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Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in ganzen Hefezellen

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DOI:

10.3791/67186

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8. November 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die mitochondriale Atmung in ganzen Hefezellen ist ein wertvoller Indikator für die Bioenergetik der Zellen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um diesen Phänotyp zu quantifizieren, das auf verschiedene Hefearten anwendbar ist.

Zusammenfassung

Der Stoffwechsel wird hauptsächlich durch die zelluläre Energieverfügbarkeit und die Umweltbedingungen koordiniert. Assays, um zu wissen, wie Zellen den Energiestoffwechsel an unterschiedliche Ernährungs- und Umweltbedingungen anpassen, liefern wertvolle Informationen zur Aufklärung molekularer Mechanismen. Die oxidative Phosphorylierung ist in den meisten Zellen die Hauptquelle für ATP, und die mitochondriale Atmungsaktivität ist eine Schlüsselkomponente der oxidativen Phosphorylierung, wodurch das Potenzial der mitochondrialen Membran für die ATP-Synthese erhalten bleibt. Die mitochondriale Atmung wird häufig in isolierten Mitochondrien untersucht, denen der zelluläre Kontext fehlt. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in hefeintakten Zellen vor. Diese Methode gilt für alle Hefearten, obwohl sie im Allgemeinen für Saccharomyces cerevisiae-Zellen verwendet wurde. Zunächst wird das Hefewachstum unter bestimmten Bedingungen getestet. Dann werden die Zellen gewaschen und in deionisiertem Wasser mit einem Verhältnis von 1:1 (w/v) resuspendiert. Die Zellen werden dann unter ständigem Rühren in eine Oximeterkammer gelegt, und eine Clark-Elektrode wird verwendet, um den Sauerstoffverbrauch zu quantifizieren. Einige Moleküle werden nacheinander in die Kammer eingebracht und entsprechend dieser Wirkung auf die Elektronentransportkette oder ATP-Synthese selektiert. Der ATPase-Inhibitor Oligomycin wird zuerst zugesetzt, um die Atmung gekoppelt an die ATP-Synthese zu messen. Anschließend wird mit einem Entkoppler die maximale Atemkapazität gemessen. Schließlich wird eine Mischung aus Elektronentransportketten-Inhibitoren hinzugefügt, um den Sauerstoffverbrauch zu verwerfen, der nicht mit der mitochondrialen Atmung zusammenhängt. Die Daten werden mit einer linearen Regression analysiert, um die Steigung zu erhalten, die die Sauerstoffverbrauchsrate darstellt. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie spezifisch für die mitochondriale Atmung der Hefe ist und den zellulären Kontext aufrechterhält. Es ist wichtig hervorzuheben, dass Inhibitoren, die bei der Quantifizierung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, zwischen Hefearten variieren können.

Einleitung

Mitochondrien spielen eine grundlegende Rolle in der zellulären Bioenergetik, da sie für die meisten Zellen die Hauptquelle für ATP sind und mehrere Signalwege zusammenlaufen und von der Aktivität der mitochondrialen Signalwege abhängen1. Für die ATP-Synthese ist eine oxidative Phosphorylierung erforderlich, die den Elektronentransport durch die Elektronentransportkette kombiniert, um die Sauerstoff- und F1F 0-ATPase-Aktivität zu reduzieren, wobei ATP unter Verwendung des mitochondrialen Membranpotentials synthetisiert wird, das aufgrund des Elektronenflusseserzeugt wird 2. Somit ist die mitochondriale Atmung Teil der oxidativen Phosphorylierung3.

