Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Summary

Das Drosophila-Augensystem ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen. Die manuelle Quantifizierung von Phänotypen des rauen Auges kann jedoch verzerrt und unzuverlässig sein. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der Ilastik und Flynotyper verwendet werden, um den Augenphänotyp unvoreingenommen zu quantifizieren.

Abstract

Das Facettenauge Drosophila melanogaster ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von etwa 800 Ommatidien, das ein symmetrisches und hexagonales Muster aufweist. Diese Regelmäßigkeit und einfache Beobachtung machen das Drosophila-Augensystem zu einem leistungsfähigen Werkzeug zur Modellierung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen des Menschen. Methoden zur Quantifizierung abnormaler Phänotypen, wie z. B. die manuelle Einstufung von Augenschweregraden, haben jedoch Grenzen, insbesondere bei der Einstufung schwacher Veränderungen in der Augenmorphologie. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie Flynotyper entwickelt. Die Verwendung eines Ringlichts ermöglicht qualitativ bessere Bilder, die auf die Unversehrtheit der einzelnen Ommatidien zugreifen. Diese Bilder können jedoch nicht direkt von Flynotyper analysiert werden, da das Ringlicht Schatten auf Ommatidien wirft. Hier beschreiben wir eine unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung von rauen Augenphänotypen, die in Drosophila-Krankheitsmodellen beobachtet wurden, durch die Kombination von zwei Softwares, ilastik und Flynotyper. Durch die Vorverarbeitung der Bilder mit Ilastik kann eine erfolgreiche Quantifizierung des rauen Augenphänotyps mit Flynotyper erreicht werden.

Introduction

Das Genom von Drosophila melanogaster enthält ~75% der menschlichen krankheitsbezogenen Gen-Orthologe. Darüber hinaus werden während der Entwicklung des Drosophila-Auges etwa zwei Drittel der Gene im Genom exprimiert, was das Drosophila-Auge zu einem hervorragenden genetischen System macht, um verschiedene molekulare und zelluläre Funktionen, Entwicklungs- und Krankheitsmodelle zu untersuchen ^1,2. Somit ist das Drosophila-Augensystem ein nützliches experimentelles Werkzeug, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen.

Das Drosophila-Facettenauge ist ein gut strukturiertes und umfassendes Array von ~800 Ommatidien, die ein symmetrisches und sechseckiges Muster aufweisen³. Die Regelmäßigkeit dieses hexagonalen Musters kann verwendet werden, um den Effekt der Einführung von Mutationen und Veränderungen der Genexpression in der Augenmorphologie abzuschätzen⁴. Frühere Studien, die eine Bewertung der Augenmorphologie erfordern, haben sich stark auf eine manuelle Einstufung des Schweregrads von Augenphänotypen verlassen, die mit bloßem Auge erkannt wurden. Um die Augenphänotypen zu ordnen, werden externe Bilder der Augenmorphologie mit einem Stereomikroskop aufgenommen ^5,6. Der Augenphänotyp jeder Gruppe wird beurteilt, indem das äußere Auge in vier Bereiche aufgeteilt und der Anteil der Degeneration in jedem Bereich berechnet^{wird 5,6}. Dann werden die Werte verwendet, um Durchschnittswerte zu berechnen, die mit den Werten verglichen werden, die aus Kontrollfliegen⁷ erhalten wurden. Die Bewertung basiert auf dem Ausmaß der Fusion, dem Verlust von Ommatidien und der Borstenorganisation ^7,8. Mit einem Stereomikroskop aufgenommene Fliegenaugenfotos werden von einem Forscher aufgenommen, und die Augenphänotypanalyse wird von einem anderen Forscher mit dreifachen Validierungssätzen ^7,8 durchgeführt.

