Kovalentes Fragment-Screening mit dem quantitativen irreversiblen Tethering-Assay

Summary

Der quantitative irreversible Tethering (qIT) Assay ist eine fluoreszenzbasierte Methode zur Identifizierung kovalenter Fragmente, die selektiv an ein Zielprotein binden. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Beschreibung des qIT-Assays mit Beispielergebnissen skizziert.

Abstract

Verbindungen, die kovalente Bindungen mit spezifischen Zielproteinen eingehen, bieten als chemische Sonden und Therapeutika eine Vielzahl von Vorteilen. Am häufigsten werden mild reaktive, elektrophile kleine Moleküle verwendet, um kovalente Bindungen mit ausgewählten Cystein-Seitenketten in bestimmten Proteinen zu bilden. Elektrophile First-Ansätze der Ligandenforschung, bei denen eine Bibliothek elektrophiler kleiner Moleküle gegen ein Proteinziel abgeschirmt wird, sind populär geworden, da sie die Notwendigkeit einer zeitaufwändigen nachgeschalteten Installation eines elektrophilen Gefechtskopfes vermeiden. Ein solches Screening ist jedoch kompliziert, da elektrophile Liganden eine Vielzahl unterschiedlicher Raten an spontanen Reaktionen mit Cysteinen aufweisen können. Quantitativ-irreversibles Tethering (qIT) bietet eine fluoreszenzbasierte Methode zur Hit-Identifizierung und -Entwicklung, die Daten für diese Unterschiede in der Reaktivität intrinsischer Verbindungen normalisiert. Die Reaktionsgeschwindigkeiten einzelner Verbindungen mit einem Zielprotein werden bestimmt und mit der Reaktivität der Verbindung mit dem unstrukturierten Tripeptid Glutathion (dies ist ein Proxy für die spontane Verbindungsreaktion) verglichen, was die Identifizierung von Verbindungen ermöglicht, die bevorzugt mit dem interessierenden Protein reagieren. Diese Methodik wurde erfolgreich angewendet, um selektive kovalente Fragmente gegen verschiedene Wirkstoffziele zu identifizieren, darunter die SARS-CoV-2-Hauptprotease, die Cyclin-abhängige Kinase 2 und RAP27A. Hier demonstrieren wir die Anwendung von qIT auf ein Zielprotein, um einen quantitativen und robusten Datensatz zu generieren, der eine Priorisierung von Hit-Liganden für die zukünftige Entwicklung ermöglicht.

Introduction

Cystein-reaktive zielgerichtete kovalente Liganden (Moleküle, die eine biologische Wirkung ausüben, indem sie mit einem ausgewählten Cysteinrest auf ein bestimmtes Protein reagieren) sind in den letzten Jahrzehnten als chemische Werkzeuge und Therapeutika immer beliebter geworden¹. Diese bestehen typischerweise aus einem leicht reaktiven Elektrophil (wie einem Acrylamid, Chloracetamid oder Vinylsulfon), das an eine Ligandeneinheit mit einer hohen Affinität für ein Proteinziel² gebunden ist. Im Idealfall verläuft die Liganden-Protein-Wechselwirkung über einen zweistufigen Mechanismus, der eine anfängliche nicht-kovalente Ligandenbindung umfasst, gefolgt von einer irreversiblen kovalenten Bindungsbildung zwischen dem Zielcystein und elektrophil³.

Mehrere frühe zielgerichtete kovalente Liganden, einschließlich des Bruton-Tyrosinkinase-Inhibitors Ibrutinib, wurden entwickelt, indem ein zuvor identifizierter reversibler Ligand mit einem elektrophilen Griff^{versehen wurde 4}. Dieser Ansatz ist jedoch nicht immer erfolgreich, und andere Versuche haben ergeben, dass die elektrophile Installation eine erhebliche Optimierung erfordert⁵. Stattdessen sind elektrophile Ansätze, insbesondere unter Verwendung elektrophiler Fragmente, in den letzten Jahren immer beliebter geworden. Diese beinhalten typischerweise die Inkubation einer Bibliothek von Elektrophilen mit einem Protein und die anschließende Auswahl von Verbindungen mit einer erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber einem Cystein, von der angenommen wird, dass sie durch produktive nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und der Bindungstasche^{induziert wird 6}. Insbesondere wurden diese Methoden bei der Entwicklung des KRAS (G12C)-Inhibitors Sotorasib¹ erfolgreich angewendet.