Die mitochondriale Atmungskette besteht aus vier Komplexen oder in einigen Fällen aus dem Hefekomplex I-defizient (z. B. Saccharomyces cerevisiae), drei Komplexen und drei Dehydrogenase-Proteinen4. Respiratorische Komplexe sind in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert; einige Hefen weisen die kanonische Elektronentransportkette mit Komplex I (NADH-Dehydrogenase) oder drei NADH-Dehydrogenasen auf, Ubichinon (Co Q), Komplex II (Succinat-Ubichinon-Oxidoreduktase), Komplex III (Ubichinon-Cytochrom-Oxidoreduktase), Cytochrom c (Cyt c) und Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase)5,6. Der Elektronentransport durch die Komplexe ermöglicht das Pumpen von Protonen aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum, wodurch ein mitochondriales Membranpotentialgebildet wird 7. Protonen, die sich im Intermembranraum befinden, werden in umgekehrter Richtung in Richtung der Mitochondrienmatrix durch F1F0 -ATPase gepumpt, um ein ATP-Molekül pro vier gepumptenProtonen 8 zu synthetisieren.

Messungen der mitochondrialen Atmung liefern wertvolle Einblicke in die mitochondriale Integrität, die bioenergetische Zellenergie und die mitochondriale Atmungskapazität9. Die Funktion der mitochondrialen Atmung konnte in vitro oder in situ mit verschiedenen Techniken analysiert werden. Die Analyse der mitochondrialen Atmung in intakten Zellen könnte jedoch eine Reihe von Vorteilen bieten, da sie den gesamten Zellstoffwechsel umfasst, da die Wechselwirkungen der Zellen mit ihrer Umgebung und des intrazellulären Stoffwechsels bei der Verwendung ganzer Zellen berücksichtigt werden10. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung intakter Zellen eine einfache Bewertung verschiedener experimenteller Bedingungen und detektiert minimale Veränderungen, die in isolierten Mitochondrien nicht beobachtet werden konnten10,11. Ein weiterer Vorteil der Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in intakten Zellen besteht darin, dass die Auswirkungen der mitochondrialen Proliferation und Lokalisation erhalten bleiben12.

Die Atmung der Mitochondrien von Säugetieren in intakten Zellen wurde sehr detailliert beschrieben12, wobei die Untersuchung anderer eukaryotischer Organismen, wie z. B. Hefen, außer Acht gelassen wurde. Hier schlagen wir eine Technik zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung vor, die an Hefe aus Säugetierprotokollen angepasst ist. Daher wurden Konzepte aus der Säugetier-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in dieser Technik verwendet. Zum Beispiel ist diese Technik in verschiedene Stadien unterteilt, wie das Säugetierprotokoll: 1) basale Atmung (substratabhängig), 2) ATP-gebundene Atmung (durch die Hemmung der ATP-Synthase), 3) maximale Atmungskapazität (Verwendung eines Entkopplers, der die Durchlässigkeit von Protonen durch die innere Mitochondrienmembran ermöglicht), 4) Hemmung der mitochondrialen Atmung (Verwendung einer Mischung aus Atmungskettenhemmern, um den Sauerstoffverbrauch für andere Quellen zu verwerfen, die sich von mitochondriale Atmung)11,13. Daher zielt diese Arbeit darauf ab, ein Protokoll zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in Hefe vorzustellen.

Protokoll

1. Nährmedien und Vorbereitung des Inokulums

  1. Bereiten Sie 100 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) vor, indem Sie 1 g Hefeextrakt, 2 g Kaseinpepton und 2 g Glukose in 95 ml destilliertem Wasser hinzufügen. 3 mL in 10 mL Glasreagenzgläser verteilen, 15 Minuten lang bei 121 °C und 1,5 psi sterilisieren.
    HINWEIS: Das Medium kann bis zu 1 Monat bei 4 - 8 °C gelagert werden.
  2. Ein 10-ml-Reagenzglas aus Glas, das 3 ml YPD-Medium enthält, wird mit 250 μl -20 μC Glycerin-konservierten Hefezellen beimpft. Über Nacht unter ständigem Rühren bei 200 U/min und 30 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubationstemperatur kann bei einigen Hefearten variieren (z. B. hat Kluyveromyces marxianus eine optimale Wachstumstemperatur von 37 °C).
  3. Füllen Sie eine Petrischale (60 x 15 mm2) mit sterilem 2 % YPD-Agar (fügen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Kaseinpepton, 20 g Glukose und 20 g bakteriologischen Agar zu 950 mL destilliertem Wasser hinzu) und bestreichen Sie die Petrischale mit den Hefezellen, die im 10-ml-Glasreagenzglas mit einer sterilen Schleife gezüchtet wurden. Inkubieren Sie die Petrischale bei 30 °C, bis isolierte Kolonien entstehen.
  4. Bereiten Sie ein Präinokulum vor, indem Sie ein steriles 10-ml-Reagenzglas aus Glas, das 3 ml YPD-Medium mit 2 % Glukose enthält, mit zwei oder drei hefeisolierten Kolonien aus der Petrischale beimpfen. Über Nacht unter ständigem Rühren bei 30 °C inkubieren.

