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Methodenartikel

Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

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DOI:

10.3791/67186

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8. November 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die mitochondriale Atmung in ganzen Hefezellen ist ein wertvoller Indikator für die Bioenergetik der Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um diesen Phänotyp zu quantifizieren, das auf verschiedene Hefearten anwendbar ist.

Zusammenfassung

Der Stoffwechsel wird hauptsächlich durch die zelluläre Energieverfügbarkeit und die Umweltbedingungen koordiniert. Assays, um zu wissen, wie Zellen den Energiestoffwechsel an unterschiedliche Ernährungs- und Umweltbedingungen anpassen, liefern wertvolle Informationen zur Aufklärung molekularer Mechanismen. Die oxidative Phosphorylierung ist in den meisten Zellen die Hauptquelle für ATP, und die mitochondriale Atmungsaktivität ist eine Schlüsselkomponente der oxidativen Phosphorylierung, wodurch das Potenzial der mitochondrialen Membran für die ATP-Synthese erhalten bleibt. Die mitochondriale Atmung wird häufig in isolierten Mitochondrien untersucht, denen der zelluläre Kontext fehlt. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in hefeintakten Zellen vor. Diese Methode gilt für alle Hefearten, obwohl sie im Allgemeinen für Saccharomyces cerevisiae-Zellen verwendet wurde. Zunächst wird das Hefewachstum unter bestimmten Bedingungen getestet. Dann werden die Zellen gewaschen und in deionisiertem Wasser mit einem Verhältnis von 1:1 (w/v) resuspendiert. Die Zellen werden dann unter ständigem Rühren in eine Oximeterkammer gelegt, und eine Clark-Elektrode wird verwendet, um den Sauerstoffverbrauch zu quantifizieren. Einige Moleküle werden nacheinander in die Kammer eingebracht und entsprechend dieser Wirkung auf die Elektronentransportkette oder ATP-Synthese selektiert. Der ATPase-Inhibitor Oligomycin wird zuerst zugesetzt, um die Atmung gekoppelt an die ATP-Synthese zu messen. Anschließend wird mit einem Entkoppler die maximale Atemkapazität gemessen. Schließlich wird eine Mischung aus Elektronentransportketten-Inhibitoren hinzugefügt, um den Sauerstoffverbrauch zu verwerfen, der nicht mit der mitochondrialen Atmung zusammenhängt. Die Daten werden mit einer linearen Regression analysiert, um die Steigung zu erhalten, die die Sauerstoffverbrauchsrate darstellt. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie spezifisch für die mitochondriale Atmung der Hefe ist und den zellulären Kontext aufrechterhält. Es ist wichtig hervorzuheben, dass Inhibitoren, die bei der Quantifizierung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, zwischen Hefearten variieren können.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine grundlegende Rolle in der zellulären Bioenergetik, da sie für die meisten Zellen die Hauptquelle für ATP sind und mehrere Signalwege zusammenlaufen und von der Aktivität der mitochondrialen Signalwege abhängen1. Für die ATP-Synthese ist eine oxidative Phosphorylierung erforderlich, die den Elektronentransport durch die Elektronentransportkette kombiniert, um die Sauerstoff- und F1F 0-ATPase-Aktivität zu reduzieren, wobei ATP unter Verwendung des mitochondrialen Membranpotentials synthetisiert wird, das aufgrund des Elektronenflusseserzeugt wird 2. Somit ist die mitochondriale Atmung Teil der oxidativen Phosphorylierung3.

Die mitochondriale Atmungskette besteht aus vier Komplexen oder in einigen Fällen aus dem Hefekomplex I-defizient (z. B. Saccharomyces cerevisiae), drei Komplexen und drei Dehydrogenase-Proteinen4. Respiratorische Komplexe sind in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert; einige Hefen weisen die kanonische Elektronentransportkette mit Komplex I (NADH-Dehydrogenase) oder drei NADH-Dehydrogenasen auf, Ubichinon (Co Q), Komplex II (Succinat-Ubichinon-Oxidoreduktase), Komplex III (Ubichinon-Cytochrom-Oxidoreduktase), Cytochrom c (Cyt c) und Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase)5,6. Der Elektronentransport durch die Komplexe ermöglicht das Pumpen von Protonen aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum, wodurch ein mitochondriales Membranpotentialgebildet wird 7. Protonen, die sich im Intermembranraum befinden, werden in umgekehrter Richtung in Richtung der Mitochondrienmatrix durch F1F0 -ATPase gepumpt, um ein ATP-Molekül pro vier gepumptenProtonen 8 zu synthetisieren.

