Methodenartikel

Etablierung eines neuartigen ex vivo Lungenperfusionssystems für Rattenlungen nach Kreislauftod

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DOI:

10.3791/67168

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18. Oktober 2024

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1China-Japan Friendship Institute of Clinical Medicine, 2Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, 3Department of Biochemistry and Molecular & Cellular Biology, Georgetown University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel ist es, ein neues ex vivo Lungenperfusionsmodell (EVLP) an Ratten zu entwickeln, das eine konsistente Lungenfunktion für 4 Stunden während der gesamten EVLP aufrechterhalten kann und der Industrie Implementierungsspezifikationen liefert, die eine robuste Methode zur Anwendung von EVLP auf Nagetiermodelle bieten.

Zusammenfassung

Die zunehmende Knappheit an Spenderlungen für Transplantationen hat ein erhebliches Interesse an der Verwendung von Organen geweckt, die von Spendern nach dem Herztod (DCD) gewonnen wurden. Eine entscheidende Herausforderung besteht jedoch nach wie vor darin, die Anzahl lebensfähiger Lungen zu maximieren, die strenge Kriterien für den klinischen Einsatz erfüllen. Die ex vivo Lungenperfusion (EVLP) erweist sich als vielversprechende Technologie, um die Funktion gespendeter Lungen zu bewerten und möglicherweise zu verbessern. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer kostengünstigen und reproduzierbaren Kleintierversuchsplattform speziell für die EVLP-Forschung beschrieben. Diese Plattform bietet ein hohes Maß an Individualisierung und ermöglicht es Forschern, experimentelle Parameter an spezifische Forschungsfragen im Bereich der EVLP anzupassen. Das Team etablierte ein Rattenmodell zur Simulation von DCD und implementierte einen zweistufigen Konservierungsansatz. Die Lungen wurden 4 h lang einer statischen Kühllagerung mit einer Perfusatlösung bei 4 °C unterzogen, gefolgt von einer normothermen EVLP für weitere 4 Stunden. Die Forscher bewerteten verschiedene Lungenfunktionsparameter, darunter den pulmonalen Gefäßwiderstand, die pulmonale dynamische Compliance, Blutgasmessungen des Perfusats und den apoptotischen Zelltod im Lungengewebe. Die Studie zeigt, dass EVLP die funktionelle Leistung von DCD-Lungen im Vergleich zur einfachen Kühllagerung bei 4 °C signifikant verbessern könnte, was darauf hindeutet, dass EVLP das Potenzial hat, Ischämie-Reperfusionsschäden zu mildern und die Transplantatfunktion nach dem Kreislauftod zu verbessern, wodurch der Pool an transplantierbaren Lungen vergrößert wird.

Einleitung

Lungentransplantation (LTx) ist nach wie vor die einzige definitive Behandlung für Patienten mit Lungenerkrankung im Endstadium. Der Erfolg einer Lungentransplantation hängt von der Verfügbarkeit hochwertiger Spenderlungen mit ausreichender Funktion ab. Aufgrund eines kritischen Mangels an Spenderlungen ist jedoch weltweit eine wachsende Warteliste für Lungentransplantationen entstanden1. Viele Patienten auf der Warteliste erleben eine Verschlechterung ihres Gesundheitszustands oder sogar den Tod, während sie innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens auf eine geeignete Spenderlunge warten2. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, den Pool potenzieller Transplantate zu erweitern, um den Bedürfnissen der Patienten auf der Warteliste für eine Transplantation gerecht zu werden. Die Spende nach kardiovaskulatorischem Tod (DCD)1,3 und die ex vivo Lungenperfusion (EVLP)4,5 sind zwei vielversprechende Strategien, um die Anzahl der für eine Transplantation verfügbaren Lungen zu erhöhen. Derzeit ist die Spende nach Hirntod (DBD)6 die primäre Quelle für Lungentransplantationen. Aufgrund des aktuellen Transplantatmangels gewinnt DCD jedoch an Bedeutung. Diese Verschiebung ist auf die Einschränkungen von DBD-Transplantaten zurückzuführen, bei denen Veränderungen des Blutflusses, der mechanischen Beatmung, der Infektion und der Aspiration die Qualität des Transplantats beeinträchtigen können. Die Qualität des Transplantats wirkt sich direkt auf die Patientenergebnisse und das Langzeitüberleben nach der Transplantation aus. Der ex vivo-Prozess der Lungenperfusion (EVLP) erhöhte effektiv die Anzahl der verfügbaren Lungentransplantate, indem Lungentransplantate von Spendern nach dem Herztod (DCD) neu bewertet wurden, was sowohl kurz- als auch langfristig zu ähnlichen Ergebnissen führte7,8. Das Ziel dieser Studie war es, ein extrakorporales Lungenperfusionssystem bei Ratten mit zyklisch toten Lungen zu entwickeln und DCD-Spender genau zu beurteilen. Um die Wahrscheinlichkeit einer primären Transplantatdysfunktion (PID) zu verringern, kann der Schaden für DCD-Spender9 durch den Einsatz von molekularer Diagnostik10 und den Einsatz spezialisierter zielgerichteter Behandlungen minimiert werden.