Wenn es darum geht, schwache Veränderungen in der Augenmorphologie mit bloßem Auge zu bewerten, gibt es Einschränkungen⁴. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden computergestützte Ansätze wie FLEYE und Flynotyper entwickelt ^1,9. Flynotyper ist eine neuartige Berechnungsmethode zur quantitativen Abschätzung morphologischer Veränderungen im Drosophila-Augensystem¹. Es erkennt automatisch das Drosophila-Auge und das einzelne Ommatidium und berechnet phänotypische Scores (P-Scores) basierend auf der Unregelmäßigkeit desAuges¹. Ein höherer P-Score deutet darauf hin, dass das Fliegenauge stärker degeneriert ist. Diese Software wurde erfolgreich bei der Quantifizierung der Anomalie von Drosophila-Augen eingesetzt¹⁰. Obwohl Flynotyper einen automatisierten Prozess gewährleistet, kann er immer noch nicht erfolgreich auf einige Augenbilder angewendet werden, die mit verschiedenen lichtmikroskopischen Methoden aufgenommen wurden.

Qualitativ bevorzugen wir eine Ringlichtquelle im Vergleich zu einer Einzelpunkt-Lichtquelle, da sie eine genauere Darstellung jedes Ommatidiums bietet. Wenn jedoch das Ringlicht verwendet wird, erzeugt es aufgrund der halbkugelförmigen Form des Ommatidiums einen ringförmigen Schatten an der Spitze jedes Ommatidiums. Dieser ringförmige Schatten verhindert die genaue Erkennung von Ommatiden durch Flynotyper, was zu einer falschen Berechnung der P-Scores führt.

Um diese Probleme zu lösen, haben wir ilastik implementiert, ein auf maschinellem Lernen basierendes Tool für verschiedene Analysen, um Ommatidien in Fliegenaugenbildern zu klassifizieren¹¹. Die von Ilastik generierten Bilder speisten wir dann in Flynotyper ein, um die P-Scores zu berechnen. Dies ermöglicht es uns, die morphologischen Defekte des Drosophila-Auges unvoreingenommen zu quantifizieren¹.

Protocol

1. Vorbereitung der Quantifizierung

1. Laden Sie ilastik¹¹, ImageJ und das ImageJ-Plugin Flynotyper¹ herunter und installieren Sie es. In der Materialtabelle finden Sie Links zur Installation auf der Website. Laden Sie die entsprechenden Pakete entsprechend dem Betriebssystem des Computers (Mac, Windows, Linux usw.) herunter. Befolgen Sie die Installationsanweisungen genau wie angegeben.
   HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, die Anweisungen genau so zu befolgen, wie sie in den bereitgestellten Links angegeben sind. Der verwendete Computer benötigt ein 64-Bit-Betriebssystem; Andernfalls gibt es keine weiteren erforderlichen Spezifikationen. In der Materialtabelle finden Sie die Computerspezifikationen des Systems, das für dieses Protokoll verwendet wird.
2. Verwenden Sie ein Standardbild, um das Machine Learning-Modell zu trainieren. Nehmen Sie ein Bild eines gesunden Fliegenauges mit einem Lichtmikroskop mit einem Ringlicht (z. B. w1118 x GMR-GAL4) auf, wobei Sie die Mitte des Auges als Brennpunkt verwenden. Analysieren Sie Männchen und Weibchen getrennt; Erfassen Sie daher ein Standardbild für Männer und für Frauen.
   HINWEIS: Die Einstellungen variieren je nach Mikroskop und Kamera stark. Im zweiten Absatz der Diskussion finden Sie allgemeinere Informationen zur Fliegenvorbereitung und Bildaufnahme.
3. Nehmen Sie Bilder der experimentellen Fliegenaugen mit den gleichen Einstellungen auf, die für die Standard-Bildaufnahme verwendet werden.
   HINWEIS: Eine gute Orientierung ist für eine genaue Quantifizierung von größter Bedeutung. Abbildung 4 ist ein Beispiel für die richtige Orientierung.

