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Einbeziehung der Flexibilität und Dynamik der Zielproteinstruktur in die computergestützte Wirkstoffforschung mithilfe der ensemblebasierten Docking-Analyse

DOI:

10.3791/67174

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Computergestützte Methoden sind vielversprechend, um die Wirkstoffforschung zu beschleunigen, übersehen jedoch häufig die dynamische Natur von Proteinstrukturen. Hier diskutieren wir die ensemblebasierte Docking-Analyse, um indirekt die Proteinflexibilität einzubeziehen und so möglicherweise die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Wirkstoffforschung zu verbessern.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Prozess der Wirkstoffforschung ist ein strenger, zeitaufwändiger und teurer Vorgang. Der computergestützte Ansatz in der Wirkstoffforschung ermöglicht es den Forschern, die vielversprechendsten Wirkstoffe für weitere Tests zu priorisieren, was die erforderlichen Ressourcen erheblich reduzieren würde, was zu einer Steigerung der Gesamteffizienz in den Pipelines der Wirkstoffforschung führen würde. Die strukturbasierte Wirkstoffforschung ist ein gängiger Ansatz, bei dem die Strukturinformationen des Zielproteins in einem dreidimensionalen Format benötigt werden. Die derzeitige Einschränkung der meisten computergestützten Wirkstoffforschungsstrategien besteht jedoch darin, dass sie nicht in der Lage sind, die Flexibilität und Dynamik der Zielproteinstruktur während der Liganden-Protein-Docking-Simulation einzuführen. Während sowohl das induzierte Fit-Docking als auch das ensemblebasierte Docking darauf abzielen, die Proteinflexibilität im Docking-Verfahren zu verbessern, kann letzteres einen umfassenderen Überblick über das dynamische Proteinverhalten bieten, indem es mehrere Konformationen in die Simulation einbezieht. In diesem Bericht demonstrieren und diskutieren wir die Anwendung einer Technik namens ensemblebasierte Docking-Analyse, die indirekt die Flexibilität und Dynamik der Zielproteinstruktur in den molekularen Docking-Prozess einführt. Das Protein und der Ligand, die für Ensemble-basierte Docking-Studien ausgewählt wurden, waren Lysozym bzw. Flovokawain B (FB). Es wurde bereits berichtet, dass FB eine Bindungsaktivität mit Lysozym hat. Eine Simulation der Molekulardynamik (MD) wurde an Lysozym in Gegenwart von Wasser durchgeführt und die Gesamtenergie, die Root-Mean-Square-Abweichung (RMSD) und die Root-Mean-Square-Fluktuation (RMSF) untersucht. Das Conformation-Clustering wurde auf der Grundlage mehrerer Clustering-Cutoff-Werte generiert und für eine zusätzliche Docking-Analyse mit FB ausgewählt. Cluster Nr. 2 ergibt mit -29,37 kJ/mol die geringste Bindungsenergie. Es wurden molekulare Andockbilder erstellt, um das Vorhandensein von Bindungskräften zu antizipieren. Durch die Einbeziehung der strukturellen Dynamik des Proteins kann der Ensemble-basierte Docking-Ansatz die Bandbreite möglicher Bindungsszenarien besser erfassen, was zu zuverlässigeren Vorhersagen der Bindungsergebnisse führt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei der computergestützten Wirkstoffforschung (CDD) werden Techniken aus der Informatik, Chemie, Biologie und Physik integriert, um den riesigen chemischen Raum zu erforschen, Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen vorherzusagen und Wirkstoffkandidaten mit höherer Effizienz und geringeren Kosten im Vergleich zu herkömmlichen experimentellen Methoden allein zu optimieren. Es handelt sich um einen leistungsstarken Ansatz, der Berechnungsmethoden und Algorithmen nutzt, um die Entdeckung und Optimierung neuer therapeutischer Wirkstoffe zu beschleunigen 1,2,3. CDD hat die Wirkstoffforschung revolutioniert. Es gibt jedoch Einschränkungen im Zusammenhang mit der dreidimensionalen (3D) Strukturdynamik von Proteinen, die die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von computergestützten Vorhersagen beeinträchtigenkönnen 4. Protein-3D-Strukturen dienen in CDD als Templates für das Design oder die Optimierung von Wirkstoffkandidaten basierend auf den Zielprotein-Wirkstoff-Wechselwirkungen. Während Röntgenkristallographie-Modelle von Proteinstrukturen wertvolle strukturelle Informationen über Proteine liefern, ist es wichtig, die dynamische Natur von Proteinstrukturen und die Grenzen statischer Modelle zu erkennen 5,6,7. Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und computergestützten Vorhersagen wie AlphaFold auch die Verfügbarkeit von Strukturdaten bei der Erfassung des gesamten Spektrums der Proteinflexibilität und -dynamik erheblich erweitert 8,9,10,11,12.