2. Wachstumsbedingungen und Versuchsplanung

  1. Ein 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml sterilem synthetischem Vollmedium (SC-Medium; 0,18 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,5 g Ammoniumsulfat, 0,2 g Dikaliumphosphat, 1 g synthetische Hefe-Drop-out-Zusätze und Glukose gemäß dem Versuchsplan in 98,02 ml destilliertem Wasser) wird mit einer Hefekultur bei einem Anfangs-ODvon 600 ~ 0,1 inokuliert. das sind etwa 3 mL des Prä-Inokulums über Nacht (OD600 ~ 3). Legen Sie die Umgebungsbedingungen oder die Ergänzung mit der chemischen Herausforderung fest, die in der mitochondrialen Atmung getestet werden soll (z. B. Zugabe von 100 μM Resveratrol). Bereiten Sie eine Fahrzeugsteuerung in einem separaten Kolben für die chemische Herausforderung vor. Testen Sie mindestens drei biologische Replikate.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, ein minimales Medium zu verwenden, um Nährgeräusche im Assay zu verwerfen, und das an dieser Stelle vorgeschlagene minimale Medium wird für S. cerevisiae verwendet und kann für andere Hefearten abweichen. Schließlich ist die in den Nährmedien supplementierte Glukosekonzentration entscheidend, um eine Glukoseunterdrückung oder den Crabtree-Effekt zu vermeiden, der die mitochondriale Atmung hemmt. Konzentrationen unter 0,5 % (w/v) zeigten ein gutes Ansprechen bei der mitochondrialen Atmung, begleitet von hohen Wachstumsraten bei S. cerevisiae. Bei Crabtree-negativen Hefen hatten hohe Glukosekonzentrationen keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung (z . B. K. marxianus).
  2. Wiegen Sie ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen und verwenden Sie es, um Zellen in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 ~ 0,5) durch Zentrifugation bei 4000 x g für 5 Minuten zu ernten.
    HINWEIS: Für die Untersuchung der mitochondrialen Atmung wird die Mid-Log-Phase empfohlen, da es sich um die Wachstumsphase handelt, in der der Energiestoffwechsel aktiver ist.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 3x mit 25 mL entionisiertem Wasser. Wiegen Sie das konische Rohr mit den Pelletzellen (Nassgewicht) und subtrahieren Sie das Gewicht des konischen Rohrs, um das zelluläre Nassgewicht zu erhalten.
  4. Suspendieren Sie das Pellet in 2 mL entionisiertem Wasser.
  5. Erfassen Sie die Zellkonzentration, indem Sie das Nassgewicht durch 2 dividieren, um mg Zellen/ml zu erhalten. Dieser Wert ist wichtig, um zu bestimmen, wie viel Volumen hinzugefügt werden muss, um 50 mg Zellen für den Assay zu erhalten.