Das elektrophile First-Screening stellt im Vergleich zum herkömmlichen nicht-kovalenten Liganden-Screening mehrere einzigartige Herausforderungen dar, vor allem aufgrund der hohen Variabilität der Reaktivität innerhalb und zwischen den Gefechtskopfklassen⁷. Die meisten Cystein-reaktiven Elektrophile reagieren im Laufe der Zeit mit allen lösungsmittelexponierten Cysteinresten, unabhängig von einer selektiven Wechselwirkung für das Zielprotein. Die Ligandenbelegung nimmt daher im Laufe der Zeit bei fast allen Elektrophilen zu, und ohne Kontrolle der Reaktivität wird die Trefferauswahl oft zugunsten reaktiverer Fragmente verzerrt sein, die ein Ziel schneller binden⁸.

Darüber hinaus wird bei elektrophilen Screening-Methoden häufig Massenspektrometrie verwendet, um die Bildung von Protein-Liganden-Addukten nachzuweisen, die im Durchsatz begrenzt ist⁹. Regelmäßige Reaktionsproben sind über einen längeren Zeitraum (Stunden bis Tage) erforderlich, um die Reaktionskinetik für eine Bibliothek von Verbindungen mit unterschiedlicher Elektrophilie richtig zu charakterisieren¹⁰. Für ein Screening von 300 Fragmenten, die zu 10-Zeitpunkten beprobt werden, müssen daher 3000 Massenspektren durchgeführt werden, was den Durchsatz der meisten Protein-Massenspektrometrie-Systeme übersteigt. Methoden mit höherem Durchsatz zur Überwachung der Protein-Liganden-Adduktbildung sind daher wünschenswert.

Der hier skizzierte Ansatz, der Quantitate Irreversible Tethering (qIT)-Assay, ist eine elektrophile Screening-Methode, die die intrinsische Reaktivität kontrolliert und eine einfache Fluoreszenzauslesung verwendet⁷. Protein oder Glutathion (ein unstrukturiertes, thiolhaltiges Tripeptid, das als Kontrolle für die intrinsische Reaktivität verwendet wird) werden mit einer Bibliothek elektrophiler Fragmente inkubiert, und es werden regelmäßige Proben zum Abschrecken in eine Lösung von CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-methylcumarin, ein fluorogenes Thiol-Quantifizierungsmittel) entnommen. Die Adduktbildung zwischen dem Cystein und dem elektrophilen Fragment reduziert die Menge an Thiol, die für die Reaktion mit CPM zur Verfügung steht, und reduziert die resultierende Fluoreszenz beim Abschrecken. Die CPM-Fluoreszenz fungiert somit als Proxy für nicht umgesetztes Thiol, wodurch die Kinetik der Thiolreaktion mit jedem elektrophilen Fragment bestimmt werden kann. Elektrophile Fragmente mit signifikant erhöhter Proteinreaktivität gegenüber Glutathion werden als Treffer ausgewählt und für die weitere Entwicklung priorisiert (Abbildung 1).

Abbildung 1: Schematische Darstellung von qIT. Ein schematischer Überblick über den qIT-Assay. (erstellt mit BioRender). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Trefferauswahl mit REF-Werten steuert die intrinsische Reaktivität und stellt sicher, dass Fragmente nur dann als Treffer ausgewählt werden, wenn sie produktive nicht-kovalente Wechselwirkungen mit einem Proteinziel eingehen. Die einfache Fluoreszenzauslesung bedeutet auch, dass der qIT-Assay hochgradig skalierbar ist und keine massenspektrometrischen Methoden der Reaktionsüberwachung erfordert.

Im Folgenden wird ein umfassendes Verfahren für den qIT-Assay skizziert, wobei Beispielergebnisse zur Veranschaulichung der Assay-Leistung und der Trefferauswahl enthalten sind.

