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Methodenartikel

Optimierte und vereinfachte Technik für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberscheiben

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DOI:

10.3791/67202

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22. November 2024

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1Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, 3National Institute of Health Research Great Ormond Street Biomedical Research Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Herstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberschnitten (PCLS) für die Untersuchung von Mauslebern. Der Artikel konzentriert sich auf Schlüsselaspekte des Protokolls, das nur eine Standard-Laborausrüstung mit Zugang zu einem Vibratom erfordert und ein Überleben von PCLS für mindestens 4 Tage ermöglicht.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein einfaches System für die Erstellung und Kultivierung von präzisionsgeschnittenen Leberschnitten (PCLS) dar. PCLS enthält alle Zellen in einer intakten Umgebung und ähnelt daher einem Mini-Modell des gesamten Organs. Sie ermöglichen die Untersuchung von lebenden Geweben und replizieren gleichzeitig deren komplexe Phänotypen. Dieses Protokoll ermöglicht die Präparation von Schnitten aus Mauslebern mit einem Vibratom und Standard-Laborgeräten. Die Protokolle für die Produktion und Kultivierung von PCLS sind nicht standardisiert und können je nach dem interessierenden Gewebe, der Art des verwendeten Vibratoms und dem Sauerstoffbedarf drastisch variieren. Diese können in einigen Laboratorien, die nur Zugang zu einem einfachen Vibratom und gemeinsamen Gewebekultureinrichtungen haben, schwierig zu reproduzieren sein. Wir haben ein Protokoll zusammengestellt, das sich auf die Bedeutung einiger wichtiger Schritte innerhalb der verschiedenen Protokolle konzentriert, die bereits verfügbar sind. Dieses Protokoll betont daher die Bedeutung der Einbettungsmethode, der Schnittausrichtung, eines dynamischen und eines statischen Systems und die Bedeutung eines minimalen Kulturvolumens. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors, die Zugang zu einem einfachen Tissue Slicer haben, auf einfache Weise erstellt und reproduziert werden. Zusammengenommen und unter Befolgung dieses Protokolls kann PCLS mindestens 4 Tage am Leben bleiben. PCLS ist ein einfaches, wirtschaftliches und reproduzierbares Modell zur Untersuchung des pathophysiologischen und therapeutischen Screenings für Organe wie die Leber.

Einleitung

Precision-Cut Tissue Slices (PCTS) sind dünne Schnitte von Organen. Sie ermöglichen die Erhaltung der Architektur des Organs, das ein Mini-Organ repliziert, während der 3-dimensionale Aspekt der Nachbarzellen und der extrazellulären Matrix erhalten bleibt. Es ist ein attraktives Modell aufgrund seines einfachen Zugangs, seiner Kostenersparnis und seiner weniger arbeitsintensiven Eigenschaften bei gleichzeitiger Beibehaltung der Gewebearchitektur.

PCTS schließen eine Lücke zwischen In-vitro-Zellstudien und In-vivo-Tierversuchen und überwinden die meisten Nachteile beider Modelle. PCTS wurde aus verschiedenen Organen generiert, wie z.B. der Leber1, dem Darm 2,3, dem Dickdarm2, dem Gehirn 4,5, der Lunge 6,7,8, der Niere 9,10, der Milz11,12, dem Herzen13,14, aber auch aus Tumoren15,16. Sie können auch von verschiedenen Tieren stammen, wie z.B. Maus1, Ratte17,18, aber auch Schwein19 und menschlichen chirurgischen Abfällen 15,20,21. Obwohl PCTS die Verwendung von Tieren erfordern, was ethische Fragen aufwirft, kann das Organ eines Tieres mehrere PCTS erzeugen, wodurch die Anzahl der Tiere in Übereinstimmung mit den NC3R-Richtlinien (Reduction, Replacement, Refinement)22 reduziert und gleichzeitig interindividuelle Variationen begrenzt werden.

Die Entwicklung verbesserter Tissue-Slicer, z. B. Vibratome23, hat einen Übergang von manuell geschnittenen Scheiben, die durch heterogene Dicke und schlechte Überlebensrate gekennzeichnet sind, zu reproduzierbaren dünneren Scheiben mit besserer Erhaltung der strukturellen Integrität ermöglicht.