2. Verwendung von Ilastik zum Nachweis von Ommatidien aus Fliegenaugenbildern

1. Bevor Sie mit der Analyse beginnen, stellen Sie sicher, dass sich alle experimentellen Gruppen, unabhängig von den experimentellen Bedingungen, im selben Dateiordner befinden, um die folgenden Prozesse zu vereinfachen. Stellen Sie sicher, dass die Dateien richtig benannt sind, um experimentelle Gruppen zu identifizieren und zwischen Männchen und Weibchen zu unterscheiden.
   HINWEIS: Wir empfehlen, das Protokoll auszudrucken und die Zahlen mit dem Computer zu vergrößern, da dieses Protokoll visuell am einfachsten zu befolgen ist.
2. Öffnen Sie die Software.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, während der Ausführung der Software keine anderen Anwendungen geöffnet zu haben. Andernfalls kann der Computer sehr langsam laufen, insbesondere in älteren oder weniger robusten Systemen.
3. Klicken Sie auf Neues Projekt erstellen | Andere Workflows, wählen Sie Cell Density Counting (Zählung der Zellendichte) aus, und wählen Sie einen Speicherort für die Projektdatei aus (Abbildung 1A).
4. Klicken Sie auf 1. Eingabedaten | Neu hinzufügen | Fügen Sie separate Bilder hinzu. Wählen Sie das Standardbild aus (Abbildung 1B).
5. Klicken Sie auf 2. Feature-Auswahl und Auswahl der zu verwendenden Features. Wählen Sie die in Abbildung 1C gezeigten Funktionen aus. Wählen Sie mehr Sigma-Werte, um die Empfindlichkeit zu erhöhen (z. B. 10, 15, 20 usw.).
   HINWEIS: Wenn zu viele Kontrollkästchen aktiviert sind, kann das Programm lange laufen.
6. Klicken Sie auf 3. Zählen und setzen Sie den Sigma-Wert für den Vordergrund auf 5,00. Markieren Sie 50 oder mehr einzelne Ommatidien mit dem Vordergrundwerkzeug auf dem Standardbild.
   HINWEIS: Fünfzig Markierungen sind in der Regel für die Analyse ausreichend. Je mehr Ommatidien jedoch markiert sind, desto genauer sind die Ergebnisse (Abbildung 1D).
7. Klicken Sie auf 3. Zählen und verwenden Sie das Hintergrundwerkzeug, um die Außenseite der Ommatidien zu markieren (Abbildung 1E). Zeichnen Sie grüne Linien in Gitterform um die Ommatidien.
   HINWEIS: Ähnlich wie bei mehr Markierungen auf den Ommatidien gilt: Je mehr grüne Linien gezeichnet werden, desto genauer sind die Ergebnisse.
8. Klicken Sie auf 4. Dichte-Export | Wählen Sie Export Image Settings (Bildeinstellungen exportieren ), um die Bildeinstellungen festzulegen (Abbildung 1F). Klicken Sie auf Informationen zur Ausgabedatei | Wählen Sie Format und tif für die weitere Analyse in Flynotyper.
9. Klicken Sie auf 5. Stapelverarbeitung | Wählen Sie Rohdatendateien und dann alle experimentellen Fliegenfotos aus, die analysiert werden sollen (Abbildung 1G). Die Liste der importierten Bilder, die analysiert werden sollen, wird unter "Rohdatendateien auswählen" angezeigt (Abbildung 1H). Klicken Sie unten in der 5 Felder auf Alle Dateien verarbeiten. Abschnitt "Stapelverarbeitung".
   HINWEIS: Zur Erinnerung: Analysen für Männer und Frauen sollten getrennt durchgeführt werden. Je nach verwendetem Computer kann dieser Schritt 10 Minuten oder länger dauern, insbesondere wenn viele Bilder importiert werden.
10. Nachdem die Software fertig ist, überprüfen Sie denselben Dateiordner, der die experimentellen Fliegenaugenbilder enthält. Es werden schwarze Bilder mit dem Namen "YourSampleName_Probabilities" angezeigt (Abbildung 1I).