EVLP ist eine Technik, die die natürliche Umgebung der Lunge außerhalb des Körpers repliziert und eine normale physiologische Temperatur aufrechterhält. Es ermöglicht die kontinuierliche Überwachung und Beurteilung der Lunge11,12, verlängert die Konservierungszeit von transplants13 und verwendet externe Perfusion, Beatmung und Medikamente, um die Qualität der marginalen Lungen zu verbessern, wodurch sie für die Transplantation geeignet sind14. Die erste erfolgreiche Verwendung von marginalen Spenderlungen für die Lungentransplantation mittels EVLP wurde von Steen et al. im Jahr 2007 berichtet15. Seitdem wurde der Einsatz der EVLP-Technologie nach und nach in die klinische Praxis integriert16,17. Das Team in Toronto passte anschließend den EVLP-Ansatz an, indem es eine Beatmung mit niedrigem Tidalvolumen und niedrige Durchflussraten in Verbindung mit der idealen Lungenschutzstrategie einer Kreiselpumpe verwendete. Dies führte zu einer stetigen Perfusion für eine Dauer von 12 h18.

EVLP bietet mehrere Vorteile, darunter die Verringerung des Risikos eines primären Transplantatversagens, die Minimierung von Lungenödemen, die Milderung von Hirntod-bedingten Entzündungen, die Vorbereitung des Immunsystems des Empfängers auf die Transplantation und die Vorbeugung von Lungeninfektionen, Aspirationen, Lungenembolien und Ischämie-Reperfusionsschäden14,19,20. Während EVLP erhebliche Vorteile bietet, besteht ein Bedarf an verbesserten Methoden, um die Transplantatqualität zu verbessern.

Derzeit gibt es keinen Konsens über die spezifischen Einstellungen für Perfusion und Beatmung in der EVLP-Plattform für Ratten. Ohsumi et al.21 entwickelten ein neues Modell, um zu untersuchen, wie Spenderlungen, die lange Zeit der kalten Ischämie (CIT) durchlaufen mussten, ihre Lungenfunktion während des ex vivo Lungenperfusionsprozesses (EVLP) und nach der Transplantation aufrechterhalten konnten. International gab es mehrere Bemühungen, ex vivo Lungenperfusionsmodelle (EVLP) für Ratten zu erstellen22,23,24,25,26,27, um eine zuverlässigere und präzisere Perfusion zu erreichen. Daher ist es wichtig, ein kostengünstiges, hochreproduzierbares und streng kontrolliertes EVLP-System für Kleintiere zu entwickeln, um die weitere Forschung in diesem Bereich zu erleichtern. Bestehende EVLP-Systeme für Kleintiere sind oft teuer und nur begrenzt flexibel, wenn es darum geht, die Betriebsbedingungen für unterschiedliche Forschungsanforderungen zu ändern. In diesem Beitrag wird ein kostengünstiges und anpassungsfähiges EVLP-Systemdesign vorgeschlagen. Darüber hinaus werden die technischen und chirurgischen Schritte, die für die Umsetzung erforderlich sind, ausführlich erläutert. Wir verwendeten ein Modell mit verstorbenen Ratten im Kreislaufstillstand, um zu zeigen, dass EVLP die Qualität der DCD-Lunge verbessert und dadurch den Pool an lebensfähigen Lungenspendern für die Transplantation erhöht. Unser Ziel ist es, unsere erfolgreichen Erfahrungen zu teilen, um andere Forscher bei der Etablierung einer leicht zugänglichen EVLP-Plattform für Kleintiere nach dem Herz-Kreislauf-Tod zu unterstützen.

Protokoll

Die Versuchstiere waren männliche SD-Ratten mit einem Gewicht von 250-400 g. Die Ratten wurden unter experimentellen Standardbedingungen bei 18-22 °C mit einem kontrollierten 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Das Animal Care and Use Committee des Institute of Clinical Research des China-Japan Friendship Hospital genehmigte die Tierversuche und führte sie in Übereinstimmung mit den Richtlinien durch. Alle Operationen wurden unter Vollnarkose durchgeführt. Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm und ein tatsächliches Bild des EVLP-Systems als Referenz. Die genaue Marke und das Modell aller verwendeten Instrumente und Geräte sind in der Werkstofftabelle aufgeführt

1. Apparatebau

HINWEIS: 3D-gedruckter Kunststoff scheint eine vielversprechende Wahl für das Gerät zu sein. Aufgrund unserer begrenzten Erfahrung ist es jedoch schwierig, die Kraft beim Binden von Knoten mit Kunststoffen zu regulieren. Zu wenig Kraft kann dazu führen, dass der Schlauch abrutscht, und zu viel Kraft kann den Kunststoffschlauch blockieren. Starre Metallrohre vermeiden diese Probleme und sind relativ langlebig, daher werden diese hier verwendet.