Protocol

1. Aufbau einer Fragmentbibliothek

1. Entwerfen Sie eine Bibliothek mit elektrophilen Fragmenten und synthetisieren Sie sie oder kaufen Sie sie. Elektrophile Fragmentbibliotheken bestehen typischerweise aus leicht reaktiven Elektrophilen (wie Acrylamiden, Chloracetamiden und Vinylsulfonamiden), die an eine Vielzahl von chemischen Gerüsten angehängt sind. Elektrophile Fragmentbibliotheken sind bei kommerziellen Anbietern weit verbreitet, und weitere Einzelheiten zu ihrem Design und ihrer Konstruktion werden an anderer Stelle besprochen ^5,11.
2. Löse jede Verbindung in DMSO bis zu einer Konzentration von 50 mM auf und dosiere dann eine andere Verbindung in jede Vertiefung der Säulen 3 bis 22 einer 384-Well-Reservoirplatte, die als Fragment Library Plate bezeichnet wird.
   1. Dispensieren Sie DMSO in jede Vertiefung der Spalten 1, 2, 23 und 24 für die Positiv- und Negativkontrollen. Das Plattenlayout kann je nach Anzahl der zu siebenden Verbindungen variiert werden (Abbildung 2). Das Volumen, das der Bibliotheksplatte hinzugefügt wird, hängt von der Anzahl der durchzuführenden Screens ab, wobei ca. 1,8 μl aus jedem Well pro qIT-Sieb erforderlich sind. Bereiten Sie diese Fragment Library Plate im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C.

Abbildung 2: Plattenlayout. Ein Überblick über das Layout der 384-Well-Platten des qIT-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Aufbau des Assays (Abbildung 3)