3. Mit ImageJ Fotos für Flynotyper vorbereiten

1. Öffnen Sie die von Ilastik generierte .tif-Datei (die schwarzen Kästchen) in ImageJ.
   HINWEIS: Jede von Ilastik generierte .tif Datei muss separat behandelt werden.
2. Verwenden Sie das Rechteckauswahl-Werkzeug , um ein Rechteck nur um das Auge zu erstellen. Nachdem das Rechteck gezeichnet wurde, schneiden Sie den Bereich zu, indem Sie entweder Strg + X oder Strg + C drücken (Abbildung 2A). Warten Sie, bis ein schwarzes Feld in Form des rechteckigen Umrisses angezeigt wird.
   HINWEIS: Das Betriebssystem des Computers bestimmt, ob "Strg + X" oder "Strg + C" verwendet werden soll. Normalerweise wird "Strg + X" für Windows und "Strg + C" für Mac verwendet.
3. Öffnen Sie das nun abgeschnittene Fliegenauge mit ImageJ; Klicken Sie auf Datei | Neu | Interne Zwischenablage (Abbildung 2B).
4. Speichern Sie das ausgeschnittene Fliegenauge als JPEG, indem Sie auf Datei | Speichern unter | JPEG. Die ausgeschnittenen Bilder befinden sich nun im selben Dateiordner wie die ursprünglichen experimentellen Bilder.
   HINWEIS: Um den nächsten Schritt zu erleichtern, wird empfohlen, einen neuen Dateiordner mit dem Namen "cut" zu erstellen und alle ausgeschnittenen Bilder in diesem Ordner abzulegen.

4. Verwendung von Flynotyper zur Berechnung phänotypischer Scores

1. Öffnen Sie Flynotyper als ImageJ-Plugin, indem Sie auf Plugins | Flynotyper.
2. Wählen Sie Genotypen hinzufügen und öffnen Sie den Ordner mit den geschnittenen Fliegenaugenbildern (Ordner mit ausgeschnittener Datei). Der Ordnername wird unter Genotypen angezeigt (Abbildung 2C).
3. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Lichtmikroskop und Vertikal , aber passen Sie sie bei Bedarf entsprechend an. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Stabilität und Abstand zur Mitte unter Rang Ommatidia nach: (Abbildung 2C).
4. Geben Sie für Anzahl der berücksichtigten Ommatidien den Wert 200 ein.
   HINWEIS: Im Allgemeinen ist 200 eine gute Zahl, aber passen Sie sie entsprechend Ihren Vorlieben an.
5. Klicken Sie auf Ausführen , und warten Sie, bis die Ergebnisse der Analyse angezeigt werden (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Dieser Schritt kann je nach Rechenleistung des verwendeten Computers 5 Minuten oder länger (oder kürzer) dauern.
6. Kopieren Sie die Beispieldatei und den P-Score und fügen Sie sie zur weiteren Analyse in eine Statistiksoftware ein.

Results

In einer früheren Studie haben wir dieses Protokoll verwendet, um genetische Modifikatoren des mutierten VCP-Proteins zu bestimmen, das mit amyotropher Lateralsklerose mit frontotemporaler Demenz (ALS-FTD) in Verbindung gebracht ^wird12. Darüber hinaus wurde diese Methode auch in einer anderen Arbeit verwendet, um die Toxizität von CHCHD10^{S59L-vermittelten} ALS-FTD zu bewerten, selbst wenn ein älteres Stereomikroskop^{verwendet wurde 13}. Um diese Ergebnisse weiter zu validieren, verwendeten wir Ilastik und Flynotyper in der gleichen ALS-FTD-Krankheitsmutation wie Baek et ^al.13; Ein nicht geschultes Laborpersonal führte das Experiment jedoch durch und erzielte ähnliche Ergebnisse. Daher ist die Kombination von Ilastik und Flynotyper eine robuste Methode, um die Degeneration der Drosophila-Ommatidien unvoreingenommen zu bewerten.

Wir bevorzugen die Verwendung eines Ringlichts, da es eine bessere qualitative Bewertung ermöglicht (Abbildung 3). Die Verwendung eines Ringlichts verursacht jedoch einen Schatten, den Flynotyper nicht direkt analysieren kann. Um dies zu umgehen, haben wir die Bilder in ilastik vorbearbeitet, bevor wir die P-Scores mit Flynotyper quantifiziert haben. Insgesamt waren die P-Scores des nicht degenerierten (GMR-GAL4) Fliegenauges signifikant niedriger als bei einem mäßig degenerierten Auge (2x_S81L) und einem stark degenerierten Auge (3x_S81L) (Abbildung 4A,B und Tabelle 1). Dies ist das erwartete Ergebnis, da höhere P-Scores, die von Flynotyper generiert werden, auf ein stärker degeneriertes Auge^{hinweisen 1}. Wenn Ilastik nicht verwendet wurde, gab es vernachlässigbare Unterschiede in den P-Werten zwischen einem nicht degenerierten Auge und einem mäßig degenerierten Auge (Abbildung 4C und Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass Flynotyper Schwierigkeiten hat, Ommatidienmuster unter Ringlichtbedingungen ohne den Einsatz von Ilastik genau zu identifizieren. Dies liegt daran, dass Flynotyper so konzipiert ist, dass Bilder verwendet werden, die mit einem Dual-Point-Licht aufgenommen wurden, das mit zusätzlichen Anpassungen in Graustufen umgewandelt wird, um das ommatatidiale Zentrum¹ zu identifizieren. Ilastik repliziert diesen Prozess, indem es einen Punkt in die Mitte jedes Ommatidiums einbaut, was eine Quantifizierung innerhalb von Flynotyper ermöglicht.

