Methodenartikel

Modellierung und Bewertung des Modells der murinen diabetischen Kardiomyopathie

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DOI:

10.3791/67189

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29. November 2024

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1Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 2Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer diabetischen Kardiomyopathie durch eine Kombination aus fettreicher Diät und Streptozotocin-Injektion. Dieser Ansatz zielt darauf ab, einen verlässlichen Rahmen für die wissenschaftliche Erforschung der diabetischen Kardiomyopathie zu schaffen und mögliche Wege für klinische Behandlungsanwendungen zu erkunden.

Zusammenfassung

Die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen der diabetischen Kardiomyopathie (DbCM), einer der Haupttodesursachen bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM), sind nach wie vor wenig verstanden. Die mit T2DM assoziierte Myokardtoxizität wird auf Faktoren wie Lipotoxizität, Glukotoxizität, oxidativen Stress, verminderte kardiale Effizienz und Lipoapoptose zurückgeführt. Im Vergleich zu Ratten bieten Mäuse eine bessere Zugänglichkeit, Kosteneffizienz und eine breitere Anwendbarkeit für Tierversuche. Insulinresistenz und gestörte Insulinsekretion sind entscheidende Faktoren in der Pathophysiologie von T2DM. Wir stellen ein neuartiges nicht-genetisches Mausmodell vor, das die Progression von humanem DbCM repliziert, die durch eine Kombination aus fettreicher Diät (HFD) und Streptozotocin (STZ) induziert wird. In dieser Studie verwendeten wir Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J, die 12 Wochen lang ein HFD-Schema verabreichten, gefolgt von intraperitonealen Injektionen von STZ für weitere 12 Wochen, um charakteristische Manifestationen von T2DM zu induzieren. Wir führten orale Glukosetoleranztests durch und maßen die Seruminsulinkonzentrationen, um die Entwicklung einer Insulinresistenz und einer unzureichenden Insulinsekretion zu bestätigen. Die Struktur und Funktion des Herzens wurde durch nicht-invasive transthorakale Echokardiographie streng beurteilt. Die pathologischen Merkmale wurden durch die Masson-Trichrom-Färbung und die Weizenkeim-Agglutinin-Färbung (WGA) bewertet, wobei pathologische Merkmale im Zusammenhang mit DbCM aufgedeckt wurden. Daher bieten wir eine robuste und vielseitige Methode zur Etablierung eines nicht-genetischen Mausmodells von DbCM an.

Einleitung

Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist ein zunehmend eskalierendes globales Gesundheitsproblem, das als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Betroffenen gilt. Die Prävalenz von T2DM steht in engem Zusammenhang mit der zunehmenden Epidemie der Adipositas 1,2. Mehr als ein Drittel der Patienten mit T2DM weist einen ausgeprägten kardiovaskulären Phänotyp auf, der als diabetische Kardiomyopathie (DbCM) bezeichnet wird und durch eine myokardiale Dysfunktion gekennzeichnet ist, die unabhängig von koronarer Herzkrankheit, Bluthochdruck und Herzklappenerkrankung auftritt3. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass etwa 20 % der Diabetiker für die Entwicklung einer Herzinsuffizienzprädisponiert sind 3, eine Erkrankung, die eng mit ihrer Prognose zusammenhängt4. Es wurden mehrere pathophysiologische Mechanismen von DbCM vorgeschlagen, darunter Entzündungen5, kardialer Umbau und Dysfunktion6, mitochondriale Dysfunktion7, oxidativer Stress8 und Stoffwechselstörungen9. Trotz umfangreicher Forschung ist das gesamte Spektrum der Mechanismen und ihre einzelnen Beiträge zum DbCM nach wie vor unvollständig verstanden10. Daher sind gut etablierte präklinische Tiermodelle unerlässlich, um die Erforschung dieser Erkrankung voranzutreiben.