Messungen der mitochondrialen Atmung liefern wertvolle Einblicke in die mitochondriale Integrität, die bioenergetische Zellenergie und die mitochondriale Atmungskapazität9. Die Funktion der mitochondrialen Atmung konnte in vitro oder in situ mit verschiedenen Techniken analysiert werden. Die Analyse der mitochondrialen Atmung in intakten Zellen könnte jedoch eine Reihe von Vorteilen bieten, da sie den gesamten Zellstoffwechsel umfasst, da die Wechselwirkungen der Zellen mit ihrer Umgebung und des intrazellulären Stoffwechsels bei der Verwendung ganzer Zellen berücksichtigt werden10. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung intakter Zellen eine einfache Bewertung verschiedener experimenteller Bedingungen und detektiert minimale Veränderungen, die in isolierten Mitochondrien nicht beobachtet werden konnten10,11. Ein weiterer Vorteil der Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in intakten Zellen besteht darin, dass die Auswirkungen der mitochondrialen Proliferation und Lokalisation erhalten bleiben12.

Die Atmung der Mitochondrien von Säugetieren in intakten Zellen wurde sehr detailliert beschrieben12, wobei die Untersuchung anderer eukaryotischer Organismen, wie z. B. Hefen, außer Acht gelassen wurde. Hier schlagen wir eine Technik zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung vor, die an Hefe aus Säugetierprotokollen angepasst ist. Daher wurden Konzepte aus der Säugetier-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in dieser Technik verwendet. Zum Beispiel ist diese Technik in verschiedene Stadien unterteilt, wie das Säugetierprotokoll: 1) basale Atmung (substratabhängig), 2) ATP-gebundene Atmung (durch die Hemmung der ATP-Synthase), 3) maximale Atmungskapazität (Verwendung eines Entkopplers, der die Durchlässigkeit von Protonen durch die innere Mitochondrienmembran ermöglicht), 4) Hemmung der mitochondrialen Atmung (Verwendung einer Mischung aus Atmungskettenhemmern, um den Sauerstoffverbrauch für andere Quellen zu verwerfen, die sich von mitochondriale Atmung)11,13. Daher zielt diese Arbeit darauf ab, ein Protokoll zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in Hefe vorzustellen.

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Protokoll

1. Nährmedien und Vorbereitung des Inokulums

  1. Bereiten Sie 100 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) vor, indem Sie 1 g Hefeextrakt, 2 g Kaseinpepton und 2 g Glukose in 95 ml destilliertem Wasser hinzufügen. 3 mL in 10 mL Glasreagenzgläser verteilen, 15 Minuten lang bei 121 °C und 1,5 psi sterilisieren.
    HINWEIS: Das Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 - 8 °C gelagert werden.
  2. Ein 10-ml-Reagenzglas aus Glas, das 3 ml YPD-Medium enthält, wird mit 250 μl -20 μC Glycerin-konservierten Hefezellen beimpft. Über Nacht unter ständigem Rühren bei 200 U/min und 30 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationstemperatur kann bei einigen Hefearten variieren (z. B. hat Kluyveromyces marxianus eine optimale Wachstumstemperatur von 37 °C).
  3. Füllen Sie eine Petrischale (60 x 15 mm2) mit sterilem 2 % YPD-Agar (fügen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Kaseinpepton, 20 g Glukose und 20 g bakteriologischen Agar zu 950 mL destilliertem Wasser hinzu) und bestreichen Sie die Petrischale mit den Hefezellen, die im 10-ml-Glasreagenzglas mit einer sterilen Schleife gezüchtet wurden. Inkubieren Sie die Petrischale bei 30 °C, bis isolierte Kolonien entstehen.
  4. Bereiten Sie ein Präinokulum vor, indem Sie ein steriles 10-ml-Reagenzglas aus Glas, das 3 ml YPD-Medium mit 2 % Glukose enthält, mit zwei oder drei hefeisolierten Kolonien aus der Petrischale beimpfen. Über Nacht unter ständigem Rühren bei 30 °C inkubieren.

