Methodenartikel

Erzeugung von 3D-Mittelhirn-Organoiden aus human-induzierten pluripotenten Stammzellen

DOI:

10.3791/67228

⸱

14. Februar 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Herstellung von 3D-Mittelhirn-Organoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die ihre Bildung so steuern, dass sie natives Mittelhirngewebe nachahmen, wodurch die Erforschung von Entwicklung und Störungen unterstützt wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung von Mittelhirn-Organoiden (MOs) aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) stellt einen bedeutenden Fortschritt für das Verständnis der Gehirnentwicklung, die Erleichterung einer präzisen Krankheitsmodellierung und die Förderung der therapeutischen Forschung dar. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Generierung von Mittelhirn-spezifischen Organoiden unter Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung eines strategischen Differenzierungsansatzes. Zu den Schlüsseltechniken gehören die Dual-SMAD-Hemmung zur Unterdrückung der SMAD-Signalgebung, die Verabreichung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors 8b (FGF-8b) und die Aktivierung des Sonic Hedgehog-Signalwegs mit dem Agonisten Purmorpholamin, der iPSCs in ein Schicksal des Mittelhirns führt.

Die mit dieser Methode hergestellten Organoide erreichen Durchmesser von bis zu 2 mm und umfassen eine Vielzahl von Neuroepithelzelltypen, die die dem Mittelhirn innewohnende zelluläre Vielfalt widerspiegeln. Die Validierung dieser Organoide als authentische Strukturen des Mittelhirns beinhaltet die Expression von mittelhirnspezifischen Markern, die ihre Identität bestätigen. Ein bemerkenswertes Ergebnis dieser Methodik ist die effektive Differenzierung von iPSCs in dopaminerge Neuronen, die für das Mittelhirn charakteristisch sind.

Die Bedeutung dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, funktionell ausgereifte, mittelhirnspezifische Organoide herzustellen, die wesentliche Aspekte des Mittelhirns genau nachbilden und ein wertvolles Modell für die eingehende Erforschung der Entwicklungsprozesse des Mittelhirns und der Pathophysiologie verwandter Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit bieten. Daher dient dieses Protokoll als wichtige Ressource für Forscher, die unser Verständnis des menschlichen Gehirns verbessern und neue Behandlungen für neurodegenerative Erkrankungen entwickeln wollen, was es zu einem unverzichtbaren Werkzeug auf dem Gebiet der neurologischen Forschung macht.

Einleitung

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Das menschliche Gehirn mit seiner komplizierten Architektur und seiner komplexen zellulären und molekularen Zusammensetzung stellt die neurowissenschaftliche Forschung vor gewaltige Herausforderungen, insbesondere im Zusammenhang mit der Modellierung von Krankheiten und der Entwicklung zellulärer Therapien1. Diese Herausforderungen werden durch die begrenzte Verfügbarkeit ausgefeilter In-vitro-Modelle, die die Komplexität des menschlichen Gehirns wirklich repräsentieren, noch komplizierter. Jüngste Fortschritte in der Technologie der humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), die eine kontrollierte Differenzierung in spezifische neuronale Subtypen ermöglichen, haben jedoch vielversprechende Wege für die Erforschung der menschlichen Gehirnentwicklung, der Krankheitspathogenese und zellbasierter therapeutischer Strategien eröffnet.

Traditionell sind zweidimensionale (2D) neuronale Kulturen, die aus iPSCs gewonnen werden, der Eckpfeiler von In-vitro-Studien, die darauf abzielen, die neuronale Physiologie und Pathologie des Menschen nachzuahmen. Diese Monolayer-Kulturen haben maßgeblich dazu beigetragen, unser Verständnis neurologischer Erkrankungen zu verbessern und neuroprotektive Wirkstoffezu entdecken 2,3,4,5,6,7. Trotz ihres Nutzens sind diese 2D-Systeme nicht in der Lage, die wahre zelluläre Vielfalt und dreidimensionale (3D) Struktur des menschlichen Gehirns zu emulieren.