  1. Verbinden Sie das Modul mit dem Kunststoffrohr und verwenden Sie einen Eisenrahmenständer und eine verstellbare Hebebühne, um alle Teile in der richtigen Höhe zu positionieren. Geben Sie 150 mL Perfusion in den Flüssigkeitsspeichertank, öffnen Sie die Peristaltikpumpe und stellen Sie die Durchflussrate auf 20 mL/min ein, damit die Perfusion den Schlauch füllt.
  2. 1.2Schleifen Sie eine kreisförmige Rille für die endotracheale Intubation. Ein Gasgemisch mit 8 % O2, 6 % CO2 und 86 % N2 als hypoxisches Gas herstellen. Hypoxisches Gas durch die künstliche Membranlunge in die Perfusion leiten. Vor der Blutgasmessung 5 Minuten lang mit reinem Sauerstoff beatmet.
  3. Stellen Sie die Lungenarterie und die Vorhofkanülen aus hohlen Rohren aus Edelstahl 304 her, die gebogen sind, um der Anatomie von Ratten zu entsprechen (Abbildung 2A). Schleifen Sie eine kreisförmige Rille für die Arterienintubation. Machen Sie ein Loch am distalen Ende der Vorhofkanülenwand und polieren Sie die Ringrille an der Außenwand (Abbildung 2C). Setzen Sie eine Absaugvorrichtung vor dem Schlauch in den Perfusionsschlauch der Lungenarterie ein.
  4. Schließen Sie ein Dreiwegeventil an das externe Zirkulationssystem des Wasserbades an und regulieren Sie die Temperatur des Reservoirs, des Organkompartiments und des Lungenarterienperfusats. Minimieren Sie die Länge des Verbindungsrohrs ohne Wasserbad und kontrollieren Sie den Temperaturfehler an allen Stellen des Geräts im Bereich von ± 0,2 °C. Die gewünschte Temperatur für das Studiendesign beträgt 37 °C.
  5. Füllen Sie die Drucküberwachungsleitung mit Kochsalzlösung und stellen Sie das Drucküberwachungsgerät auf die gleiche Höhe wie die Lunge des Spenders ein. Öffnen Sie das Ventil, um die Drucküberwachungsleitung mit der Pulmonalarterie und der venösen Perfusionsleitung zu verbinden, starten Sie den Datensammler und setzen Sie den Nullpunkt. Überwachen Sie den arteriellen Perfusionsdruck und den venösen Rückdruck in Echtzeit.

2. Betäubung von Ratten

  1. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung: chirurgische Masken, Handschuhe und Einweg-Overalls, bevor Sie mit Ratten und Rattentüchern umgehen.
  2. Wiegen Sie die Ratten und notieren Sie ihr Gewicht. Füllen Sie eine Spritze mit 1000 U/kg Heparin und injizieren Sie es mit einer Nadel in die Schwanzvene.
  3. Setzen Sie die Ratten in eine geschlossene Induktionskammer und betäuben Sie sie mit 3% Isoflurangas. Klemmen Sie die Zehen der Ratten fest; Wenn es keine Reaktion gibt, bedeutet dies, dass die Ratten die gewünschte Anästhesietiefe erreicht haben. Andernfalls verlängern Sie die Anästhesiezeit weiter. Tragen Sie eine sterile Augensalbe auf, um Trockenheit der Augen zu verhindern.
  4. Bereiten Sie mehrere Nähte vor (3-0 oder 4-0). Bringen Sie die Ratten auf den Operationstisch, lagern Sie sie in Rückenlage, sichern Sie sie mit Nähten und desinfizieren Sie sie mit Alkoholspray.

