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Skalierbarer Biomanufacturing-Workflow zur Herstellung und Isolierung von natürlichen, aus Killerzellen gewonnenen extrazellulären Krebs-Biotherapeutika auf Vesikelbasis

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DOI:

10.3791/67227

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16. August 2024

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Natürliche, aus Killerzellen gewonnene extrazelluläre Vesikel (NK-EVs) bergen vielversprechendes Potenzial als Krebsbiotherapeutika. Diese methodenbasierte Studie stellt einen skalierbaren geschlossenen Bioproduktions-Workflow vor, der darauf ausgelegt ist, kontinuierlich große Mengen hochreiner NK-EVs zu produzieren und zu isolieren. Während des gesamten Bioproduktions-Workflows werden In-Prozess-Kontrolltests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Elektrofahrzeuge die Qualitätsstandards für die Produktfreigabe erfüllen.

Zusammenfassung

Natürliche, aus Killerzellen gewonnene extrazelluläre Vesikel (NK-EVs) werden als Krebs-Biotherapeutika untersucht. Sie besitzen einzigartige Eigenschaften als zytotoxische Nanovesikel gegen Krebszellen und als immunmodulatorische Kommunikatoren. Ein skalierbarer Biomanufacturing-Workflow ermöglicht die Produktion großer Mengen hochreiner NK-EVs, um die präklinischen und klinischen Anforderungen zu erfüllen. Der Arbeitsablauf verwendet einen geschlossenen Hohlfaser-Bioreaktor, der die kontinuierliche Produktion von NK-EVs aus der NK92-MI-Zelllinie unter serumfreien, xenofreien, feederfreien und antibiotikafreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Standards der Good Manufacturing Practices ermöglicht. Diese protokollgestützte Studie skizziert den Arbeitsablauf der Bioproduktion für die Isolierung von NK-EVs mittels Größenausschlusschromatographie, Ultrafiltration und filterbasierter Sterilisation. Die Charakterisierung wesentlicher NK-EV-Produkte erfolgt über eine Nanopartikel-Tracking-Analyse, und ihre Funktionalität wird durch einen validierten auf Zellviabilität basierenden Wirksamkeitsassay gegen Krebszellen bewertet. Dieser skalierbare Bioproduktionsprozess birgt ein erhebliches Potenzial, die klinische Umsetzung von NK-EV-basierten Krebsbiotherapeutika voranzutreiben, indem er sich an Best Practices hält und die Reproduzierbarkeit sicherstellt.

Einleitung

Im 21. Jahrhundert wurden bemerkenswerte Fortschritte im Kampf gegen Krebs erzielt. Dies ist vor allem auf den Aufstieg von Krebsimmuntherapeutika zurückzuführen, einer Klasse von Medikamenten, die das Immunsystem zur Bekämpfung von Krebs nutzen. Natürliche, aus Killerzellen gewonnene extrazelluläre Vesikel (NK-EVs) stellen vielversprechende Anwärter im expandierenden Bereich der Immuntherapie dar. Als Integrativ zur angeborenen und adaptiven Immunität spielen NK-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Abwehr des Körpers gegen virusinfizierte, gestresste und bösartige Zellen. Sie setzen ein umfassendes Arsenal an Anti-Krebs-Maschinerien ein, um abnormale Zellen mit zytotoxischen Mitteln zu eliminieren 1,2,3. Zu diesen Mechanismen gehört die Produktion und Sekretion von EVs, nanoskaligen Doppelschichtstrukturen, die verschiedene Biomoleküle wie Proteine, RNAs und DNAs enthalten, die für die Erleichterung der interzellulären Kommunikation entscheidend sind 4,5,6. NK-EVs erweisen sich aufgrund ihrer einzigartigen Trägereigenschaften als vielversprechende zellfreie Therapeutika. Dazu gehören ihre geringe Größe, die eine filterbasierte Sterilisation ermöglicht, eine hohe Biokompatibilität, eine bevorzugte Akkumulation innerhalb von Tumoren, ein breites Spektrum an Frachtabgaben, die Fähigkeit, biologische Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, und ein minimales Toxizitätsprofil. Aus mehreren Gründen machen NK-EVs eine Lymphodepletion des Patienten durch Chemotherapie vor der Verabreichung überflüssig: 1) Herkömmlicherweise wird die Lymphodepletion eingesetzt, um ein gastfreundlicheres Umfeld für die zellbasierte Therapie zu schaffen, das es infundierten Zellen ermöglicht, sich zu vermehren und ihre therapeutische Wirkung auszuüben; 2) Im Gegensatz zu Zellen verfügen Elektrofahrzeuge nicht über die Replikationskapazität und sind wesentlich kleiner. 3) EVs funktionieren durch unterschiedliche Mechanismen und weisen im Vergleich zu Zellen eine verminderte Immunogenität auf 5,6,7. Darüber hinaus zeigten NK-EVs konsistent in vitro eine Wirksamkeit gegen verschiedene Krebsmodelle und zeigten auch immunmodulatorische Wirkungen auf Immunzellen, die Anti-Krebs-Reaktionen fördern 8,9. In-vivo-Ergebnisse bestätigen diese Ergebnisse und zeigen eine Regression des Krebses nach NK-EV-Behandlung und vernachlässigbare Toxizitäten 10,11,12. Daher sind NK-EV-basierte Therapeutika vielversprechend, um die Herausforderungen bei der Behandlung kalter, immunologisch inerter solider Tumoren zu bewältigen 13,14,15,16,17.

Unsere aktuelle Studie befasst sich mit einem signifikanten Engpass bei der klinischen Translation von NK-EVs durch Bioproduktion7. Der Artikel stellt einen Proof-of-Concept für einen kostengünstigen und skalierbaren Bioproduktions-Workflow von NK-EVs vor, der sorgfältig entwickelt wurde, um In-Prozess-Qualitätskontrolltests zu gewährleisten. Auf diese Weise wurden kontinuierlich große Mengen an hochreinen NK-EV-basierten Krebsbiotherapeutika produziert, wobei eine gründliche Produktcharakterisierung gemäß den MISEV2018 Richtlinien18 durchgeführt wurde. Die Skalierbarkeit des Biomanufacturing-Workflows kann durch eine Erhöhung der Kartuschengröße oder den parallelen Betrieb mehrerer Bioreaktoren erreicht werden. In ähnlicher Weise kann die Skalierbarkeit des Arbeitsablaufs bei der EV-Isolierung mit Techniken wie der auf Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) basierenden Größenausschlusschromatographie (SEC), der Ultrafiltration (UF) und der filterbasierten Sterilisation leicht erreicht werden. Das geschlossene Hohlfaser-Bioreaktor-System (HFB) züchtete die IL-2-autarke NK-Zelllinie (NK92-MI-Zellen), ohne dass eine Serumsupplementierung, ein Feeder-System und Antibiotika erforderlich waren. Dies wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen, chemisch definierten und xenofreien Mediums erreicht (eine GMP-Version ist jetzt kommerziell erhältlich). Als Ergebnis wurden innerhalb von 5 - 7 Tagen große Mengen an NK-Zellen (109 lebensfähige Zellen) und NK-EVs (1012 EVs) erfolgreich mit einer einzigen mittelgroßen Bioreaktorkartusche hergestellt, wobei beide Produkte umfassend charakterisiert wurden. Während des gesamten Bioproduktionsprozesses wurde die Zellgesundheit täglich anhand quantifizierbarer Metriken wie pH-Wert, Glukose- und Laktatspiegel sowie visueller Indikatoren wie der Medienfarbe und aller Anzeichen von Kontamination überwacht, die wesentliche Prädiktoren für die Zell- und EV-Qualität sind. Die Bewertung der Lebensfähigkeit und Funktionalität der NK-Zellen, die im HFB-System erzeugt wurden, insbesondere der Zytotoxizität, nach der Ernte ergab eine signifikante Verbesserung im Vergleich zu kolbenbasierten Kulturen7. Ebenso wiesen gereinigte NK-EVs ein hohes Reinheitsprofil auf, frei von Bakterien, Mykoplasmen, gemeinsamen viralen Entitäten und zellulären Komponenten und mit vernachlässigbaren Endotoxinwerten. Wichtig ist, dass gereinigte NK-EVs über 99,9 % aller Nanopartikel im Endprodukt ausmachten7. Schließlich behielten diese gereinigten NK-EVs wichtige NK-Eigenschaften bei, einschließlich Oberflächenmarker (CD2, CD45, CD56), Zytokin-Nutzlast (GzmB, PFN, IFN-g) und zeigten eine starke Zytotoxizität gegen leukämische K562-Zellen, die Goldstandardlinie für die Beurteilung der Zytotoxizität von NK-Zellen7.

