mit hohem Kontrast, wie z. B. toten Zellen und Zelltrümmern, hinzuzufügen oder zu entfernen.
      3. Minimale Zellbreite (μm): Wählen Sie einen Wert, um die Größe zu definieren, ab der Zellkörper als Neuriten betrachtet werden.
    3. Passen Sie für Zellkörper-Cluster-Filter die folgenden Schritte wie unten beschrieben an.
      1. Fläche (μm2): Legen Sie einen minimalen und einen maximalen Wert für die Zellkörperfläche fest. Werte, die über und unter den eingestellten Werten liegen, werden nicht als Zellkörper betrachtet.
    4. Für Neuriten-Parameter passen Sie Folgendes wie unten beschrieben an.
      1. Filterung: Es reduziert die Maskierung von kleinen Gefäßfehlern und Ablagerungen. Wählen Sie zwischen den Optionen Keine, Besser und Best. Wählen Sie None nur für sehr saubere Kulturen und Gefäße. Wählen Sie Better für eine schnellere Verarbeitung auf Kosten des Verlusts der Detektion sehr feiner Neuriten. Es kann für Zellen mit dicken oder kontrastreichen Neuriten ausreichend sein; Es kann auch für Schiffe mit vielen Unvollkommenheiten oder Ablagerungen nützlich sein. Wählen Sie Best für eine längere Verarbeitungszeit, aber es ist die empfindlichste Filtereinstellung, um den Nachweis sehr feiner Neuriten zu gewährleisten.
      2. Neuritenempfindlichkeit: Verwenden Sie diese Option, um die Erkennungsempfindlichkeit anzupassen. Erhöhen Sie die Empfindlichkeit, um feinere Neuriten zu erkennen. Er reicht von 0,25 (weniger) bis 0,75 (mehr).
        HINWEIS: Es erhöht oder verringert die Empfindlichkeit der Software bei der Erkennung von Neuriten. Wenn der Schieberegler in Richtung 0,25 (weniger) bewegt wird, ist die Software strenger bei der Erkennung von Neuriten. Wenn der Schieberegler stattdessen in Richtung 0,75 (Mehr) bewegt wird, ist die Software bei dieser Erkennung weniger streng, und daher werden mehr Unvollkommenheiten (z. B. Zelltrümmer, Schmutz) als Neuriten betrachtet.
      3. Neuritenbreite (μm): Verwenden Sie diese Option, um die Detektion auf die Größe der Neuronen abzustimmen. Es kann 1, 2 oder 4 sein. Durch die Erhöhung werden die dünneren Neuriten nicht berücksichtigt. Legen Sie den Wert auf 1 für primäre adulte sensorische Neuronenkulturen und 2 für Zelllinien und embryonale sensorische Neuronenkulturen fest.
  4. Klicken Sie auf Vorschau aktuell , um das segmentierte Bild zu visualisieren. Für jedes Bild werden die folgenden Maße angegeben: Neuritlänge (mm/mm 2), Neurit-Verzweigungspunkte (pro mm2), Zell-Körper-Cluster (pro mm2) und Zell-Körper-Cluster-Fläche (mm 2/mm 2).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für alle ausgewählten Bilder. Klicken Sie auf Weiter.
  6. Wählen Sie die Scanzeit und das zu analysierende Bohrloch aus. Vergeben Sie einen Definitionsnamen und, falls erforderlich, Analysehinweise. Klicken Sie auf Weiter > Fertigstellen.