Abbildung 1: Beispiel für einen ilastik-Workflow. (A) Erstellen eines neuen Projekts in ilastik. (B) Auswahl des Standardbildes. (C) Auswahl von Sigma-Werten unter Feature-Auswahl. (D) Markierung des Vordergrunds von Ommatidien für die Empfindlichkeit. (E) Markierung des Hintergrunds von Ommatidien für die Empfindlichkeit. (F) Auswählen, wie die Software verarbeitete Dateien exportieren soll. (G) Auswahl der experimentellen Fliegenaugenbilder, die analysiert werden sollen. (H) Zeigen, welche experimentellen Fliegenaugenbilder analysiert werden. (I) Fertiges Produkt nach dem Ausführen der Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für einen Flynotyper-Workflow. (A) Nur das Auge der Fliege für die weitere Analyse auswählen. (B) Öffnen des abgeschnittenen Augenbildes in einem neuen Fenster. (C) Auswahl der zu analysierenden Schnittbilder und der Parameter, die für die Analyse überprüft werden sollen. (D) Beispielhafte Ergebnisse. Phänotypische Werte werden ganz rechts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Qualitative Drosophila-Augenbilder . Dasselbe Fliegenauge, aufgenommen mit einem Ringlicht (links) und aufgenommen mit einem Doppelpunktlicht (rechts) unter nicht entarteten (oben) und degenerierten (unten) Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Verwendung von Ilastik vor Flynotyper zur genauen Quantifizierung des Phänotyps des rauen Auges bei Drosophila. (A) Repräsentative Drosophila-Augenbilder eines nicht degenerierten Auges (GMR-GAL4), eines mäßig degenerierten Auges (2x_S81L) und eines schwer degenerierten Auges (3x_S81L). (B) Die Quantifizierung erfolgt durch Flynotyper nach Anwendung von ilastik. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0) (C) Quantifizierungsergebnisse von Flynotyper ohne Verwendung von Ilastik. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 für jede Gruppe. Datenpunkte werden auf der X-Achse verwackelt oder gestapelt, um die visuelle Übersichtlichkeit zu gewährleisten. Die durchgezogene horizontale Linie stellt den Durchschnitt dar. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Mit ilastik	Ohne Ilastik	Mit ilastik	Ohne Ilastik	Mit ilastik	Ohne Ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

Tabelle 1: P-Scores bei Verwendung von Flynotyper mit Ilastik und bei alleiniger Verwendung von Flynotyper.