T2DM ist gekennzeichnet durch Insulinresistenz und fortschreitende Insulininsuffizienz11, wobei die meisten übergewichtig oder adipös sind12. In dieser Studie etablieren wir ein stabiles und modifiziertes Mausmodell von DbCM auf der Grundlage früherer Studien, das die Fütterung mit fettreicher Diät (HFD) und die Injektion von Streptozotocin (STZ) kombiniert. Bei T2DM tragen die Insulinresistenz und die β-Zell-Zerstörung der Bauchspeicheldrüse zur Pathophysiologie der Erkrankung bei12. Dieses Modell nutzt zwei wichtige Risikofaktoren von T2DM. Insbesondere entwickeln Mäuse, die mit HFD gefüttert werden, eine Insulinresistenz, und nachfolgende STZ-Injektionen beeinträchtigen die Funktion der Pankreasinseln β Zellen weiter, was signifikant zum Fortschreiten der T2DM-ähnlichen Pathophysiologie führt. STZ, isoliert aus Streptomyces achromogenes, wurde erstmals 1963 für seine selektive Zerstörung von Pankreas-Inselzellen β-Zellen und seine diabetogenen Eigenschaften beschrieben13. Es gibt zwei STZ-Behandlungsmodelle: Die Verabreichung einer relativ hohen Dosis STZ führt zu einem kurzfristigen Kardiomyopathie-Modell, während wiederholte niedrig dosierte STZ-Injektionen ein T2DM-Modell induzieren, das auf natürliche Weise zu DbCM fortschreitet. Als Ergebnis der letztgenannten Methode entwickeln Tiere Hyperglykämie, Polydipsie und Polyurie, die alle Merkmale von menschlichem T2DM sind und DbCM auf natürliche Weise entwickeln.

Diese Studie ergab, dass Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J, die mit HFD gefüttert wurden, gefolgt von intraperitonealen STZ-Injektionen (30 mg/kg), am Ende des Experiments Herzfunktion, Morphologie und Histologie aufwiesen, die mit den Eigenschaften von DbCM übereinstimmten. Dieser Ansatz bietet eine effektive Methode zur Etablierung eines murinen DbCM-Modells.

Protokoll

Alle Verfahren folgten den institutionellen Richtlinien für Tierversuche in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, der von den US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996) ausgearbeitet wurde. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierhaltung und der Ethikkommission der Universität Sichuan genehmigt. Männliche C57BL/6J-Mäuse wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. (China) gekauft. Während der gesamten Versuchsdauer wurden die Mäuse unter kontrollierten Bedingungen von 24 °C und einem regulierten 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser.

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Abbildung 1: Schematische Zeitleiste des Experiments. Die Mäuse, die in den HFD/STZ- und ND-Gruppen verwendet wurden, waren beide etwa 7-8 Wochen alt. Das Körpergewicht und der zufällige Blutzuckerspiegel jeder Maus wurden wöchentlich aufgezeichnet. In den 12-wöchigen und 24-wöchigen Fütterungsintervallen wurde der metabolische Phänotyp der Mäuse durch einen oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und die Messung des Seruminsulinspiegels bewertet. Zusätzlich wurde die Echokardiographie zu Studienbeginn (Woche 0), 12 Wochen und 24 Wochen untersucht. Nach der 24-wöchigen Fütterungsperiode wurden die Mäuse eingeschläfert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. HFD-Zuführung

  1. Füttern Sie männliche C57BL/6J-Mäuse (7-8 Wochen alt) 24 Wochen lang entweder mit normaler Ernährung (ND) oder HFD (60 % kcal Fett), um Fettleibigkeit zu induzieren.
  2. Erfassen Sie alle 4 Wochen das Körpergewicht jeder Maus. Stellen Sie sicher, dass die Gewichtskurve vor 12 Wochen ein ähnliches Aufwärtsmuster aufweist, wobei in der HFD-Gruppe eine steilere Steigung beobachtet wird.

2. Vorbereitung und Injektion der STZ-Lösung

HINWEIS: STZ bei -20 °C lagern, um eine Degradation aufgrund seiner hohen Instabilität bei Raumtemperatur (RT) zu verhindern. Mischen Sie STZ sofort innerhalb von 5 Minuten vor der Injektion mit Citratpuffer.