3. Sauerstoffverbrauchs-Assay (Polarographie)

  1. Verwenden Sie eine Sauerstoffelektrode vom Typ Clark, die mit einem YSI5300A Monitor und einem Computer für die Datenerfassung verbunden ist.
    1. 5 ml Morphoethanolsulfonsäure, angepasst an pH 6, mit Triethanolamin (MES-TEA-Puffer; 10 mM) und 50 mg Zellen (Nassgewicht) in die Polarographenkammer geben. Platzieren Sie die Elektrode vorsichtig und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
    2. Schalten Sie den YSI5300A Monitor, den Computer für die Datenerfassung und die Kammer für das Rühren ein. Stellen Sie den YSI5300A Monitor ein, indem Sie den Einstellregler für Kanal 1 in AIR auswählen. Stellen Sie Kanal 1 mit dem Kalibrierregler für Kanal 1 auf 100 % ein und stabilisieren Sie das Signal 5 Minuten lang bei 100 %.
    3. Starten Sie die Datenaufzeichnung auf dem Computer und die Zeitmessung mit einem Chronometer.
      HINWEIS: Der YSI5300A Monitor verfügt nicht über einen Datenerfassungscomputer oder ein Datenerfassungsprogramm. Dies kann extern durch den Benutzer implementiert werden.
    4. Verwenden Sie eine laterale Kanalisierung der Elektrode in der Oximeterkammer, um das oxidierbare Substrat, das Oligomycin, den Entkoppler und die Mischung der Atmungskettenhemmer nacheinander hinzuzufügen.
  2. Geben Sie das oxidierbare Substrat (Glukose, Glycerin, L-Laktat oder eine andere Kohlenstoffquelle gemäß dem Versuchsdesign) mit einer Chromatographiespritze in eine Endkonzentration von 10 mM. Halten Sie die Kammer immer geschlossen und unter ständigem Rühren. Erfassen Sie den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten, um die Grundatmung zu bestimmen.
    HINWEIS: Glukose, Glycerin und L-Laktat werden verwendet, um die Elektronentransportkette an verschiedenen Stellen der Atmungskette zu analysieren: Der Glukosestoffwechsel reduziert NAD+ zu NADH und wird zur Analyse der gesamten Atmungskette verwendet; Glycerin überträgt Elektronen auf Ubichinon und wird verwendet, um die Atmungskette von Ubichinon zu bewerten; schließlich tritt L-Laktat seine Elektronen an Cytochrom c ab und wird verwendet, um die Wirkung von Cytochrom c14 zu bestimmen. Diese Substrate können je nach enzymatischer Leistungsfähigkeit der Hefespezies variieren.
  3. Fügen Sie Oligomycin hinzu, um eine Endkonzentration von 0,01 mM in der Oximeterkammer mit einer Chromatographiespritze zu erhalten, um die ATP-gebundene Atmung zu bewerten und den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten aufzuzeichnen.
  4. Ergänzen Sie den Entkoppler 3-Chlorphenylhydrazoncarbonylcyanid (CCCP), um eine Endkonzentration von 0,015 mM in der Oximeterkammer mit einer Chromatographiespritze zu erhalten, um die maximale Atmungskapazität zu bestimmen und den prozentualen Luftverbrauch für 2-3 Minuten aufzuzeichnen.
  5. Verwenden Sie eine Chromatographiespritze, um die Elektronentransportketteninhibitoren hinzuzufügen: zuerst 2-Thenoyltrifluoraceton (TTFA) und dann Antimycin A (AA) in Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1 mg/ml. Messen Sie jeden Inhibitor für 2-3 min.
    HINWEIS: Die Inhibitoren der Elektronentransportkette können sich zwischen den Hefearten unterscheiden; Dies sollte in diesem Schritt berücksichtigt werden.
  6. Sieben Sie jede Kohlenstoffquelle unabhängig voneinander (d. h. Glukose, Glycerin oder L-Laktat). Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5 für jede Kohlenstoffquelle. Waschen Sie die Kammer nach jedem Gebrauch 3x mit 70% Ethanol und 3x mit entionisiertem Wasser.