2. Wachstumsbedingungen und Versuchsplanung

  1. Ein 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml sterilem synthetischem Vollmedium (SC-Medium; 0,18 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,5 g Ammoniumsulfat, 0,2 g Dikaliumphosphat, 1 g synthetische Hefe-Drop-out-Zusätze und Glukose gemäß dem Versuchsplan in 98,02 ml destilliertem Wasser) wird mit einer Hefekultur bei einem Anfangs-ODvon 600 ~ 0,1 inokuliert. das sind etwa 3 mL des Prä-Inokulums über Nacht (OD600 ~ 3). Legen Sie die Umgebungsbedingungen oder die Ergänzung mit der chemischen Herausforderung fest, die in der mitochondrialen Atmung getestet werden soll (z. B. Zugabe von 100 μM Resveratrol). Bereiten Sie eine Fahrzeugsteuerung in einem separaten Kolben für die chemische Herausforderung vor. Testen Sie mindestens drei biologische Replikate.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, ein minimales Medium zu verwenden, um Nährgeräusche im Assay zu verwerfen, und das an dieser Stelle vorgeschlagene minimale Medium wird für S. cerevisiae verwendet und kann für andere Hefearten abweichen. Schließlich ist die in den Nährmedien supplementierte Glukosekonzentration entscheidend, um eine Glukoseunterdrückung oder den Crabtree-Effekt zu vermeiden, der die mitochondriale Atmung hemmt. Konzentrationen unter 0,5 % (w/v) zeigten ein gutes Ansprechen bei der mitochondrialen Atmung, begleitet von hohen Wachstumsraten bei S. cerevisiae. Bei Crabtree-negativen Hefen hatten hohe Glukosekonzentrationen keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung (z . B. K. marxianus).
  2. Wiegen Sie ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen und verwenden Sie es, um Zellen in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 ~ 0,5) durch Zentrifugation bei 4000 x g für 5 Minuten zu ernten.
    HINWEIS: Für die Untersuchung der mitochondrialen Atmung wird die Mid-Log-Phase empfohlen, da es sich um die Wachstumsphase handelt, in der der Energiestoffwechsel aktiver ist.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 3x mit 25 mL entionisiertem Wasser. Wiegen Sie das konische Rohr mit den Pelletzellen (Nassgewicht) und subtrahieren Sie das Gewicht des konischen Rohrs, um das zelluläre Nassgewicht zu erhalten.
  4. Suspendieren Sie das Pellet in 2 mL entionisiertem Wasser.
  5. Erfassen Sie die Zellkonzentration, indem Sie das Nassgewicht durch 2 dividieren, um mg Zellen/ml zu erhalten. Dieser Wert ist wichtig, um zu bestimmen, wie viel Volumen hinzugefügt werden muss, um 50 mg Zellen für den Assay zu erhalten.