Das vorliegende Protokoll beschreibt den oben diskutierten skalierbaren Arbeitsablauf der Bioproduktion. Es wird die Methodik zur Isolierung von NK-EVs erläutert, die mit FPLC-SEC in Verbindung mit UF- und filterbasierter Sterilisation hergestellt wurden. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll entscheidende Schritte, einschließlich der Produktcharakterisierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), der Qualitätsbewertung mit verschiedenen Instrumenten (Protein-/dsDNA-Quantifizierung und mikrobielle Tests) und der funktionellen Validierung des gereinigten NK-EV-Produkts gegen Krebszellen durch einen Zellviabilitätsassay. In der Regel ergibt dieser Arbeitsablauf 1,0 - 1,5 ml NK-EV-Produkt mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,18 x 1012 EVs/mL7, insgesamt mindestens 1 x 1012 EVs, basierend auf ca. 40 mL EV-reichem CM. Dieses Verfahren ermöglicht die Produktfreigabe für verschiedene Downstream-Anwendungen, wie z. B. investiäre, präklinische und Multi-Omics-Studien (Proteomik, Transkriptomik, Genomik, Metabolomik, Lipidomik und Epigenomik), die hohe Mengen an hochwertigen EVs erfordern und gleichzeitig Potenzial für eine klinische Translation mit nachgewiesener Reproduzierbarkeit aufweisen.

Protokoll

1. NK-EV-Bioproduktion aus NK92-MI-Zellen unter Verwendung eines Bioreaktors mit geschlossenem Kreislauf

HINWEIS: NK-EVs werden unter Verwendung eines skalierbaren Biomanufacturing-Workflows hergestellt, der den Good Manufacturing Practices (GMP) entspricht und die NK92-MI-Zellen verwendet (siehe Abbildung 1). Unsere jüngste Veröffentlichung enthält detaillierte Einblicke in das Bioproduktionsverfahren und die Identität und das Sicherheitsprofil von NK-EV-Produkten7.