Das Aufkommen der Hirnorganoid-Technologie stellt einen bedeutenden Sprung in der In-vitro-Modellierung dar und bietet ein Werkzeug, das die komplizierte Biologie des menschlichen Gehirns innerhalb eines physiologisch relevanten Rahmens genau nachahmt8. Frühe Techniken in der Entwicklung von Hirnorganoiden nutzten die inhärenten regulatorischen Eigenschaften von iPSCs, um spontan Ektodermderivate zu bilden, wodurch die frühen Stadien der Gehirnentwicklung nachgeahmtwurden 5,9,10,11,12. Angesichts der komplexen Netzwerke, die Neuronen mit anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen bilden, ist die 3D-Modellierung für die genaue Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen unerlässlich. 3D-Kulturen bieten eine repräsentativere In-vivo-Umgebung, erleichtern eine beschleunigte neuronale Differenzierung und Netzwerkbildung 12,13,14 und fördern eine breitere Expression neuronaler Gene im Vergleich zu 2D-Kulturen15. Neuronen, die in 3D-Kontexten entwickelt wurden, erreichen Morphologien und physiologische Eigenschaften, die eher an ihre in vivo-Gegenstücke erinnern16.

Die jüngsten Fortschritte bei 3D-Gehirnmodellen waren entscheidend für die effektivere Erfassung der räumlichen und funktionellen Komplexität des menschlichen Gehirns. In den letzten zehn Jahren hat sich die Weiterentwicklung verschiedener Protokolle zur Generierung von Ganzhirn-Organoiden und regionenspezifischen Gehirnmodellen 11,17,18,19,20,21,22 bei der Modellierung neurologischer Erkrankungen wie Mikrozephalie11, Alzheimer 14,23 und Parkinson 24 als unschätzbar wertvoll erwiesen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Erstellung von menschlichen 3D-MOs zu entwickeln und zu verfeinern, die von menschlichen iPSCs abgeleitet sind. Dieses Protokoll zielt speziell darauf ab, Organoide zu erzeugen, die mit dopaminergen Neuronen angereichert und räumlich so organisiert sind, dass sie die natürliche Struktur und Funktionalität des menschlichen Mittelhirns genau nachahmen. Der Hauptzweck dieser Organoide besteht darin, als fortschrittliche In-vitro-Modelle für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit zu dienen und ein genaueres und physiologisch relevanteres System zur Erforschung der neurologischen Entwicklungsprozesse und Pathologien bereitzustellen, die mit dieser Erkrankung verbunden sind. Durch die Nutzung von patienteneigenen iPSCs zur Erzeugung dieser Mittelhirn-spezifischen Organoide zielt das Protokoll darauf ab, das Verständnis der Mechanismen der Parkinson-Krankheit zu verbessern, die Entdeckung potenzieller therapeutischer Ziele zu erleichtern und die Entwicklung zellbasierter Therapien zu verbessern. Durch diesen innovativen Ansatz zielt das Protokoll darauf ab, die Einschränkungen traditioneller 2D-Neurokulturen zu überwinden und einen wichtigen Beitrag zur Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen zu leisten, indem es ein wirksames Werkzeug für die In-vitro-Modellierung von Krankheiten und die Erforschung neuartiger Behandlungsstrategien bietet.

In den letzten 10 Jahren haben verschiedene Forschungsteams Mittelhirn-Organoide (MOs)8,21,25,26,27,28 entwickelt, wobei Methoden verwendet wurden, die mehrere wichtige Ähnlichkeiten aufweisen. In unserem Bestreben, das Verständnis der Parkinson-Krankheit zu vertiefen, haben wir ein Protokoll zur Erstellung von menschlichen 3D-MOs entwickelt, die aus menschlichen iPSCs abgeleitet sind. Diese Organoide, angereichert mit räumlich angeordneten dopaminergen Neuronen, stellen ein ideales Modell für die Erforschung der Parkinson-Krankheit dar. Unsere Entwicklung und Verfeinerung von mittelhirnspezifischen Organoid-Protokollen hat zu fortschrittlichen In-vitro-Modellen geführt, die wesentlich zu unserem Verständnis von neurologischen Entwicklungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen beigetragen haben. Diese Modelle, insbesondere wenn sie auf patienteneigene MOs angewendet werden, haben ihre Wirksamkeit als wirksame Werkzeuge für die In-vitro-Modellierung von Krankheiten unter Beweis gestellt und bieten neue Perspektiven und Methoden auf dem Gebiet der fortschrittlichen 3D-Zellkultur.