3. Aufbau für die Immunzytochemie (ICC) Bildanalyse

  1. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1 bis 2.4. Wählen Sie die Bildkanäle für Neuriten und Zellkerne aus. Wählen Sie die Gruppe von Bildern aus. Wählen Sie Alle Bilder für jedes Well aus, um den Algorithmus zu trainieren.
  2. Verfeinern Sie die Einstellungen für die Analysedefinition, indem Sie die folgenden Parameter wie unten beschrieben anpassen.
    HINWEIS: Standardmäßig sind Neuriten blau segmentiert, während Zellkörper violett sind. Die Farben können jedoch nach Belieben geändert werden.
    1. Zell-Körper-Cluster-Segmentierung: Verwenden Sie diese Option, um das Bild in Objekte von Interesse zu segmentieren. Schätzen Sie die Hintergrundhelligkeit bei jedem Pixel im Bild. Nachdem der Hintergrund gefunden wurde, führen Sie eine der folgenden Optionen aus.
      1. Keine Hintergrundsubtraktion: Verwenden Sie diese Option, um zu segmentieren, ohne das Originalbild zu verändern. Wählen Sie zwischen adaptivem oder festem Schwellenwert. Adaptiv: Der Hintergrund wird verwendet, um Objekte zu finden, aber nicht explizit subtrahiert; Mit dieser Option ist es möglich, die Schwellenwertanpassung (GCU) einzustellen. Fester Schwellenwert: Objekte, die heller als dieser Schwellenwert sind, werden im Originalbild erkannt; Mit dieser Option ist es möglich, den Schwellenwert (GCU) festzulegen.
      2. Hintergrundsubtraktion: Verwenden Sie diese Option, um den Hintergrund mithilfe einer Top-Hat-Transformation vom Bild zu subtrahieren und dann einen Schwellenwert darauf anzuwenden. Legen Sie mit dieser Option Radius und Schwellenwert fest. Radius: Es wird eine Scheibe mit diesem Radius verwendet. Die Festplatte sollte groß genug sein, damit sie nicht vollständig in ein Objekt im Image passt. Schwellenwert: Objekte, die heller als dieser Schwellenwert sind, werden im Bild mit subtrahiertem Hintergrund erkannt.
    2. Bereinigung: Verwenden Sie dazu die folgende Option.
      1. Lochfüllung (μm2): Verwenden Sie diese Option, um Löcher in der Zellkörpermaske zu entfernen, die kleiner als der angegebene Bereich sind.
      2. Größe anpassen (Pixel): Verwenden Sie diese Option, um die violette Maske um die angegebene Anzahl von Pixeln zu vergrößern (wenn positiv) oder zu verkleinern (wenn negativ). Der Bereich liegt zwischen -10 und +10. Es fügt Violett auf kontrastreichen Objekten wie abgestorbenen Zellen und Zelltrümmern hinzu oder entfernt es.
      3. Minimale Zellbreite (μm): Verwenden Sie diese Option, um die Größe zu definieren, ab der Zellkörper als Neuriten betrachtet werden.
    3. Zellenkörper-Clusterfilter: Verwenden Sie die folgende Option, um die Filter anzuwenden.
      1. Fläche (μm2): Legen Sie einen minimalen und einen maximalen Wert für die Zellkörperfläche fest. Werte, die über und unter den eingestellten Werten liegen, werden nicht als Zellkörper betrachtet.
    4. Neuritenparameter: Verwenden Sie die folgende Option, um diese festzulegen.
      1. Grobempfindlichkeit des Neuriten: Verwenden Sie diese Option, um die Helligkeit der Neuriten anzupassen. Die Empfindlichkeit sollte erhöht werden, wenn die Fluoreszenzintensität der Neuriten gering ist. Er reicht von 0 (weniger) bis 10 (mehr). Es erhöht oder verringert die Empfindlichkeit der Software, um weniger helle Neuriten zu erkennen. Optimale Werte liegen zwischen 7 und 10; Beachten Sie, dass, wenn es auf 10 eingestellt ist, es sehr wahrscheinlich ist, dass auch der Hintergrund bei der Neuritenmessung berücksichtigt wird.
      2. Neurit-Feinempfindlichkeit: Verwenden Sie diese Option, um die Erkennungsempfindlichkeit anzupassen. Die Empfindlichkeit sollte erhöht werden, um feinere Neuriten zu detektieren. Er reicht von 0,25 (weniger) bis 0,75 (mehr). Es erhöht oder verringert die Empfindlichkeit der Software, um feine und weniger helle Neuriten zu erkennen. Wenn der Schieberegler in Richtung 0,25 (weniger) bewegt wird, berücksichtigt die Software schwache Neuriten nicht. Wird der Schieberegler stattdessen in Richtung 0,75 (Mehr) bewegt, erkennt die Software auch sehr schwache (fast im Hintergrund) Neuriten.
      3. Neuritenbreite (μm): Verwenden Sie diese Option, um die Erkennung auf die Größe der Neuronen abzustimmen. Es kann 1, 2 oder 4 sein. Durch die Erhöhung werden die dünneren Neuriten nicht berücksichtigt. Setzen Sie es auf 1 für primäre adulte sensorische Neuronenkulturen, auf 2 für Zelllinien und embryonale sensorische Neuronenkulturen.

4. Datenexport

  1. Öffnen Sie die Analyse. Klicken Sie auf Graph Metrics.
  2. Wählen Sie die Metrik, die Zeitpunkte und die Wells aus, die Sie interessieren möchten.
  3. Wählen Sie die Gruppierungsoption zwischen Alle, Keine, Spalten, Zeilen und Plattenzuordnungsreplikate aus.
  4. Klicken Sie auf Daten exportieren und wählen Sie den Zielordner und ggf. weitere Optionen aus. Es wird eine .txt Datei erstellt.
    HINWEIS: Das Gerät liefert für jede Vertiefung einen einzelnen Durchschnittswert der ausgewählten Metrik. Während der Analyse ist eine manuelle Annotation erforderlich, um Einzelbildwerte abzurufen.

5. Bildexport

  1. Öffnen Sie das Gefäß. Klicken Sie auf Bilder und Filme exportieren.
  2. Wählen Sie den Exporttyp für die Bilder aus.
    1. Wählen Sie Wie angezeigt , um Bilder wie angezeigt zu exportieren. Klicken Sie auf Weiter und wählen Sie die Bilder von Interesse für den Export aus. Klicken Sie auf Weiter.
      1. Wählen Sie den Sequenztyp zwischen einem einzelnen Film oder einer Bildserie und den gewünschten Zeitpunkten aus. Klicken Sie auf Weiter.
      2. Passen Sie die Exportoptionen nach Bedarf an und klicken Sie auf Weiter. Legen Sie den Ausgabeordner, das Dateiformat und den Namen der Datei fest und klicken Sie dann auf "Exportieren".
    2. Wählen Sie "Als gespeichert", um Bilder im RAW-Format zu exportieren. Wählen Sie den Bildtyp aus.
      1. Wählen Sie die gewünschten Zeitpunkte und Vertiefungen aus. Klicken Sie auf Weiter. Legen Sie den Ausgabeordner, das Dateiformat und den Namen der Datei fest und klicken Sie dann auf "Exportieren".
  3. Bildexport mit den Segmentierungsmasken
    1. Öffnen Sie die Analyse. Klicken Sie auf das Symbol der Bildebenen. Wählen Sie die gewünschten Kanalmasken aus (Phasenneurit und Phasenzell-Körper-Cluster). Folgen Sie Schritt 5.2.