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Abbildung 1: Bioproduktion von extrazellulären Vesikeln (NK-EVs) aus natürlichen Killerzellen in einem geschlossenen Hohlfaser-Bioreaktor (HFB) mit skalierbarem Isolationsablauf. Schematische Darstellung des Biomanufacturing-Workflows zur Erzeugung großer Mengen hochreiner NK-EV-Produkte. IL-2-autarke NK92-MI-Zellen werden in eine geschlossene HFB-Kartusche ausgesät und unter serumfreien (SF), xenofreien (XF), feederfreien und antibiotikafreien Bedingungen kultiviert, wo sie für eine kontinuierliche Sammlung von EV-reichen konditionierten Medien gezüchtet werden. Die Isolierung von NK-EV aus EV-reichem CM erfolgt durch Fast Protein Liquid Chromatographie-basierte Größenausschlusschromatographie (FPLC-SEC) in Verbindung mit Ultrafiltration (UF). NK-EVs werden durch mehrere Assays charakterisiert und bewertet, und ihre Funktionalität gegen K562-Leukämiezellen wird mit einem Viabilitäts-Potenz-Assay bewertet. Diese Abbildung wurde von7 (erstellt mit Biorender.com) geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Ausgehend von 1 - 5 x 106 NK92-MI Zellen und unter Beibehaltung einer Zelldichte zwischen 3 - 8 x 105 Zellen/ml werden die Zellen in T25 - T175 Kolben unter Verwendung eines vorgewärmten Nährmediums kultiviert. Inkubieren bei 37 °C mit 5 % CO2 (siehe Materialtabelle). Tauschen Sie das Medium alle 2 - 3 Tage aus, bis 1 x 108 NK92-MI-Zellen mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 70 % hergestellt sind.
    HINWEIS: Halten Sie 1/5th-1/3 des konditionierten Mediums (CM) bei der Nachsaat der Zellen bereit, da es günstige Wachstumsfaktoren enthält.
  2. Führen Sie die Vorbereitung der mittleren HFB-Kartuschen und die Inokulation der NK-Zellen wie unten beschrieben durch.
    HINWEIS: Alle Manipulationen sollten in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten und aufrechtzuerhalten. Bevor Sie das Kartuschensystem in die Biosicherheitswerkbank einschieben, sprühen Sie großzügig mit 70%igem Ethanol und achten Sie dabei besonders auf den Reservoirengpass und die Spritzenanschlüsse.
    1. Bereiten Sie die HFB-Patrone gemäß den Anweisungen des Herstellers19 (siehe Materialtabelle; siehe Abbildung 2) wie unten beschrieben vor.
      1. Wickeln Sie die Luer-Lock-Anschlüsse mit Wachsfilm ein und stellen Sie die Fördermenge der Pumpe gemäß den Herstellerangabenein 19. Konditionieren Sie die HFB-Kartusche, indem Sie 150 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; siehe Materialtabelle) mindestens fünf Tage lang zirkulieren lassen.
      2. Um die Luft aus dem extrazellulären Kapillarraum (ECS; Volumen beträgt ca. 29 ml) zu entfernen, injizieren Sie ca. 40 mL PBS durch den linken ECS-Anschluss und lassen Sie die Luft durch den rechten ECS-Anschluss entweichen. Schließen Sie dabei die linken und rechten Endklemmen. Stellen Sie sicher, dass die Spritze immer an den linken und rechten ECS-Anschluss angeschlossen ist.
      3. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, setzen Sie die Kartusche auf die Durchflusspumpe (siehe Materialtabelle) im Inkubator ein, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt ist. Stellen Sie sicher, dass nach einigen Tagen der Zirkulation keine Lecks mehr vorhanden sind.
    2. Ersetzen Sie das PBS durch 150 ml Kulturmedium in der Reservoirflasche und das ECS 2 Tage, bevor Sie die Zellen in die Patrone aussäen. Wiederholen Sie die vorherigen Konditionierungsschritte (Schritt 1.2.1.) mit dem Nährmedium, jedoch für 2 Tage Zirkulation.
    3. Ersetzen Sie vor der Aussaat der Zellen den Inhalt der Reservoirflasche und des ECS durch 250 ml frisches Kulturmedium.
    4. Entnehmen Sie den Kulturkolben aus dem Inkubator und geben Sie die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen. Bei 300 x g 5 min schleudern. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 21 ml Kulturmedium.
    5. Bereiten Sie zwei Aliquots von je 20,5 μl aus der Zellsuspension für die Zellzählung auf einem automatisierten Zellzähler vor (siehe Materialtabelle). Zu jedem Aliquot der 20,5-μl-Zellsuspension wird die gleiche Menge AO/PI-Farbstoff hinzugefügt (siehe Materialtabelle) und mindestens 10x auf- und abgemischt.
      HINWEIS: Wir empfehlen Trypanblau nicht für eine genaue NK-Zellzählung. Alternativ können Sie ein Hämozytometer für die manuelle Zählung verwenden.
    6. Laden Sie 20 μl in jede Zählkammer des Zählobjektträgers und führen Sie die automatische Zellzählung mit dem entsprechenden Programm durch. Berechnen Sie die durchschnittliche Konzentration lebender Zellen und notieren Sie die Lebensfähigkeit.
    7. Mischen Sie die NK-Zelllösung einige Male, bevor Sie sie mit einer 20-ml-Spritze und einer 18-g-Nadel aspirieren, um die Sterilität zu erhalten. Diese Lösung sollte ungefähr 1 x 108 lebende NK-Zellen in etwa 20 ml oder etwa 5 x 106 Zellen/ml enthalten.
    8. Nachdem Sie die Nadel aus der Spritze genommen haben, injizieren Sie die NK-Zellen vorsichtig durch den linken ECS-Anschluss in die Patrone. Um eine gleichmäßige Zelldispersion in der gesamten Patrone zu gewährleisten, rezitieren Sie die Zelllösung vorsichtig mindestens 10x mit den Spritzen, die an den linken und rechten ECS-Anschlüssen angeschlossen sind.
      HINWEIS: Die Lösung sollte über beide Spritzen hinweg die gleiche Trübung aufweisen, wobei der linke und der rechte Endanschluss geschlossen sein sollten.
    9. Öffnen Sie den linken und rechten Endanschluss und injizieren Sie, was in den Spritzen verbleibt. Schließen Sie die linken und rechten ECS-Ports mit den Klemmen.
    10. Setzen Sie die Kartusche in den Inkubator ein und lassen Sie sie 30 Minuten einwirken, bevor Sie sie ordnungsgemäß an der Durchflusspumpe einsetzen. Lassen Sie die Kartusche für die Bioproduktion drin. Passen Sie die Durchflussmenge je nach Hersteller an.
    11. Um die Zellgesundheit zu überwachen, entnehmen Sie täglich ein Aliquot von 0,5 ml des Mediums aus dem gründlich gemischten Medium in der Reservoirflasche und lagern Sie es bei -20 °C, nachdem Sie den Glukose- und pH-Wert überprüft haben. Der L-Laktat-Gehalt kann später überprüft werden (siehe Materialtabelle).
    12. Ersetzen Sie das Medium im Reservoir (250 - 500 ml) alle 1 - 2 Tage, um den Glukosegehalt über 50 % der Ausgangswerte im Medium und den pH-Wert über 7,0 (Bereich von 7,0 - 8,0) zu halten.
  3. Führen Sie die Entnahme von NK-EV-reichem CM täglich nach 1 Tag Ruhezeit durch, wenn Sie die Kartusche zum ersten Mal wie unten beschrieben säen.
    1. Schieben Sie das Kartuschensystem in die Biosicherheitswerkbank ein. Injizieren Sie vorsichtig ca. 21 ml Kulturmedium durch den linken ECS-Anschluss, um ein äquivalentes Volumen EV-reicher CM durch den rechten ECS zu drücken - nicht mischen (siehe Abbildung 3).
      HINWEIS: Verwenden Sie immer neue Kunststoffgeräte, um eine Kontamination zu vermeiden.
    2. Übertragen Sie die EV-reiche CM-Lösung in ein 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 x g . Schieben Sie in der Zwischenzeit das Kartuschensystem wieder in den Inkubator an der Durchflusspumpe.
    3. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 2000 x g 10 min zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand erneut in ein neues Röhrchen. Anschließend aliquotieren Sie das EV-reiche CM gleichmäßig auf 3,50 ml-Röhrchen (~7 ml/Röhrchen) und lagern es bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C.
      HINWEIS: Sequentiell geerntetes EV-reiches CM wird auf diese drei Röhrchen gepoolt, wodurch drei technische Replizierungsprobenröhrchen erzeugt werden.
  4. Führen Sie die HFB-NK-Zellernte durch, um weiterhin EV-reiches CM mit derselben HFB-Kartusche zu produzieren, wie unten beschrieben.
    HINWEIS: NK-Zellen können aus dem ECS des HFB entnommen werden, indem das HFB-NK-Zellernteprotokoll durchgeführt wird, sobald die Kartusche die Konfluenz erreicht hat (maximal 1 x 109 Zellen). Dies geschieht nach 5 - 7 Tagen für jede Charge oder wenn festgestellt wird, dass der Glukosegehalt an 2 aufeinanderfolgenden Tagen unter der Nachweisgrenze des Glukosemessgeräts liegt (z. B. kein Messwert oder Messwerte von ~ 0). Wenn es sich um die endgültige Zellernte handelt, kann das Medium durch PBS ersetzt werden, um die Kartusche zu spülen und die Zellen zu entnehmen.
    1. Ernten Sie EV-reiches CM genau wie oben in Schritt 1.3 beschrieben.
    2. Injizieren Sie ca. 50 ml des Mediums durch den linken ECS-Anschluss. Um eine homogene Zelldispersion in der gesamten Patrone zu gewährleisten, schieben Sie die Zelllösung mit den Spritzen, die mit dem linken und rechten ECS-Anschluss verbunden sind, mindestens 10x vorsichtig hin und her, um die Zellen aufzulockern, bevor Sie sie schließlich mit einer Spritze durch den rechten ECS-Anschluss schieben und auffangen. Übertragen Sie das geerntete EV-reiche CM in ein 50-ml-Röhrchen. Vorerst bei 37 °C (Wasserbad oder Inkubator) beiseite stellen.
      HINWEIS: Die Push-Back-Aktion hilft, die Zellen zu entfernen, bevor sie vollständig ausgestoßen und von einer Spritze durch den rechten ECS-Anschluss gesammelt werden. Die Lösung sollte über beide Spritzen hinweg die gleiche Trübung aufweisen, wobei der linke und der rechte Endanschluss geschlossen sein sollten. Das Klopfen auf die Bioreaktorkartusche (physikalische Störung) kann dazu beitragen, den Zellcluster am Boden der Kartusche präventiv zu entfernen. Ein aggressives Hin und Her der Zellsuspension kann sich negativ auf die Lebensfähigkeit der zurückgewonnenen Zellen auswirken. Sorgfalt und Geduld sollten angewendet werden, um die Lebensfähigkeit zu maximieren.
    3. Wiederholen Sie den letzten Schritt 2x. Insgesamt sollten 150 ml Zellsuspension zurückgewonnen werden. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Überstand verwerfen.
    4. Resuspendieren Sie beide Zellpellets in jeweils 20 mL frischem Medium und kombinieren Sie sie. Sammeln Sie zwei Aliquots à 20,5 μl der Zellsuspension für die Zellzählung auf einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: In der Regel sind zahlreiche Zellverdünnungen mit PBS als Verdünnungsmittel erforderlich, um innerhalb des Dynamikbereichs des Zellzählers zu liegen.
    5. Zu dem Aliquot der 20,5-μl-Zellsuspension wird die gleiche Menge AO/PI-Farbstoff hinzugefügt (siehe Materialtabelle) und mindestens 10x auf- und abgemischt. Laden Sie 20 μl in jede Zählkammer des Zählobjektträgers und führen Sie die automatische Zellzählung mit dem entsprechenden Programm durch.
    6. Mittelwerten Sie die Lebendzellkonzentration aller verdünnungskorrigierten Zählungen, bestimmen Sie die Gesamtmenge der lebenden Zellen und erfassen Sie die Lebensfähigkeit. Wie oben beschrieben, wird zur kontinuierlichen Herstellung von EV-reichem CM mit derselben Bioreaktorkartusche 1 x 108 HFB-produzierte NK-Zellen neu ausgeimpft.
      HINWEIS: Falls gewünscht, können HFB-hergestellte NK-Zellen mit einem Kryokonservierungs-Gefriermedium und einem Gefrierbehälter gelagert werden, um die Gefrierrate zu kontrollieren (siehe Materialtabelle).