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Protokoll

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Die iPSCs, die aus humanen normalen Fibroblasten Detroit 551 und humanen embryonalen Stammzellen (ESCs) der hESC-Linie 360 erzeugt wurden, wie zuvor beschrieben4. Die iPSCs wurden mit Genehmigung des Westnorwegischen Komitees für ethische Gesundheitsforschung REK nr. 2012/919. Alle Zellen wurden regelmäßig mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit auf Mykoplasmenkontamination überwacht. Die Materialtabelle enthält Informationen über alle Materialien, Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendet werden. Tabelle 1 beschreibt die verwendeten Medien und sonstigen Materialien.

1. Auftauen von iPSCs

  1. Matrixbeschichtete Platte und Essential 8 (E8) Mediumvorbereitung
    1. Tauen Sie das Basalmembranmatrix-Fläschchen über Nacht auf Eis auf. 1:100 in kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1 % Endkonzentration) verdünnen (siehe Materialtabelle und Tabelle 1). Lagern Sie die Aliquote für den Langzeitgebrauch bei -20 °C.
    2. Tauen Sie die verdünnte Basalmembran bei 4 °C auf; Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 ml Lösung pro Well. Bei 37 °C 1 h inkubieren.
    3. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
      HINWEIS: Die Platten können maximal 2 Wochen im Kühlschrank aufbewahrt werden (vor Gebrauch auf RT erwärmen). Für eine längere Lagerung geben Sie 1 ml E8 Medium (siehe Materialtabelle und Tabelle 1) in die beschichtete Platte, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden.
  2. E8 mittlere Zubereitung
    1. Kombinieren Sie in einer sterilen Umgebung das E8-Basalmedium mit dem E8-Präparat (siehe Materialtabelle und Tabelle 1).
      HINWEIS: Dieser kann 2 Wochen lang bei 4 °C gelagert werden. Tauen Sie das gefrorene E8-Präparat über Nacht bei 4 °C auf, bevor Sie das volle Medium zubereiten. Nicht bei 37 °C auftauen, da dies die Stabilität beeinträchtigen kann. Erwärmen Sie vor dem Gebrauch nur die erforderliche Menge E8 Medium auf Raumtemperatur (RT), bis es sich nicht mehr kühl anfühlt.

2. Aussaat von iPSCs

  1. Die matrixbeschichteten Platten und E8 Medium bei RT oder Inkubator bei 37 °C vorwärmen.
  2. Nährmedium aspirieren; Spülen Sie iPSCs, die eine Konfluenz von 60 % bis 70 % aufweisen, mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (DPBS Ca2+/Mg2+-frei, 4 mL pro Well in einer 6-Well-Platte).
  3. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,5 mM, 1 mL pro Vertiefung, siehe Materialtabelle und Tabelle 1) zugeben; Bei 37 °C inkubieren, bis sich die Ränder des Bienenvolkes lösen (3-5 min).
  4. Aspirieren Sie die Dissoziationslösung; Um Kolonien zu lösen, pipettieren Sie das vorgewärmte E8 Medium (4 mL pro Well) vorsichtig direkt auf die Kolonien mit einer stärkeren Kraft als üblich aus der Pipette, wodurch eine lokalisierte Flüssigkeitsbewegung über die Zelloberfläche erzeugt wird.
  5. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 auf, indem Sie sie in zwei neue Vertiefungen einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte überführen und 2 ml Medium pro Vertiefung hinzufügen. Anschließend bei 37 °C inkubieren.
  6. Tauschen Sie die Medien täglich aus, bis die Kolonien zu 80% zusammenfließen.
  7. Beobachten Sie die Kolonien mit einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass sie eine angemessene Größe haben, die sich typischerweise durch eine ausgeprägte, runde Form mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1 mm auszeichnet. Vergewissern Sie sich, dass es sich bei den Kolonien um dichte, kompakte Strukturen mit abgegrenzten, glatten Rändern handelt.