3. Sauerstoffverbrauchs-Assay (Polarographie)

  1. Verwenden Sie eine Sauerstoffelektrode vom Typ Clark, die mit einem YSI5300A Monitor und einem Computer für die Datenerfassung verbunden ist.
    1. 5 ml Morphoethanolsulfonsäure, angepasst an pH 6, mit Triethanolamin (MES-TEA-Puffer; 10 mM) und 50 mg Zellen (Nassgewicht) in die Polarographenkammer geben. Platzieren Sie die Elektrode vorsichtig und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
    2. Schalten Sie den YSI5300A Monitor, den Computer für die Datenerfassung und die Kammer für das Rühren ein. Stellen Sie den YSI5300A Monitor ein, indem Sie den Einstellregler für Kanal 1 in AIR auswählen. Stellen Sie Kanal 1 mit dem Kalibrierregler für Kanal 1 auf 100 % ein und stabilisieren Sie das Signal 5 Minuten lang bei 100 %.
    3. Starten Sie die Datenaufzeichnung auf dem Computer und die Zeitmessung mit einem Chronometer.
      HINWEIS: Der YSI5300A Monitor verfügt nicht über einen Datenerfassungscomputer oder ein Datenerfassungsprogramm. Dies kann extern durch den Benutzer implementiert werden.
    4. Verwenden Sie eine laterale Kanalisierung der Elektrode in der Oximeterkammer, um das oxidierbare Substrat, das Oligomycin, den Entkoppler und die Mischung der Atmungskettenhemmer nacheinander hinzuzufügen.
  2. Geben Sie das oxidierbare Substrat (Glukose, Glycerin, L-Laktat oder eine andere Kohlenstoffquelle gemäß dem Versuchsdesign) mit einer Chromatographiespritze in eine Endkonzentration von 10 mM. Halten Sie die Kammer immer geschlossen und unter ständigem Rühren. Erfassen Sie den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten, um die Grundatmung zu bestimmen.
    HINWEIS: Glukose, Glycerin und L-Laktat werden verwendet, um die Elektronentransportkette an verschiedenen Stellen der Atmungskette zu analysieren: Der Glukosestoffwechsel reduziert NAD+ zu NADH und wird zur Analyse der gesamten Atmungskette verwendet; Glycerin überträgt Elektronen auf Ubichinon und wird verwendet, um die Atmungskette von Ubichinon zu bewerten; schließlich tritt L-Laktat seine Elektronen an Cytochrom c ab und wird verwendet, um die Wirkung von Cytochrom c14 zu bestimmen. Diese Substrate können je nach enzymatischer Leistungsfähigkeit der Hefespezies variieren.
  3. Fügen Sie Oligomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,01 mM in der Oximeterkammer mit einer Chromatographiespritze zu erhalten, um die ATP-gebundene Atmung zu bewerten und den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten aufzuzeichnen.
  4. Ergänzen Sie den Entkoppler 3-Chlorphenylhydrazoncarbonylcyanid (CCCP), um eine Endkonzentration von 0,015 mM in der Oximeterkammer mit einer Chromatographiespritze zu erhalten, um die maximale Atmungskapazität zu bestimmen und den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten aufzuzeichnen.
  5. Verwenden Sie eine Chromatographiespritze, um die Elektronentransportketteninhibitoren hinzuzufügen: zuerst 2-Thenoyltrifluoraceton (TTFA) und dann Antimycin A (AA) in Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1 mg/ml. Messen Sie jeden Inhibitor für 2-3 min.
    HINWEIS: Die Inhibitoren der Elektronentransportkette können sich zwischen den Hefearten unterscheiden; Dies sollte in diesem Schritt berücksichtigt werden.
  6. Sieben Sie jede Kohlenstoffquelle unabhängig voneinander (d. h. Glukose, Glycerin oder L-Laktat). Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5 für jede Kohlenstoffquelle. Waschen Sie die Kammer nach jedem Gebrauch 3x mit 70% Ethanol und 3x mit entionisiertem Wasser.