Ergebnisse

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Der Algorithmus zur Messung des Neuritenwachstums ist robust in der Lage, Neuriten sowohl in neuronalen Netzen als auch in einzelnen Neuronen zu erkennen. Es wird eine gelbe Maske erzeugt, die Objekte mit hohem Kontrast segmentiert, wie z. B. Zellkörper, Zelltrümmer, abgestorbene Zellen, Gewebeexplantate und Schatten. Zusätzlich erscheint eine magentafarbene Maske auf Neuriten unterschiedlicher Dicke. Die Werte für die Neuritenlänge werden in mm/mm2 angegeben, was bedeutet, dass die axonale Länge durch den Bereich des Bildes dividiert wurde, der 0,282739 mm2 beträgt und für jede Scanbedingung konstant ist. Um reine Werte der Neuritenlänge in mm zu erhalten, müssen die von der Software bereitgestellten Zahlen mit der Fläche des Bildes multipliziert werden.

Halbautomatische versus manuelle Methode
Bei der verwendeten Software handelt es sich um eine halbautomatische Methode zur Messung der gesamten axonalen Länge. Um die Genauigkeit der Software zu beurteilen, haben wir Messungen an denselben Neuronen mit der manuellen Methode mit dem NeuronJ-Plug-in durchgeführt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist die Segmentierungsmaske auf den Neuronen zwischen den beiden Methoden sehr ähnlich (Abbildung 1A).

Zusätzlich führten wir statistische Analysen der erhaltenen Werte durch, um ihre Korrelation zu überprüfen. Die Spearman-Korrelationsanalyse ergab einen hohen Koeffizienten r von 0,8526 und lieferte damit einen starken Beweis für die Genauigkeit und Präzision des Algorithmus (Abbildung 1B). Die automatische Messung erfordert hohe Standards an die Qualität der Kultur, die auf ihrer Sauberkeit, Dichte und Reinheit basiert. Die Ergebnisse, die mit der halbautomatischen Segmentierung erzielt werden, sind reproduzierbar und werden nicht durch individuelle Beurteilung beeinflusst. Unverzerrte Reproduzierbarkeit ist ein Problem für manuelle Methoden.

Manchmal können halbautomatische Segmentierungsfehler aus verschiedenen Gründen auftreten. In Phasenkontrastbildern konnten Verschmutzungen in der Kultur durch die halbautomatische Segmentierung als Neuriten erkannt werden. Darüber hinaus kann das Vorhandensein verschiedener Zelltypen den Segmentierungsprozess stören. Solche Probleme treten bei der manuellen Segmentierung nicht auf, da sie vom menschlichen Auge durchgeführt wird. Wenn solche Probleme jedoch auftreten, können sie durch die Verwendung immunzytochemischer Bilder als Kontrolle überwunden werden.

Segmentierung der Neuriten
Für adulte DRG-Neuronen-Primärkulturen besteht der optimale Ausgangspunkt für eine zuverlässige Phasenanalyse darin, Neuronen gleichmäßig in der Well- und Clean-Kultur plattieren zu lassen. Wenn während der Aussaat Fehler auftreten und sich die Zellen an einer Stelle konzentrieren, wie in Abbildung 2A-B dargestellt, handelt es sich bei den Werten eher um eine Schätzung als um eine genaue Widerspiegelung der Realität. In solchen Situationen bedeckt die gelbe Maske die meisten Neuriten zwischen den Zellen (Abbildung 2A-B), was zu einem Verlust der Neuritenlänge führt. Darüber hinaus wird die Software bei der Erkennung von Neuriten erheblich verzerrt sein, und es ist sehr wahrscheinlich, dass eine magentafarbene Maske auf Objekten erscheint, die keine Neuriten sind (Abbildung 2D). In einem optimalen Bild sollten bis zu 15 Neuronen bei 20-facher Vergrößerung vorhanden sein.

Wenn die Neuronen korrekt plattiert sind und die Kultur sauber ist, wie in Abbildung 3A-B dargestellt, ist es ratsam, den Segmentierungsschieberegler in Richtung Hintergrund (0,5 - 0,7; Abbildung 3C). Dies trägt dazu bei, den gelben Anteil zu reduzieren, der bei Objekten mit hohem Kontrast im Bild angezeigt wird, z. B. bei Verzweigungspunkten, die in Magenta angezeigt werden sollten. Darüber hinaus sollte eine Neuritensensitivität zwischen 0,4 und 0,5 ausreichen, um die meisten von ihnen abzudecken (Abbildung 3C-D).

Eine weitere häufige Situation, die auftreten kann, ist eine verschmutzte Kultur mit vielen Zelltrümmern und abgestorbenen Zellen, wie in Abbildung 4A-B gezeigt. Unter solchen Bedingungen gibt es viele kontrastreiche Objekte. Daher ist es ratsam, die gelbe Maske zu vergrößern, indem Sie den Schieberegler für die Segmentierung in Richtung der Zelle anpassen oder den Parameter Größe anpassen (+1, +2 usw.) erhöhen. Abbildung 4C). Nichtsdestotrotz wäre es auch sinnvoll, die Neuritenempfindlichkeit etwas zu verringern, um zu verhindern, dass die Software fälschlicherweise Objekte als Neuriten identifiziert, die keine Neuriten als solche sind. (Abbildung 4C-D).

Manchmal können Neuriten sehr dünn und blass erscheinen, wie in Abbildung 5A-B gezeigt, was die Software vor Herausforderungen stellt, sie genau zu segmentieren (Abbildung 5D). In diesem Fall ist es ratsam, die Neuritensensitivität auf mindestens 0,6 zu erhöhen (Abbildung 5C). Beachten Sie jedoch, dass je höher die Empfindlichkeit ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Software Objekte, die keine Neuriten sind, fälschlicherweise als solche markiert (Abbildung 5D). Um zu verhindern, dass die Sensitivitätsverzerrung zu stark zunimmt, können einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, z. B. durch Anpassen des Segmentierungsschiebereglers in Richtung Zellen. Wenn die Neuriten jedoch zu dünn sind, um von der Software erkannt zu werden, werden die Werte für die Neuritenlänge trotzdem verzerrt.