Die Protokolle für die Vorbereitung und Kultur von PCTS und insbesondere für die Herstellung und Kultur von Precision-cut Liver Slices (PCLS) variieren jedoch in der Literatur erheblich und sind nicht standardisiert, insbesondere für wesentliche Parameter wie Schneideausrüstung, Mediumgehalt und Kulturbedingungen. Die Protokolle können auch je nach Herkunftsgewebe spürbar variieren. Einige der Protokolle erfordern eine Sauerstoffanreicherung des Puffers oder der Kultur mit einigen komplizierten Bioreaktorsystemen24. Sie konzentrieren sich in der Regel individuell auf unterschiedliche technische Aspekte oder sind für unterschiedliche Gewebe konzipiert und können in einem durchschnittlichen Labor oft kostspielig und schwieriger kosteneffizient zu reproduzieren sein.

Hier fasst dieses Protokoll einige Schlüsselpunkte zusammen, wie z. B. die Einbettungsmethode, die Schnittrichtung, die Verwendung von Transwells25, ein dynamisches Kultursystem26 und die Bedeutung eines minimalen Kulturvolumens. Einige dieser Schritte wurden zuvor unabhängig voneinander oder in einem anderen Kontext optimiert, wie z.B. die Fibrose27 oder das Tumoransprechen28. Dieses Protokoll betont auch die Bedeutung des Einbettens mit bestimmten Arten von Slicern und die Ausrichtung des Schneidens, beides schwer zu beherrschende Parameter, die in der Literatur oft vernachlässigt werden. Diese einfache Methode erzeugt PCLS, das mindestens 4 Tage lang in Kultur gehalten wird, mit einer einfachen Einrichtung und unter Verwendung von Standard-Laborgeräten mit Zugang zu einem rudimentären Gewebeschneider.

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Protokoll

Wildtyp-CD57Bl/6J-Mäuse wurden von Charles River Laboratories gekauft. Die Mäuse hatten freien Zugang zu Futter und Wasser und wurden in individuell belüfteten Käfigen mit kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen und einem 12-stündigen Lichtzyklus untergebracht. Tiere im Alter von 3 Wochen wurden getötet und die Lebern wurden sofort ohne Durchblutung entnommen. Alle Tierarbeiten wurden nach einer lokalen ethischen Überprüfung durch das Animal Welfare and Ethical Review Board des University College London genehmigt und unter der Projektlizenz des Innenministeriums PP9223137 und in Übereinstimmung mit dem Home Office (Animals) Scientific Procedures Act (1986) und den ANARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um den Schaden für Tiere in Übereinstimmung mit der üblichen Praxis in der Abteilung für biologische Dienste am University College London zu begrenzen.

1. Einrichten des Experiments

  1. Führen Sie am Tag vor der Ernte die folgenden Schritte durch.
    1. Bereiten Sie 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KREBS) vor, indem Sie eine Durchstechflasche Krebspulver in 1 l sterilem Wasser auflösen. Kühle es auf 4 °C ab und bewahre es auf nassem Eis auf.
    2. Desinfizieren Sie das Tablett mit 70% Ethanol und spülen Sie es mit sterilem PBS ab. Bewahren Sie das Tablett in Alufolie eingewickelt über Nacht im Kühlschrank auf, um beim Schneiden eine kalte Umgebung zu erhalten.
    3. Alle anderen abnehmbaren Teile mit Ethanol besprühen, mit sterilem PBS abspülen, trocknen lassen und steril halten. Autoklavieren Sie die Klingen und halten Sie sie bis zur Verwendung steril.
    4. Bereiten Sie 4% w/v niedrigschmelzende Agarose in sterilem Wasser zu. Sobald die Agarose wieder aufgehängt und geschmolzen ist, lagern Sie sie im Kühlschrank bei 4 °C.
  2. Führen Sie am Tag der Ernte und vor der Ernte der Leber die folgenden Schritte durch.
    1. Die 4% niedrigschmelzende Agarose schmelzen und bis zur Verwendung in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahren. Stellen Sie sicher, dass die Agarose auf 37 °C abgekühlt ist und dass sich alle Blasen vor der Verwendung aufgelöst haben.
    2. Bereiten Sie die Kulturplatten vor, indem Sie jeweils 2,6 mL, 1,5 mL und 0,7 mL pro Vertiefung in 6-, 12- und 24-Well-Platten geben. Geben Sie 8 μm poröse Einsätze in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platten in einen befeuchteten Inkubator, der auf 37 °C, 5 % CO2 und 21 % O2 eingestellt ist. Dies hilft dabei, den pH-Wert beim Erwärmen des Mediums anzupassen, so dass es für die Kultur bereit ist.
    3. Kulturieren Sie die Scheiben mit porösen 8-μm-Einsätzen, um den Zugang zu beiden Seiten der Scheibe zu ermöglichen. Bereiten Sie das Medium wie folgt vor: Fügen Sie dem William's Medium E (WME) 2 mM L-Glutamin-Supplement, 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, 10 μg/ml Gentamycin, 25 mM D-Glucose-Lösung und 15 mM HEPES-Lösung hinzu.