3. Beschaffung von Spenderlunge

  1. Legen Sie den Kopf der Ratte in die Anästhesiemaske und halten Sie die Narkose aufrecht, indem Sie Luft mit 1,5 % Isofluran abführen. Klemmen Sie die Zehen der Ratten fest; Wenn es keine Reaktion gibt, bedeutet dies, dass die Ratten die gewünschte Anästhesietiefe erreicht haben.
  2. Machen Sie einen 2-3 cm langen Längsschnitt mit einer chirurgischen Nagetierschere entlang der Mittellinie des Halses vor der Luftröhre, schneiden Sie die Haut, präparieren Sie das Muskelgewebe vor der Luftröhre und legen Sie die Luftröhre vollständig frei.
  3. Befreien Sie den Raum hinter der Luftröhre, führen Sie eine 3-0-Naht durch diese und binden Sie einen losen Knoten für den späteren Gebrauch. Machen Sie einen V-förmigen Schnitt 0,5 cm mit einer chirurgischen Nagetierschere über dem Knoten in der Luftröhre, führen Sie einen Trachealtubus (14G) in die Luftröhre ein, ziehen Sie den Nahtknoten fest und sichern Sie den Trachealtubus (Abbildung 3A).
  4. Schließen Sie den Trachealtubus an das Beatmungsgerät an, schalten Sie ihn ein und beginnen Sie mit der Beatmung der Lunge.
  5. Überwachen und zeichnen Sie die Vitalparameter häufig auf, um eine Anästhesie und Veränderungen der Vitalparameter zu gewährleisten, bis der Tod bestätigt wird.
  6. Initiieren Sie die Lungenrekrutierungsmanöver, starten Sie die mechanische Beatmung im druckkontrollierten Modus neu und atmen Sie 5 Minuten lang. Verwenden Sie die folgenden Parameter: PEEP 3 cmH2O, inspiratorisch: exspiratorisches (I:E) Verhältnis 1:2, Atemfrequenz 40 Atemzüge/min und FiO2 0,5.
  7. Klemmen Sie die Luftröhre ab und lassen Sie die Lunge 1 h warme ischämische Zeit (WIT) durchlaufen. Nach der WIT-Periode extrahieren Sie die Lunge wie unten beschrieben und teilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein: (1) direkte Lungenentnahme, (2) 4 h kalte statische Konservierung (CS) und (3) 4 h EVLP-Bewertung.
  8. Für die direkte Lungenentnahme nehmen Sie die entnommene Spenderlunge ohne Behandlung für verschiedene Tests in Probe. Bewahren Sie die Spenderlungen 4 h lang in kalter statischer Konservierung im Kühlschrank bei 4 °C auf und nehmen Sie dann eine Probe zum Nachweis. 4 h EVLP-Auswertung. Für eine 4-stündige EVLP-Evaluierung befolgen Sie Schritt 5.
  9. Stellen Sie den Operationstisch auf eine um 45° kopfhohe und fußniedrige Neigungsposition ein.
  10. Entfernen Sie die Haare mit einem Haarrasierer aus der Mitte der Brust und des Bauches der Ratte, desinfizieren Sie sie 3x mit Jod und drapieren Sie sie mit einem chirurgischen Handtuch.
  11. Machen Sie mit einer chirurgischen Nagetierschere einen 6-7 cm langen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Bauches, schneiden Sie die Haut auf, öffnen Sie die Bauchdecke zur Bauchhöhle und legen Sie die Bauchorgane frei. Schiebe den Darm mit einem Wattestäbchen vorsichtig auf die rechte Seite der Bauchhöhle, um die dahinter liegende untere Hohlvene freizulegen.
  12. Injizieren Sie mit einer Spritze eine Lösung von 1000 U/kg Heparin in die untere Hohlvene. Warten Sie 5 Minuten, um eine ausreichende Heparinisierung des Blutes sicherzustellen. Heparin verhindert die Bildung von Mikrothromben in der Lungenarterie.
  13. Schneide die untere Hohlvene der Ratte mit einer Schere ab und entblute sie. Beginnen Sie die mechanische Beatmung der Lunge mit den anfänglichen Beatmungseinstellungen bei einem Atemzugvolumen von 3 ml/kg, einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 2 cmH2O, einer Atemfrequenz von 60 Atemzügen/min und einem I:E-Verhältnis von 1:2.
  14. Benutze eine Pinzette, um den Xiphoid-Prozess anzuheben; mache einen Längsschnitt entlang des Brustbeins von unten nach oben. Verwenden Sie einen Rippenspreizer um die Brusthöhle freizulegen. Entfernen Sie das Thymusgewebe, um das Herz und die großen Blutgefäße darunter freizulegen.
    HINWEIS: Rattenlungen sind zerbrechlich; Vermeiden Sie es, sie oder Bauchorgane mit metallischen Instrumenten zu berühren. Für eine bessere Sicht schieben Sie die Lunge vorsichtig mit einem Wattestäbchen zur Seite.
  15. Befreien Sie die Aorta der Ratte und den Raum hinter der Lungenarterie, führen Sie eine 3-0-Naht durch sie und binden Sie einen losen Knoten für den späteren Gebrauch.
  16. Machen Sie einen 2-3 mm V-förmigen Schnitt an der vorderen Oberfläche des Ausflusstrakts des rechten Ventrikels, führen Sie eine Lungenarterienkanüle durch den Schnitt in die Lungenarterie ein und ziehen Sie die vorgebundene Naht fest, um die Kanüle zu sichern (Abbildung 3B).
  17. Schneiden Sie die Spitze des Rattenherzens ab, führen Sie eine hämostatische Pinzette in den linken Ventrikel ein, stören Sie die Klappen zwischen dem linken Ventrikel und dem linken Vorhof und stellen Sie sicher, dass der linke Vorhofausflusstrakt frei ist.
  18. Schließen Sie die Lungenarterienkanüle an den Perfusionskreislauf an und spülen Sie das Restblut mit einer Geschwindigkeit von 0,6-1 ml/min mit 15 ml kaliumarmer Lösung. Spülen Sie, bis die Lunge weiß wird oder bis die aus dem linken Ventrikel austretende Perfusionsflüssigkeit weiß wird.
  19. Legen Sie eine Naht hinter das Herz und umschließen Sie den Ventrikel. Führen Sie die Kanüle des linken Ventrikels durch den Schnitt im linken Ventrikel ein und ziehen Sie die vorgebundene Naht fest, um die Kanüle zu sichern (Abbildung 3C).
  20. Schneiden Sie die Luftröhre oberhalb des Trachealtubus ab, heben Sie die Luftröhre an und trennen Sie mit einer Schere das Bindegewebe hinter der Luftröhre nach unten bis auf Höhe des Zwerchfells.
  21. Die untere Hohlvene und die Lungenhauptarterie oberhalb des Zwerchfells abschneiden; Herz und Lunge entfernen (Abbildung 3D).
  22. Um die Lunge aufgeblasen zu halten, klemmen Sie am Ende der Inhalation sofort das untere Drittel der Luftröhre ein, sammeln Sie Herz und Lunge und legen Sie sie zur Konservierung in eine kaliumarme Lösung.
  23. Bringen Sie Herz und Lunge in die vorgesehene Position des EVLP-Kreislaufs und verbinden Sie die Kanüle des linken Ventrikels mit dem Perfusionskreislauf (Abbildung 4A).