4. Datenverarbeitung

  1. Verwenden Sie Sauerstoffverbrauchskurven (Darstellung des Luftanteils über die Zeit), um die Steigungen des oxidierbaren Substrats (basale Atmung), Oligomycin (ATP-gebundene Atmung), CCCP (maximale Atmung), AA und TTFA (nicht mitochondriale Atmung; Abbildung 1). Berechnen Sie einzelne Steigungen für jede ergänzte Verbindung mit Hilfe der linearen Regression, wie unten beschrieben.
    1. Erstellen Sie eine neue Projektdatei in der Statistiksoftware. Wählen Sie im Abschnitt Erstellen die Option XY aus. Wählen Sie die Option Daten in eine neue Tabelle eingeben oder importieren im Abschnitt Datentabelle.
    2. Wählen Sie Zahlen im Unterabschnitt X im Abschnitt Optionen aus. Klicken Sie auf Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten im Unterabschnitt Y im Abschnitt Optionen ein.
      HINWEIS: Das Tabellenformat besteht aus einer X-Spalte und mehreren Y-Spalten mit jeweils 3 Unterspalten mit den Namen A: Y1 und A: Y2.
    3. Geben Sie Zeitdaten in X-Spalten ein (z. B. 0, 2, 4, 6, 8 s oder 0, 1, 2, 3 min). Schreiben Sie den Luftanteil in die Y-Spalten.
    4. Erstellen Sie eine lineare Regressionsfitness. Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren . Wählen Sie in der Option Analyse die Option Einfache lineare Regression auf XY-Analysen und klicken Sie auf OK.
    5. Rufen Sie den Neigungswert aus den Tabellen Ergebnisse in Daten im linken Teil des Bildschirms ab.
  2. Schreiben Sie die Steigungswerte in ein Datenblatt und subtrahieren Sie den Steigungswert, der aus der Mischung der Ateminhibitoren (AA und TTFA) erhalten wurde, von den Steigungen aus dem oxidierbaren Substrat, Oligomycin und CCCP, um den Sauerstoffverbrauch aus anderen Quellen als der mitochondrialen Atmung zu verwerfen.
  3. Multiplizieren Sie die erhaltenen Werte mit 237 μM O2. Dieser Wert gilt als Löslichkeit von O2 in einem gepufferten mitochondrialen Medium, das mit Luft (20,9 % O2) bei 25 °C ausgeglichen ist; Dieser Wert variiert je nach Temperatur, Höhe und verwendetem Puffer.
  4. In Minute umrechnen; Die erhaltenen Werte sind μM von O2 pro Zeit, abhängig davon, wie die Zeit aufgetragen wird, um μM von O2/ min zu erhalten.
  5. Teilen Sie durch 50, dh das mg der verwendeten Zellen; Zell-MG kann je nach Versuchsdesign variieren. Schließlich wird der Sauerstoffverbrauch in μM O2/mg Zellen x min ausgedrückt

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Ergebnisse

Diese mitochondriale Atmungstechnik kann auch für andere Hefearten als S. cerevisiae verwendet werden, wie z. B. Scheffersomyces stipitis15 und K. marxianus16. Zu repräsentativen Zwecken stellen wir jedoch nur Ergebnisse von S. cerevisiae vor. Es ist allgemein bekannt, dass S. cerevisiae bei niedrigen Glukosekonzentrationen (unter 0,8 mM) einen vorherrschenden respiratorischen Stoffwechsel aufweist17,18

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Diskussion

Die Phosphorylierung der mitochondrialen Atmung spielt eine grundlegende Rolle in mehreren Signalwegen, die vom mitochondrialen Membranpotenzial abhängen und den ATP-Spiegel durch oxidative Phosphorylierung aufrechterhalten. Das Verständnis, wie sich Umwelt- und Ernährungsbedingungen auf die mitochondriale Atmung von Hefen auswirken, dient als Werkzeug, um molekulare Mechanismen aufzuklären.

Es ist wichtig, die folgenden kritischen Schritte zu berücksichtigen,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) unterstützt, das an LAMP vergeben wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Thenoyltrifluoraceton (TTFA)MerckT27006Inhibitor-Komplex II
3-Chlorphenylhydrazon-Carbonylcyanid (CCCP)MerckC2759Mitochondrien-Entkoppler für die Atmung  
Absolut ethanolMerck107017Zum Auflösen von Quercetin
AgarMerckA1296YPD Agar Zubereitung
Ammoniumsulfat granuliert (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC Bouillon
Zubereitung Antimycin A (AA)MerckA8674Inhibitor Komplex III
aYSI5300A--------Monitor 
ZentrifugeHermleZ 206 AFür die Zentrifugation
von Zellen Clark-Typ Sauerstoff--------Elektrode 
Computer--------Für die Datenerfassung 
Dikaliumphosphat K2HPO4J.T. Baker3252-05SC Brühezubereitung
GlukoseMerckG7021YPD Brühezubereitung
GlycerinolMerckG5516Substrat Medium Supplementierung 
LaktatMerckL1250Substrat Medium Supplementierung 
Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Hemmung der mitochondrialen ATP-Synthase
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000Inoculum Inkubation Glasröhrchen und -kolben 
Pepton aus Kasein, enzymatischer AufschlussMerck82303YPD Brühe
Zubereitung Quercetin Merck337951Zur Verringerung der mitochondrialen Atmung
Uracil MerckU0750SC Brühezubereitung
HefeextraktMerckY1625YPD Brühezubereitung
Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatMerckY1251SC Brühezubereitung
Hefe Synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen ohne UracilMerckY1501SC Brühezubereitung

Referenzen

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