Molekulardynamik-Simulationen (MD) simulieren die Bewegung und Wechselwirkungen von Atomen und Molekülen im Laufe der Zeit und geben Einblicke in das dynamische Verhalten und die Flexibilität der 3D-Struktur von Proteinen13,14. MD-Simulationen werden verwendet, um 3D-Strukturen von Proteinen zu generieren, die verschiedene Konformationszustände repräsentieren, die als Input für die ensemblebasierte Docking-Analyse dienen. Durch die Probenahme verschiedener Proteinkonformationen berücksichtigt die ensemblebasierte Docking-Analyse die inhärente Flexibilität und Dynamik biologischer Ziele und ermöglicht eine umfassendere Untersuchung der Ligandenbindungsmodi und -wechselwirkungen3.

Das Verständnis der Proteinflexibilität ist von entscheidender Bedeutung, da es beeinflusst, wie Arzneimittel ihre biologische Wirkung entfalten, den Ort und die Ausrichtung von Bindungsstellen bestimmt und die Bindungskinetik, den Stoffwechsel und den Transport beeinflusst15,16. Die Erfassung dieser dynamischen Natur kann die Genauigkeit und Zuverlässigkeit von Docking-Vorhersagen erheblich verbessern. Im Jahr 1994 führten Kearsley et al. eine flexible Docking-Technik ein, ein Framework, das die Flexibilität von Liganden und Proteinen modelliert. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Konformation des Proteins während des Andockens anzupassen, was die Vorhersage von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen verbessert, indem die strukturelle Flexibilität berücksichtigtwird 17. In ähnlicher Weise berichteten Carlson et al. 1999 über das Ensemble-Docking, das eine flexible Pharmakophormodellierung sowohl auf statische als auch auf dynamische Modelle der HIV-1-Integrase anwendet, was die Bedeutung der Berücksichtigung der Proteindynamik in Docking-Studien weiter unterstreicht18. Darüber hinaus berichteten Cavasotto et al. auch über die Verbesserung der Liganden-Docking-Genauigkeit, indem sie die Rezeptorflexibilität in den Docking-Prozess mit Hilfe der Normalmodus-Analyse einbezogen19. In jüngerer Zeit haben Ensemble-basierte Techniken 20,21,22,23,24,25,26,27 die Wirkstoffforschung erweitert, indem sie potenzielle neue Ligandenbindungsstellen identifiziert und genauere Schätzungen der freien Liganden-Rezeptor-Bindungsenergie liefern. Diese Fortschritte wurden auf Ziele wie Quadruplex-Duplex-DNA20, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 165 (VEGF-165)21, das SARS-CoV-2-Zielenzym22, die menschlichen Leber-Cytochrom-P450-Enzyme23 und Krebsproteine24 angewendet.

Flavokawain B (FB), das als Flavonoid eingestuft wird, weist nachweislich verschiedene pharmakologische Eigenschaften auf 28,29,30. Basierend auf experimentellen und computergestützten Analysen wurde berichtet, dass FB einen stabilen Komplex mit Lysozym (LYZ)31 bildet, einem Protein, das weithin für seine antimikrobielle Aktivität anerkannt ist und auch als Ligandentransporter identifiziert wurde 32,33,34. In diesem Bericht analysieren wir die Art der Interaktion von FB mit LYZ unter Verwendung einer Ensemble-basierten Docking-Analyse, um den Einfluss der Proteinflexibilität auf die Bildung von FB-LYZ-Komplexen zu berücksichtigen. Ziel dieser Methode ist es, den Forschern einen schrittweisen, wiederholbaren Prozess für die ensemblebasierte Docking-Analyse zur Verfügung zu stellen. Darüber hinaus empfiehlt es sich für Forscher, die Proteinstrukturen aus dem Zielorganismus für die Forschung auszuwählen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der Flavokawain B-Ligandenstruktur