2. Entnahme der Leber und Zubereitung (15 min)

  1. Sterilisieren Sie alle Instrumente vor der Ernte.
  2. Betäuben Sie die Maus nach lokalen Verfahren für die Pflege von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken mit einer Isofluran-Maske. Bevor Sie die Bauchhöhle öffnen, kneifen Sie zwischen den Zehen zusammen, um sicherzustellen, dass das Tier richtig betäubt ist. Wenn die Leber schnell entfernt werden kann, kann die Maus durch CO2 -Erstickung oder Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert werden. Da es sich um einen tödlichen Eingriff handelt, verwenden Sie keine Augensalbe, da dies das Tier nicht beeinträchtigen würde.
  3. Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Optional: Rasieren Sie die Maus, um eine Kontamination mit den Haaren zu vermeiden.
  4. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer sterilen Pinzette und einer Schere, indem Sie die Haut und das Bauchfell von der Bauchmitte aus durchschneiden. Präparieren Sie die Leber vorsichtig von anderen Organen oder Gefäßen und vermeiden Sie eine Beschädigung der Lappen.
  5. Lagern Sie die ganze Leber sofort in eiskaltem Krebs Puffer. Führen Sie alle weiteren Schritte auf dem Eis bei 4 °C durch und fahren Sie so schnell wie möglich mit der Lebervorbereitung fort, um einen weiteren Zelltod zu verhindern.

3. Einbettung der Leberlappen (25 min für jeden Leberlappen)

  1. Übertragen Sie die Leber in eine Petrischale auf Eis mit eiskaltem Krebspuffer und stellen Sie sicher, dass die gesamte Leber vollständig untergetaucht ist.
  2. Trennen Sie jeden Lappen einzeln mit einer stumpfen Pinzette und einem scharfen, sterilen Messer, um eine Beschädigung der Lappen zu vermeiden.
  3. Wählen Sie den ersten Lappen zum Schneiden und bewahren Sie die restlichen Lappen in einem eiskalten Krebspuffer auf, bis sie zum Einbetten und Schneiden bereit sind.
  4. Schneiden Sie alle Kanten ab, um einen handlicheren Lappen mit geraden Kanten zu erhalten, die zum Einbetten bereit sind. Dies wird auch dazu beitragen, einen Teil der fibrösen Glisson-Kapsel zu entfernen, um das Schneiden weiter zu erleichtern. Halten Sie dazu die Leberoberflächen in einem eiskalten Krebspuffer feucht.
  5. Stellen Sie eine 3 cm große Petrischale (o.ä.) auf nasses Eis und gießen Sie die 4%ige niedrigschmelzende Agarose (bereits im 37 °C warmen Wasserbad) hinein. Gut auf Eis lagern, damit die Agarose nach oben abkühlen kann und gleichzeitig verhindert wird, dass der Lappen auf den Boden sinkt und gleichmäßig eingebettet wird.
  6. Lassen Sie die Agarose 30 s weiter abkühlen und legen Sie den abgeschnittenen Lappen hinein. Der Lappen setzt sich in der Mitte des Agaroseblocks ab. Der Einbettungsprozess erfordert Übung und Optimierung, um jeder Laborbedingung und persönlichen Erfahrung gerecht zu werden.
  7. Legen Sie den eingebetteten Lappen, noch auf Eis, für 5 min in den Kühlschrank. Die Agarose sollte dann klar ausgehärtet sein.
  8. Den Agaroseblock außen abschneiden. Den Agaroseblock aus der Schale lösen.
  9. Schneiden Sie die Agarose in eine handlichere Größe und stellen Sie sicher, dass die Oberseite und die Seite, die mit der Vibratogramm-Plattform verklebt ist, parallel zur Oberkante des Lappens sind.
  10. Beginnen Sie so schnell wie möglich mit dem Schneiden, aber stellen Sie sicher, dass der Agaroseblock in einem eiskalten Krebspuffer und auf Eis aufbewahrt wird.