Bei immunzytochemischen Bildern liegt das Hauptproblem im Hintergrund. Abgesehen von den Seeding-Bedingungen, für die die oben genannten Regeln gelten, ist die Hauptquelle der Verzerrung die Fluoreszenz selbst. Die Software erkennt effektiv sehr helle Neuriten, während dünnere, weniger intensive Neuriten zurückbleiben (Abbildung 6A-B). Um einen Verlust der Neuritenlänge zu verhindern, kann die Feinempfindlichkeit des Neuriten auf bis zu 0,75 erhöht werden (Abbildung 6C). Es ist jedoch dringend ratsam, die Grobempfindlichkeit der Neuriten auf mindestens 8-9 zu reduzieren, um eine übermäßige Detektionsverzerrung zu vermeiden, indem Neuriten im Hintergrund berücksichtigt werden (Abbildung 6C-D). Wenn letzteres nicht reduziert wird, wird der gesamte Hintergrund segmentiert, wie in Abbildung 7 dargestellt.

Ein häufiges Problem bei der Fluoreszenzerfassung ist die Streuung des Lichts. Häufig zeigen immunzytochemische Bilder Blitzlichter im Bild, die die Qualität und Präzision der Analyse erheblich beeinträchtigen (Abbildung 8A-B). In einer solchen Situation kann nicht viel getan werden, um die Analyse zu verbessern, und die Werte sind eher eine Schätzung. Lichtstreuung stört die Neuritenerkennung, so dass nur sehr helle Neuriten detektiert werden (Abbildung 8C-D). Ein weiteres Problem bei immunzytochemischen Bildern ist die Qualität der Färbung an sich. Häufig können aufgrund menschlicher Fehler Axone gebrochen werden (Abbildung 9A) und Zellkörper während des Waschvorgangs weggerissen werden (Abbildung 9B). Diese Fehler stellen ein kritisches Problem dar, da die Längenwerte der Neuriten an Präzision und Genauigkeit verlieren. Infolgedessen wird die Interpretation biologischer Daten verändert, was zu falschen Schlussfolgerungen führt.

Bei embryonalen Kulturen sieht die Situation anders aus. Bei dieser Art von Kultur ist das Vorhandensein von Gliazellen vorherrschend. Folglich nehmen die Fehler deutlich zu, da die Software auch die Auskleidungen von Gliazellen erkennt (Abbildung 10A-B). Um dieses Problem zu minimieren, sollte der Segmentierungsschieberegler in Richtung Zellen verschoben werden, in der Regel um Werte von 1,7-2 (Abbildung 10C-D). Dieser Ansatz stellt sicher, dass die meisten Gliazellen von der gelben Maske bedeckt sind und somit bei der Neuritenlängenmessung nicht berücksichtigt werden. Ein weiterer nützlicher Tipp ist, die Neuritenbreite bei 2 zu halten, da embryonale Neuronen in Kultur typischerweise bipolare oder unipolare Formen mit dicken Neuriten aufweisen (Abbildung 10C-D). Diese Vorsichtsmaßnahme filtert die meisten Schleimhäute der Gliazellen heraus, die normalerweise sehr dünn sind. Achten Sie schließlich darauf, die Neuritenempfindlichkeit nicht zu stark zu erhöhen. Andernfalls wird das, was durch den Parameter Neuritenbreite herausgefiltert wurde, wieder in die Neuritenlängenmessung einbezogen.

Bei embryonalen Kulturen, in denen die Gliazellkomponente vorherrscht, könnte die Immunzytochemie die bessere Option sein. Durch die gezielte Färbung von Neuronen wird das Problem der Segmentierung von Gliazellen gelöst, da Gliazellen nicht gefärbt werden, was die Analyse viel einfacher und genauer macht (Abbildung 11).

Schließlich kann die Software auch genutzt werden, um das Differenzierungsprogramm von Zelllinien und/oder iPSCs zu bewerten und deren Wachstumszustand zu beurteilen. Somit kann die Anwendung ähnlicher Parameter und Vorsichtsmaßnahmen für unterschiedliche Ziele genutzt werden.

Was den Differenzierungsprozess betrifft, so wurde die Robustheit der Software in der NSC-34-Zelllinie (hybride Zelllinie, bestehend aus Maus-Neuroblastomzellen und Motoneuronen, die aus dem Rückenmark von Mausembryonen gewonnen werden) während der Reifung zu Motoneuronen-ähnlichen Zellen nachgewiesen. Bei DRG-Primärkulturen ist die einheitliche Zellaussaat der optimale Ausgangspunkt für eine gute Analyse. Die undifferenzierten und differenzierten Zellen können nach der Retinsäurebehandlung durch Akquisitionen während des gesamten Kulturzeitraums oder, wie in Abbildung 12 gezeigt, zum letzten Zeitpunkt verfolgt werden.

Neben der Neuritenlänge liefert der Algorithmus auch den Parameter Verzweigungspunkt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der Parameter Abzweigpunkt nicht die genaue Anzahl der Abzweigpunkte darstellt. Vielmehr gibt es die Dichte der Verzweigung im Bild an, wie sie in mm/mm2 ausgedrückt wird. Diese Messung wird maßgeblich durch Ablagerungen in der Kultur und die Aussaatkonzentration beeinflusst. Daher sind die Dichte der Neuronen im Bild und die Sauberkeit der Kultur entscheidende Faktoren, um verlässliche Werte zu erhalten. Wenn die Kultur viele Zelltrümmer enthält, die nicht durch die gelbe Maske weggefiltert werden, werden diese sowohl in die Neuritenlänge als auch in die Messung des Verzweigungspunkts einbezogen.

Daher wird empfohlen, diese Werte für die Zellzahl zu normalisieren, da die Anzahl der Neuronen im Bild die Messung der Neuritenlänge und des Verzweigungspunktes beeinflusst.