  1. Öffnen Sie die PubChem-Website. Suche nach Flavokawain B. Wählen Sie Herunterladen und dann Speichern für SDF-2D-Struktur als Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF aus.
  2. Öffnen Sie die Avogadro-Software. Verschieben Sie die SDF-Datei in den leeren Bereich der Software. Klicken Sie auf Ja.
    HINWEIS: Die Avogadro-Software erstellt automatisch eine dreidimensionale (3D) Geometrie.
  3. Klicken Sie auf der Registerkarte auf das Symbol, wie in Abbildung 1 dargestellt. Ändern Sie auf dem linken Menüreiter das Kraftfeld in MMFF9435,36. Passen Sie die Schritte pro Update auf 15 an. Legen Sie den Algorithmus auf Steilster Abstieg fest, und klicken Sie auf Start.
    HINWEIS: Bewegen Sie während der Drehung keine Atome. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Stopp. MMFF94 eignet sich für eine breite Palette von niedermolekularen Liganden (einschließlich neutraler und geladener Liganden) und wird häufig zur Energieminimierung und molekularen Modellierung eingesetzt37. Die Methode des steilsten Abstiegs wird für die anfängliche Energieminimierung gewählt, da sie einfach, rechnerisch effizient und effektiv ist, um große strukturelle Dehnungen zu beseitigen und einen grundlegenden Minimierungszustand 38,39,40 zu erreichen.
  4. Gehen Sie auf der Registerkarte "Datei" zu "Datei " und klicken Sie auf "Speichern unter". Wenn der Ordner Molekül speichern unter angezeigt wird, schreiben Sie den Dateinamen als ligand.pdb und klicken Sie auf Speichern.

2. Vorbereitung der Lysozym-Proteinstruktur

  1. Öffnen Sie die Website der RCSB-Proteindatenbank. Suchen Sie nach Lysozym, Code: 1LYZ. Klicken Sie auf Dateien herunterladen und wählen Sie PDB-Format. Speichern Sie als 1lyz.pdb.
  2. Öffnen Sie die Chimera-Software. Klicken Sie auf der Registerkarte auf Datei und Öffnen. Wählen Sie im Ordner die Datei 1lyz.pdb aus.
    HINWEIS: Eine 3D-Struktur des Lysozyms wird mit Hilfe einer Software erstellt.
  3. Klicken Sie auf der Registerkarte auf Select > Residue > HOH. Klicken Sie dann auf Aktionen > Atom/Bonds > Löschen. Klicken Sie auf Auswahl und Auswahl aufheben.
    HINWEIS: Dadurch wird dem Protein jegliches Wasser entzogen.
  4. Klicken Sie auf der Registerkarte auf > Kette > A auswählen. Klicken Sie dann auf Extras > Strukturbearbeitung > AddH. Es wird ein Parameterfeld angezeigt, das als Standard beibehalten wird. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Select and Clear Selection (Auswahl auswählen und aufheben) (Abbildung 2).
    HINWEIS: Dadurch wird dem Protein Wasserstoff hinzugefügt. Der Histidinrest wird ebenfalls protoniert, um ein neutrales System zu erzeugen. Die Software kann durch die Integration von PROPKA41,42 pKa-Berechnungen durchführen.
  5. Klicken Sie auf der Registerkarte dann auf Tools, Strukturbearbeitung und Gebühr hinzufügen. Eine Parameterbox wird angezeigt. wählen Sie Gasteiger aus. Klicken Sie auf OK. HINWEIS: Dadurch werden dem Protein Teilladungen hinzugefügt.
  6. Um die Datei zu speichern, klicken Sie auf der Registerkarte auf Datei > PDB speichern. Speichern Sie als protein.pdb.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde die Struktur des Lysozyms so gewählt, dass sie mit dem zuvor berichteten Ergebnisverglichen wurde 31. Den Lesern wird empfohlen, Proteinstrukturen aus dem Zielorganismus, für den sie sich interessieren, sorgfältig auszuwählen.

3. MD-Simulation von Lysozym in Wasser

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten benutzerdefinierten Computer für die Simulation der Molekulardynamik (MD) sind Intel CORE i7 der 11. Generation für CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 für GPU und DDR4 128 GB Speicher. Das Betriebssystem ist Ubuntu 22.04.4 LTS. Die MD-Simulation verwendet die GROMACS-Software. Die GPU-Unterstützung ist CUDA.