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: rekombinante Proteinlösung (Zielprotein in einem beliebigen Puffer), qIT-Assay-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), qIT-Assay-Quench-Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) und zusammengesetzte Stammlösungen (elektrophiles Fragment (50 mM) in DMSO).
   HINWEIS: Im Reaktionspuffer wird ein pH-Wert von 8 verwendet, um die Reaktion zwischen dem Ziel-Cysteinrest und den Fragmenten zu beschleunigen, so dass die Reaktionsgeschwindigkeit auch bei extrem schwach reaktiven Fragmenten gemessen werden kann. Ein etwas niedrigerer pH-Wert von 7,5 wird im Quench-Puffer verwendet, da die Thioetherbindung, die zwischen dem Maleimid von CPM und dem Cysteinthiol gebildet wird, bei basischeren pH-Werten zur Hydrolyse neigt (z. B. fanden frühere Arbeiten heraus, dass Cystein-Maleimid-Konjugate bei pH 7,3 weitaus stabiler sind als bei pH 8¹²).
2. Nehmen Sie die DMSO-Fragment-Stammlösungen aus dem Lager und lassen Sie sie mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur, damit die zusammengesetzten Bestände auftauen können.
3. Entgasen Sie den qIT-Assay-Puffer durch Blasen mit Argongas für ca. 30 Minuten.
4. Tauschen Sie die Zielproteinlösung gründlich in entgasten qIT-Assay-Puffer aus. Entscheidend ist, dass Reduktionsmittel wie DTT und TCEP bis zu Konzentrationen < 100 nM gründlich entfernt werden, da sie die Thiolquantifizierung beeinträchtigen. Dieser Schritt kann über eine sich wiederholende Reihe von Puffertauschen durchgeführt werden, wie unten beschrieben.
   1. Die Proteinlösung, die den entgasten qIT-Assay-Puffer übersteigt, in einer Spin-Filtereinheit verdünnen, durch Zentrifugation (4000 x g, 4 °C, 15 min) konzentrieren und den Vorgang wiederholen. Typischerweise sind 4 Runden von 1 zu 15 Verdünnungen erforderlich, um DTT (1 mM) ausreichend aus 1 ml rekombinanter Proteinstammlösung zu entfernen, obwohl dieser Schritt in Abhängigkeit von der Reduktionsmittelkonzentration in der ursprünglichen rekombinanten Proteinlösung angepasst werden kann.
      HINWEIS: Alternativ kann die Dialysierung der Zielproteinlösung gegen einen großen Überschuss an entgastem qIT-Assay-Puffer das gleiche Ergebnis erzielen.
5. Die Zielproteinlösung (hergestellt in Schritt 2.1) wird in entgastem qIT-Assay-Puffer auf eine Proteinkonzentration von 15 μM verdünnt. Ungefähr 9 ml Zielproteinlösung sind erforderlich, um eine 384-Well-Platte mit ausreichendem Totvolumen zu füllen.
6. Bereiten Sie eine 1,5%ige (v/v) Suspension von TCEP-Agarose in entgastem qIT-Assay-Puffer vor. Pro Siebplatte sind ca. 9 ml TCEP-Agarose-Suspension erforderlich.
7. Dispensieren Sie 20 μl TCEP-Agaroselösung in jede Vertiefung von zwei 384-Well-Platten.
8. Bereiten Sie einen 15 μM Glutathion-Stamm in entgastem qIT-Assay-Puffer vor. Dies sollte unmittelbar vor dem Plattieren zubereitet werden, da Glutathion in Lösung ohne Reduktionsmittel schnell oxidiert.
9. Geben Sie 20 μl qIT-Assay-Puffer in die Spalten 1 und 2 der beiden 384-Well-Platten.
10. Geben Sie 20 μl 15 μM Protein- oder Glutathionlösung (entsprechend der vorgesehenen Platte) in die Spalten 3-24 der 384-Well-Platte. Diese werden als Protein-Reaktionsplatte und Glutathion-Reaktionsplatte bezeichnet. Bei RT 1 h einkochen lassen.
11. Geben Sie 58,2 μl entgasten qIT-Assay-Puffer in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte und übertragen Sie dann 1,8 μl aus jeder entsprechenden Vertiefung der Fragmentbibliotheksplatte, um eine Verbindungsverdünnungsplatte zu erstellen, in der jede Verbindung auf eine Konzentration von 1,5 mM in qIT-Assay-Puffer plus 3 % DMSO verdünnt wird.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird durch eine Pipettierstation mit 384 erleichtert, mit der Mischbestände für jede Vertiefung in einem Arbeitsgang übertragen werden können.
12. Nach einer 1-stündigen Inkubation von Protein und Glutathion mit TCEP-Agarose werden 20 μl Verbindungslösung aus jeder Vertiefung der Verbindungsverdünnungsplatte in die Protein- und Glutathion-Reaktionsplatten überführt, um den Assay zu starten. Auch dieser Schritt wird durch eine Pipettierstation 384 erleichtert. Die Untersuchungsschritte sind in Abbildung 3 zusammengefasst.
    HINWEIS: Die Fragmentkonzentration kann nach Bedarf variiert werden, und qIT-Assays können für die Treffer bei niedrigeren Konzentrationen wiederholt werden, falls gewünscht, um zu bestätigen, dass die Proteinaffinität kein Artefakt der hohen Fragmentkonzentration ist. Die relativ hohe Fragmentkonzentration wird verwendet, um den k_pro und k_GSH zu erhöhen, um sicherzustellen, dass genaue Raten für leicht reaktive Verbindungen (die unter den Assay-Bedingungen t_1/2(GSH) > 24 h anzeigen können) bestimmbar sind. Obwohl eine Fragmentkonzentration von 500 μM hoch ist, wurden beim Fragmentscreening beispielsweise hohe bis niedrige μM-Konzentrationen verwendet, z. B.¹³.
13. Starten Sie einen Timer - der Assay hat begonnen, und die Quenches sollten zu regelmäßigen Zeitpunkten gemäß dem folgenden Abschnitt durchgeführt werden.

Abbildung 3: Zusammenfassung des qIT-Assays. Eine Zusammenfassung, die die wichtigsten Schritte der Einrichtung der qIT-Assay-Reaktions-Wells veranschaulicht. (erstellt mit BioRender). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. CPM-Quenches

HINWEIS: CPM-Quenches werden durchgeführt, um die Menge an nicht umgesetztem Thiol zu quantifizieren, die in den Protein- und Glutathion-Reaktionsplatten verbleibt. Diese sollten zu diskreten Zeitpunkten durchgeführt werden (z. B. werden typischerweise die folgenden Zeitpunkte verwendet: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 und 1440 min), um die Überwachung der Reaktionskinetik zu ermöglichen.