Ergänzende Abbildung S1: Fliegenkopfhalterung für die Bildaufnahme eingerichtet. Dies ist ein Beispiel für die Einrichtung der Bildaufnahme mit mehreren Blättern Papier. Es kann jedoch jede Methode verwendet werden, die die richtige Ausrichtung des Kopfes und des Fliegenauges gewährleistet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Quantitative Ergebnisse von ilastik und Flynotyper bei Verwendung eines Sigma-Wertes von 2,5 unter Merkmalsauswahl. Die Verwendung eines anderen Sigma-Werts als 5,0 bei der Merkmalsauswahl in Ilastik kann zu einer ungenauen Quantifizierung führen. Konkret führt ein Sigma-Wert von 2,5 zu einem Verlust der Empfindlichkeit. Die p-Werte eines zweiseitigen Permutations-t-Tests wurden berechnet, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern (GMR-GAL4 vs. 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs. 3x_S81L: p = 0). N = 3 für jede Gruppe. Datenpunkte werden auf der X-Achse verwackelt oder gestapelt, um die visuelle Übersichtlichkeit zu gewährleisten. Die durchgezogene horizontale Linie stellt den Durchschnitt dar. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Verlust der Sensitivität und ungenaue P-Scores aufgrund nekrotischer Flecken. Weiße Pfeile zeigen auf Segmente nekrotischer Flecken. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: P-Scores bei Verwendung eines Sigma-Wertes von 2,5 unter Merkmalsauswahl. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Ommatidien von Drosophila stellen ein nützliches System zur Untersuchung verschiedener biologischer Funktionen und genetischer Krankheiten dar. Die Regelmäßigkeit von Ommatidien ist ein gutes Maß, um die Wirkung genetischer Mutationen zu untersuchen⁴. Obwohl es mehrere Methoden zur Berechnung der ommatidialen Regelmäßigkeit gibt, wie z. B. das manuelle Ranking, können diese Methoden stark verzerrt sein. Um diesen verzerrten Ansatz zu überwinden, wurden halbautomatische Werkzeuge entwickelt ^1,11.

Für eine genaue Augenquantifizierung müssen die Vorbereitung und Einrichtung der Fliege optimiert werden. Obwohl wir verstehen, dass jedes Labor seine eigene Einrichtung haben wird, stellen wir die folgende Einrichtung in unserem Labor zur Verfügung, um den Lesern eine Vorstellung davon zu geben, wie sie Fliegen für die Bildaufnahme vorbereiten können. Fliegen werden eingefroren und bei -80 °C gelagert. Wir haben eine Stichprobengröße von 3 verwendet, da es unserer Erfahrung nach bei der Kombination von GMR-GAL4 mit der S81L-Mutation nur sehr geringe Unterschiede in der Population gibt. Beachten Sie jedoch, dass der Stichprobenumfang angepasst werden sollte, um Signifikanztests mit Nullhypothesen durchzuführen. Um die Fliegen für die Bildaufnahme zu montieren, ruht der Fliegenkopf auf einem sehr kleinen Blatt Papier, das als Kissen dient, so dass die Mitte des Auges ungefähr der Brennebene entspricht (Ergänzende Abbildung S1). Unser Labor verwendet ein Z-Stapel-Mikroskop und eine Kamera (siehe Materialtabelle), da dies insgesamt klarere Bilder liefert und die beste Visualisierung des gesamten Auges ermöglicht, da das Fliegenauge kuppelförmig ist. Die Z-Stapel-Funktion ist für dieses Protokoll jedoch keine Voraussetzung, da wir diese Methode erfolgreich mit einem älteren Stereomikroskop ohne die Z-Stapel-Funktion¹³ angewendet haben. Das Ringlichtrad für die Helligkeit ist nicht mehr als 1/4 nach oben gedreht, um eine Überbelichtung zu vermeiden. Die Gesamtdicke unserer Proben liegt zwischen 300 und 450 Mikrometern.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Analyse von Fliegenaugen mit Ilastik und Flynotyper unvoreingenommene und zuverlässige Ommatidien-Quantifizierungsergebnisse liefert. Wir analysierten Drosophila-Ommatidienmuster mit Ilastik, einem auf maschinellem Lernen basierenden Biobild-Analysewerkzeug, um Ommatidien zu markieren, und dann mit Flynotyper, einer Berechnungsmethode zur Messung der Regelmäßigkeit von Ommatidien ^1,11. Wir bevorzugen es, ein Ringlicht zu verwenden, um Bilder für eine bessere qualitative Bewertung zu erhalten. Dieser Ansatz erlaubt es Flynotyper jedoch nicht, mit diesen Bildern quantitative Ergebnisse zu erzielen. Daher wird Ilastik implementiert, um diese Bilder vorzuverarbeiten, und diese verarbeiteten Bilder wurden erfolgreich mit Flynotyper verwendet, um quantitative Ergebnisse zu erzielen. Wenn die Bilder vor Flynotyper nicht mit Ilastik vorbearbeitet wurden, waren die P-Scores bei nicht-degenerativen und degenerativen Augen insgesamt ähnlich. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, bei der Implementierung eines Ringlichts zuerst Ilastik zu verwenden, um quantitative Ergebnisse zu erzielen.