4. Initialisierung des ex vivo Lungenperfusionssystems

  1. Montieren Sie den EVLP-Kreislauf: Schließen Sie den Schlauch, den Oxygenator, das Reservoir, die Schlauchpumpe und die Organkammer an.
  2. Füllen Sie den EVLP-Kreislauf mit 120 ml Lungenperfusionsreparaturlösung, die vor der Perfusion 1000 Einheiten Natriumheparin, 50 mg Cefoperazon und 50 mg Methylprednisolon enthält. Entfernen Sie alle Luftblasen in den Schläuchen, um die Absaugvorrichtung am Ende der Lungenarterienperfusion zu verwenden.
  3. Stellen Sie das Wasserbad auf Raumtemperatur ein und beginnen Sie mit der Zirkulation von warmem Wasser, um den gesamten EVLP-Kreislauf zu erwärmen.
  4. Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm des Computers und verbinden Sie den Lungenarteriendrucksensor, den Lungengewichtssensor, den Pumpendrehzahlsensor und den Temperatursensor mit dem EVLP-Schaltkreis und dem Rekorder.
  5. Füllen Sie den Blutdruckmessschlauch mit normaler Kochsalzlösung, passen Sie die Höhe des Tisches an die Höhe der versorgten Lunge an, schließen Sie den Druckmessschlauch an die Lungenarterie und den venösen Perfusionsschlauch an, öffnen Sie das Ventil, starten Sie den Datensammler und stellen Sie das System auf Null.
  6. Öffnen Sie das hypoxische Gasventil, leiten Sie hypoxisches Gas 10 Minuten lang durch die Membranlunge, bis die Perfusionslösung einen stabilen hypoxischen Zustand erreicht, schließen Sie das Gasventil und halten Sie die Peristaltikpumpe an, um auf die Ankunft der Spenderlunge für die ex vivo Lungenperfusion zu warten.
  7. Bereiten Sie den Operationstisch und die chirurgischen Instrumente in der Nähe der EVLP-Plattform für Kleintiere vor und sterilisieren Sie sie mit Hochdruckdampfsterilisation.

5. Ex-vivo-Lungenperfusion

  1. Füllen Sie die Blasenfalle mit einer ausreichenden Menge Perfusionslösung, um zu verhindern, dass Blasen in die Lunge gelangen (und eine Luftembolie verursachen).
  2. Platzieren Sie die kardiopulmonale Einheit in der Organkammer, schließen Sie sie an das EVLP-Gerät an, schalten Sie das Beatmungsgerät und die Peristaltikpumpe ein und starten Sie die EVLP-Perfusion (Abbildung 4B).
  3. Beginnen Sie die Perfusion bei 20 % der Zielflussrate; erhöhen Sie die Flussrate schrittweise auf die Zielflussrate innerhalb von 1 h; berechnen Sie die Zielflussrate als 20 % des Herzzeitvolumens (75 ml/min/250 g Spendergewicht).
  4. Stellen Sie den Wärmetauscher auf 40 °C ein, um eine Lungentemperatur von 37,5 °C zu halten. Innerhalb von 20 min steigt die Temperatur der Perfusionslösung von 25°C auf 37°C.
  5. Entfernen Sie die endotracheale Klemme 20 Minuten nach Beginn der Perfusion. Beginnen Sie die maschinelle Beatmung mit einer Atemfrequenz (RR) von 60 Schlägen pro Minute, einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 3 cmH2O und einem anfänglichen Tidalvolumen (VT) von 4 ml/kg, wobei innerhalb von 10 Minuten ein maximales Tidalvolumen von 6 ml/kg erreicht wird.
  6. Starten Sie den Fluss von hypoxischem Gas (8 % CO2, 6 % O2 und 86 % N2), um die Perfusionslösung PCO2 gleichzeitig während der Beatmung zwischen 35 und 45 mmHg in die Lungenarterie zu halten.
  7. Überwachen Sie während der Perfusion ständig die Flussrate der Perfusionslösung, den arteriovenösen Druck, den Spitzendruck der Atemwege und die Lungenfunktionsparameter.

Ergebnisse

Zur Bestimmung, wie gut die EVLP DCD-Spenderlungen erhalten hat, ist die Bewertung der Anzahl apoptotischer Zellen (nachgewiesen mittels TUNEL-Färbung), der Spiegel entzündlicher Marker (im Perfusat mit dem QAH-INF-1-Assaykit nachgewiesen) sowie des allgemeinen makroskopischen Erscheinungsbildes (gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H&E)) der Spenderlungen mit pulsatilem Herzschlag in allen Gruppen erforderlich. Alle DCD-Spenderlungen wurden 4 h lang perfundiert. Die meisten Lungen zeigten eine stabile Compliance, wobei über den Zeitraum von 4 h ein allmählicher Rückgang beobachtet wurde (Abbildung 5B). Bei den DCD-Spenderlungen wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich des vaskulären Widerstands und der Sauerstoffanreicherung des Lungenpräparats festgestellt (Abbildung 5A,C). Die Glukosespiegel im Perfusat nahmen im Laufe der Zeit ab, ohne dass signifikante Unterschiede zwischen einzelnen Ratten beobachtet wurden (Abbildung 5D). Die Elektrolytspiegel im Perfusat blieben zwischen den Gruppen vergleichbar (Abbildung 5E-F).

Die TUNEL-Färbung wurde mittels der Terminal-Desoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nick-End-Labeling-Technik unter Verwendung des Apoptose-Detektionskits gemäß den Herstelleranweisungen zur Nachweis von apoptotischen Kernen durchgeführt. Die TUNEL-Färbung diente der Quantifizierung der Apoptose (programmierter Zelltod) alveolärer Epithelzellen in DCD-Spenderlungen unter verschiedenen Konservierungsbedingungen. Die verblindete Analyse der Anzahl apoptotischer Zellen zeigte eine signifikant höhere Zahl positiver Zellen in der Spendergruppe im Vergleich zu anderen Gruppen. Zusätzlich wies die Gruppe mit kalter Konservierung eine höhere Anzahl positiver Zellen auf als die mit EVLP-perfundierte DCD-Spenderlungen (Abbildung 6). Zur Bewertung der histopathologischen Schnitte, die mit H&E gefärbt wurden, wurden fünf unabhängige Variablen herangezogen: 1) inflammatorischer Zelleinwanderung in den Alveolarraum, 2) Verdickung der Alveolarsepten, 3) intra- und extraalveoläre Blutung, 4) intraalveoläres Ödem und 5) Bildung von hyalinen Membranen. Die Variablen wurden von 0–4 bewertet: 0 = negativ, 1 = leicht, 2 = moderat, 3 = stark und 4 = schwer. Die Summe der bewerteten Variablen ergab die Gesamtwerte für die Lungenverletzung. Der Lungenverletzungsscore ist in der EVLP-Gruppe signifikant niedriger als in der Gruppe mit kalter statischer Konservierung und der Kontrollgruppe (Abbildung 7A). Verdickung der Alveolarwände und alveoläre Blutungen sind in der Gruppe mit 4-stündiger kalter statischer Konservierung erkennbar (Abbildung 7B). Die normale alveoläre Struktur bleibt in der EVLP-Gruppe erhalten (Abbildung 7C).