  1. Citratpuffer vorbereiten. 2,1 g Zitronensäure (relative Molekülmasse: 210,14) werden gewogen und gründlich in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst, um Lösung A herzustellen. Wiegen Sie 2,94 g Natriumcitrat (relative Molekülmasse: 294,10) und lösen Sie es gründlich in 100 ml destilliertem Wasser auf, um Lösung B herzustellen. Mischen Sie Lösung A und B im Verhältnis 1: 1,32, um die Zitronensäure-Arbeitslösung zu erhalten. Filtern Sie Verunreinigungen mit einer 0,45 μm Filtermembran heraus.
  2. Wiegen Sie 1 g STZ und lösen Sie es gründlich in 100 ml der vorbereiteten gemischten Zitronensäure-Arbeitslösung auf. Die resultierende STZ-Lösung bei 4 °C lagern. Stellen Sie sicher, dass die Injektion der STZ-Lösung nach Möglichkeit innerhalb von 30 Minuten erfolgt.
  3. Mit einer 1-ml-Spritze wird Mäusen der HFD/STZ-Gruppe an 7 aufeinanderfolgenden Tagen intraperitoneale Injektionen einer Lösung mit 30 mg/kg STZ täglich verabreicht, während Mäusen der ND-Gruppe ein gleiches Volumen Citratpuffer (0,1 mmol/l, pH = 4,5) verabreicht wird.
  4. Messen Sie den Blutzuckerspiegel 1 Woche nach der letzten Injektion. Klassifizieren Sie Mäuse mit zufälligen Blutzuckerkonzentrationen von mehr als 16,7 mmol/l als T2DM-Mäuse.
    1. Positionieren Sie die Maus vorsichtig auf einer Rückhaltevorrichtung und stellen Sie sicher, dass der Schwanz vollständig nach außen ragt.
    2. Desinfizieren Sie vor der Blutentnahme die Blutentnahmestelle des Schwanzes gründlich mit einem 70%igen Alkoholtupfer, um die Sterilität und Sauberkeit zu erhalten.
    3. Führen Sie diese mit einer scharfen Nadel in die Schwanzvene ein und schieben Sie sie von der Spitze in Richtung Basis in einer Tiefe von 3-4 mm. Sobald die Nadel fest sitzt, drücke vorsichtig auf die Oberseite des Schwanzes, um die Durchblutung zu fördern.
    4. Entnehmen Sie einer Maus etwa 10 μl Blut und tragen Sie das gesammelte Blut vorsichtig auf den entsprechenden Teststreifen auf. Sobald das Blut absorbiert ist, zeigt das Glukosemessgerät sofort den Blutzuckerwert an.

3. Oraler Glukosetoleranztest (OGTT)14

  1. Vor OGTT können Sie jede Maus über Nacht 14 Stunden lang fasten, während sie uneingeschränkten Zugang zu Wasser hat.
  2. Bereiten Sie ca. 10 ml einer 20%igen Glukoselösung vor. Verabreichen Sie jeder Maus während der OGTT eine Dosis von 1 g/kg Glukose über eine orale Sonde.
  3. Überwachen Sie den Blutzuckerspiegel zu verschiedenen Zeitpunkten: sofort (0 min), 15 min, 30 min, 60 min und 120 min nach der Verabreichung.