4. Datenverarbeitung

  1. Verwenden Sie Sauerstoffverbrauchskurven (Darstellung des Luftanteils über die Zeit), um die Steigungen des oxidierbaren Substrats (basale Atmung), Oligomycin (ATP-gebundene Atmung), CCCP (maximale Atmung), AA und TTFA (nicht mitochondriale Atmung; Abbildung 1). Berechnen Sie einzelne Steigungen für jede ergänzte Verbindung mit Hilfe der linearen Regression, wie unten beschrieben.
    1. Erstellen Sie eine neue Projektdatei in der Statistiksoftware. Wählen Sie im Abschnitt Erstellen die Option XY aus. Wählen Sie die Option Daten in eine neue Tabelle eingeben oder importieren im Abschnitt Datentabelle.
    2. Wählen Sie Zahlen im Unterabschnitt X im Abschnitt Optionen aus. Klicken Sie auf Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten im Unterabschnitt Y im Abschnitt Optionen ein.
      HINWEIS: Das Tabellenformat besteht aus einer X-Spalte und mehreren Y-Spalten mit jeweils 3 Unterspalten mit den Namen A: Y1 und A: Y2.
    3. Geben Sie Zeitdaten in X-Spalten ein (z. B. 0, 2, 4, 6, 8 s oder 0, 1, 2, 3 min). Schreiben Sie den Luftanteil in die Y-Spalten.
    4. Erstellen Sie eine lineare Regressionsfitness. Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren . Wählen Sie in der Option Analyse die Option Einfache lineare Regression auf XY-Analysen und klicken Sie auf OK.
    5. Rufen Sie den Neigungswert aus den Tabellen Ergebnisse in Daten im linken Teil des Bildschirms ab.
  2. Schreiben Sie die Steigungswerte in ein Datenblatt und subtrahieren Sie den Steigungswert, der aus der Mischung der Ateminhibitoren (AA und TTFA) erhalten wurde, von den Steigungen aus dem oxidierbaren Substrat, Oligomycin und CCCP, um den Sauerstoffverbrauch aus anderen Quellen als der mitochondrialen Atmung zu verwerfen.
  3. Multiplizieren Sie die erhaltenen Werte mit 237 μM O2. Dieser Wert gilt als Löslichkeit von O2 in einem gepufferten mitochondrialen Medium, das mit Luft (20,9 % O2) bei 25 °C ausgeglichen ist; Dieser Wert variiert je nach Temperatur, Höhe und verwendetem Puffer.
  4. In Minute umrechnen; Die erhaltenen Werte sind μM von O2 pro Zeit, abhängig davon, wie die Zeit aufgetragen wird, um μM von O2/ min zu erhalten.
  5. Teilen Sie durch 50, dh das mg der verwendeten Zellen; Zell-MG kann je nach Versuchsdesign variieren. Schließlich wird der Sauerstoffverbrauch in μM O2/mg Zellen x min ausgedrückt

Ergebnisse

Diese mitochondriale Atmungstechnik kann auch für andere Hefearten als S. cerevisiae verwendet werden, wie z. B. Scheffersomyces stipitis15 und K. marxianus16. Zu repräsentativen Zwecken stellen wir jedoch nur Ergebnisse von S. cerevisiae vor. Es ist allgemein bekannt, dass S. cerevisiae bei niedrigen Glukosekonzentrationen (unter 0,8 mM) einen vorherrschenden respiratorischen Stoffwechsel aufweist17,18. Um den respiratorischen Phänotyp von S. cerevisiae zu bestätigen, wurde es in zwei Glukosekonzentrationen zur Stimulierung (0,5 % Glukose) und zur Begrenzung (5 % Glukose) der mitochondrialen Atmung gezüchtet18,19. Erwartungsgemäß validieren die Ergebnisse der basalen Atmung (oxidierbares Substrat), der ATP-gebundenen Atmung (Oligomycin) und der maximalen Atmungskapazität (CCCP) den charakteristischen Energiestoffwechsel von S. cerevisiae (Abbildung 2). Wir beobachteten höhere Werte des Sauerstoffverbrauchs (basale Atmung, ATP-gebundene Atmung und maximale Atmungskapazität) in Zellen, die mit 0,5 % Glukose gezüchtet wurden, verglichen mit Werten, die in Zellen mit 5 % Glukose gewonnen wurden (Abbildung 2).

Darüber hinaus wurden in den Assays drei Substrate verwendet: Glukose, Glycerin und L-Laktat. Das Ziel des Einsatzes verschiedener Substrate ist es, verschiedene Teile der mitochondrialen Atmungskette zu bewerten. Unter diesen Bedingungen zeigte die mitochondriale Atmung keine signifikanten substratabhängigen Veränderungen, da keine Behandlung zur Störung der Atmungskette hinzugefügt wurde (Abbildung 2).