3. Neuronale Induktion

  1. Mittlere Vorbereitung und Einrichtung von Tag 0
    1. Bereiten Sie jeweils 500 ml chemisch definiertes Medium (CDM), neuronales Induktionsmedium (NIM) und neuronales Stammzellserum-freies (NSC SF) Medium unter Bezugnahme auf die Materialtabelle und Tabelle 1 vor.
    2. Spülen Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte mit 4 mL DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+- frei) pro Well, gefolgt von der Zugabe von 3 mL NIM pro Well für die Einrichtung an Tag 0.
    3. Ersetzen Sie NIM (3 mL pro Well) an den Tagen 1, 3 und 5; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.
    4. Trennen Sie an Tag 6 die neuralen Rosetten mit den folgenden Schritten in eine Suspensionskultur.
      1. Einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-frei) waschen (4 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Kollagenase IV (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzufügen und 1 Minute inkubieren. Entfernen Sie die Kollagenase IV und spülen Sie sie einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-frei) ab (4 mL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      2. Geben Sie 2 mL NSC SF Medium in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Entfernen Sie die Zellen, indem Sie die Vertiefungsböden abkratzen und mit einer 200-μl-Pipettenspitze Gitter erstellen.
      3. Übertragen Sie die Zellsuspension von der 6-Well-Platte in eine 10 cm große, nicht anhaftende Schale. Stellen Sie das Volumen mit NSC SF Medium auf 12 mL ein.
      4. Die nicht haftende Schale auf den Schüttler (SSM1 Compact Orbital Shaker) bei 85 U/min im Winkel von 0° in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO2 stellen, um eine Aggregation zu verhindern.

4. Musterung des Mittelhirns

  1. An Tag 7 fügen Sie 12 mL CDM mit 100 ng/ml FGF-8b hinzu; Auf den orbitalen Shaker-Inkubator stellen.
  2. Wechseln Sie an den Tagen 8-13 alle 2 Tage das Medium; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.
  3. An Tag 14 fügen Sie 12 ml CDM mit 100 ng/ml FGF-8b und 1 μM Purmorphamin (PM) hinzu; Auf den Orbitalschüttler stellen.
  4. Wechseln Sie an den Tagen 15-20 alle 2 Tage das Medium; Täglich unter dem Mikroskop beobachten.

5. Matrigel-Einbettung und MO-Terminierung und -Reifung

  1. Matrigel auf Eis bei einer Temperatur zwischen 2 °C und 8 °C für eine Dauer von 1-2 h auftauen.
    HINWEIS: Tauen Sie eine ausreichende Menge Matrigel auf, um 15 μl für jeden Embryoidkörper (EB) bereitzustellen. Bewahren Sie Matrigel auf Eis ab, um eine frühe Polymerisation zu vermeiden. Kühlen Sie alle Kunststoffe, die mit Matrigel in Berührung kommen, vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang bei -20 °C ab.
  2. Legen Sie ein steriles Organoid-Einbettblatt in eine leere Schale.
  3. Nehmen Sie das Organoid mit einer 200-μl-Pipettenspitze mit breiter Bohrung vorsichtig aus der Schale und übertragen Sie es mit einem Organoid pro Vertiefung auf die Einbettungsoberfläche. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich 12-16 EBs auf der Einbettungsfläche angesammelt haben.
  4. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medium von jedem EB und fügen Sie dann 15 μl kaltes Matrigel tropfenweise auf jedes EB hinzu. Positionieren Sie das EB mit Hilfe einer Pipette wieder in die Mitte des Matrigel-Tröpfchens.
  5. Inkubieren Sie die Platte in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator für 15-20 Minuten, damit das Matrigel polymerisieren kann.
  6. Heben Sie mit einer sterilen Pinzette das Einbettblatt mit den Matrigel-Tröpfchen an. Halten Sie das Blech direkt über einer Vertiefung in einer 6-Well-Platte mit extrem geringer Haftung. Pipettieren Sie 3 ml CDM mit 10 ng/ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 10 ng/ml Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) und spülen Sie die Matrigel-Tröpfchen vorsichtig aus dem Blatt in jede Vertiefung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 6-8 Matrigel-Tröpfchen in eine Vertiefung überführt sind.
  7. Legen Sie die Platten auf einen Orbitalschüttler in einem 37 °C Inkubator bei 85 U/min und wechseln Sie das CDM alle 3 Tage mit 10 ng/mL BDNF und 10 ng/mL GDNF.
    HINWEIS: Pflegen Sie differenzierende Kulturen bis zu 3 Monate lang; Die neuronale Morphologie tritt 2 Wochen nach der Beendigung auf. BDNF und GDNF sind für eine Kultivierung über 3 Monate hinaus nicht erforderlich.

6. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette, um das Organoid vorsichtig aus dem Medium zu entnehmen, und platzieren Sie es vorsichtig auf einem Objektträger mit minimalem Medium.
  2. Lassen Sie es vollständig an der Luft trocknen und geben Sie 4 % Paraformaldehyd (PFA) (300 μl pro Probe) für 30 Minuten hinzu.
    HINWEIS: PFA ist gefährlich und kann krebserregende Eigenschaften haben. Gehen Sie vorsichtig damit um, vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut und Augen und stellen Sie sicher, dass sie in einem chemischen Abzug verwendet werden.
  3. Geben Sie 30%ige Saccharoselösung (300 μl pro Probe) zu den Objektträgern und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  4. Blockieren und pervenieren Sie die Organoide durch Zugabe von Blockierungspuffer (BB) (300 μl pro Probe), der PBS (mit Ca2+/Mg2+), 0,3 % Triton X-100 und 10 % normales Ziegenserum für 2 Stunden bei RT (oder über Nacht bei 4 °C) enthält. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um die Organoide abzugrenzen und den Puffer auf dem Objektträger einzuschließen.
  5. Die Proben werden mit einem geeigneten Volumen Primärantikörper in Blockierungspuffer (300 μl pro Probe), Anti-Forkhead-Box-Protein G1 (FOXG1, 1:200), Anti-Orthodentikel-Homöobox 2 (OTX2, 1:100), Anti-Forkhead-Box A2 (FOXA2, 1:100), Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH, 1:100), Anti-SRY (geschlechtsbestimmende Region Y)-Box 2 (SOX2, 1:100), anti-gepaartes Box-Protein (PAX6, 1:100) und anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2 1:500) abgedeckt. und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln inkubieren (siehe Materialtabelle).
  6. Waschen Sie die Proben in 1x PBS für 3 h mit zwei bis drei Pufferwechseln auf einer leicht schaukelnden Plattform.
  7. Inkubieren Sie mit dem Sekundärantikörper (300 μl pro Probe), anti-Alexa Fluor 488 (1:800), anti-Alexa Fluor 594 (1:800) und anti-Alexa Fluor 647 (1:800) über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Dunkelkammer. Fügen Sie gleichzeitig Hoechst 33342 (1:5.000) Kernfleck hinzu (siehe Materialtabelle).
  8. Entfernen Sie den Antikörper, spülen Sie ihn schnell mit PBS aus und fügen Sie anschließend 1-2 Tage lang bei 4 °C PBS mit 0,01 % Natriumazid hinzu, um eine Kontamination zu verhindern.
  9. Aspirieren Sie das PBS, entfernen Sie überschüssige Lösung und mounten Sie die Organoide mit einem Einbettmedium (siehe Materialtabelle). Legen Sie ein Deckglas an, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, und lagern Sie es mindestens 12 Stunden lang in einem dunklen Raum bei RT, damit das Eindeckmedium vollständig polymerisieren kann.
    HINWEIS: Die Probe ist nun bereit für die Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop.

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Ergebnisse

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In dieser Studie stellen wir ein bahnbrechendes Protokoll für die Ableitung von MOs aus iPSCs vor. Im Mittelpunkt unserer Methodik steht der innovative Einsatz der Dual-SMAD-Hemmung, synergetisch kombiniert mit FGF-8b und dem Sonic Hedgehog (SHH)-Signalweg-Agonisten Purmorphamin (PM). Dieser Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Differenzierungsprozess beginnt damit, dass iPSCs in Richtung Neuroektodermlinie gelenkt werden und neuroepitheliale oder neurale Rosettenkolonien bilden. Dies ...