Herz-Lungen-Maschine, Membran-Oxygenierung, schematisches Diagramm, experimentelle Methode
Abbildung 1: Schema- und Fotografie des ex vivo-Lungenperfusionskreislaufs (EVLP) für Kleintiere. Die Buchstaben im Schema entsprechen den Buchstaben auf der Fotografie und erläutern die Funktion der einzelnen Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

Komponenten des Chromatographiesystems; Diagramm aus Metallverbindungen, Armaturen und Rohrteilen
Abbildung 2: Selbstgefertigte Kanülen. (A) Lungenarterie-Kanüle. (B) Trachea-Kanüle. (C) Linker Vorhof-Kanüle. (D) Ein Satz von Ratten-ex vivo-Lungenperfusionskanülen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

Schema eines chirurgischen Eingriffs an Nagetieren, das die Schritte der kardiovaskulären Dissektion und Organexposition zeigt.
Abbildung 3: Isolierung der Ratte-Lunge. (A) Die Trachealkanüle wird positioniert und mit einer Seidennaht fixiert. (B) Die Lungenarterie wird kanüliert und mit der zuvor angelegten Seidennaht abgebunden. (C) Die Linke-Atrium-Kanüle wird mit einer Seidennaht gesichert. (D) Das Bindegewebe wird stumpf dissekiert, um den Herz-Lungen-Block zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbau des Organperfusionsexperiments; A: Schlauchverbindungen, B: Organ in der Erhaltungskammer für die Forschung.
Abbildung 4: Aufbau der pulmonalen Perfusion bei der Ratte. (A) Der Herz-Lungen-Block wird in den ex vivo-Lungenperfusionkreislauf eingebracht. (B) Eine Lunge mit korrekter Beatmung und Perfusion, die mit dem EVLP-Kreislauf verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramme physiologischer Parameter über die Zeit: PaO2/FiO2, CDyn, PVR, Glukose, Natrium, Kalium.
Abbildung 5: Lungenfunktion während des Ratten-EVLP-Protokolls. (A–F) Lungenfunktion und Blutgasanalyse von Spenderlungen während des EVLP nach einer einstündigen warmen Ischämiezeit (WIT). (A) Pulmonaler Sauerstoffierungsindex. (B) Dynamische Lungencompliance (Cdyn). (C) Pulmonalvaskulärer Widerstand (PVR). (D) Glukosespiegel in der Perfusion 4 h nach EVLP. (E) Natriumspiegel in der Perfusion 4 h nach EVLP. (F) Kaliumspiegel in der Perfusion 4 h nach EVLP. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

TUNEL-Assay-Diagramm mit DAPI-Färbung, Vergleich der Bedingungen DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP
Abbildung 6: Repräsentative Bilder des TUNEL-Assays verschiedener Fälle. TUNEL-positive Zellen: Grün fluoreszierende Zellen zeigen Apoptose an, DAPI: Blaue Fluoreszenz markiert den Zellkern, Merge: Alle Zellen, einschließlich solcher, die einen programmierten Zelltod (Apoptose) durchlaufen; DCD bezeichnet die Gruppe mit direkter Lungenentnahme. DCD+COLD bezeichnet die Gruppe mit vierstündiger kalter statischer Lagerung. DCD+EVLP bezeichnet die Gruppe mit vierstündiger ex vivo-Lungenperfusion (EVLP). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Darstellung dieser Abbildung anzusehen.

Balkendiagramm zur Lungenverletzungsskala und histologische Analyse des Lungengewebes, Darstellung experimenteller Ergebnisse.
Abbildung 7: Lungenverletzungsskala und histologische Befunde. (A) Die Lungenverletzungsskala in der Kontrollgruppe, der SCS- und der EVLP-Gruppe (*, p <0,05). (B) Vertretende mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbte Schnitte von Spendern nach kalter statischer Konservierung (SCS). Der schwarze Pfeil zeigt einen Riss des pulmonalen kapillären Epithels, die blauen Pfeile weisen auf eine Verdickung der Alveolarwände hin. (C) Vertretende H&E-gefärbte Schnitte von EVLP-Spendern. Der rote Pfeil zeigt eine Infiltration entzündlicher Zellen an. (D) Vertretende H&E-gefärbte Schnitte von direkt entnommenen Spendern (Kontrolle). Die schwarzen Pfeile zeigen Risse und Blutungen im pulmonalen kapillären Epithel. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung an; die Signifikanzanalyse erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