  1. Laden Sie alle erforderlichen Dokumente unter diesem Link herunter: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (GROMACS Tutorial, Lysozym in Water)43.
    HINWEIS: Die benötigten Dokumente sind em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff und protein.pdb (aus Schritt 2.5). Für die Systemeinrichtung dient em.mdp der Energieminimierung und ions.mdp dem Hinzufügen von Ionen und der Neutralisierung des Systems. Für den Gleichgewichtsausgleich steht nvt.mdp für den Temperaturausgleich, während npt.mdp für den Druckausgleich zuständig ist. Für die Produktion ist md.mdp für die Simulation vorgesehen. Charmm36 ff steht für die Topologie.
  2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die leere Stelle im Ordner (dem Arbeitsverzeichnis) und klicken Sie auf Terminal öffnen. Geben Sie gmx ein, um die GROMACS-Software zu öffnen. HINWEIS: GROMACS verfügt nicht über eine grafische Benutzeroberfläche. Es ist alles von dem Befehl, der am Terminal geschrieben wurde.
  3. Geben Sie für die Generierung der Proteintopologie gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh ein. Es wird eine Liste von Kraftfeldern gegeben, und Typ 1 für das CHARMM All-Atom-Kraftfeld44, gefolgt von Typ 1 für TIP3P für das Wassermodell.
    HINWEIS: Die aktualisierte Version, CHARMM36, ist ebenfalls verfügbar und kann vonhttp://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml 45 heruntergeladen werden.
  4. Definieren Sie eine kubische Box, die die gesamte Proteinstruktur abdeckt. Geben Sie gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic ein. HINWEIS: Das Protein wird mindestens 1 nm vom Schachtelrand entfernt platziert. Stellen Sie sicher, dass die Wasserbox groß genug für Proteine, Lösungsmittel und Ionen ist. Darüber hinaus sollte die Wasserbox ausreichend sein, um Wechselwirkungen zwischen periodischen Bildern des Proteins zu verhindern. Der empfohlene Mindestabstand zwischen dem Protein und dem Schachtelrand beträgt mindestens 1,0–1,5 nm.
  5. Für die Lösungsmittelkonfiguration46 geben Sie gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro ein.
  6. Fügen Sie Ionen wie Natrium und/oder Chlorid hinzu, indem Sie gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro eingeben.
    HINWEIS: Natrium- und/oder Chloridionen werden/werden zur Neutralisation des Systems verwendet.
  7. Neutralisieren Sie das System, indem Sie gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral eingeben. Wählen Sie 13 für die SOL-Gruppe aus.
    HINWEIS: Für Lysozym wurden 8 gelöste Moleküle durch Chloridionen ersetzt (Abbildung 3).
  8. Suchen Sie in der Datei CHARMM 36 nach dem Ordner ions.itp . Die Abkürzung für Chloridion ist CLA.
  9. Öffnen Sie topol.top Datei, fügen Sie CLA und Nummer 8 hinzu, wie in Abbildung 4 dargestellt.
  10. Öffnen Sie die Datei solv_ions.gro und tauschen Sie alle CL in CLA aus.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Dateien solv_ions.gro und topol.top die gleiche Abkürzung der jeweiligen ions haben, sonst wird eine Warnung ausgegeben. Die Umbenennung des Ionennamens entspricht der Dateiversion CHARMM 36 ff. Da die Abkürzung für Chlorid bereits CL ist, ist es nicht notwendig, die Ionen in der älteren Version umzubenennen. Achten Sie jedoch immer auf das Ionenkürzel.
  11. Entspannen Sie die Proteinstruktur durch die Minimierung der steilsten Abstiegsenergie mit der maximalen Anzahl von 50.000 Schritten. Geben Sie dazu gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr gefolgt von gmx mdrun -v -deffnm em ein.
    HINWEIS: Das Lösungsmittel und die Ionen werden in zwei Phasen um das Protein herum äquilibriert: (i) Anzahl der Partikel (N), Systemvolumen (V) und Temperatur (T) sind konstant (NVT) und (ii) Anzahl der Partikel (N), Systemdruck (P) und Temperatur (T) sind konstant (NPT). Die Temperaturkopplung (NVT-Phase) ist auf 300 K eingestellt, basierend auf einem modifizierten Berendsen-Thermostat, während die Druckkupplung (NPT-Phase) auf 1 bar basierend auf Parrinello-Rahman eingestellt ist. Die elektrostatischen Wechselwirkungen mit großer Reichweite und die Suche nach dem nächsten Nachbarn werden automatisch mit der Particle-Mesh-Ewald-Methode (PME) bzw. dem Verlet-Algorithmus berechnet.
  12. Für das Gleichgewicht von NVT geben Sie gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr gefolgt von gmx mdrun -v -deffnm nvt ein.
    HINWEIS: Die für den Temperaturausgleich benötigte Zeit beträgt je nach CPU und GPU etwa 5 Minuten. Für das Systemgleichgewicht liegt die Simulationszeit bei 100 ps.
  13. Für das Gleichgewicht von NPT geben Sie gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr gefolgt von gmx mdrun -v -deffnm npt ein.
    HINWEIS: Die für den Druckausgleich benötigte Zeit beträgt je nach CPU und GPU etwa 5 Minuten. Für das Systemgleichgewicht liegt die Simulationszeit bei 100 ps.
  14. Lassen Sie das System 1 ns lang Äquilibrierungsläufe durchlaufen, gefolgt von einem Produktionslauf mit der Funktion mdrun mit einer Dauer von 100 ns. Öffnen Sie die Datei md.mdp. In n Schritten wird auf 50000000 geändert; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Für die Erzeugung der Molekulardynamik geben Sie gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr gefolgt von gmx mdrun -v -deffnm md ein.
    HINWEIS: Die Zeit dafür beträgt ca. ~2 Tage. Die aus der MD-Simulation generierten Trajektorienrahmen werden in Intervallen von 10 ps erfasst und für eine auf RMSD (Mean Square Deviation) basierende Clustering-Analyse verwendet.