1. Bereiten Sie CPM-Stammlösungen (500 μM) in DMSO vor, geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen in 111,2 μl Aliquots ab und lagern Sie sie bei -20 °C. Diese CPM-Bestände können im Voraus vorbereitet werden, und es ist 1 Aliquot pro Quench-Zeitpunkt erforderlich.
2. Bereiten Sie CPM-Quenchlösung (1,4 μM) vor, indem Sie eine gefrorene CPM-Stammlösung (500 μM) auftauen und sie zu einem 40 mL qIT-Assay-Quenchpuffer hinzufügen.
3. Dispensieren Sie 27 μl CPM-Quenchlösung in jede Vertiefung von zwei 384-Well-Platten – zwei sind zum Quenchen sowohl der Protein- als auch der Glutathion-Reaktionsplatten erforderlich. Diese werden als CPM-Quench Plates bezeichnet, bereiten Sie diese maximal 30 min vor Gebrauch vor.
4. Die Proteinreaktionsplatte wird 3 min lang bei 200 x g zentrifugiert, um sicherzustellen, dass TCEP-Agarose pelletiert wird.
5. Übertragen Sie zu festgelegten Zeitpunkten eine 3 μl Probe aus jeder Vertiefung der Proteinreaktionsplatte auf eine vorgefüllte CPM-Quenchplatte. Auch dieser Schritt wird mit einer Pipettierstation 384 vereinfacht.
6. Mischen Sie die CPM Quench Plate, indem Sie 3 x 25 μl aspirieren und dosieren. Es ist wichtig, die Probe von der Oberseite der Vertiefung zu entfernen, um zu vermeiden, dass die TCEP-Agarose am Boden aspiriert wird, da dies die CPM-Quenchung beeinträchtigen würde.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.6 mit der Glutathion-Reaktionsplatte.
8. Die CPM-Quenchplatten (vorbereitet in 3.4-3.6) 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
9. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der CPM-Quenchplatte (Anregung bei 384 nm und Emission bei 470 nm).

4. Datenanalyse und Trefferauswahl

1. Berechnen Sie für jede Quench Z' als Maß für die Qualität des Assays. CPM-Quenches mit Z' < 0,5 sollten nicht berücksichtigt werden.
   Z' = 1 - ((3σ_{Positivkontrolle} + 3σ_{Negativkontrolle}) / (μ_{Positivkontrolle} - μ_{Negativkontrolle}))
   Dabei σ = Standardabweichung der Fluoreszenzintensität und μ = Mittelwert der Fluoreszenzintensität
2. Berechnen Sie die mittleren Fluoreszenzwerte für die negativen und positiven Kontrollvertiefungen (Spalten 1 und 2 bzw. 23 bzw. 24).
3. Normalisieren Sie jede Reaktion gut auf die durchschnittlichen Fluoreszenzwerte der Positiv- und Negativkontrolle:
   % modifiziert = 100 x (Compound-Well-Fluoreszenz - Negativkontrollfluoreszenz) / (Positivkontrollfluoreszenz - Negativkontrollfluoreszenz)
4. Separat ist der über die Zeit modifizierte Prozentsatz für jede Verbindung, die mit Glutathion und mit dem Zielprotein reagiert, darzustellen.
5. Passen Sie die normalisierten prozentual modifizierten Daten über die Zeit an ein einphasiges exponentielles Zerfallsmodell sowohl für die Reaktion mit Protein als auch mit Glutathion an, indem Sie die folgende Gleichung verwenden:
   % Modifiziert = ae ^{- kt + c}
   Dabei ist a = der Bereich der in % geänderten Werte, k = Reaktionsgeschwindigkeit, t = Zeit, c = der in % geänderte Wert in unendlicher Zeit. Die Kurvenanpassung und Parameterbestimmung kann mit kommerzieller Software (z. B. Graphpad) durchgeführt werden.
6. Verwenden Sie die Geschwindigkeit, mit der Fragmente mit Protein (k_pro) und Glutathion (k_GSH) reagieren, um den Wert des Rate Enhancement Factor (REF) für jedes Fragment zu berechnen:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Verwenden Sie die REF-Werte, um Trefferfragmente auszuwählen. Dies kann durch Festlegen eines REF-Schwellenwerts (z. B. REF > 3), einer willkürlichen Trefferquote (z. B. obere 2 %) oder durch die Auswahl von Fragmenten mit REF 3 Standardabweichungen größer als das geometrische Mittel erfolgen.