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Abbildung 2: Systemkomponente und Aufbau des Hohlfaser-Bioreaktors (HFB). Die Reservoirflasche (1) enthält das gesamte Medium, das durch die Bioreaktorpatrone (2) durch die Einwirkung einer Peristaltikpumpe (nicht dargestellt), die auf den Pumpenschlauch (3) wirkt, zirkuliert. Die Zellen werden durch die linken (4) und rechten (5) ECS-Seitenports in den extrazellulären Kapillarraum (ECS) eingeführt. Sobald die ECS-Schiebeklemmen geschlossen sind, sind die Anschlüsse an der linken (6) und rechten (7) Endseite geöffnet, damit das Medium im gesamten System zirkulieren kann. Achten Sie auf die Hinzufügung von Wachsfilm auf dem Luer-Lock-Anschluss in der Nähe des Behälterdeckels der Mediumflasche, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung des NK-EV-Isolationsprozesses. Nach täglicher Entnahme von EV-reichem konditioniertem Medium (CM) wurde die Lösung differenziell zentrifugiert, um Zellen (erste Drehung bei 300 x g für 5 Minuten) und zelluläre Ablagerungen (zweite Drehung bei 2000 x g für 10 Minuten) zu entfernen. Geklärtes EV-reiches CM wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert. Sobald es für die NK-EV-Isolierung bereit ist, wird das gefrorene EV-reiche CM aufgetaut und ein weiteres Mal zentrifugiert, um die Entfernung von Zelltrümmern sicherzustellen (dritte Umdrehung bei 10.000 x g für 30 Minuten). Anschließend wird das EV-reiche CM für 2 - 4 Stunden bei 37 °C mit Endonuklease behandelt, um Nukleinsäuren zu verdauen, die als Wirtszellkontaminanten gelten. Als nächstes wird das EV-reiche CM durch die auf Fast Protein Liquid Chromatographie basierende Größenausschlusschromatographie (FPLC-SEC) für die EV-Aufreinigung unter Verwendung eines bimodalen Harzes verarbeitet. Eluierte Fraktionen von ca. 10 - 15 mL werden kombiniert und mit 0,22 μM-Filtern filtriert, um die Sterilität des NK-EV-Endprodukts zu gewährleisten. Die Ultrafiltration ermöglicht eine Konzentration des Produkts um den Faktor 35 - 50X, was zu einer garantierten Konzentration von über 1 x 1012 EVs/mL führt, insgesamt 1,0 - 1,5 mL. Diese Abbildung wurde von7 geändert (erstellt mit Biorender.com). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. NK-EV-Aufreinigung durch FPLC-SEC in Verbindung mit UF- und filterbasierter Sterilisation

  1. Bereiten Sie folgende Lösungen vor und filtrieren Sie diese zweimal mit einem 0,1 μm Filter (siehe Materialtabelle): Wasser (Leitfähigkeit von 0 mS/cm), PBS: 50 mL von 10x PBS + 450 mL Wasser (Leitfähigkeit von ca. 14,7 mS/cm), 20% Ethanol, Reinigungslösung (0,5 M NaOH und 30% Isopropylalkohol in Wasser).
  2. Führen Sie die Inbetriebnahme des FPLC-Systems gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Führen Sie CIP-Schritte (Clean-in-Place) vor und nach dem Lauf gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Waschen Sie alle Fäden und das Säulenharz und spülen Sie es mit doppelt gefiltertem (DF) Wasser, Reinigungslösung, DF-Wasser und DF-PBS aus.
    HINWEIS: Es ist erwähnenswert, dass CIP bei Bedarf an einem anderen Tag durchgeführt werden kann.
  3. Verwenden Sie eine Chromatographiesäule, die mit einem bimodalen Harz gefüllt ist (siehe Materialtabelle) mit einer Betthöhe von 20 cm. Stellen Sie Verbindungen mit der Tropf-zu-Tropf-Methode her, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Säule gelangt.
  4. Richten Sie den Fraktionssammler mit den entsprechenden Sammelröhrchen ein und ändern Sie die Fraktionierungseinstellungen auf das gewünschte Auffangvolumen (z. B. 15 mL). Platzieren Sie genügend Röhrchen und zwei zusätzliche Röhrchen, um das gesamte Probenvolumen zu sammeln.
  5. Führen Sie die Probenvorbereitung wie unten beschrieben durch.
    1. Nehmen Sie 40 - 80 mL EV-reiches CM aus dem -80 °C-Gefrierschrank und tauen Sie es schnell bei 37 °C auf. Laden Sie die Probe in die Ultrazentrifuge und schleudern Sie sie 30 Minuten lang bei 10.000 x g bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Rohre müssen genau nach Gewicht und nicht nach Volumen ausbalanciert werden.
    2. Nach dem Schleudern den Überstand auffangen und in ein neues Röhrchen umfüllen. Um die dsDNA-Spiegel zu senken, behandeln Sie das EV-reiche CM mit 50 U/ml Endonuklease und 1,5 mM MgCl2 (siehe Materialtabelle). 2 - 4 h in einem Inkubator (37 °C) inkubieren, wobei eine mäßige Durchmischung möglich ist.
  6. Sobald das System (Leitungen und Säule) für die EV-Isolierung bereit ist, laden Sie das EV-reiche CM in eine 60-ml-Spritze und schließen Sie sie an die Probenleitung an. Starten Sie das System, indem Sie auf Manueller Lauf klicken und die Durchflussmenge auf 0 setzen. Befolgen Sie die Anweisungen der Software, um die Ausführung präventiv zu speichern, und klicken Sie dann auf Start.
  7. Wählen Sie die Linie B (DF-PBS) und fahren Sie mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 150 cm/h (Durchflussrate von 2,0 mL/min). Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Spalte durchläuft.
  8. Sobald sich die Leitfähigkeit stabilisiert hat, drücken Sie Auto Zero UV. Ändern Sie den Durchflussweg, um die Probe in die Abfallflasche vor der Säule zu leiten. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen in das System gelangen.
  9. Nach maximal 5 - 20 s richten Sie die Probe auf die Säule. Klicken Sie auf Fraktionierung , sobald die UV-Messwerte ca. 230 mAU erreichen.
  10. Sobald die Probe vollständig durch das System injiziert wurde, schalten Sie das Puffersystem auf DF-PBS (am Probenventil) um, um die Aufreinigung fortzusetzen. Klicken Sie erneut auf Fraktionierung , wenn der UV-Wert ca. 1600 mAU erreicht.
    HINWEIS: Dies entspricht der Schnittmenge zwischen UV-Messwerten und Leitfähigkeitsmesswerten. Eine längere Fraktionierung verdünnt das Retentat nur, ohne die EV-Ausbeute zu erhöhen.
  11. Kombinieren Sie alle Fraktionen (verdünnte NK-EVs) und lagern Sie sie bei 4 °C, bis sie für die filterbasierte Sterilisation und Ultrafiltration (UF) bereit sind.
  12. Führen Sie DF-PBS weiter aus, bis der UV-Wert ca. 1000 mAU erreicht. Stoppen Sie danach die Ausführung und speichern Sie das Chromatogramm als PDF-Dokument.

3. Sterilisation und Konzentration von NK-EV-Produkten auf Basis von Filtern durch UF

  1. Die Zentrifuge auf 10 °C abkühlen lassen. Desinfizieren Sie jede Komponente des UF-Geräts (siehe Materialtabelle), indem Sie mit 20 - 30 ml 90%igem Ethanol spülen. Bei 4000 x g 5 - 10 min schleudern.
    HINWEIS: Der Filter besteht aus 10 kDa MWCO regenerierter Zellulose.
  2. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie dann die Spülung mit sterilem PBS, um das Gerät auszugleichen. Wiederholen Sie dies insgesamt 2x.
  3. Um die Sterilität zu maximieren, filtrieren Sie die verdünnte NK-EV-Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter, der mit DF-PBS vorgetränkt wurde (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie das Filtrat direkt in der sterilisierten Konzentrationsvorrichtung.
  4. Schleudern Sie bei 4000 x g für 15 - 40 min (die Schleuderzeit ist probenabhängig). Mischen Sie die Lösung nach dem Schleudern mit einer serologischen Pipette im oberen Filterfach. Bei 4000 x g weitere 10 min schleudern.
    HINWEIS: Der Mischschritt ist optional, da er lediglich den Konzentrationsschritt erleichtert, indem er verhindert, dass die Membran durch EVs verstopft wird.
  5. Legen Sie den Durchfluss vorübergehend beiseite und entnehmen Sie die NK-EV-Probe, indem Sie die Filtrationsvorrichtung umdrehen und an der Auffangvorrichtung anbringen.
  6. Bei 2000 x g 2 min schleudern. Übertragen Sie das gereinigte NK-EV-Produkt in ein 2-ml-Röhrchen. Lagern Sie das gereinigte NK-EV-Produkt bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch (≤ 7 Tage) oder gefroren bei -20 °C für den langfristigen Gebrauch.