Wir verwendeten Quercetin, um die Kapazität der Technik zu bewerten, eine Verbindung, die die mitochondriale Atmung negativ beeinflusst20. Die erhaltenen Daten zeigten, dass Quercetin die mitochondriale Atmung in Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, die mit 0,5 % Glukose angereichert waren, signifikant verringerte (Abbildung 3). Auf der anderen Seite zeigten Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, die mit 5 % Glukose angereichert waren, keinen signifikanten negativen Einfluss von Quercetin (Abbildung 4).

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Abbildung 1: Repräsentative Sauerstoffverbrauchskurve. Kurve des Sauerstoffverbrauchs in S. cerevisiae-Zellen , die in SC-Medien gezüchtet wurden (0,5 % Glukose). Die Farben repräsentieren unterschiedliche Steigungen, die bei Substrat, Entkopplern und Inhibitorergänzung erhalten werden. Grün: Das Substrat nutzte Glukose und die steigungsentsprechende basale Atmung. Blau: Oligomycin, ATP-Synthase-Inhibitor, Steigung zur Bestimmung der ATP-gebundenen Atmung. Gelb: CCCP, Entkoppler, Steigung zur Bewertung der maximalen Atmung. Grau und Rot: Inhibitorkomplex II bzw. III; Steigung zur Bestimmung des nicht von Mitochondrien abhängigen Sauerstoffverbrauchs. Abkürzungen: CCCP = 3-Chlorphenylhydrazoncarbonylcyanid; TTFA = 2-Thenoyltrifluoraceton; AA = Antimycin A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Sauerstoffverbrauchsassays in S. cerevisiae-Zellen, die mit 0,5 % und 5 % Glukose gezüchtet wurden. Die mitochondriale Atmung wird durch den Sauerstoffverbrauch bewertet, der bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S. cerevisiae-Zellen gemessen wird, die in SC gezüchtet und mit 0,5 % und 5 % Glukose ergänzt wurden. Drei Substrate wurden verwendet, um ihren spezifischen Einfluss auf die Elektronentransportkette zu bewerten: Glukose (NADH-Dehydrogenasen), Glycerin (Ubichinonpool) und L-Lactat (Cytochrom c). (A) Basale Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrate; (B) maximale Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrate; (C) ATP-gebundene Atmung bei 5 % und 0,5 % Glukose mit Glukose, Glycerin und L-Laktat als Substrat. Die Ergebnisse werden als mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt, wobei jedes Experiment zwei technische Wiederholungen hat. Einfache ANOVA gefolgt vom Tukey-Test (p ≤ 0,05; verschiedene Buchstaben: signifikanter Unterschied, gleiche Buchstaben: kein signifikanter Unterschied) für die statistische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Quercetin begrenzte die mitochondriale Atmung bei niedriger Glukosekonzentration in gezüchteten S. cerevisiae-Zellen . Die Messung des Sauerstoffverbrauchs wurde bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S. cerevisiae-Zellen durchgeführt, die in SC-Medien (0,5 % Glukose) mit Quercetin (100 μM) gezüchtet wurden. Ethanol wurde verwendet, um die Quercetin-Lösung aufzulösen. Die Ergebnisse werden als mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt, wobei jedes Experiment zwei technische Wiederholungen hat. Die statistischen Analysen wurden unter Verwendung eines studentischen t-Test-Paares (*, ** p ≤ 0,05) durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Quercetin beeinflusst die mitochondriale Atmung bei hohen Glukosekonzentrationen in S. cerevisiae nicht. Der Sauerstoffverbrauch wurde bei der basalen Atmung, der maximalen Atmungskapazität und der ATP-gebundenen Atmung in S . cerevisiae-Zellen gemessen, die in SC-Medien (5 % Glukose) mit Quercetin (100 μM) gezüchtet wurden. Ethanol wird verwendet, um die Quercetin-Lösung aufzulösen. Die Ergebnisse zeigen mittlere ± S.D. aus drei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei technischen Wiederholungen. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des gepaarten t-Tests der Studierenden durchgeführt (p ≤ 0,05; ns: nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die Phosphorylierung der mitochondrialen Atmung spielt eine grundlegende Rolle in mehreren Signalwegen, die vom mitochondrialen Membranpotenzial abhängen und den ATP-Spiegel durch oxidative Phosphorylierung aufrechterhalten. Das Verständnis, wie sich Umwelt- und Ernährungsbedingungen auf die mitochondriale Atmung von Hefen auswirken, dient als Werkzeug, um molekulare Mechanismen aufzuklären.