4. Echokardiographische Beurteilung der Herzfunktion

  1. Führen Sie eine Echokardiographie an jeder Maus zu Studienbeginn (0 Wochen), 12 Wochen und 24 Wochen nach der Fütterung mit HFD oder ND durch.
  2. Vor der Echokardiographie wird die Maus durch Inhalation von 3 % Isofluran betäubt, das mit einem Anästhesiegerät mit 100 % Sauerstoff verabreicht wird. Stellen Sie sicher, dass die Maus keine Reaktion auf das Einklemmen der Haut mit einer Zahnpinzette oder die Stimulation ihrer Zehen und ihres Schwanzes zeigt. Tragen Sie tierärztliche Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
  3. Positioniere die Maus auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur zu halten, und befestige ihre Krallen an einer Elektrode, um eine stabile Rückenlage zu gewährleisten. Passen Sie die Isoflurankonzentration für die Erhaltungsanästhesie zwischen 1 % und 2 % an, um eine Zielherzfrequenz von etwa 450 Schlägen pro Minute aufrechtzuerhalten.
  4. Entfernen Sie das Fell der Maus mit Enthaarungscreme und tragen Sie Ultraschallgel auf die Brust auf. Entfernen Sie die Enthaarungscreme und das Ultraschallgel mit steriler Kochsalzlösung nach der Echokardiographie.
  5. Beurteilen Sie die Herzfunktion und die strukturellen Parameter mit einer 50 MHz Sonde.
    1. Um eine optimale Ansicht der Längsachse des linken Ventrikels (LV) zu erhalten, positionieren Sie die Sonde auf der linken Seite des Brustkorbs des Tieres.
    2. Drehen Sie die Sonde je nach individueller Anatomie gegen den Uhrzeigersinn zwischen 15° und 45° relativ zur linken parasternalen Linie, wobei die Kerbe zur rechten Schulter zeigt. Passen Sie die x-Achse und die y-Achse im B-Modus15 an.
      HINWEIS: Eine geeignete LV-Längsachsenansicht sollte Folgendes umfassen: (i) die Aortenklappe und die Aortenwurzel; (ii) die LV-Kammer befindet sich in der Mitte des Blicks; iii) Die Achse von der Basis bis zur Spitze sollte parallel zu dem Wandler16 verlaufen.
    3. Drücken Sie den M-Modus 2x, um die Messlinie anzuzeigen. Positionieren Sie diese Linie auf Höhe des Papillarmuskels. Führen Sie anschließend Messungen für mindestens drei aufeinanderfolgende Herzschläge durch, um die Genauigkeit sicherzustellen. Tippen Sie auf Clip speichern , um den Cine-Loop in der Serie zu speichern.
    4. Identifizieren Sie die endsystolische Dimension als die Phase, die mit der EKG-T-Welle zusammenfiel, und bestimmen Sie die enddiastolische Dimension als die Phase, die der EKG-R-Welle entspricht.
    5. Neigen Sie das Bedienpad, so dass die obere linke Ecke am unteren und die untere rechte Ecke am höchsten ist. Stellen Sie die Sonde so ein, dass sie in Richtung der Herzspitze der Maus parallel zur Längsachse des Herzens eindringt, um eine transapikale Vier-Kammer-Ansicht zu erhalten.
    6. Wählen Sie nacheinander die Modi C (Farbdoppler) und PW (PW-Doppler), platzieren Sie das Probenvolumen am höchsten Geschwindigkeitspunkt, passen Sie die Probenahmerichtung an die Richtung des Blutflusses an und zeichnen Sie hämodynamische Informationen der Mitralklappe (E- und A-Welle) auf16. Tippen Sie auf Clip speichern, um den Cine-Loop in der Serie zu speichern.
  6. Stoppen Sie die Isofluran-Inhalation, damit die Mäuse wieder zu Bewusstsein kommen. Bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück, die in einer kontrollierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei 0 und 12 Wochen untergebracht sind. Nach der 24-wöchigen echokardiographischen Untersuchung werden die Mäuse durch Gebärmutterhalsdislokation nach Isofluran-Inhalation human eingeschläfert.
  7. Führen Sie die Analyse der Ejektionsfraktion (EF), der Fraktionsverkürzung (FS), der linksventrikulären Hinterwand (LVPW), des linksventrikulären Innendurchmessers (LVID), des interventrikulären Septums (IVS) und des E/A-Verhältnisses mit dem Workstation-Dongle durch.

5. Histologische Färbung

  1. Nach Abschluss der echokardiographischen Analyse nach 24 Wochen wird die Maus durch Rückenmarksluxation nach Isofluran-Inhalation eingeschläfert.
  2. Präparieren Sie die Maus mit einer Augenschere und einer Pinzette. Trennen Sie die Rippen vorsichtig, um eine vollständige Freilegung des Herzens zu gewährleisten.
  3. Perfundierten Sie das Herz durch die Spitze mit Kochsalzlösung, bis die Leber blass wird, was auf eine erfolgreiche Durchblutung hinweist. Entfernen Sie das Herz und spülen Sie es gründlich mit Kochsalzlösung aus, um eine vollständige Blutentnahme zu gewährleisten.
  4. Führen Sie die Paraffineinbettungdurch 17.
    1. Fixieren Sie das Herz mit 4% Formalin bei RT für mindestens 24 h.
    2. Stellen Sie die Dörrbox mit dem Herzen in einen Dörrautomaten, um einen allmählichen Dehydratisierungsprozess mit Gradientenalkohol und Wachsauslaugung bei 65 °C durchzuführen.
  5. Gewebeschnitte vorbereiten17.
    1. Legen Sie den zugeschnittenen Wachsblock mit den Papillarmuskeln zum Schneiden in ein Mikrotom mit einer Dicke von 4 μm und lagern Sie ihn zur pathologischen Färbung bei RT.
  6. Führen Sie die Färbung mit MassonsTrichrom-18 - und Weizenkeim-Agglutinin-Färbung (WGA)19 durch.