4. NK-EV-Charakterisierung durch Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

  1. Bereiten Sie die Lösung vor und filtrieren Sie sie zweimal bei 0,1 μm (siehe Materialtabelle): Wasser, PBS, Reinigungslösung (10% Bleiche (VORSICHT) in Wasser).
  2. Starten Sie das NTA-System gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie auf ähnliche Weise die CIP-Schritte (Clean-in-Place) vor und nach dem Lauf aus. Waschen Sie alle Fäden und spülen Sie sie mit doppelt gefiltertem (DF) Wasser, Reinigungslösung und DF-Wasser. Äquilibrieren Sie die Linien mit DF-PBS.
  3. Überprüfen Sie die Durchflusszelle und prüfen Sie, ob Luftblasen vorhanden sind. Entfernen Sie Blasen, falls vorhanden. Sobald das Licht frei ist, setzen Sie die Durchflusszelle vorsichtig wieder in das NTA-Gerät ein.
    HINWEIS: Obwohl vom Hersteller nicht empfohlen, können sehr schwer zu entfernende Luftblasen leicht durch Spülen mit 20%igem Ethanol und dann DF-Wasser entfernt werden.
  4. Sobald die Durchflusszelle eingesetzt und die Tür geschlossen ist, klicken Sie auf Kamera starten. Wenn die Linien mit DF-PBS gefüllt sind, sollte das Sieb eine absolute Mindestanzahl an Partikeln anzeigen.
  5. Ändern Sie die Aufnahmeeinstellungen auf eine Bildschirmverstärkung von 2 und eine Kamerastufe von 14. Schalten Sie außerdem die Heizung ein, um die Durchflusszelle temperaturstabil zu halten.
  6. Klicken Sie auf Standardmessung , um auf der Registerkarte SOP ein Skript für die Erfassung einer Erfassung über 1 Minute bei einer Durchflussrate von 30 Partikeln/Bild und 23 °C zu erstellen.
  7. Fügen Sie direkt darunter den Ordner- und Dateinamen zum Pfadnamen hinzu, um die Daten zu speichern.
  8. Bereiten Sie im Voraus Verdünnungen des gereinigten NK-EV-Produkts mit DF-PBS vor. Bei der Ausführung von NTA sind für eine genaue Quantifizierung 30 - 80 Partikel/Frame erforderlich.
  9. Wirbeln Sie die Probe vor, bevor Sie sie in die Spritze laden (siehe Materialtabelle).
  10. Schließen Sie die 1-ml-Entnahmespritze vorsichtig an die Instrumentenladeleitung an. Es sollte keine Luft vorhanden sein, da dies die Erfassung und Analyse negativ beeinflusst. Drücken Sie die Hälfte der Probe langsam hindurch und lassen Sie etwa 0,5 ml in der Spritze.
  11. Sobald die Partikel auf dem Bildschirm sichtbar sind, fokussieren Sie die Kamera so, dass sich maximal ein Halo um jedes Partikel herum befindet. Klicken Sie auf der Registerkarte Hardware mit einer Rate von 1000 für 5 s auf Infusion . Reduzieren Sie es dann auf eine Rate von 30.
  12. Drücken Sie auf Skript ausführen und folgen Sie den Anweisungen. Die Software stellt sicher, dass die Temperatur eingestellt ist, und fragt, ob die Einstellungen korrekt sind. Klicken Sie auf Ja und folgen Sie den Anweisungen der Software.
  13. Klicken Sie nach Abschluss der Erfassung auf Abbrechen , wenn die Software Sie auffordert, Dateien zu verarbeiten oder zu exportieren. Klicken Sie auf der Registerkarte Hardware mit einer Rate von 1000 für 10 - 15 s auf Infusion . Schalten Sie in der Zwischenzeit die Heizung und die Kamera wieder ein. Verringern Sie dann die Rate auf 30, bis sich die Partikel bewegen.
  14. Sammeln Sie vier weitere Aufnahmen, indem Sie die vorherigen Schritte wiederholen. Sobald insgesamt fünf Erfassungen pro Verdünnung aufgezeichnet wurden, führen Sie die Analyse durch, nachdem Sie alle fünf Erfassungen importiert haben.
  15. Wählen Sie die zu verarbeitenden Dateien aus, indem Sie sie markieren. Klicken Sie auf Ausgewählte Dateien verarbeiten. Passen Sie auf der Registerkarte Prozess die Analyseeinstellungen auf eine Bildschirmverstärkung von 2 und einen Erkennungsschwellenwert von 15 an.
    Die Einstellungen sind sample-abhängig; Stellen Sie sicher, dass 30 - 80 Partikel pro Bild sichtbar sind.
  16. Aktivieren Sie diese Option und klicken Sie auf OK für die Analyse.
  17. Sobald die Dateien verarbeitet sind, fordert die Software Sie auf, sie zu exportieren. Klicken Sie auf Ja , ohne auf weitere Felder zu klicken, oder klicken Sie auf Exportieren.
  18. Wiederholen Sie den Vorgang für alle EV-Verdünnungen oder Proben. Schalten Sie das NTA-Gerät aus, nachdem alle Proben abgeschlossen und die CIP abgeschlossen ist.

5. Prüfung der Qualitätssicherung

  1. Führen Sie mikrobielle Tests mit zwei Tests durch: 1) Ein kleines Aliquot gereinigter NK-EVs wird in autoklaviertes LB-Bouillonmedium gespickt, und 2) ein kleines Aliquot gereinigter NK-EVs wird für den Mykoplasmen-PCR-Nachweis verwendet (siehe Materialtabelle).
    1. Test 1: LB-Medium bis zu 5 Tage lang bei 37 °C kultivieren, einschließlich Positiv- und Negativkontrollen. Nehmen Sie bei Bedarf den OD600 auf.
    2. Test 2: Führen Sie den Mykoplasmen-PCR-Nachweis gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
  2. Quantifizieren Sie Protein und dsDNA auf gereinigten NK-EV-Verdünnungen mit fluorometerbasierten Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).

6. Wirksamkeitsbewertung von NK-EV-behandelten Krebszellen unter Verwendung eines validierten hochsensitiven Resazurin-basierten Zellviabilitätsassays 20