Es ist wichtig, die folgenden kritischen Schritte zu berücksichtigen, um zuverlässige Ergebnisse mit dieser Methode zu erhalten. Ein Rühren von >200 U/min ist entscheidend, um unter Wachstumsbedingungen der Atemwege eine ausreichende Biomasse zu erhalten, um die mitochondriale Atmung zu testen. Rührbedingungen unter 200 U/min führen zu schlechtem Wachstum und Biomassebildung, so dass es länger dauert, bis die mittlere Wachstumsphase erreicht wird, und kann sich auf den Sauerstoffverbrauch auswirken, da die Zellen in einer weniger sauerstoffreichen Umgebung überleben. Die Glukosekonzentration im Medium wird entsprechend dem Hefephänotyp (Crabtree-positiv oder negativ) eingestellt; Dies ist im Fall von Crabtree-positiven Hefen von entscheidender Bedeutung, da hohe Glukosekonzentrationen die mitochondriale Atmung hemmen und eine Verzerrung bei der Dateninterpretation bewirken könnten. Zum Beispiel verursacht Glukose bei S. cerevisiae eine katabole Repression und hemmt die mitochondriale Atmung bei hohen Glukosekonzentrationen21,22. Basierend auf diesen Erkenntnissen werden niedrigere Werte bei der basalen Atmung, der ATP-gebundenen Atmung und der maximalen Atmung von Zellen erhalten, die bei hoher Glukosekonzentration (5%) gezüchtet wurden, verglichen mit Hefezellen, die bei niedrigen Glukosekonzentrationen (0,5%) gezüchtet wurden. Inhibitoren der Atmungskette sollten je nach Empfindlichkeit der Hefe sorgfältig ausgewählt werden; Dies ist entscheidend, um andere Quellen des zellulären Sauerstoffverbrauchs als die mitochondriale Atmung zu verwerfen.

Substrate, mitochondriale Entkoppler und Inhibitoren werden verwendet, um verschiedene Parameter der mitochondrialen Atmung in intakten Zellen zu bestimmen. Dennoch hat ihre Verwendung einige Einschränkungen. Zum Beispiel müssen die unspezifischen Ziele außerhalb der Mitochondrien von mitochondrialen Inhibitoren und Entkopplern in intakten Zellen berücksichtigt werden, um eine Verzerrung bei der Interpretation des Sauerstoffverbrauchs zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Verwendung alternativer Kohlenstoffquellen für das Screening des Wirkorts in der Atmungskette genauer getestet werden, da Nebenprodukte des Glycerin- oder L-Laktatstoffwechsels oxidiert werden könnten, um NAD+ oder FAD+ zu reduzieren, das Elektronen abgibt und die Atmungskette aktiviert, da NADH-Dehydrogenasen bzw. Komplex II vorhanden sind. Schließlich beherbergen S. cerevisiae und andere Hefen PDR-Transporter wie Yor1p (Hefe-Oligomycin-Resistenzprotein), was auf den Ausfluss von Oligomycin aus den Zellen hindeutet23. Darüber hinaus sind Assays mit PDR-defizienten Zellen, z. B. dem AD1-8-Stamm, bei dem wichtige PDR-Transporter und PDR1/PDR3-Transkriptionsfaktoren entfernt sind, erforderlich, um die Verwendung von Oligomycin in S. cerevisiae zur Quantifizierung der mitochondrialen Atmung zu validieren.