Ergebnisse

Diese Studie beinhaltete die zufällige Einteilung von Mäusen in zwei Gruppen: die ND-Gruppe und die HFD/STZ-Gruppe, mit 6 Mäusen in jeder Gruppe. Nach der abschließenden Echokardiographie und den OGTT-Tests 24 Wochen nach der Fütterung wurden die Mäuse euthanatisiert, um ihr Herzgewebe für eine histologische Beurteilung zu entnehmen.

HFD/STZ verursachte eine deutliche Körpergewichtszunahme, die nach 12 Wochen ihren Höhepunkt erreichte und im Vergleich zur ND-Gruppe signifikant höher war. Nach der Verabreichung von STZ wurde bei den Mäusen der HFD/STZ-Gruppe eine deutliche Abnahme des Körpergewichts beobachtet. Im Gegensatz dazu nahmen die Mäuse in der ND-Gruppe über den folgenden Zeitraum von 12 Wochen stetig an Körpergewicht zu (Abbildung 2A). Die zufälligen Blutzuckerspiegel der HFD/STZ-Gruppe waren während der gesamten Fütterungszeit immer signifikant höher als die der ND-Gruppe (Abbildung 2B). Die OGTT-Kurve der HFD/STZ-Gruppe war deutlich höher als die der ND-Gruppe. Es zeigte sich, dass der Blutzuckerspiegel in beiden Gruppen nach 15 Minuten erreichte und dann abnahm (Abbildung 2C,D). Im Verlauf der Studie waren die Seruminsulinspiegel in der ND-Gruppe in den ersten 12 Wochen zunächst höher als in der HFD-Gruppe. Nach der Verabreichung von STZ wurde jedoch ein umgekehrter Trend bei den Seruminsulinspiegeln beobachtet (Abbildung 2E, F).

Herzen, die einer HFD/STZ ausgesetzt waren, zeigten im Vergleich zur ND-Gruppe sowohl eine diastolische als auch eine systolische Dysfunktion, die sich als schwache Amplitude des interventrikulären Septums (IVS) und der Pulsation der linksventrikulären hinteren Wand (LVPW) (Abbildung 3), verminderte Ejektionsfraktion (EF) und fraktionelle Verkürzung (FS) (Abbildung 4A,B), erhöhte enddiastolische linksventrikuläre interne Dimension (LVID), infrassierte IVS und LVPW (Abbildung 4C,D,E) zeigte. und verringertes E/A-Verhältnis (Abbildung 4F) in der HFD/STZ-Gruppe innerhalb von 24 Wochen.

Der kardiale Umbau, der auf Stoffwechselstörungen zurückzuführen ist, ist in Abbildung 5A,B dargestellt. Eine histologische Untersuchung ergab einen Anstieg der kardialen Fibrose und des Anteils der von Kardiomyozyten besetzten Fläche innerhalb der HFD/STZ-Gruppe im Vergleich zur ND-Gruppe (Abbildung 5C).