  1. Kulturieren Sie humane K562-Leukämiezellen mit RPMI-1640 einige Tage lang mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, bevor Sie den Wirksamkeitstest durchführen (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Dichte zwischen 2 - 8 x 105 Zellen/ml und wechseln Sie das Medium alle 2 - 3 Tage.
  2. Erwerben Sie eine 96-Well-Platte mit flachem Boden (siehe Materialtabelle) und fügen Sie präventiv das für die Normalisierung erforderliche Volumen des Untersuchungsmediums (ergänzt mit 5 % EV-abgereichertem FBS) hinzu (siehe Materialtabelle). Das Endvolumen beträgt 150 μL/Well.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um die Schwankungen von Well zu Well zu reduzieren.
  3. Entnehmen Sie die Zellkultur und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen. Bei 300 x g 5 min schleudern. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 - 5 ml Testmedium in eine Einzelzelllösung.
  4. Entnehmen Sie ein Aliquot von 20,5 μl der Zellsuspension für die Zellzählung auf einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).
  5. Zu dem Aliquot der 20,5-μl-Zellsuspension wird die gleiche Menge AO/PI-Farbstoff hinzugefügt (siehe Materialtabelle) und mindestens 10x auf- und abgemischt.
    HINWEIS: Wir empfehlen AO/PI für eine genaue Zellzählung. Alternativ können Sie ein Hämozytometer für die manuelle Zählung verwenden.
  6. Laden Sie 20 μl in jede Zählkammer des Zählobjektträgers und führen Sie die automatische Zellzählung mit dem entsprechenden Programm durch. Mittelwerten Sie die Konzentration lebender Zellen und erfassen Sie die Lebensfähigkeit.
  7. Übertragen Sie ca. 1 x 106 Zellen in ein Sekundärröhrchen. Verdünnen Sie die Zellen auf genau 7 ml Testmedium und wiederholen Sie die Zellzählung. Die Konzentration sollte ungefähr 1,2 - 1,5 x 105lebende Zellen/ml betragen.
  8. Wie oben beschrieben, passen Sie die Konzentration der Einzelzellsuspension auf 1 x 105 lebende Zellen/ml an und wiederholen Sie die Zellzählung bei Bedarf.
    HINWEIS: Der Variationskoeffizient zwischen den Zählungen technischer Duplikate sollte weniger als 25 % betragen. typischerweise liegt sie bei AO/PI-Zählung bei weniger als 5 %.
  9. Sobald die gewünschte Konzentration erreicht ist, geben Sie 50 μl (± 1 μl) dieser Lösung in jede Vertiefung, um so nah wie möglich an 5000 Zellen/Vertiefung (4900 - 5100 Zellen/Vertiefung) zu kommen. Bereiten Sie technische Triplikate für jede Assay-Bedingung vor und verwenden Sie einen Repeater-Pipettierer, um die Variation von Bohrung zu Bohrung zu reduzieren.
  10. Übertragen Sie die Platte für 2 Minuten in einen Orbitalschüttler (350 - 500 U/min). Übertragen Sie die Zellen zurück in den Inkubator, bis sie mit der NK-EV-Behandlung fortfahren können.
  11. Bereiten Sie die erforderlichen NK-EV-Verdünnungen (1:5, 1:10 und 1:100) mit einem Testmedium vor.
  12. Bei diesen Verdünnungen sind die folgenden EV-Konzentrationen zu prüfen: 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 10 9, 1 x 1010, 5 x 1010 und 1 x 1011 Partikel/ml. Das Dosierungsvolumen ist auf 20% des gesamten Assayvolumens begrenzt.
  13. Sobald dies fertig ist, übertragen Sie das erforderliche Volumen einer bestimmten Verdünnung in die Vertiefungen, die eine gewünschte EV-Konzentration für die Behandlung benötigen. Geben Sie 15 μl 10x Triton-X in die Positivkontrollvertiefung (siehe Materialtabelle). Das endgültige Well-Volumen sollte auf 150 μl normiert werden.
  14. Die Platte für 2 min in einen Orbitalschüttler (350 - 500 U/min) geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C im 5% CO2 -Inkubator für 3 h.
  15. Erwärmen Sie den Plattenleser (siehe Materialtabelle) auf 37 °C und laden Sie das folgende Skript: 37 °C (reduziert temperaturbedingte Schwankungen), 450 U/min Mischen für 1 Minute (stellt die Homogenität der Probe sicher) und lesen Sie es ab.
  16. Geben Sie 15 μl des Reagenzes auf Resazurinbasis in jede Vertiefung (siehe Materialtabelle). Schützen Sie das Reagenz vor Licht und verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um Schwankungen von Bohrung zu Bohrung zu reduzieren.
  17. Die Platte für 2 min in einen Orbitalschüttler (350 - 500 U/min) geben. Die Platte in den Inkubator geben und 60 min inkubieren. Entfernen Sie Luftblasen mit einer in Ethanol getauchten Pipettenspitze. Leseplatte mit einer Anregung von 560 nm und einer Emission von 590 nm.
  18. Datenanalyse: Durchschnittliche technische Replikate wurden gemittelt und für den Hintergrund korrigiert, bevor eine Dosis-Wirkungs-Analyse unter Verwendung einer nichtlinearen Regression für den Hemmeffekt durchgeführt wurde, die die Steigung des log(Inhibitors) im Vergleich zur normalisierten Antwortvariablen ohne Einschränkung zeigte. Notieren Sie die Werte für Hillslope und EC50 .

Ergebnisse

NK-EVs besitzen inhärente zytotoxische Funktionen und haben eine hohe Wirksamkeit gegen verschiedene Krebsmodelle gezeigt. Es bedarf jedoch einer stärkeren Standardisierung in den aktuellen Studien hinsichtlich eines Bioproduktions-Workflows, der für die großtechnische Produktion von NK-EVsgeeignet ist 6,21. In unserer vorherigen Studie wurde die Machbarkeit eines geschlossenen Hohlfaser-Bioreaktors (HFB) zur Herstellung großer Mengen hochreiner NK-EV-Produkte beschrieben7. Im Anschluss daran wird in dieser protokollbasierten Studie der Arbeitsablauf der Bioproduktion detailliert beschrieben und seine Reproduzierbarkeit durch Herstellung und Isolierung des NK-EV-Produkts nachgewiesen (Abbildung 1). Darüber hinaus ist eine wesentliche Produktcharakterisierung und -validierung erforderlich, bevor die Produktfreigabe durchgeführt wird, wobei in dieser Studie neue und originelle Daten vorgestellt werden.

Das HFB-System wurde aufgrund seiner Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit, Skalierbarkeit und GMP-Konformität für die NK-EV-Produktion ausgewählt7. In Anlehnung an den Aufbau des HFB-Systems werden die NK-Zellen durch den linken ECS-Anschluss injiziert und in die Bioreaktorpatrone eingesät (Abbildung 2). Gleichzeitig wird die Medienflasche über die seitlichen Anschlüsse mit dem HFB verbunden, und das Medium kann durch das System fließen. Die NK-Zellen werden in serum-, xeno-, feeder- und antibiotikafreien Medien kultiviert, wobei das Medium ausgetauscht wird, wenn der Glukosegehalt unter 50 % fällt, um die Zellgesundheit im Laufe der Zeit zu erhalten und zu maximieren. CM wird täglich gesammelt, durch Differenzzentrifugationen verarbeitet und bis zur weiteren Verarbeitung gefroren (-80 °C) aufbewahrt. Anschließend erfolgt die EV-Isolierung durch eine Kombination aus Differenzzentrifugationen und FPLC-SEC in Verbindung mit UF und Filtration (Abbildung 3). Das Ergebnis ist ein konzentriertes und steriles NK-EV-Produkt mit einem Endvolumen von ca. 1,0 - 1,5 mL. Ein repräsentatives Chromatogramm der FPLC-SEC-Isolierung von NK-EVs ist vorhanden (Abbildung 4). Vor der FPLC-SEC-Verarbeitung wird das NK-EV-reiche CM mit Endonukompaktase behandelt, wodurch der dsDNA-Gehalt, eine potenzielle Wirtszellkontaminante (NK), signifikant reduziertwird 7. Somit entfernt der beschriebene Arbeitsablauf zur EV-Isolierung zelluläre Trümmer und RNA/DNA-Verunreinigungen aus dem NK-EV-Produkt, was für die Gewährleistung eines geringen und unerwünschten immunogenen Potenzials und der Eignung des Endprodukts für nachgelagerte Studien unerlässlich ist.

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Abbildung 4: NK-EV-Isolationschromatogramm, das während des Größenausschlusses der Fast-Protein-Flüssigchromatographie erstellt wurde. Die blaue Linie stellt die Extinktion (mAU; maximaler Messwert von 2000 mAU) dar, die rote Linie stellt die Leitfähigkeit dar, der rote Text stellt das Laufprotokoll dar und der grau schattierte Bereich stellt die fraktionierten NK-EVs dar (gekennzeichnet durch die Fraktionen T2 - T7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nach der Isolierung werden grundlegende NK-EV-Charakterisierungs- und Qualitätssicherungstests durchgeführt, um zu bewerten, ob das NK-EV-Produkt für weitere nachgelagerte Experimente freigegeben werden kann. Der Partikelgrößenbereich und die Partikelkonzentration des NK-EV-Produkts werden mittels Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) mit Größen von 76,30 bis 174,30 nm (D10 von 78,38 ± 2,07 nm, D50 von 106,72 ± 2,43 nm und D90 von 169,80 ± 4,17 nm) und einer durchschnittlichen Konzentration von 1,39 x 1012 EVs/ml gemessen (Abbildung 5A-B). Darüber hinaus zeigte die Fluorometer-Quantifizierung eine Protein- und dsDNA-Konzentration von 298,90 ± 66,62 mg/ml bzw. 225,60 ± 37,7 ng/ml für das Endprodukt (Abbildung 5C-D). Dies entspricht einem durchschnittlichen Verhältnis von 5,06 x 106 EV/μg Protein und 6,16 x 1012 EV/μg DNA. Sowohl mikrobielle als auch Mykoplasmentests lieferten negative Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse stimmen mit der Charakterisierung von NK-EVs aus früheren Arbeitenüberein 7. Die frühere Veröffentlichung7 bietet auch eine weitere detaillierte Charakterisierung der NK-EV-Produkte gemäß den MISEV-Richtlinien (d. h. TEM, Western Blot, Endotoxinspiegel, virale Entitäten und Durchflusszytometrie für Oberflächenantigene und Zytokine).