Results

Der qIT-Assay wird hier verwendet, um kovalente Fragmenttreffer für ein unbenanntes, einzelnes Cysteinprotein zu identifizieren. MgCl₂ (10 mM) wurde zu den Reaktionspuffern hinzugefügt, da bekannt ist, dass das Zielprotein an Mg²⁺ -Ionen bindet. Das Screening wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Geschwindigkeit bestimmt, mit der jedes Fragment sowohl mit dem Zielprotein (k_pro) als auch mit dem Glutathion (k_GSH) reagierte. Die Z-Werte lagen bei allen Quench-Platten über 0,5 und im Durchschnitt bei 0,75 für Protein-Quenches und 0,79 für Glutathion-Quenches, was auf eine hervorragende Assay-Leistung hinweist. Die REF-Werte wurden dann für jedes Fragment berechnet, und die Treffer wurden ausgewählt, bei denen REF 3 >.

Die repräsentativen Ergebnisse (Abbildung 4) sind ein Beispiel für die Trefferauswahl mit dem qIT-Assay. Verbindung 1 reagierte mit einer 6,0-fach höheren Rate mit dem Cysteinrest auf dem Zielprotein als mit Glutathion und wurde unter Verwendung eines Kriteriums von REF > 3 als Treffer ausgewählt (Abbildung 4B). Diese Geschwindigkeitsbeschleunigung deutet auf das Vorhandensein eines Templating-Effekts hin, wobei nicht-kovalente Wechselwirkungen Position 1 in der richtigen Ausrichtung für das Cystein auf dem Zielprotein einnehmen, um mit dem Chloracetamid-Gefechtskopf zu reagieren. Im Gegensatz dazu ist 2 ein Beispiel für ein Non-Hit-Fragment, da die Reaktion zwischen 2 und dem Ziel-Cysteinrest relativ zur Reaktion zwischen 2 und Glutathion nicht beschleunigt wird. Das Fehlen einer Geschwindigkeitsbeschleunigung deutet darauf hin, dass es keine produktiven nicht-kovalenten Wechselwirkungen gibt, die 2 in der richtigen Ausrichtung positionieren, um mit dem Ziel-Cysteinrest zu reagieren.

Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen ein Monitoring der Protein- und Glutathionreaktion durch qIT auf (A) eine hohe intrinsische Reaktivität, ein mögliches falsch-positives Trefferfragment und (B) ein Trefferfragment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Der qIT-Assay bietet eine effektive und komfortable Plattform für das Screening von Cystein-reaktiven elektrophilen Fragmenten gegen ein Zielprotein. Es gibt jedoch kritische Überlegungen, die die Assay-Leistung beeinträchtigen können, wenn sie nicht angemessen berücksichtigt werden. Vor allem dürfen Zielproteine nur ein einziges oberflächenexponiertes Cystein enthalten, um für das qIT-Screening geeignet zu sein, da andere Cysteinreste mit CPM reagieren und Fluoreszenzmessungen beeinträchtigen. In früheren Fällen, in denen Zielproteine mehrere oberflächenexponierte Cysteine enthalten (z. B. für die SARS-CoV-2-Hauptprotease, die kleine GTPase RAP27A und die Cyclin-abhängige Kinase 2), wurden zuvor Screening-Konstrukte mit entfernten störenden Resten erfolgreich eingesetzt. Die Wirksamkeit dieser Strategie variiert jedoch je nach Protein 10,14,15.

Da der qIT-Assay die Abnahme des Thiols misst, das für die Reaktion mit CPM im Laufe der Zeit zur Verfügung steht, kann jeder Faktor, der den Anteil der verfügbaren Thiole verringert, wie z. B. Thioloxidation oder Proteinaggregation, die Assay-Leistung beeinträchtigen. Die Pufferentgasung und die Verwendung eines immobilisierten Reduktionsmittels (TCEP-Agarose) stellen sicher, dass die Thioloxidation langsam ist, und die verbleibende Oxidation sollte durch Normalisierung der Fluoreszenzmessungen auf die der positiven Kontrollvertiefungen gemildert werden. Probleme können jedoch auftreten, wenn eine ungleichmäßige Verteilung von TCEP-Agarose zwischen den Wells eine ungleichmäßige Thioloxidation verursacht. Eine konsistente TCEP-Agarose-Plattierung ist daher für die Assay-Leistung unerlässlich, was eine Herausforderung darstellen kann, da TCEP-Agarose-Partikel in Pipettierreservoirs absinken.