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Abbildung 2: Veränderung des Körpergewichts, des zufälligen Blutzuckers, des OGTT und des Seruminsulinspiegels während der Fütterungszeit. (A) Verschiebung des Körpergewichts von Mäusen während der Fütterungszeit. Die Gewichtskurve zeigte vor 12 Wochen ein ähnliches Aufwärtsmuster, wobei in der Gruppe eine steilere Steigung beobachtet wurde. Nach dem 12-wöchigen Zeitraum wurde in der HFD/STZ-Gruppe eine bemerkenswerte Gewichtsreduktion beobachtet, während die ND-Gruppe ihren Aufwärtstrend bei der Gewichtszunahme beibehielt. (B) Zufällige Blutzuckerspiegel änderten sich während der Fütterungszeit. Der Blutzuckerspiegel blieb in der ND-Gruppe stabil, während er in der HFD/STZ-Gruppe weiter anstieg, mit einem deutlichen Anstieg nach 12 Wochen. (C) und (D) Blutzuckerspiegel während der OGTT bei 12- und 24-wöchiger Fütterung. (E,F) Seruminsulinspiegel nach 12 Wochen und 24 Wochen für die ND- und HFD/STZ-Gruppe. Nach 12-wöchigen Experimenten zeigte der Insulinspiegel in der HFD/STZ-Gruppe einen bemerkenswerten Anstieg im Vergleich zur ND-Gruppe. Nach 24 Wochen kehrte sich dieser Trend jedoch um, wobei der Insulinspiegel in der HFD/STZ-Gruppe deutlich niedriger war als in der ND-Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die P-Werte wurden durch ungepaarten t-Test berechnet. **: P < 0,01, ***: P < 0,001, ****: P < 0,0001; ND (n = 6) vs. HFD/STZ (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentative M-Mode-Echokardiographie und E/A-Welle der Mitralklappe nach 0, 12 und 24 Wochen. Es gab Unterschiede in der Höhe der E- und A-Peaks zwischen den beiden Gruppen, wobei der E-Peak > der A-Peak nach 0 Wochen und der E-Peak in der HFD/STZ-Gruppe nach 24 Wochen fast gleich dem A-Peak war. Der M-Mode-Farbdoppler-Ultraschall zeigte, dass die Amplitude der IVS- und LVPW-Pulsation in der HFD/STZ-Gruppe nach 12 und 24 Wochen schwächer war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Quantitative Ergebnisse der kardialen Struktur und Funktion. (A) Ejektionsfraktionen (EF); (B) Bruchteils-Leerverkäufe (FS); (C) Linksventrikulärer enddiastolischer Innendurchmesser (LVID, d); (D) Interventrikuläres enddiastolisches Septum (IVS, d); (E) Linksventrikuläre enddiastolische Hinterwand (LVPW, d); (F) E/A-Verhältnis. Nach 12 Wochen zeigte die HFD/STZ-Gruppe eine diastolische Dysfunktion, die sich in einem erhöhten LBID- und E/A-Verhältnis und einer normalen EF manifestierte. Nach 24 Wochen nahmen sowohl die systolischen als auch die diastolischen Funktionen ab, was zu einer Verdickung von LVPW und IVS, einer signifikanten Abnahme von EF und FS, einem weiteren Anstieg der LVID und einer weiteren Abnahme des E/A-Verhältnisses führte. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die P-Werte wurden durch ungepaarten t-Test berechnet. *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001, ****: P < 0,0001; ND (n = 6) vs. HFD/STZ (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Mäuse in der HFD/STZ-Gruppe führen nach 24 Wochen zu einem kardialen Remodeling. (A) Repräsentative WGA-Färbung von Herzgewebe in jeder Gruppe. (B) Repräsentative Masson-Färbung von Herzgewebe in jeder Gruppe. (C,D) Quantifizierte Querschnittsfläche und fibrotische Fläche des LV. Signifikant erhöhte Fibrose und kardiale Hypertrophie wurden in der HFD/STZ-Gruppe im Vergleich zur ND-Gruppe beobachtet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die P-Werte wurden durch ungepaarten t-Test berechnet. : P < 0,001, ****: P < 0,0001; ND (n=6) vs. HFD/STZ (n=6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Angesichts der weltweit weit verbreiteten Prävalenz von Diabetes mellitus und den damit verbundenen kardiovaskulären Komplikationen besteht ein dringender Bedarf, die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen aufzudecken und präventive und therapeutische Strategien für diese Erkrankung zu entwickeln20. Die Pathogenese von DbCM, einer der kardiovaskulären Komplikationen bei Patienten mit T2DM, ist nach wie vor unklar, da es keine wirksamen Ansätze zur Vorbeugung und Behandlung gibt21. Das Fehlen zuverlässiger präklinischer Modelle, die die pathophysiologischen Prozesse des menschlichen Herzens genau nachahmen, unterstreicht, wie wichtig es ist, ein stabiles und effektives Modell zu entwickeln, das speziell für die Untersuchung von DbCM-Mechanismen entwickelt wurde.

Das von uns vorgestellte Protokoll beschreibt eine etablierte und stabile Methode zur Generierung eines DbCM-Mausmodells, das als robustes Werkzeug zur Untersuchung der T2DM-assoziierten Myokarddysfunktion dient. Die HFD-Fütterung zur Induktion von Insulinresistenz wird allgemein als wirksamer Ansatz zur Modellierung vieler Komplikationen im Zusammenhang mit menschlichem Diabetes angesehen22. Bei dieser Methode wird HFD mit niedrig dosierten STZ-Injektionen kombiniert, einem Mittel, das eine Schädigung der Pankreasinseln induziert. Mit dieser Methode kann der Prozess der Insulinresistenz und der relativen Insulininsuffizienz besser simuliert werden.