Schließlich wurde die Funktionalität des NK-EV-Produkts (d. h. die Zytotoxizität gegen Krebszellen) mit einem validierten hochsensitiven Resazurin-basierten Zellviabilitätsassay nach einer NK-EV-Behandlung gegen die leukämische Zelllinie K562 7,20 bewertet. Die Behandlung von K562-Zellen mit NK-EVs für 3 h erzeugte einen dosisabhängigen Effekt auf die Zellviabilität, der einem EC50 von 9,33 x 109 EVs/ml entspricht (d. h. die Dosis, die der Abtötung von 50 % der Zellpopulation entspricht; Abbildung 6A-B). Daher wird das NK-EV-Produkt gemäß den skizzierten Kriterien für die Produktfreigabe als geeignet für weitere Experimente erachtet.

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Abbildung 5: Charakterisierung des gereinigten NK-EV-Produkts. (A) Die Größenverteilung des NK-EV-Produkts, gemessen mit NTA, dargestellt als Mittelwert aus 5 unabhängigen Experimenten mit jeweils 10 technischen Replikationen (5 Videoaufnahmen x 2 Verdünnungen). (B) NK-EV-Partikelproduktkonzentration (Partikel/ml), gemessen mit NTA, dargestellt als Mittelwert ± SD aus 5 unabhängigen Experimenten, jeweils mit technischen Duplikaten. (C) Die Proteinkonzentration des NK-EV-Produkts (mg/ml) wurde mit einem Fluorometer gemessen und als Mittelwert ± SD aus 5 unabhängigen Experimenten mit jeweils technischen Triplikaten dargestellt. (D) dsDNA-Konzentration des NK-EV-Produkts (ng/ml), gemessen mit einem Fluorometer, dargestellt als Mittelwert ± SD aus 5 unabhängigen Experimenten mit jeweils technischen Triplikaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Funktionsvalidierung des gereinigten NK-EV-Produkts. NK-EVs zeigen eine dosisabhängige Zytotoxizität gegen humane K562-Leukämiezellen, die 3 Stunden lang in verschiedenen NK-EV-Konzentrationen mit einem hochsensitiven Resazurin-basierten Zellviabilitätsassay behandelt wurden. (A) Normalisierte Assay-Messwerte (die grüne Linie stellt die unbehandelte K562-Leukämiezellkontrolle dar, und die schwarze gestrichelte Linie stellt die lysierte K562-Leukämie-Totzellenkontrolle dar; mit Detergenzien behandelt). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM aus 11 unabhängigen Experimenten mit technischen Triplikaten dargestellt. (B) EC50-Kurvenanalyse mit variabler Steigung für die NK-EV-Behandlung mit 95 % Konfidenzintervall/Vorhersagebändern (die rote gestrichelte Linie steht für 50 % Ansprechen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Mehrere Studien deuten darauf hin, dass NK-EVs ein enormes Potenzial als Anti-Krebs-Therapeutikum besitzen 4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Für weitere präklinische Tests und zukünftige klinische Anwendungen ist jedoch ein skalierbares, GMP-konformes Bioproduktionssystem erforderlich, das in der Lage ist, große Mengen an hochreinen NK-EVs zu produzieren. Um dieses Problem zu lösen, wurde in einer früheren Studie ein geschlossenes HFB-System verwendet, um kontinuierlich NK-Zellen und NK-EV-reiche CM zu produzieren, die für nachgelagerte Experimente geeignet sind. Aufgrund ihres 3D-Designs spiegeln HFB-Systeme die Bedingungen des Gefäßsystems genau wider und verfügen über ein unglaublich hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, wodurch mehr als eine Milliarde Zellen in Kultur verbleiben können, was letztendlich zu einer verbesserten EV-Produktion führt 7,31,32. Wichtig ist, dass diese Arbeit die erste war, die jemals über die Verwendung eines HFB-Systems zur Kultivierung von NK-Zellen berichtet wurde, wahrscheinlich aufgrund der Selbstversorgung der Zelllinie IL-27.

Es müssen zusätzliche Schritte unternommen werden, um die Sterilität des HFB-Systems und die Herstellung von hochreinen NK-EVs sicherzustellen. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind besonders wichtig, wenn es keinen sterilen, sauberen Raum gibt, wie es bei mehreren Forschungseinrichtungen der Fall sein kann. Vor dem Betreten der Biosicherheitswerkbank wird das HFB-System sorgfältig mit 70%igem Ethanol besprüht, um alle Außenflächen zu desinfizieren. Zusätzlich sind alle Luer-Lock-Anschlüsse mit einem Wachsfilm umwickelt, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, da bei diesem Arbeitsablauf der Bioproduktion keine Antibiotika verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie das biochemische Profil von Zellen und zellabgeleiteten Produkten beeinflussen33. Verschiedene Metriken wurden verwendet, um die Zellgesundheit während der Bioproduktion von Zellprodukten zu bewerten. Zum Beispiel wurden tägliche Bewertungen des pH-Werts, der Glukose- und des Laktatspiegels des Reservoirmediums durchgeführt, da diese wichtige Surrogate für die Zellgesundheit für die Überwachung sind. Neben quantitativen Bewertungen sind auch qualitative Beobachtungen des HFB-Systems (z.B. Medienfarbe und visuelle Anzeichen von Kontaminationen wie Trübung) hilfreich für die Überwachung der Zellgesundheit. Es wurde nicht festgestellt, dass die Zellzählung bei täglich entnommenen CM eine repräsentative Metrik für die Lebensfähigkeit der Kultur ist (Daten nicht gezeigt). Dies ist wahrscheinlich das Ergebnis von toten Zellen, die während der CM-Probenahme entnommen wurden und in den Schläuchen gefunden wurden, in denen das Medium nicht zirkulieren durfte (der kleine Abschnitt zwischen dem ECS und dem ECS-Spritzenanschluss), wodurch die Lebensfähigkeit der gesamten Zellkultur unterbewertet wurde. Nur geerntete NK-Zellen, die vom HFB am Ende einer Produktionscharge produziert werden, können eine zuverlässige Metrik für den Gesundheitszustand der Kultur liefern. Diese Zellen zeigten über alle Produktionschargen hinweg durchweg Viabilitätswertevon über 70 %. Zusammen stellen diese Qualitätsbewertungsmethoden die kontinuierliche Produktion von hochreinen NK-EVs sicher.

Es wurden mehrere Isolationstechniken entwickelt, um EVs zu reinigen undzu isolieren 34. Eine Methode, SEC, verwendet eine Säule, die mit einem porösen Material - Harz - gefüllt ist, was eine Molekültrennung auf der Grundlage von Größenunterscheidung ermöglicht. Hier werden die größeren EVs schneller durch die Säule eluiert; Diese Methode wird als Durchflussreinigung auf der Grundlage des Größenausschlusses bezeichnet. Gleichzeitig werden kleinere Verunreinigungen (dsDNA, frei schwebende Proteine wie Endonuklease, Salze, Phenolrot usw.) zurückgelassen und durch elektrostatische Kräfte weiter im Harz zurückgehalten (d.h. es wurde ein bimodales Harz verwendet). Die SEC-basierte Prozessierung entfernt nicht-EV-gebundene Proteine unter Beibehaltung der ursprünglichen EV-Struktur und -Funktionalität35,36. Darüber hinaus ist die SEC-basierte Reinigung leicht skalierbar, ohne die hohe Ausbeute und Reinheit zu beeinträchtigen, was sie zu einer geeigneten Wahl für die Isolierung von NK-EVs für biotherapeutische Anwendungen macht. Trotz dieser Vorteile hat SEC einige Nachteile, wie z. B. den relativ verdünnten Durchfluss (Eluent); Daher ist UF für die Produktkonzentration erforderlich, ermöglicht aber auch den Austausch von Puffern. Das unsterile UF-Gerät wird mit 70 % Ethanol und PBS gespült und vor der Verwendung in der Biosicherheitswerkbank aufbewahrt, um die Sterilität zu gewährleisten. In der Regel kann der Durchfluss auf das 35- bis 50-fache des ursprünglichen Volumens konzentriert werden, während kleine Moleküle entfernt werden, die in den Eluenten gelangt sein könnten. Eine differentielle Zentrifugation und eine Endonuklease-Behandlung werden vor der FPLC-SEC-Kopplung mit UF durchgeführt, um Restzellen, zelluläre Trümmer und lange Stränge antigener dsDNA7 zu entfernen.