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Diskussion

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In dieser Untersuchung haben wir eine Methodik zur Unterscheidung von MO von iPSCs entwickelt. Unser Protokoll verwendet eine duale SMAD-Hemmstrategie, die mit morphogenen Faktoren wie FGF-8b und dem SHH-Agonisten PM verstärkt ist. Dieser Ansatz simuliert genau die Entwicklungshinweise, die für die Ontogenese des Mittelhirns entscheidend sind. Der von uns eingerichtete Differenzierungsweg führt zur Bildung von neuroepithelialen Strukturen, die an neuronale Rosetten erinnern, die während ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1 wird mit BioRender.com erstellt. Wir danken der Universität Bergen Meltzers Høyskolefonds (Projektnummer: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson und Gerdt Meyer Nyquists legat (Projektnummer: 103816102) für die Finanzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CCD-Mikroskop Kamera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Deutschland
Chemisch definiertes LipidkonzentratThermo Fisher Scientific11905031CDM-Inhaltsstoff
Kollagenase IVThermo Fisher Scientific17104019Reagenz zur schonenden Dissoziation humaner iPSCs
Corning  unbehandelte KulturschalenSigma-AldrichCLS430589Suspensionskultur 
DMEM/F-12, GlutaMAX SupplementThermo FisherScientific 10565018Astrozytendifferenzierung Basalmedium
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Wird für eine Vielzahl von Zellkulturwäschen
verwendet EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagenz für die schonende Dissoziation von humanen iPSCs
Essential 8 BasalmediumThermo Fisher ScientificA1516901Basalmedium für die iPSC-Kultur
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101 Supplement für iPSC-Kultur
FCCPAbcamab120081Eliminiert das Potenzial der Mitochondrienmembran und die TMRE-Färbung
FGF-basicPeproTech100-18BAstrozyten-Differenzierungsmedium Inhaltsstoff
Flüssigkeitsabsaugsystem BVC-SteuerungVacuubrand, Deutschland
Formaldehyd (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Zellfixierung 
GDNFPeprotech450-10DA Neuronen mittlerer Inhaltsstoff
Geltrex (Basalmembranmatrix)Thermo Fisher ScientificA1413302Wird zur Bindung und Aufrechterhaltung von menschlichen iPSCs verwendet
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement für NSC-Kultur
Heracell 150i CO2-InkubatorenFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basalmedium für CDM
InSolution AMPK-InhibitorSigma-Aldrich171261Inhaltsstoff für neuronales Induktionsmedium
InsulinRocheCDM-Inhaltsstoff
iPSCs aus Detroit 551 Fibroblats ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED KonfokalmikroskopLeica Microsystems, Deutschland
MatrigelLife Science354230Matrigel Embedding
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM Inhaltsstoff
Normales ZiegenserumThermo Fisher ScientificPCN5000Wird zur Blockierung von Puffer
verwendet Orbital Schüttler - SSM1Stuart Equipment, UK
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies8579Matrigel Embedding
Organoid Embedding SheetSTEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Wird für eine Vielzahl von Waschvorgängen
verwendet Poly-D-LysinhydrobromidSigma-AldrichP7405Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Poly-L-Ornithin-LösungSigma-AldrichP4957Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36930Anbringen des Deckglases für konfokale Bilder
PurmorphaminSTEMCELL Technologies72204Fördert die Differenzierung von DA-Neuronen
Rekombinantes Mensch/Maus FGF-8b Protein Forschung & Forschung D Systems423-F8-025/CFFördert die Differenzierung von DA-Neuronen 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium Inhaltsstoff
TRITON X-100VWR International9002-93-1Wird für die Permeabilisierung von Zellen in Immunfärbeassays verwendet
SSM1 kompakter Orbitalschüttler Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, Mini-Rotator 230Vfür die Organoid-Kultivierung.
Wasserbad Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
strong>Antikörper für die Immunfärbung
Primärer Antikörper
Anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Kaninchen; 1:100 
anti-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Kaninchen; 1:100 
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Kaninchen; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Kaninchen; 1:100 
anti-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Huhn; 1:500
anti-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Kaninchen; 1:100 
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Kaninchen; 1:100 
Sekundärer AntikörperVerdünnung (μ L)
  Alexa Fluor  594 Anti-Kaninchen für Ziegen IgGThermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  488 Ziege Anti-Kaninchen IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 Ziege Anti-Kaninchen IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 Ziege Anti-Kaninchen IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 Ziege Anti-Kaninchen IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 Ziege Anti-Kaninchen IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 Ziegen Anti-Hühner IgG Thermo Fisher ScientificA-21469  1:400
1376497 < Uhr

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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