In dieser Studie wird ein kostengünstiges und modulares Design für eine EVLP-Plattform für Kleintiere vorgestellt und die Wirksamkeit dieser Plattform in einem Rattenmodell der DCD validiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass EVLP die Qualität der Lungen von verstorbenen Spendern signifikant verbessern und damit den Pool potenzieller Spender für eine Lungentransplantation erweitern kann. Der Mangel an Spenderlungen für Transplantationen bleibt eine kritische Herausforderung. Um dieses Problem anzugehen, haben einige Länder mit der Umsetzung von DCD-Programmen begonnen28. Dieser Ansatz bietet eine wertvolle Strategie, um die Anzahl lebensfähiger Organtransplantate zu erhöhen. Insbesondere haben mehrere Studien gezeigt, dass die Langzeitüberlebensraten nach Lebertransplantation mit DCD-Organen mit denen von Organen aus DBD29,30 vergleichbar sind. Die Verwendung von Lungen von DCD-Spendern bleibt jedoch aufgrund der umfangreichen Schäden, die durch eine anhaltende Ischämie verursacht werden, begrenzt31. Die effiziente Bewertung und Nutzung der begrenzten Lungenressourcen, die von DCD-Spendern erhalten werden, birgt ein immenses Potenzial, um den Mangel an transplantierbaren Lungen zu lindern. EVLP ist eine vielversprechende Technik, die die Qualität der Lunge verbessern und ihre Konservierungszeit vor der Transplantation verlängern kann. Um die Wirksamkeit von EVLP im Vergleich zur Kühllagerung bei 4 °C zu validieren, verwendeten wir ein Rattenmodell des zirkulatorischen Todes. Wir vermuten, dass unsere Perfusionstechnik die durch Ischämie-Reperfusionsschäden verursachten Schäden mildern und die Lungenfunktion nach dem Kreislauftod verbessern kann. Unsere experimentellen Ergebnisse stimmen mit den jüngsten Ergebnissen von Wang et al.32 und Hasenauer et al.33 überein.

Die Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur im gesamten Perfusionskreislauf ist entscheidend für eine optimale EVLP-Funktion. Vielen bestehenden EVLP-Systemen fehlen jedoch zuverlässige und anpassungsfähige Temperiermechanismen. Einzelwärmetauschersysteme erfordern oft Anpassungen, die die Temperatur an bestimmten Stellen ändern. Diese Temperaturschwankung kann die Zusammensetzung der Perfusionsflüssigkeit beeinflussen, die Messung des Oxygenierungsindex stören und letztendlich die Genauigkeit der Versuchsergebnisse beeinträchtigen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, wurde ein EVLP-System entwickelt und mit drei separaten Wasserbad-Wärmetauschern ausgestattet, die im Reservoir, in den Perfusionszonen der Lungenarterie und in der Organkammer platziert wurden. Darüber hinaus verwendet das System minimale Rohrleitungen, um Wärmeverluste zu minimieren und eine präzise Temperaturregelung in einem Bereich von 4-40 °C zu gewährleisten. Diese Konfiguration ermöglicht eine hochpräzise Temperaturregelung, wobei die gemessenen Temperaturen in jedem Schaltungssegment nicht mehr als ± 0,2 °C vom Sollwert abweichen. Das Design erfüllt effektiv die strengen Anforderungen an die Temperaturregelung für EVLP-Experimente.

Kleintiermodelle sind aufgrund ihrer kleineren Organe besonders anfällig für Lungenödeme und Atelektasen34. Diese Komplikationen erschweren die Durchführung langwieriger Perfusionsexperimente erheblich. Um dieser Herausforderung zu begegnen und einen optimalen Lungenschutz während der Perfusion zu gewährleisten, haben wir den Toronto-Ansatz übernommen, den aktuellen Goldstandard in der klinischen Praxis. Bei diesem Verfahren wird sowohl die Perfusatflussrate als auch die Belüftung über einen festgelegten Zeitraum schrittweise erhöht35. Die Perfusion wurde bei 10 % der Zielflussrate (20 % des Herzzeitvolumens = 75 ml/min/250 g Spendergewicht) eingeleitet und über 1 h allmählich erhöht. In ähnlicher Weise wurde die Beatmung mit einer niedrigen Rate (4 ml/kg) eingeleitet und das Atemzugvolumen schrittweise auf ein Maximum von 6 ml/kg über 10 min erhöht. Die Forschung unterstreicht auch die Vorteile der Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) zum Perfusat. Die BSA-Supplementierung erhöht den kolloidosmotischen Druck und reduziert dadurch Gewebeödeme36. Bei der EVLP von Kleintieren gibt es zwei primäre Perfusionskonfigurationen, die auf der Vorhofkanülierung basieren: Closed-Loop und Open-Loop. Closed-Loop-Systeme halten einen konstanten, niedrigen Druck in den Vorhöfen aufrecht, ahmen physiologische Bedingungen nach und ermöglichen genaue Blutgasmessungen. Eine Studie von Linacr et al. hat gezeigt, dass die Aufrechterhaltung eines spezifischen Vorhofdrucks während der Perfusion die Lungenfunktion verbessern und Ödeme reduzieren kann34. Es kann jedoch zu Druckspitzen kommen, wenn der Vorhofmuskel den Schaltkreis verstopft. Darüber hinaus können das Anbinden des Vorhofs und das Vorhandensein von Luftblasen die experimentellen Ergebnisse aufgrund einer möglichen Schädigung der Myokardfasern und inkonsistenter Druckmesswerte beeinträchtigen7. Um diese Einschränkungen zu überwinden und eine effektive Perfusion im geschlossenen Kreislauf zu erreichen, wurde eine speziell entwickelte Vorhofkanüle angefertigt. Diese Kanüle verfügt über eine hervorstehende Spange an der Spitze, um eine Obstruktion durch den Vorhofmuskel zu verhindern. Zusätzlich erleichtern ringförmige Rillen entlang des Kanülenkörpers eine sichere Platzierung der Ligatur. Darüber hinaus verfügt das System über Blasenfallen und Vorperfusionstechniken, um Luftembolien zu eliminieren und einen konstanten Perfusionsdruck aufrechtzuerhalten.