Segmentierung von Zellkörpern
Unter allen Parametern, die das System zur Verfügung stellt, gibt es Zell-Körper-Cluster und Zell-Körper-Cluster-Fläche. Diese beiden Parameter können jedoch nicht zuverlässig als Werte für die Zellzählung verwendet werden. Wie in Abbildung 4 dargestellt, segmentiert die Software kontrastreiche Objekte in der gelben Maske, einschließlich Schatten, die durch mittlere Bewegungen im Vertiefungsbereich verursacht werden. Darüber hinaus segmentiert es auch abgestorbene Zellen und Zelltrümmer (Abbildung 4). Um eine zuverlässige Zellzahl der wachsenden Neuronen zu erhalten, kann eine manuelle Methode, wie z. B. das Cell Counter Tool in Fidschi (Abbildung 13), verwendet werden.

Eine Zusammenfassung der vorgeschlagenen Analyseparameter, sortiert nach Art der Kultur, finden Sie in Tabelle 1 für Phasenbilder und Tabelle 2 für immunzytochemische Bilder. Darüber hinaus finden Sie in Tabelle 3 eine Zusammenfassung der vorgeschlagenen Analyseparameter zur Lösung spezifischer Probleme.

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Abbildung 1: Korrelationsanalyse zwischen manueller und halbautomatischer Neuritensegmentierung. (A) Auf der linken Seite ein repräsentatives Phasenbild eines Neurons, das mit dem NeuronJ-Plug-in in Fidschi segmentiert wurde. Auf der rechten Seite wird ein repräsentatives Phasenbild eines Neurons mit der halbautomatischen Software segmentiert. (B) Eine einfache lineare Regression, die an 20 Neuronen durchgeführt wurde, wurde sowohl mit manuellen als auch mit halbautomatischen Methoden analysiert. Spearman-Korrelationskoeffizient r = 0,8526, p**** < 0,0001. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Seeding-Fehler in der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives Phasenbild des Seeding-Fehlers. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die gelbe Maske segmentiert Zellkörper, die magentafarbene Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Oberes Bild: Zoom auf den Fehler der Zellkörpersegmentierung (gelbe Maske) aufgrund der Clusterbildung von Zellkörpern. Unteres Bild: Zoom auf den Fehler der Segmentierung von Neuriten (Magenta-Maske) aufgrund von Zelltrümmern. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Ideale adulte sensorische Neuronenkultur für die Analyse des Neuritenwachstums. (A) Repräsentatives Phasenbild einer idealen Aussaatbedingung für die Analyse des Neuritenwachstums. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die gelbe Maske segmentiert Zellkörper, die magentafarbene Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Zoom auf die Zellkörpersegmentierung (gelbe Maske) und auf die Segmentierung der Neuriten (magentafarbene Maske). Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Störende Elemente in der Analyse des Neuritenwachstums in der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives Phasenbild von zellulären Trümmern und Schatten aufgrund von Mediumbewegungen. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die gelbe Maske segmentiert Zellkörper, die magentafarbene Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Zoom auf den Fehler der Zellkörpersegmentierung (gelbe Maske) und der Neuritensegmentierung (magentafarbene Maske) aufgrund von Zelltrümmern und Schatten des bewegten Mediums. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Dünne Neuriten in der Analyse des Neuritenwachstums in der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives Phasenbild von Neuronen, die durch sehr dünne Neurite gekennzeichnet sind. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die gelbe Maske segmentiert Zellkörper, die magentafarbene Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Oberes Bild: Zoom auf den Verlust der Neuritenlänge aufgrund der Nachweisgrenzen der Neuritensegmentierung (magentafarbene Maske). Unteres Bild: Vergrößern Sie den Fehler der Neuritensegmentierung (magentafarbene Maske) bei Fremdkörpern. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Die Helligkeit von Neuriten bei der Analyse des Neuritenwachstums in der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) von Neuronen, die durch sehr helle und dicke Neuriten gekennzeichnet sind. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die violette Maske segmentiert Zellkörper, die blaue Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Oberes Bild: Zoom auf den Zellkörpersegmentierungsfehler (violette Maske) aufgrund der Dicke der Neuriten. Unteres Bild: Zoom auf den Verlust der Neuritenlänge aufgrund der intensiven Fluoreszenzhelligkeit dicker Neuriten. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Hintergrundfluoreszenz bei der Analyse des Neuritenwachstums in der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) von hohem Hintergrundfluoreszenzrauschen. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die violette Maske segmentiert Zellkörper, die blaue Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Zoom auf den Neuritensegmentierungsfehler (blaue Maske) aufgrund der Interferenz der Hintergrundfluoreszenz. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: Lichtstreuung bei der Analyse des Neuritenwachstums der Kultur adulter sensorischer Neuronen. (A) Repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) der Lichtstreuung. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die violette Maske segmentiert Zellkörper, die blaue Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Obere Platte: Zoom auf den Verlust der Neuritenlänge aufgrund der Interferenz der Lichtstreuung. Unterer Bereich: Zoom auf den Fehler bei der Segmentierung des Zellkörpers (violette Maske). Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 9: Qualitätsbeeinflussende Fehler des Färbeverfahrens, die die Analyse des Neuritenwachstums der adulten sensorischen Neuronenkultur beeinträchtigen. (A) Links ein repräsentatives Phasenbild von adulten sensorischen Neuronen. Rechts ein repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) von gebrochenen Neuriten durch Waschen im Färbeverfahren. (B) Links ein repräsentatives Phasenbild von adulten sensorischen Neuronen. Rechts ein repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) der Zellkörperentnahme aufgrund von Waschungen des Färbeverfahrens. Die Bilder wurden 48 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 10: Ideale embryonale (E13.5) sensorische Neuronenkultur für die Analyse des Neuritenwachstums. (A) Repräsentatives Phasenbild einer idealen Aussaatbedingung für die Analyse des Neuritenwachstums in embryonalen sensorischen Neuronenkulturen. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die gelbe Maske segmentiert Zellkörper, die magentafarbene Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Zoom auf die Zellkörpersegmentierung (gelbe Maske) und auf die Segmentierung der Neuriten (magentafarbene Maske). Die Bilder wurden 24 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 11: Ideale embryonale (E13.5) sensorische Neuronenkultur für die Analyse des Neuritenwachstums. (A) Repräsentatives immunzytochemisches Bild (neuronaler Marker Tuj1) einer idealen embryonalen sensorischen Neuronenkultur für die Analyse des Neuritenwachstums. (B) Repräsentatives automatisch segmentiertes Bild. Die violette Maske segmentiert Zellkörper, die blaue Maske segmentiert Neuriten. (C) Illustrative Definitionsparameter für die Analyse des Neuritenwachstums. (D) Zoom auf die Zellkörpersegmentierung (violette Maske) und auf die Segmentierung der Neuriten (blaue Maske). Die Bilder wurden 24 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 20x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 12: Differenzierte NSC-34-Zellen haben im Vergleich zu undifferenzierten Kontrollen erhöhte Neuriten und Verzweigungen. Repräsentative Bilder von NSC-34-Zellen. Oberseite: undifferenzierte NSC-34-Zellen (Steuerung). Unteres Bild: differenzierte NSC-34-Zellen nach 96-stündiger Retinsäure-Behandlung. Auf der linken Seite beider Panels befinden sich Phasenkontrastbilder, während auf der rechten Seite beider Panels automatisch segmentierte Bilder zu sehen sind (Soma in Gelb, Neuriten in Magenta). Die Bilder wurden 96 Stunden nach der Aussaat aufgenommen. Vergrößerung 10x. Maßstabsleiste, 50 μm. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 13: Cell Counter Tool auf Fidschi. Die manuelle Zellzählung wurde an einem Phasenbild einer idealen Aussaatbedingung für die Analyse des Neuritenwachstums durchgeführt. Vergrößerung 20x. Die Figur wurde mit BioRender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Art der KulturDRG-Kultur für Erwachsene (Phase)Embryonale DRG-Kultur (Phase)NSC-34 (Phase)
Vergrößerung20-mal20-mal10x
Segmentierungs-ModusHelligkeitHelligkeitHelligkeit
Anpassung der Segmentierung0.5 - 0.71.7 - 21
Größe anpassen (Pixel)0, +1, +20, +10
FilterndBesterBesterBester
Neurit-Empfindlichkeit0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
Neuriten-Breite122