4. Herstellung von Leberschnitten (40 min pro Lappen)

  1. Stellen Sie das Vibratom zum Schneiden auf eine Dicke von 250 μm mit einer Geschwindigkeit von 5 und einer Frequenz von 7 Hz ein. Dies sind Leitparameter; Abhängig von der Art des verwendeten Vibratoms kann dies eine Optimierung erfordern.
  2. Besprühen Sie das Vibratom und den Laborbereich vor dem Schneiden mit 70 % Ethanol, um die Umgebung so steril wie möglich zu halten.
  3. Stellen Sie das Tablett auf das Vibratom und gießen Sie Eis darum. Platzieren Sie die Klingen in einem Winkel von 10° nach unten und unten horizontal auf das Vibratom.
  4. Füllen Sie den Vibratome-Tank mit eiskaltem Krebs-Puffer. Lege eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Plattform.
  5. Trocknen Sie die Kante des Agaroseblocks, der auf die Plattform geklebt wird, mit einem sterilen saugfähigen Tuch.
  6. Legen Sie den Agaroseblock auf die abnehmbare Plattform. Positionieren Sie den Keulen aufrecht, damit er quer geschnitten werden kann. Obwohl die Größe der Scheiben reduziert wird, wird der Schneidprozess drastisch erleichtert, da der Druck auf den Keulen während des Schneidens begrenzt wird.
  7. Warten Sie 1 Minute, bis der Kleber ausgehärtet ist, tauchen Sie die abnehmbare Plattform in den Tank und stellen Sie sicher, dass der Agaroseblock vollständig mit Krebspuffer bedeckt ist.
  8. Programmieren Sie das Vibratom für das Schneiden, indem Sie die Start- und Stopppositionen einstellen. Beginnen Sie mit dem Schneiden dickerer Scheiben, bis der Leberlappen erreicht ist.
  9. Entsorgen Sie die erste Scheibe, da sie möglicherweise nicht auf die richtige Dicke zugeschnitten ist. Um eine Beschädigung der Scheiben zu vermeiden, verwenden Sie einen Spatel, um die Leberscheiben anstelle einer Pinzette oder Bürste zu sammeln.
    HINWEIS: Eine kleine Bürste, die mit 70% Ethanol desinfiziert und mit sterilem PBS gespült wurde, kann auch verwendet werden, um das Gewebe während des Schneidvorgangs sanft zu führen.
  10. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die erforderliche Anzahl von Scheiben erreicht ist. Der Lappen kann sich gelegentlich von der Agarose lösen und so eine weitere Verwendung verhindern. Sammeln Sie die Scheiben in eiskaltem Krebspuffer, bis sie kultiviert werden.

5. Inkubation von Leberscheiben

  1. Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel in die vorbereiteten Vertiefungen, die das Medium und die Einsätze enthalten.
  2. Stellen Sie die Platten auf einen Orbitalschüttler, stellen Sie die Drehzahl auf 130 U/min ein und inkubieren Sie mit einem herkömmlichen Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO2 und 21 % O2 bei 37 °C. Das endgültige Kulturvolumen beträgt 2,6 ml, 1,5 mL und 0,7 mL pro Well in 6-, 12- bzw. 24-Well-Platten.
  3. Stellen Sie eine leere Platte unter die Kulturplatte, die die Scheiben in Kultur enthält, damit überschüssige Wärme, die von der Plattform des Schüttlers ausgeht, abgeführt werden kann. Wechseln Sie das Medium alle 48 h.