EVLP-Plattformen für Kleintiere werden in der wissenschaftlichen Forschung aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile bevorzugt: kontrollierte Tierbedingungen, Kosteneffizienz, Unterbringung großer Probengrößen und geringer Verbrauch von Perfusionsflüssigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines einzigen Kleintierstamms (z. B. Ratten in dieser Studie, aber auch Meerschweinchen und Kaninchen 24,35,36) eine sorgfältige Kontrolle sowohl der Ernährung als auch der Versuchseinstellungen. Die Vielseitigkeit des Systems ermöglicht die Anpassung an alle diese Spezies durch Anpassung der Atemparameter und der Perfusionsflussrate. Begleitende Videos beschreiben das Tiermodell und die EVLP-Verfahren und vermitteln den Forschern ein umfassendes Verständnis. Durch die Befolgung dieser Protokolle können Forscher den Versuchserfolg steigern, das Leiden der Tiere minimieren und den Tierverbrauch insgesamt reduzieren.

Während die Forschung ein erschwingliches, modulares und benutzerfreundliches EVLP-System für Kleintiere etabliert hat, das die kommerziellen Optionen in Bezug auf Stabilität, Perfusionsqualität und Einstellbarkeit übertrifft, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die EVLP-Protokolle, einschließlich Perfusions- und Beatmungsparameter, zu optimieren und die wirksamsten Lungenschutzmedikamente zu identifizieren. Diese benutzerfreundliche und effiziente Technologie hat erfolgreiche Tests an vielen Spenderlungen unter Nutzung der Infrastruktur ermöglicht. Die aktuellen Forschungsbemühungen konzentrieren sich auf die Wiederherstellung und Konservierung von Lungen von Spendern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National National High-Level Hospital Clinical Research Funding und das Elite Medical Professionals project of China-Japan Friendship Hospital (Fördernummern[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] und [ZRJY2021-GG07]).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3,0 mm Medizinische aseptische SchläucheZhifang Pump Industry Co., LTD, Hebei, China3,0 mmIn der Zirkulation des Blutes anstelle von Blutgefäßen
RinderserumalbuminSigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, ChinaBSAV-ROErhöhen Sie den kolloidosmotischen Druck der Perfusion
BP-100/102 Intravaskulärer BlutdruckwandleriWorx Systems, Inc, New Hampshire, USABP-100/102Aufzeichnungen des pulmonalen Gefäßdrucks bei Ratten
CefazolinBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Beijing, ChinaPHR1291Antibakterielle Infektion
DeoxygenatorDongguan Kewei Medical Instrument, Guangdong, ChinaKeine ModellspezifikationErsetzen Ratte Lungenfunktion Gasaustausch im Blut
F500 Allgemeinanästhesiegerät für KleintiereBeijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Peking, ChinaF500Verabreichung einer Gasanästhesie für die Bereitstellung von Anästhesie
Gasgemisch (6% O2, 8% CO2, 86% N2)Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Peking, ChinaKeine ModellspezifikationAufrechterhaltung des Blutsäure-Basen-Gleichgewichts, simuliert die Physiologie der Lungengefäße
WärmetauscherChanghong Precision Instrument Center, Shenzhen, ChinaDHC-05-BTemperaturregelung im Perfusionskreislauf
HeparinBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Peking, ChinaH0200000Anti-Mikrothrombose
IsofluranRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, ChinaR510-22Anästhesierte Ratten
IsolationskammerHandgefertigt von Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, ChinaKeine ModellspezifikationLagerung von Rattenlungen
i-STAT 1 Tragbarer klinischer AnalysatorAbbott point of care, Inc, NJ, USA300GDie Analyse von Blutgas in der Perfusion
iWorx RA-834 RecorderiWorx Systems, Inc, New Hampshire, USARA-834Signalausgang für den Druck von Lungengefäßen
Mehrkanal-Schlauchpumpe LabMateZhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, ChinaLabMate2Liefert Energie für den Prozess der Perfusionszirkulation
PERFADEX PlusXVIVO Perfusion, Göteborg, SchwedenNADie Lunge des Rattenspenders wurde einer Vorspülung unterzogen; kaliumarme Lösung 
LungenvenenkanüleAus Edelstahl304 / SUS3042,0/2,5 mm
LungenvenenkanüleAus Edelstahl304 / SUS3044,0 mm
QAH-INF-1 Assay-KitInnopsys, Parcd'Activité s Activestre
R415 Beatmungsgerät für KleintiereRWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, ChinaR415Die Beatmung der Rattenlunge
ReservoirShanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, ChinaKapazität 1 LPerfusionsspeicher
SOLU-MEDROLBeijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Peking, ChinaM0639NA
Temperatursensor (TM-100)iWorx Systems, Inc, New Hampshire, USATM-100Rekordtemperatur bei der Lungenperfusion

Referenzen

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