Tabelle 1: Zusammenfassung der vorgeschlagenen Analysedefinitionsparameter für adulte sensorische Neuronenkulturen, embryonale (E13.5) sensorische Neuronenkulturen und NSC-34-Kulturen in Phasenkontrastbildern.

Art der KulturDRG-Kultur für Erwachsene (ICC)Embryonale DRG-Kultur (ICC)
Vergrößerung20-mal20-mal
Segmentierungs-ModusHelligkeitHelligkeit
Anpassung der Segmentierung0.5 - 0.71.7 - 2
Größe anpassen (Pixel)0, +1, +20, +1
FilterndBesterBester
Neurit-Grobempfindlichkeit8 - 98 - 9
Neurit-Feinempfindlichkeitbis zu 0,750.5 - 0.75
Neuriten-Breite12

Tabelle 2: Zusammenfassung der vorgeschlagenen Analysedefinitionsparameter für adulte sensorische Neuronenkulturen, embryonale (E13.5) sensorische Neuronenkulturen und NSC-34-Kulturen in immunzytochemischen Bildern.

AUSSTELLENANREGUNGEN
Schmutzige KulturPassen Sie den Schieberegler für die Segmentierung in Richtung Zellen an
Erhöhen Sie den Parameter für die Anpassung der Größe (+1,+2...)
Verringern Sie leicht die Neuritenempfindlichkeit
Blasse/dünne NeuritenErhöhung der Neuritensensitivität (mind. 0,6)
Passen Sie den Schieberegler für die Segmentierung in Richtung Zellen an.
Dünne Neuriten bei ICCErhöhung der Feinneuritenempfindlichkeit (bis zu 0,75)
Reduzieren Sie die Grobempfindlichkeit der Neuriten (mindestens auf 8-9)
GliazellenPassen Sie den Schieberegler für die Segmentierung in Richtung Zellen an (1.7-2)
Neuritenbreite bei 2

Tabelle 3: Zusammenfassung der vorgeschlagenen Analysedefinitionsparameter zur Lösung spezifischer Probleme in verschiedenen Kulturtypen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die genaue Messung des Wachstums von Neuronen unter gesunden, verletzten und kranken Zuständen ist ein kritischer Parameter in vielen Versuchsanordnungen im Bereich der Neurowissenschaften. Unabhängig davon, ob es sich um organotypische Kulturen ganzer DRG-Explantate oder dissoziierter Kulturen handelt, war die korrekte Messung des axonalen Auswuchses in den letzten 20 Jahren eine große Herausforderung. Ohne eine zuverlässige und genaue Quantifizierung des Neuritenwachstums ist es unmöglich zu beurteilen, ob eine spezifische Behandlung, wie z. B. Retinsäure (für 4 Tage) für NSC-34-Zellen34 oder Neurotrophine (für 1-2 Tage) für embryonale DRG-Neuronen 14,35, wirksam war. Neuronen zeigen in der Regel ein kontinuierliches Wachstum, wenn sie gesund sind; Nach einer Verletzung nimmt die axonale Wachstumsrate jedoch zu12,13. Das Timing ist entscheidend bei der Messung des axonalen Wachstums. Daher ist es wichtig, vor Beginn eines Experiments einen Versuch durchzuführen, um den optimalen Zeitpunkt für die Fixierung der Zellen auf der Grundlage ihrer Wachstumsraten-Plateaukurve zu bestimmen.