4. RMSD-basierte Clustering-Analyse

  1. Fahren Sie nach der MD-Simulation mit der Befehlsanalyse fort. Das Protein diffundiert durch die Elementarzelle und kann "kaputt" erscheinen oder auf die andere Seite der Box "springen". Geben Sie gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -your compact ein. Typ 1 für die Zentrierung des Proteins und 0 für die Ausgabe des Systems. Geben Sie vmd em.gro ein, um das Protein zu visualisieren.
  2. Geben Sie für die Gesamtenergieanalyse gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg ein, und fahren Sie mit Typ 14 für die Gesamtenergie fort.
    HINWEIS: Die Überwachung der Gesamtenergie ist von grundlegender Bedeutung, um die Zuverlässigkeit und Richtigkeit von MD-Simulationen zu gewährleisten47,48.
  3. Geben Sie für die RMSD-Analyse gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns ein. Fahren Sie mit Typ 3 für das C-Alpha der Anpassung der kleinsten Quadrate und 3 für das C-Alpha der RMSD-Berechnung fort (Abbildung 5).
  4. Geben Sie für die RMSF-Analyse gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res ein. Fahren Sie mit Typ 1 für Protein fort.
  5. Um die Kulanz zu verwenden, geben Sie den Befehl xmgrace totalenergy.xvg ein. Passen Sie die Achsen an, indem Sie auf die Linie des Diagrammrahmens doppelklicken. Ein Feld "Gnade: Äxte" wird angezeigt. Klicken Sie auf Akzeptieren.
  6. Klicken Sie im Registerkartenmenü auf Datei und Print_setup. Eine Kulanz: Das Geräte-Setup wird angezeigt. Ändern Sie das Gerät von PostScript auf JPEG. Klicken Sie auf Akzeptieren. Klicken Sie nun im Dateimenü auf Drucken . Speichern Sie unter totalenergy.jpg.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 für xmgrace rmsd.xvg und xmgrace rmsfxvg.
  8. Geben Sie für die Clusteranalyse gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz cluster-size.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0 ein. Fahren Sie mit Typ 1 (Proteingruppe) fort, um die Anpassung der kleinsten Quadrate sowie RMSD und Typ 1 (Proteingruppe) für die Systemausgabe zu berechnen.
    HINWEIS: Passen Sie den Grenzwert entsprechend dem Clustering-Ergebnis an. Der Befehl -cl stellt die durchschnittlichen Ausgaben für jeden Cluster dar.
  9. Öffnen Sie cluster-size.xvg.
    1. Erhöhen Sie auf der Grundlage der bereitgestellten Informationen den RMSD-Grenzwert, wenn die Anzahl der Cluster niedrig ist, oder verringern Sie den RMSD-Grenzwert, wenn die Anzahl der Cluster hoch ist.
  10. Wiederholen Sie Schritt 4.8 mit anderen Cutoff-Werten.
    HINWEIS: Clustering mit unterschiedlichen Grenzwerten, bis ein optimaler RMSD-Grenzwert basierend auf den folgenden Kriterien bestimmt wurde: (1) Die Gesamtzahl der Cluster sollte auf weniger als 30 begrenzt werden. (2) Die Minimierung des Vorhandenseins von Clustern mit nur einem Mitglied wird bevorzugt. (3) Es ist wünschenswert, dass mehr als 90 % der Trajektorie in weniger als 10 Clustern dargestellt werden.
  11. Öffnen Sie die Chimera-Software und suchen Sie nach cluster.pdb.
    HINWEIS: cluster.pdb enthält einen Durchschnitt für jede Clustergruppe.
  12. Klicken Sie auf Geschenke und Publikation 1 (Silhouette, abgerundetes Band).
  13. Gehen Sie dann zu Datei > Bild speichern > Speichern.
  14. Klicken Sie > cluster.pdb auf > Kette > (ohne ID) auswählen. Klicken Sie auf Auswählen > Invertieren (alle Modelle). Klicken Sie auf Aktionen > Atome/Bindungen> löschen.
    HINWEIS: Dadurch werden alle Gruppencluster mit Ausnahme von Cluster 1 entfernt.
  15. Gehen Sie dann zu Datei > PDB speichern > speichern. Speichern Sie als cluster1.pdb.
  16. Wiederholen Sie die Schritte 4.11 bis 4.15 für verschiedene Cluster. Speichern Sie als cluster2.pdb, cluster3.pdb und cluster4.pdb.
    HINWEIS: Da die Gesamtzahl der Top-4-Cluster mehr als 90 % der Gesamttrajektorien beträgt, wird jeder Repräsentant der Top-4-Cluster extrahiert und einer molekularen Docking-Analyse mit Chimera unterzogen (siehe Abbildung 6).