6. Überlebenstest für Zellen

  1. Die Scheiben werden in eine 48-Well-Platte mit 400 μl vorgewärmtem Williams' Medium E überführt und 80 μl MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)-Tetrazolium-Reagenz hinzugefügt.
  2. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37 °C werden 5 % CO2 auf einen Schüttler gegeben, 200 μl des Mediums in eine 96-Well-Platte überführt und die Absorption bei 490 nm mit einem Multiwell-Plattenleser gemessen. Verwenden Sie die Scheiben, die in PBS und 24 Stunden lang bei Raumtemperatur auf der Bank belassen wurden, als Negativkontrollen.

7. Histologische Färbung

  1. Entparaffinisieren und rehydrieren Sie die Schnitte mit Xylol und Ethanol, gefolgt von entionisiertem Wasser. Färben Sie die Schnitte 3 Minuten lang mit Hämatoxylinlösung.
  2. 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülen. Tauchen Sie schnell 10x in saures Ethanol (1 mL konzentriertes HCL und 400 mL 70% Ethanol).
  3. 2x in entionisiertes Wasser spülen und überschüssiges Wasser abtupfen. Tauchen Sie die Abschnitte 30 s lang in Eosin.
  4. Dörren Sie zu 95 % Ethanol, dann zu 100 % Ethanol für 5 Minuten, jeweils 3x. Tauchen Sie die Schnitte 3x für jeweils 15 min in Xylol. Platzieren Sie Deckgläser auf Objektträgern.

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Ergebnisse

Bei der Entnahme wird bewusst auf die Durchblutung des Tieres verzichtet, um eine schnelle Verarbeitung des Organs zu gewährleisten und Organschäden zu vermeiden. Die Leber wird schnell nach der Inzision extrahiert und sofort in einen eiskalten Organschutzpuffer, z. B. Krebspuffer24,29, gelegt. Obwohl das Schneiden von frischem Lebergewebe ohne Einbettung bereits zuvor beschrieben wurde1, ermöglicht die Einbettung der Leber in niedrigschme...

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Diskussion

Wir zeigen, dass die Produktion und Kultivierung von PCLS leicht zu erreichen ist und gleichzeitig eine Halbwertszeit von mindestens 4 Tagen gewährleistet ist. Dieses Protokoll rekapituliert fünf kritische Schritte: die Einbettungsmethode, wenn diese Art von Vibratom verwendet wird, die Ausrichtung des Schnitts, ein dynamisches Kultursystem, ein minimales Kulturvolumen und die Verwendung von Einsätzen.

Protokolle für die Herstellung und Kultivierung von PCLS s...

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Offenlegungen

Es besteht kein konkurrierendes Interesse, das offengelegt werden muss.

Danksagungen

Die Autoren danken Mirabela Bandol, Samantha Richards, Louise Fisher, Rebecca Towns und den Mitarbeitern von UCL Biological Services für ihre Hilfe bei der Zucht und Pflege der Tierkolonien. Diese Arbeit wurde durch Mittel des United Kingdom Medical Research Council Clinician Scientist Fellowship MR/T008024/1 (JB) und des NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (JB) unterstützt. Die geäußerten Ansichten sind die des Autors/der Autoren und nicht unbedingt die des NHS oder des NIHR.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3 cm PetrischaleBeliebigGeeignet für Zellkultur
6, 12, 24 Wells KulturplatteBeliebigGeeignet für Zellkultur
Cyanacrylat SekundenkleberBeliebig
D-GlucoseGibcoA24940
EosinMerckHT110316
EthanolBeliebig
Fötales RinderserumThermoFisher26400044
Gentamycin Gibco15750060
HämatoxylinMerck51275
HEPESGibcoH0887
Einsätze 8um, für 12 Well PlattenStrastedt83.3931.800
Einsätze 8um, für 24 Well PlattenStrastedt83.3932.800
Einsätze 8um, für 6 Well PlattenStrastedt83.3930.800
KREBSMerckK3753
Laminar-Flow-HaubeHepa-Luftfiltration
Niedrigschmelzende Agarose ThermoFisher16520050
MTS Tetrazolium-Reagenz Abcamab197010
Multi-Well-Plattenlesegerät Alle
PBS TablettenThermoFisherP4417
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
SkalpellklingeAlle
miteiner flachen quadratischen Spitze 
Chirurgische SchereBeliebig
VibratomeLeicaVT1000 S William
' s Medium E mit GlutaMAX (WME)ThermoFisherW4125
Chirurgische Zange Alle

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