Es gibt einige Einschränkungen in unseren Methoden. Die Einstellungen in ilastik können stark variieren und zu unbedeutenden Daten führen. Zum Beispiel haben wir eine weitere Reihe von Analysen mit denselben Bildern durchgeführt, aber den Vordergrund-Sigma-Wert in ilastik auf 2,5 statt auf 5 angepasst. Dies führte zu einem Verlust der Sensitivität bei mäßig degenerativen Phänotypen (Ergänzende Abbildung S2 und Ergänzende Tabelle S1). Eine weitere Einschränkung ist der Verlust der Sensibilität in den Augen bei zu starker Degeneration. Im Vergleich zu einem 3x_S81L Auge ist ein Auge mit nekrotischen Flecken qualitativ deutlich stärker degeneriert. Der durchschnittliche P-Score für 3x_S81L Augen lag jedoch bei 60,2, während der durchschnittliche P-Score für die Augen mit nekrotischen Flecken bei 60,9 lag. So können auch Augen mit zu starker Degeneration, wie z. B. nekrotische Flecken, zu einem Verlust der Empfindlichkeit führen (Ergänzende Abbildung S3).

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Auswahl eines geeigneten Standardbildes, das zum Trainieren von Ilastik verwendet wird. Ein nicht degeneriertes Standardbild mit einem deutlichen Kontrast zwischen den Ommatidien und den umgebenden Pigmentzellen, wie z. B. roten oder orangefarbenen Augen, führt zu einer genaueren Quantifizierung in Flynotyper. Ein weiterer kritischer Schritt ist die Merkmalsauswahl in ilastik, bei der die Empfindlichkeit, dargestellt als Sigma-Werte, ausgewählt wird, um die Software für maschinelles Lernen fein abzustimmen (Abbildung 1D). Die Auswahl von zu wenigen Merkmalen kann die Empfindlichkeit der Ilastik verringern, was zu einer ungenauen Markierung der Ommatidien führt. Die Auswahl zu vieler Merkmale erhöht die Zeit- und Rechenleistung, die zum Generieren von Ergebnissen erforderlich sind, und verringert die Effizienz des Verfahrens. Wenn es zu einer spürbaren qualitativen Degeneration des Auges kommt, die Analyseergebnisse jedoch statistisch nicht signifikant sind, wäre eine Erhöhung des Sigma-Wertes der ausgewählten Merkmale eine mögliche Lösung. Die in diesem Protokoll bereitgestellte Merkmalsauswahl führt jedoch regelmäßig zu genauen Ergebnissen. Wenn Sie die kritischen Schritte so befolgen, wie sie geschrieben sind, können Sie die häufigsten Probleme verringern und in Zukunft eine Problembehandlung durchführen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode bessere qualitative Bilder liefert und gleichzeitig eine unvoreingenommene und zuverlässige Quantifizierung des Drosophila-Augensystems ermöglicht. Folglich könnte diese Methode den Nutzen der Augendegeneration als leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung degenerativer Erkrankungen in der Zukunft erhöhen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ryzen			5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Software hier herunterladen: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html Open-Source-Software	. Verwenden Sie Flynotyper 2.0 nicht. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung war 2.0 noch recht neu und dieses Protokoll ist für die ursprüngliche Version von Flynotyper optimiert.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Software hier herunterladen: https://www.ilastik.org/download.html Open-Source-Software	. Laden Sie Version 1.4.0.post1 unter Reguläre Builds herunter, die dem Betriebssystem Ihres Computers entsprechen.
ImageJ		Laden Sie die Software hier herunter: https://imagej.net/ij/download.html Open-Source-Software	. Zum Einsatz kamen die Versionen 1.53 und 1.54. 1.54 ist die aktualisierte Version und der Standard-Download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System und Software für die Erfassung von Z-Stacks.
Leica Z16 APO-Mikroskop mit DMC2900 Kamera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Im Text als Z-Stapel-Mikroskop und Kamera bezeichnet. Dieses Produkt ist jetzt archiviert.