5. Ensemble-basiertes Andocken

  1. Doppelklicken Sie auf Autodock Tools .
    HINWEIS: Für das Andocken wurde in dieser Studie AutoDock und die AutoDock-Werkzeugsoftware 13,49,50,51 verwendet.
  2. Platzieren Sie die Dateien cluster1.pdb und ligand.pdb in einem neuen Ordner.
  3. Klicken Sie im Menü auf Datei > Einstellungen > Festlegen. Das Feld "Benutzereinstellungen festlegen " wird angezeigt. Kopieren Sie die Adresse des "neuen Ordners" als Text. Fügen Sie die Adresse im Startverzeichnis in das Feld Benutzereinstellungen festlegen ein. Klicken Sie auf Festlegen.
    HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt, wenn Sie ein Windows-Betriebssystem verwenden.
  4. Klicken Sie auf das blaue Ordnerbild. Ein Ordner mit dem gelesenen Molekül wird angezeigt. Wählen Sie cluster1.pdb aus.
    HINWEIS: Autodock-Tools lesen die Molekularstruktur des Proteins.
  5. Klicken Sie auf > Kosten bearbeiten > Kollman-Gebühren hinzufügen. Klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie auf > Wasserstoffatome bearbeiten > Unpolar zusammenführen.
    HINWEIS: Kollman-Ladungen werden dem Protein zugesetzt.
  6. Klicken Sie auf Raster > Makromoleküle > wählen Sie aus. Das Feld Makromoleküle auswählen wird angezeigt. Wählen Sie cluster1 aus, und klicken Sie auf Moleküle auswählen. Klicken Sie auf OK. Eine modifizierte AutoDock4-Makromoleküldatei wird angezeigt. Speichern Sie als cluster1.pdbqt.
  7. Leeren Sie den Arbeitsbereich, indem Sie auf Bearbeiten > Löschen > Alle Moleküle löschen klicken. Klicken Sie auf Weiter.
  8. Klicken Sie auf Ligand > Eingabe > Öffnen.  Eine Ligandendatei für den Autodock4-Ordner wird angezeigt. Wählen Sie Alle Dateien aus, wählen Sie ligand.pdb aus, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf OK.
    HINWEIS: Der Aufbauligand umfasst den Einbau von Gasteiger-Ladungen und die Verschmelzung von unpolarem Wasserstoff.
  9. Klicken Sie auf Ligand > Torsionsbaum > Wurzel erkennen.
  10. Klicken Sie auf Ligand > Ausgabe > Als PDBQT speichern. Der Ordner Formatted Autotors Molecules wird angezeigt. Speichern Sie als ligand.pdbqt.
  11. Leeren Sie den Arbeitsbereich, indem Sie auf Bearbeiten > Löschen > Alle Moleküle löschen klicken. Klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Gehen Sie wie in Schritt 5.6 beschrieben vor.
  12. Klicken Sie auf Raster > Makromoleküle > auf Öffnen. Wählen Sie cluster1.pdbqt aus, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf Ja. Klicken Sie auf OK.
  13. Klicken Sie auf Raster > Festlegen von Map-Typen > Öffnen Sie den Liganden. Wählen Sie ligand.pdbqt aus, und klicken Sie auf Öffnen.
    HINWEIS: Im Arbeitsbereich befinden sich Proteine und Liganden.
  14. Klicken Sie auf Raster und Rasterfeld. Das Feld "Rasteroptionen" wird angezeigt. Stellen Sie bei Anzahl der Punkte in der x-Dimension den Parameter auf 120 ein, legen Sie die Anzahl der Punkte in der y-Dimension auf 120 fest, legen Sie die Anzahl der Punkte in der z-Dimension auf 120 fest. Legen Sie den Abstand (Angström) auf 0,375 fest. Behalten Sie die Standardparameter für das mittlere Rasterfeld bei. Klicken Sie auf Datei und schließen Sie Aktuelles speichern.