Auch die Proteinaggregation kann ein Problem darstellen, da die Assay-Bedingungen (24 h Inkubation bei Raumtemperatur) relativ rau sind. Strategien zur Fehlerbehebung wie die Fusion von Zielproteinen mit Solubilisierungsmarkierungen, die Änderung von Reaktionspuffern oder die Durchführung des Assays bei niedrigeren Temperaturen können die Aggregation verringern und Probleme mit der Proteinstabilität lösen. Bestimmte Fragmente können auch eine Proteinaggregation induzieren, was wiederum den Anteil an Thiol reduziert, das für die Reaktion mit CPM zur Verfügung steht, und zu falsch positiven Treffern führt. Die orthogonale Hit-Validierung mit Hilfe der Massenspektrometrie intakter Proteine ist eine effektive Methode zum Nachweis dieser Fälle, da falsch positive Treffer bei Inkubation mit einem Zielprotein zu einer kleinen oder nicht vorhandenen Population markierter Spezies führen.

Wenn diese Überlegungen kontrolliert werden, hat der qIT-Assay einige klare Vorteile gegenüber anderen kovalenten Fragment-Screening-Methoden. Die Trefferselektion mittels REF stellt sicher, dass Treffer nur dann selektiert werden, wenn sie produktive nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Zielprotein eingehen. Die Elektrophilie der Fragmente variiert über große Bereiche, sowohl zwischen verschiedenen Gefechtsköpfen als auch innerhalb der Gefechtskopfklassen; Frühere Arbeiten haben beispielsweise mehrere hundertfache Schwankungen in der Rate der Glutathion-Reaktivität zwischen Acrylamiden¹⁰ festgestellt. Dieser breite Bereich der Elektrophilie kann es schwierig machen, Fragmente mit hohen k_pro-Werten aufgrund eines Templating-Effekts von solchen zu unterscheiden, die einfach hochreaktiv sind, was dazu führen kann, dass hochreaktive Fragmente als falsch positive Treffer ausgewählt werden. Zum Beispiel reagierte 2 mit dem Cystein-Zielrest schneller als 1 und kann ohne Berücksichtigung der intrinsischen Reaktivität als Treffer ausgewählt werden. Allerdings reagiert 2 nicht mit dem Ziel-Cysteinrest mit einer höheren Rate als mit Glutathion, was darauf hindeutet, dass das größere k_pro von 2 im Verhältnis zu 1 auf eine größere intrinsische Reaktivität des Fragments und nicht auf einen Templating-Effekt zurückzuführen ist.

Sehr vorteilhaft ist auch die einfache Fluoreszenzauslesung, die vom qIT-Assay zur Quantifizierung des verbleibenden Thiols verwendet wird. Andere Methoden des kovalenten Fragmentscreenings verwenden die Massenspektrometrie intakter Proteine, um die Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der Fragmente mit einem Zielprotein reagieren, und LC-MS, um die Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der Glutathion mit Fragmenten reagiert - beide erfordern spezielle Geräte und haben keinen Durchsatz ^8,16. Die praktische Fluoreszenzauslesung macht den qIT-Assay hochgradig skalierbar und erfordert nur allgemein verfügbare Laborgeräte.

In Kombination schaffen diese Innovationen eine robuste und skalierbare Methode des kovalenten Fragmentscreenings, die den Bedarf an Massenspektrometriegeräten überflüssig macht.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argongas	BOC	I1149
Corning 384-Well-Analyseplatten mit niedrigem Flansch und flachem Boden	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Immobilisiertes TCEP-Agarose-Pierce		77712
Mikroplatten-Reader	CLARIOstar
PCR-Plattendichtungen	BioRad	MSA5001
Reduziertes L-Glutathion	Sigma-Aldrich	G4251
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888
Natrium-Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7