Im Anschluss an die Isolierung des NK-EV-Produkts werden die Charakterisierung und die Funktionsvalidierung gemäß den Richtlinien in MISEV2018 und MISEV2023 durchgeführt, um die Eignung des Produkts für die weitere Verwendungzu bestimmen 6,18. Jede Isolierung ergibt 1,0 - 1,5 mL hochreines NK-EV-Produkt bei einer Mindestkonzentration von 1 x 1012 EVs/ml mit einer durchschnittlichen Konzentration von 1,39 x 1012 Partikeln/ml. Zuvor hatten Gupta et al. festgestellt, dass die mediane EV-Dosis in vivo 3,37 x 108 EVs/kg Körpergewicht von Mäusenbeträgt 37. Die Behandlung mit der Mediandosis würde 8,43 x 106 EVs/Maus bei einem Körpergewicht von 25 g erfordern, ein Wert, der weit unter dem garantierten Minimum (1 x 1012 Partikel/ml) liegt, das durch diesen Arbeitsablauf erhalten wird. Somit kann der beschriebene Biomanufacturing-Workflow mehr als genug NK-EVs für präklinische Experimente oder zur Erreichung von Dosierungszielen produzieren. Jede Isolierung wird im Rahmen der Qualitätskontrolle des Produkts auf das Vorhandensein von Mykoplasmen und Mikroben getestet. Darüber hinaus zeigte eine frühere Studie das Fehlen gemeinsamer viraler Entitäten und Endotoxine im Endprodukt sowie das Fehlen von zellulären Komponenten, die als Wirtszellkontaminanten gelten (durch Western-Blot-Analyse)7,34. Schließlich wurde die Funktionsbewertung mit einem validierten hochsensitiven Resazurin-basierten Zellviabilitätsassay durchgeführt, um die Funktionalität der NK-EVs zu beurteilen20. Der beschriebene Viabilitätsassay funktioniert, indem er Resazurin (schwach fluoreszierend) zu Resorufin (stark fluoreszierend) durch metabolisch aktive Zellen reduziert, was die Beurteilung der Zellviabilität nach einer NK-EV-Behandlung ermöglicht. Im Vergleich zu anderen alternativen Zellviabilitätsassays ist der in der Studie verwendete Resazurin-basierte Assay sehr empfindlich gegenüber Veränderungen der Zellviabilität (sehr geringes Hintergrundrauschen) und ermöglicht eine verkürzte Inkubationszeit zur Beobachtung der Ergebnisse (weniger als 30 Minuten, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten)20. Im Allgemeinen zeigen die NK-EVs einen dosisabhängigen Effekt auf die Lebensfähigkeit von K562. Zusammengenommen stellen die vorgestellten Ergebnisse ein NK-EV-Produkt dar, das die Produktfreigabekriterien für die präklinische Bewertung erfüllt hat und für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese protokollbasierte Studie die Bioproduktion von NK-EVs mit klinischem Potenzial beschreibt. Wie bereits erwähnt, werden die NK-EVs unter Verwendung eines geschlossenen HFB-Systems unter serumfreien, xenofreien, feederfreien und antibiotikafreien Bedingungen hergestellt7. Eine Kombination aus FPLC-SEC/UF isoliert und reinigt das NK-EV-Produkt. Vor der Freigabe der Produkte für die nachgelagerte Anwendung müssen die NK-EVs charakterisiert und funktional validiert werden, um sicherzustellen, dass sie für den Einsatz geeignet sind. Wie gezeigt, kann die Befolgung dieses Bioproduktionsprotokolls erfolgreich eine große Menge an hochreinen NK-EVs erzeugen, die eine On-Target-Zytotoxizität gegen Krebszellen aufweisen. Daher kann das beschriebene Bioproduktionsprotokoll eine Bereicherung für zukünftige Studien sein, die die Herstellung von NK-EVs in klinischer Qualität erfordern.

Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt oder keine Offenlegung vorliegt.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Simon Sauvé, Dr. Roger Tam und Dr. Xu Zhang für ihre kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse aus der Genomics Research and Development Initiative (GRDI) Phase VII (2019-2025) der kanadischen Regierung unterstützt, die von JRL, LW erhalten wurden, sowie durch Betriebszuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council RGPIN-2019-05220, der Cancer Research Society/University of Ottawa 24064, des Research Operating Grant der Canadian Institutes of Health (CIHR) 175177 von LW erhalten, das CIHR MSc-Stipendium, das von MK erhalten wurde, und die Queen Elizabeth II Scholarships in Science and Technology (QEII-GSST), die von der FSDB erhalten wurden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 &Mikro; m Vakuum-Filteranlage Filtropur V50 Sarstedt83.3941.002
0,22 &Mikro; m Acrodisc Spritzenfilter Pall CorporationPN4612
1-ml-SpritzeThermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 kDa Centricon Plus-70 ZentrifugalfilterSigmaUFC701008
60 mL Spritze BD Biosciences309653
96-Well-Mikrotiterplatten aus schwarzem Polystyrol mit flachem, klarem Boden und TC-Behandlung Costar3603
Agarose Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Flüssigchromatograph für schnelles ProteinGE Lifesciences29022094
BD PrecisionGlide Nadel - 18GBD Biosciences305196
Benzonase-Nuklease SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Multimode ReaderBioTek SH1M2G-SN
Blausaft-Gel-LadepufferInvitrogen10816015
CaptoCore 700 Harz Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 ViabilitätszählerNexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 GefriermediumSigmaC2874
DPBS−/−  FisherBP399-1
Dual-LED-Durchleuchter mit blauem/weißem LichtInvitrogenLB0100
Duet P3202 DurchflussregelpumpeFiberCell Systems
phosphatgepufferte KochsalzlösungGibco14190250
 Kommerzielle AlkoholeP006EAAN
Exosom-depletierte FBS GibcoA2720803
Fluorobrite DMEM GibcoA18967-01
GlukosemessgerätAccuCheckModell 930
HiScale Chromatographiesäule 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (GMP-Medium-Alternative)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF T-Zell-Expansionsmedium StemCell Technologies10981
Isopropylalkohol EMDPX1834-1
K562 ZellenATCCCCL-243
LB Medien  BioBasicSD7002
L-Laktat-Assay-Kit Abcamab65331
Mittlere Hohlfaserkassette FiberCell SystemsC2011
MgCl2 SigmaM1028
Mykoplasmen-PCR-Nachweiskit Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH SupelcoSX0607N-6
NK92-MI Zellen ATCCCRL-2408
pH-Streifen-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS Reagenz für die ZellviabilitätInvitrogenP50200
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231 
Qubit Flex Assay Röhrchen-Streifen InvitrogenQ33252
Qubit Flex Fluorometer InvitrogenQ33327
Qubit Protein BR Assay-Kit InvitrogenA50669
Quick Load 1Kb Plus DNA-Leiter NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
SpritzenpumpeHarvard-Gerät984730
Triton-X 100 SigmaT-9284
UltraPure TAE Puffer Invitrogen15558042
ViaStain Acridine Orange und Propidium Iodid (AO/PI) Färbelösung ESBE WissenschaftlichCS2-0106
Die Ethanol von Dulbecco

Referenzen

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

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