    HINWEIS: Die Gitterbox deckt das gesamte Protein ab, was bedeutet, dass es sich um ein Blinddocking handelt.
  15. Klicken Sie auf Raster > Ausgabe > GPF speichern. Eine Ausgabedatei für Rasterparameter wird angezeigt. Geben Sie im Dateinamen grid.gpf ein und klicken Sie auf Speichern.
  16. Klicken Sie auf Ausführen und AutoGrid ausführen. Das Feld AutoGrid ausführen wird angezeigt. Klicken Sie auf der Registerkarte Parameterdateiname auf Durchsuchen. Eine Autogrid-Parameterdatei wird angezeigt. Wählen Sie grid.gpf aus. Klicken Sie auf Öffnen. Unter Programmpfadname > Durchsuchen. Eine autogrid4-Datei wird angezeigt. Suchen Sie nach autogrid4.exe und klicken Sie auf Öffnen > Starten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Ordnername keine Leerzeichen enthält, da dies während der Ausführung zu einem Fehler führen kann. Der Ordner autogrid4.exe kann von https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/ installiert werden.
  17. Klicken Sie auf Andocken > Makromoleküle > legen Sie starre Dateinamen fest. Eine PDBQT-Makromolekül-Datei wird angezeigt. Wählen Sie cluster1.pdbqt aus, und klicken Sie auf Öffnen.
  18. Klicken Sie auf Andocken > Ligand > Auswählen. Das Feld Liganden auswählen wird angezeigt. Wählen Sie den Liganden aus und klicken Sie auf Liganden auswählen. Das Feld AutoDpf4-Liganden-Parameter wird angezeigt. Klicken Sie auf Akzeptieren.
  19. Klicken Sie auf Andocken > Suchparameter > genetischer Algorithmus. Das Feld Parameter des genetischen Algorithmus wird angezeigt. Ändern Sie die Anzahl der GA-Ausführungen in 100. Behalten Sie die restlichen Parameter als Standard bei. Klicken Sie auf Akzeptieren.
  20. Klicken Sie auf Docking > Ausgabe > Lamarckian GA (4.2). Eine Ausgabedatei für Autodock4.2 GALS Docking-Parameter wird angezeigt. Geben Sie als Dateinamen docking.dpf ein, und klicken Sie auf Speichern.
  21. Klicken Sie auf Ausführen > AutoDock ausführen. Das Feld Autodock ausführen wird angezeigt. Klicken Sie bei Parameter Dateiname auf Durchsuchen. Eine autodock4-Parameterdatei wird angezeigt. Wählen Sie docking.dpf aus. Klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie unter Programmpfadname auf Durchsuchen. Eine autodock4-Datei wird angezeigt. Suchen Sie nach autodock4.exe und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf Starten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Ordnername keine Leerzeichen enthält, da dies während der Ausführung zu einem Fehler führen kann. Die benötigte Zeit beträgt ~30 Minuten. Der Ordner autodock4.exe kann über den folgenden Link installiert werden: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Löschen Sie alle Moleküle, wie in Schritt 5.7 beschrieben.
  23. Wiederholen Sie die Schritte von 5.1 bis 5.22 für cluster2.pdb, cluster3.pdb und cluster4.pdb.
    HINWEIS: Alle 4 Andockgruppen werden für die Analyse verwendet.