Die Wahl des Verfahrens, manuell oder automatisch, markiert einen Wendepunkt in Bezug auf Zeitaufwand und Genauigkeit. Zu den gebräuchlichsten manuellen Methoden gehören NeuronJ18,20 und Metamorph (Visitron)2,22,28. Bei manuellen Methoden müssen die Neuriten manuell verfolgt werden, was extrem zeitaufwändig ist und Einzelzellbilder erfordert. Durch die manuelle Segmentierung von Neuriten sind neuronale Netze völlig unerreichbar. In der Regel messen diese Methoden nur das längste Axon oder verwenden die vektorielle Abstandsmessung, wodurch wichtige Informationen wie die Anzahl der Verzweigungspunkte und die gesamte axonale Länge verloren gehen. Eine gewisse Verbesserung bietet die Sholl-Analyse30, die ohnehin auf Einzelzellbedingungen beschränkt ist. Die Einzelzellanalyse stellt mehrere Herausforderungen dar, angefangen bei der Aussaat von Zellen. Neuronen müssen in einer sehr niedrigen Konzentration plattiert werden, was möglicherweise nicht für jeden Zelltyp die geeignetste Wachstumsbedingung ist. Ein weiteres Problem ergibt sich aus der Bildaufnahme. In der Regel wird das konfokale Mikroskop für die Bildgebung eingesetzt, was geschulte Benutzer und fluoreszierende Neuronen erfordert und weder zeit- noch kosteneffizient ist. Mit dem konfokalen Mikroskop werden hochauflösende Bilder erhalten, aber nur sehr wenige Neuronen werden von jedem Experiment abgebildet. Dies stellt eine Einschränkung dar, da mehr biologische Replikate notwendig sind, um eine ausreichende Anzahl von Neuronen zu erreichen.

Einige automatische Methoden, wie z.B. NeuroMath 2,28, lösen das Problem der zeitaufwändigen Neuritensegmentierung, die automatisch durchgeführt wird.

Aus Zeitgründen liefert dieses Modul zur Messung des Neuritenwachstums jedoch schnellere Ergebnisse bei der Aufnahme von Bildern am Zeitraffermikroskopiegerät. Letzteres verbessert zusammen mit dieser Software die Zeit- und Kosteneffizienz sowohl für die Studierenden als auch für die Principal Investigators erheblich.

Die Erfassungsmaschine ermöglicht die Erstellung einer vollständigen Karte des Bohrlochs, wobei eine variable Anzahl von Bildern basierend auf dem Durchmesser des Bohrlochs aufgenommen wird. Dies stellt einen erheblichen Vorteil dar, da mehrere Neuronen gleichzeitig abgebildet werden. Das Erreichen einer 20-fachen Vergrößerung ist jedoch ausreichend und geeignet, um die Bilder mit der Software zu analysieren. Seine Leistungsfähigkeit beruht auf seiner Fähigkeit, mit einer Reihe von Bildern zu trainieren und eine halbautomatische Messung der gesamten axonalen Länge durchzuführen. Darüber hinaus kann die Software sowohl mit einzelnen Neuronen als auch mit neuronalen Netzwerken arbeiten. Die Software ist in der Lage, Neuriten und Zellkörper mit zwei verschiedenen Masken zu segmentieren. Eine gelbe Maske segmentiert alle kontrastreichen Objekte im Bild, z. B. Zellkörper, Zellablagerungen und Schatten. Eine magentafarbene Maske segmentiert stattdessen Neuriten. Die Präzision und Genauigkeit der Software wurde durch die Segmentierung der gleichen Neuronen sowohl mit der Software als auch mit NeuronJ bewiesen. Vom Standpunkt der statistischen Analyse aus korrelierten die Werte der Neuritenlängen gut mit einem hohen Spearman-Korrelationskoeffizienten.

Nachdem wir die Zuverlässigkeit der Methode bewertet hatten, gingen wir zur Analyse verschiedener Testbedingungen über. Für eine optimale Analyse sind einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Zunächst müssen die Neuronen gleichmäßig in der Vertiefung ausgesät werden, um Flecken mit hoher Zellkonzentration zu vermeiden. Die Häufung von Neuronen führt dazu, dass die Software bei der Erkennung der Neuriten an Präzision verliert. Eine weitere Variable, die die Genauigkeit und Präzision der Analyse beeinflusst, ist die Sauberkeit der Kultur. Eine saubere Kultur mit wenigen Zelltrümmern und abgestorbenen Zellen ist vorzuziehen. Die Software ist jedoch in der Lage, solche Probleme durch Modulation der Neuritenempfindlichkeit und der Zellkörpersegmentierungsmaske zu kompensieren. Wie bereits erwähnt, segmentiert die gelbe Maske kontrastreiche Objekte, unter denen es auch Schatten gibt, die durch die Bewegung des Mediums in der Vertiefung verursacht werden. Die Schatten könnten Neuriten überdecken, was zu einem Verlust der Neuritenlänge führt. Ein solches Problem lässt sich jedoch leicht lösen, indem man das Medium vor der Bildaufnahme zur Ruhe kommen lässt.