Im Allgemeinen lassen sich präklinische Modelle von DbCM in zwei Kategorien einteilen: genetische und ernährungspharmakologisch induzierte Modelle. Die ob/ob-Maus 23,24, die db/db-Maus 25,26 und die zuckerdiabetischen Fettratten27 sind die drei am weitesten verbreiteten genetischen Modelle 28,29. Diese drei Nagetiermodelle entwickeln ein erhöhtes Körpergewicht, Hyperglykämie, eine gestörte Glukosehandhabung und eine Insulinresistenz aufgrund der Intervention des Leptin-Signalwegs oder seines Rezeptors. Leptin hat jedoch kardioprotektive Eigenschaften30, was die Interpretation der Ergebnisse aus diesen Modellen möglicherweise erschweren kann, da Veränderungen in der Leptin-Signalübertragung die Herzfunktion direkt beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mutationen im Leptinrezeptor selten die Ursache für T2DM beim Menschen31. Darüber hinaus sind genetische Modelle auch kostspielig und weisen erhebliche Unterschiede zum menschlichen Zustand auf32. Im Vergleich zu Ratten sind Mäuse leichter verfügbar, kostengünstiger und in Tierversuchen weit verbreitet. Einige Studien verwenden rein ernährungsbedingte Methoden, um das T2DM-Modell zu etablieren, wie z. B. HFD und/oder Zucker (hohe Saccharose oder hohe Fruktose), die Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Diabetes verursachen können 33,34,35,36. Der Schweregrad von Hyperglykämie und Insulinresistenz ist jedoch im Vergleich zu genetischen Modellen wie den ob/ob- oder db/db-Mäusen weniger ausgeprägt37.

Die Kombination von diätinduziertem mit diabetogenem Wirkstoff STZ wird für die medizinische Forschung als geeigneter angesehen als diätbasierte Modelle allein. Obwohl die allgemeinen Vorgehensweisen des HFD/STZ DbCM-Modells in mehreren Studien beschrieben wurden, haben wir einige Verbesserungen vorgenommen. Obwohl T2DM bei den Diabetesfällen beim Menschen vorherrscht, stellt die Erstellung eines Tiermodells dafür im Vergleich zu T1DM größere Herausforderungen dar. Der entscheidende Faktor liegt in der Dosierung und Häufigkeit der STZ-Injektionen, die die Etablierung des Modells maßgeblich beeinflussen. Zu hohe STZ-Dosen führen zu einem Modell, das T1DM sehr ähnlich ist, und führen zu höheren Mortalitätsraten.

Frühere Studien zeigten, dass die Verabreichung mehrerer niedrig dosierter Injektionen von STZ in einer Dosierung von 50 mg/kg die Modelle T2DM 31,38,39 verbesserte. Diese Studien haben jedoch oft eine relativ kurze HFD-Fütterungsdauer, die von 3 Wochen bei unterschiedlichem Fettgehalt reicht. Eine Studie von Ahlke Heydemann40 zeigte, dass eine längere HFD-Fütterung zu einer übermäßigen Lipidspeicherung führt, was zu Lipidtoxizität, Fettleibigkeit, verminderter metabolischer Flexibilität, oxidativem Stress und chronischen Entzündungszuständen führt, die denen im DbCM-Herzgewebe ähneln. In dieser Studie verlängerten wir die HFD-Fütterungsperiode auf 24 Wochen und verwendeten eine niedrigere STZ-Konzentration (30 mg/kg), um die DbCM-Pathologie nachzuahmen. Als Modelltier wurden C57BL/6J-Mäuse verwendet, die ein Gen tragen, das sie für T2DM prädisponiert.41,42. Unsere Beobachtungen zeigten, dass die Mäuse in der HFD/STZ-Gruppe nach 12 Wochen begannen, an Gewicht zu verlieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Gewichtsverlust bei Diabetes ein komplexes Thema sein kann. Während Insulinmangel und Hyperglykämie zu Gewichtsverlust führen können, können auch andere Faktoren wie verminderter Appetit, Ernährungsumstellungen und erhöhte körperliche Aktivität eine Rolle spielen. Darüber hinaus erleben nicht alle Diabetiker einen Gewichtsverlust. Bei einigen kann es sogar zu einer Gewichtszunahme kommen, insbesondere wenn sie eine Insulinresistenz haben und sich kalorienreich ernähren.