6. Ensemble-basierte Docking-Analyse

  1. Verwenden Sie die AutoDock Tools, um die Analyse fortzusetzen. Klicken Sie auf Analysieren > Docking > Öffnen. Eine Docking-Protokolldatei wird angezeigt. Wählen Sie docking.dlg aus, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie dann auf OK.
  2. Klicken Sie auf > Makromoleküle analysieren > Öffnen.
  3. Klicken Sie auf Analyze > Conformations > Play, geordnet nach Energie. Eine Ligandenbox wird angezeigt.
  4. Öffnen Sie im neuen Ordner den Ordner docking.dlg mit einem Editor. Suche nach Clusteranalyse der Konformation. Suchen Sie anhand der gegebenen Informationen nach dem Konformationslauf (angegeben als Run), der die niedrigste Bindungsenergie aufweist.
    HINWEIS: Da 100 Konformationen durchlaufen werden, hat nur eine die stärkste Bindungsaffinität zwischen Ligand und Protein. Der Begriff für die niedrigste Bindungsenergie ist definiert als eine stärkere Bindungsaffinität 52,53,54.
  5. Geben Sie in Schritt 6.3 (Ligandenfeld ) den Konformationslauf (aus Schritt 6.4) ein, und drücken Sie die Eingabetaste.
    HINWEIS: Der Ligand positioniert sich entsprechend im Inneren des Proteins.
  6. Klicken Sie in der Ligandenbox auf die Schaltfläche Fenster öffnen, um die Wiedergabeoption zu ändern. Das Feld "Wiedergabeoption festlegen" wird angezeigt. Klicken Sie auf Write Complex. Es erscheint ein Schreibkomplex des Rezeptorordners . Speichern Sie als complex.pdb.
    HINWEIS: Da es 4 Clustergruppen gibt, kann die Datei complex.pdb entsprechend benannt werden, z. B. complex1.pdb für Clustergruppe 1.
  7. Öffnen Sie die Chimera-Software und suchen Sie nach complex.pdb (wie in Schritt 6.6).
  8. Klicken Sie auf Vorgaben > Interaktiv 1 (Menübänder) > Publikation 1 (Silhouette, abgerundetes Menüband).
  9. Gehen Sie dann zu Datei und klicken Sie auf Bild speichern.
    HINWEIS: Das gespeicherte Bild ist die Farbbandstruktur des FB-LYZ-Komplexes.
  10. Klicken Sie > Interactive 3 (Hydrophobizitätsoberfläche) > Publikation 1 (Silhouette, abgerundetes Menüband) auf Vorgaben.
    HINWEIS: Das gespeicherte Bild ist die Ballonstruktur des FB-LYZ-Komplexes.
  11. Öffnen Sie die Discovery Studio-Software.
  12. Ziehen Sie die Datei complex.pdb in den leeren Bereich der Software.
  13. Klicken Sie auf die Registerkarte Werkzeuge und wählen Sie 2D-Diagramm anzeigen.
    HINWEIS: Die Software generiert automatisch die 2D-Struktur des Komplexes (Abbildung 7).
  14. Klicken Sie auf Datei und Speichern unter. Geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.

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Results

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Die chemische Struktur und die 3D-Strukturdarstellung von FB nach der Optimierung sind in Abbildung 8A dargestellt. Abbildung 8B zeigt die 3D-Struktur des Lysozyms mit dem pdb-Code 1LYZ im Anfangszustand vor der MD-Simulation. Um die Dynamik und Flexibilität der Lysozym-3D-Struktur zu untersuchen, wurde eine MD-Simulation für 100 ns durchgeführt. Die Gesamtenergie der Proteinstruktur war während der Simulation stabil, wie in

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Discussion

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Die ensemblebasierte Anwendung in der computergestützten Wirkstoffforschung umfasst die Verwendung zahlreicher Konformationsensembles, die aus Kristallstrukturen, Kernspinresonanzstudien (NMR) oder Molekulardynamiksimulationen abgeleitet werden26. Die Nutzung mehrerer computergestützter Konformationen würde es ermöglichen, die Dynamik und Flexibilität einer Proteinstruktur in die Analyse einzubeziehen, was zu einer Verbesserung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit ...

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch das RMF-Stipendium der Universiti Malaya, Projektnummer RMF1392-2021, der Universiti Malaya unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoDockThe Scripps Research Institute, USVersion 4.2.6
AutoDock ToolsThe Scripps Research Institute, USVersion 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Department of Chemistry, University of Pittsburgh, Pittsburgh, USAVersion 1.95
Discovery StudioDassault Systè mes, Massachusetts, USAVersion 2021
GROMACsUniversität Groningen
Royal Institute of Technology
Universität Uppsala, Schweden		Version 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization, and Informatics
University of California		Version 1.16

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