Die Verwendung intakter Zellen für die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung behält den zellulären Kontext bei und bietet eine robustere Technik, um die ernährungsphysiologischen oder umweltbedingten Auswirkungen auf die Bioenergetik der Hefe zu kennen. Darüber hinaus ist die Verwendung von hefeintakten Zellen für die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung wirtschaftlicher und auf technischer Ebene einfacher als isolierte Mitochondrien. Darüber hinaus deuten verschiedene Kohlenstoffquellen, wie bei isolierten Mitochondrien-Assays, auf den Wirkort einiger Moleküle in der Atmungskette hin. Als Proof of Concept bestätigt diese Technik, dass eine Resveratrol-Supplementierung die Atmungskette auf NADH-Dehydrogenase-Niveau beeinflusst, da eine Resveratrol-Hemmung der Basalatmung nur bei Glukose und nicht bei Glycerin oder L-Lactatbeobachtet wird 24. In vitro-Studien mit solubilisiertem Komplex I zeigten, dass Resveratrol mit NAD+ konkurriert und die Aktivität von Komplex I beeinflusst25. Dies bestätigt den Phänotyp, der mit der hier vorgestellten Technik in intakten Zellen beobachtet wurde. Darüber hinaus ist diese Technik auch zuverlässig, um die negativen Auswirkungen von Chemikalien auf die mitochondriale Atmung der Hefe zu untersuchen. Zum Beispiel ist Quercetin ein Polyphenol, das in den letzten Jahrzehnten umfassend untersucht wurde. Zu den wichtigsten gefundenen Beweisen gehört, dass es die mitochondriale Atmung in intakten Zellen einschränkt, was durch die Aktivität der komplexen Atmungskette bestätigt wurde26,27. Wichtig ist, dass verschiedene Forschungen in verschiedenen Modellstudien über Quercetin-hemmende Wirkungen auf die mitochondriale Atmung berichtethaben 28.

Es ist wichtig, eine detaillierte Beschreibung des Hefestoffwechsels, einschließlich der Bioenergetik, zu haben, da diese Mikroorganismen tierische Krankheitserreger, einschließlich des Menschen, sein können und auch als Zellfabriken oder in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt werden.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) unterstützt, das an LAMP vergeben wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-Thenoyltrifluoraceton (TTFA)MerckT27006Inhibitor-Komplex II
3-Chlorphenylhydrazon-Carbonylcyanid (CCCP)MerckC2759Mitochondrien-Entkoppler für die Atmung  
Absolut ethanolMerck107017Zum Auflösen von Quercetin
AgarMerckA1296YPD Agar Zubereitung
Ammoniumsulfat granuliert (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC Bouillon
Zubereitung Antimycin A (AA)MerckA8674Inhibitor Komplex III
aYSI5300A--------Monitor 
ZentrifugeHermleZ 206 AFür die Zentrifugation
von Zellen Clark-Typ Sauerstoff--------Elektrode 
Computer--------Für die Datenerfassung 
Dikaliumphosphat K2HPO4J.T. Baker3252-05SC Brühezubereitung
GlukoseMerckG7021YPD Brühezubereitung
GlycerinolMerckG5516Substrat Medium Supplementierung 
LaktatMerckL1250Substrat Medium Supplementierung 
Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Hemmung der mitochondrialen ATP-Synthase
Orbital ShakerThermo FisherSHKE6000Inoculum Inkubation Glasröhrchen und -kolben 
Pepton aus Kasein, enzymatischer AufschlussMerck82303YPD Brühe
Zubereitung Quercetin Merck337951Zur Verringerung der mitochondrialen Atmung
Uracil MerckU0750SC Brühezubereitung
HefeextraktMerckY1625YPD Brühezubereitung
Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und AmmoniumsulfatMerckY1251SC Brühezubereitung
Hefe Synthetisches Drop-out-Medium Ergänzungen ohne UracilMerckY1501SC Brühezubereitung

Referenzen

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SauerstoffverbrauchClark Elektrodeoxidative PhosphorylierungElektronentransportketteATP Syntheselineare RegressionOximeter KammerSaccharomyces cerevisiae

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