Diese Methode hat einige Einschränkungen. Erstens dauert die Entwicklung von DbCM relativ lange, insgesamt 24 Wochen. Darüber hinaus kann STZ eine Toxizität gegenüber Organen und Geweben jenseits der Pankreasinseln aufweisen, wodurch das HFD/STZ-Modell bei der Replikation menschlicher Krankheiten weniger genau ist. Darüber hinaus hat Citratpuffer, der für STZ verwendet wird, einen pH-Wert von 4,5. Die intraperitoneale Verabreichung saurer Lösungen kann Tieren schaden, indem sie eine Hämolyse der roten Blutkörperchen sowie Schmerzen und Beschwerden43 verursacht, was die Anwendbarkeit des Modells einschränken kann. Schließlich sind die kardialen Manifestationen bei T2DM-Patienten vielfältig und werden oft von Bluthochdruck, koronarer Herzkrankheit und anderen Herz-Kreislauf-Erkrankungen begleitet, was die klinische Behandlung erschwert. Zu den kardialen Manifestationen gehören in diesem Modell LV-Dilatation und Hypertrophie sowie systolische und diastolische Dysfunktion, die jedoch nicht vollständig das Spektrum von DbCM repräsentieren, das in der klinischen Praxis beobachtet wird. DbCM umfasst auch Merkmale wie elektrophysiologische Veränderungen44 oder atriale Veränderungen45, wobei hier primär die LV-Struktur und die Pumpenfunktion im Vordergrund stehen.

In Übereinstimmung mit früheren Studien zielt die hier beschriebene Methode der Kombination von HFD-Fütterung mit STZ-Injektionen darauf ab, Diabetes schneller zu induzieren, indem das Pankreasgewebe teilweise zerstört und eine Insulinresistenz gegen das Modell-DbCM induziert wird. Vergrößerte Kardiomyozyten mit unorganisierter Anordnung, Myokardfaserruptur, Auflösung, verminderte EF, FS usw. weisen auf eine myokardiale Dysfunktion und eine verminderte Herzfunktion hin. Zusammenfassend haben wir einen Ansatz vorgestellt, wie DbCM kostengünstig und komfortabel etabliert werden kann. Unter Verwendung nicht-invasiver echokardiographischer Techniken und pathologischer Färbung untersuchten wir die Wirksamkeit dieser Methode.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummern: U23A20395, 81900258 und 82170375); das Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprojekt des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie der Provinz Sichuan (2022ZDZX0020); Projekt für klinische Forschung der Chinese Medical Association Cardiovascular Branch (CSC) (CSCF2020B04); 1· 3· 5 Projekt des West China Hospital, Sichuan University (ZYGD23021). Vielen Dank an Qing Yang (Animal Imaging Core Facilities, West China Hospital, Sichuan University) für ihre Hilfe bei der Ultraschalluntersuchung von Kleintieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ultrosound-System für TiereFujifilm Visual SonicsVEVO 3100Echokardiographie
BlutzuckermessgerätYuwellGU100Beurteilung des Blutzuckerspiegels
ZitronensäureSigma-Aldrich251275
IsofluranRWD Life ScienceR510-22Anästhesie
Isofluran-VerdampferRWD Life ScienceR500Anästhesie
Mausinsulin (INS) ELISA KitWuhan Feiyue Biotechnology Co., LtdFY-EM14029Bewerten Sie den Seruminsulinspiegel
Nair HaarentfernungscremeNair255gEntfernen Sie das Fell der Maus
Nagetierdiät mit 60% kcal FettResearch Diets IncD12492Fettreiche Diät Fütterung
NatriumcitratSigma-AldrichS4641
SterilfilterMerck MilliporeSLHV033N
StreptozocinSolarbioS8050
UltraschallgelKepplerKL-250Echokardiographie-Workstation
DongleFujifilm Visual SonicsVevo LABEchokardiographische Datenanalyse

Referenzen

  1. Defronzo, R. A., et al. Type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Dis Primers. 1, 15019(2015).
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