Der Algorithmus ist in der Lage, die Quantifizierung der Neuritenlänge sowohl auf Phasenkontrastbildern als auch auf immunzytochemischen Bildern durchzuführen. Wenn es sich um Fluoreszenz handelt, müssen andere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um eine zuverlässige Analyse zu erhalten. Erstens hat die Qualität der Färbung einen tiefgreifenden Einfluss auf das Ergebnis der Analyse. Werden Neuriten aufgebrochen oder segmentiert und Zellkörper beim Waschen weggerissen, verliert die Analyse an Festigkeit und Zuverlässigkeit. Darüber hinaus stellt die Fluoreszenz selbst ein potenziell störendes Element für die Analyse dar. Da die Fokussierung automatisch von der Maschine durchgeführt wird, stellt das Objektiv sehr helle Objekte wie Artefakte, Zellkörper oder dicke Neuriten in den Fokus. Infolgedessen bleiben dünnere und weniger helle Neuriten zurück, die es für den Benutzer schwierig machen, die Neuritenlänge richtig zu messen.

Dies hat zur Folge, dass die Analyse von Phasenbildern im Vergleich zur Analyse von immunzytochemischen Bildern fundierter sein kann. Die Software ist in der Lage, an vielen verschiedenen neuronalen Morphologien zu arbeiten, von den kompliziertesten und aufwendigsten bis hin zu den einfachsten, entweder als Einzelzellen oder in neuronalen Netzwerken. Daher ist es in vielen verschiedenen Forschungsbereichen einsetzbar, von Primärkulturen von Neuronen aus dem zentralen oder peripheren Nervensystem verschiedener Entwicklungsstadien bis hin zu iPSC-abgeleiteten Neuronen und Zelllinien wie NSC-34.

Trotz des erheblichen Potenzials der Software sind einige Einschränkungen zu beachten. Erstens ist die Präzision der Zellkörpersegmentierung suboptimal. Folglich können Parameter wie Zellkörpercluster und Zellkörperclusterfläche nicht zuverlässig für die Zellzählung verwendet werden. Zweitens können neben den notwendigen Vorkehrungen für eine optimale Neuritensegmentierung auch unzureichend dicke Axone von der Neuritenlängenmessung ausgeschlossen werden, was zu einem Datenverlust führt.

Beim Parameter Verzweigungspunkt treten Probleme im Zusammenhang mit beiden Arten der Segmentierung auf. Schatten, abgestorbene Zellen oder Ablagerungen in der Kultur, die sich an den Verzweigungspunkten festsetzen, verdecken diese, da sie von der Zellkörpersegmentierung verdeckt werden. Darüber hinaus ist bei dünnen Neuriten die Zuverlässigkeit des Verzweigungspunktparameters erneut stark beeinträchtigt.

Darüber hinaus kann die automatische Fokussierung während der Bildaufnahme manchmal suboptimal sein. Die maximale Vergrößerung des Geräts ist auf das 20-fache begrenzt, was für die Beobachtung feinerer Details oder der Fluoreszenz in schlanken Strukturen wie Neuriten möglicherweise nicht ausreicht. Darüber hinaus eignet sich die Maschine am besten für homogene Kunststoffsubstrate. Wenn ein Deckglas in die Vertiefung eingesetzt wird, kann es vorkommen, dass der Fokus auf dem Glas fehlschlägt, was zu teilweise unscharfen Bildern führt. Diese Software gilt aber nicht nur für Neuronen, sondern auch für ganz andere Forschungsgebiete, wie zum Beispiel das Pilzwachstum36.

Alles in allem glauben wir, dass dieses Modul zur Messung des Neuritenwachstums ein zuverlässiges Werkzeug ist, um Neuriten schnell, unvoreingenommen und effizient zu messen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die möglicherweise zu einem Interessenkonflikt führen könnten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Alessandro Vercelli für die kritischen Kommentare und den technischen Support von Sartorius für die Hilfe. Unsere Forschung zu diesen Themen wurde großzügig durch das Rita-Levi Montalcini Stipendium 2021 (MIUR, Italien) unterstützt. Diese Forschung wurde vom Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR-Projekt Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 an die Abteilung für Neurowissenschaften Rita Levi Montalcini finanziert. Die Forschung von D.M.R. wurde im Rahmen und mit Unterstützung des italienischen nationalen interuniversitären Doktorandenkurses für nachhaltige Entwicklung und Klimawandel (Link: www.phd-sdc.it) durchgeführt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagenase AMerck / Roche10103586001
Dispase II (neutrale Protease, Grad II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's modifiziertes AdlermediumMerck / SigmaD5796
Fötales Bovin-SerumMerck / SigmaF7524
Schinkens F-12 Nährstoffmischung (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Schinken F12 mit L-GlutaminEurocloneECM0135L
Hanks' Balanced Salt SolutionEurocloneECM0507L
HBSS (10X), kein Kalzium, kein Magnesium, kein PhenolrotThermoFisher Scientific14185045
HyClone charakterisiertes fötales Rinderserum (USA)CytivaSH30071.03
Inzozyten, Neurotrack-Analysesoftware Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Laminin Mausprotein, natürlichesThermoFisher Scientific23017015
L-CysteinMerck / SigmaC7352
Leibovitz' L-15 Medium ohne L-GlutaminEurocloneECB0020L
Maus NGF 2,5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasales Medium [-] GlutaminThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Kanada)CLU140
Papain aus Papaya-LatexSigmaP4762
Penicillin-Streptomycin (5.000 U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Dichte 1,130 g/ml)Cytiva17089101
Poly-D-Lysin-Lösung (1 mg/ml)EMD Millipore/MerckA-003-E
Poly-L-Lysin-Lösung (0-01%)SigmaP4832
Rekombinante humane NT-3-PeproTech450-03
RetinsäureMerck / SigmaR2625
Trypsin-EDTA-LösungSigmaT3924
β-Tubulin III (Tuj1) AntikörperMerck / SigmaT8660

Referenzen

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