Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

Summary

Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.

Abstract

Die zweidimensionale Neutral/Neutral-Gelelektrophorese (2DGE) hat sich als Benchmark-Technik zur Analyse der DNA-Replikation durch natürliche Impedimente herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Progression der Replikationsgabel durch strukturanfällige, expandierbare DNA-Wiederholungen innerhalb des auf dem Affenvirus 40 (SV40) basierenden Episoms in menschlichen Zellen analysiert werden kann. Kurz gesagt, bei der Plasmidtransfektion in menschliche Zellen werden Replikationszwischenprodukte durch das modifizierte Hirt-Protokoll isoliert und mit dem DpnI-Restriktionsenzym behandelt, um nicht-replizierte DNA zu entfernen. Zwischenprodukte werden dann von geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um die Wiederholung des Interesses in der ursprungsdistalen Hälfte eines 3-5 kb langen DNA-Fragments zu platzieren. Die Replikationszwischenprodukte werden in zwei senkrechte Dimensionen unterteilt, zunächst nach Größe und dann nach Form. Nach der Southern-Blot-Hybridisierung ermöglicht dieser Ansatz den Forschern, das Abwürgen der Gabel bei verschiedenen strukturbildenden Wiederholungen in der absteigenden Hälfte des Replikations-Y-Bogens zu beobachten. Darüber hinaus ermöglicht diese Positionierung des Strömungsabrisses die Visualisierung verschiedener Ergebnisse des wiederholt vermittelten Gabelabwürgens, wie z. B. die Gabelumkehr, das Aufkommen einer konvergierenden Gabel und den rekombinatorischen Gabelneustart.

Introduction

Short Tandem Repeats (STR) sind kleine, typischerweise 2-9 Basenpaare (bp), sich wiederholende DNA-Sequenzen, die etwa 3 % des menschlichen Genoms ausmachen¹. STR spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation²; ihre repetitive Zusammensetzung macht sie jedoch anfällig für die Bildung nicht-kanonischer DNA-Sekundärstrukturen und die anschließende genetische Instabilität ^3,4. Von linkshändigen Helices über Haarnadeln/Kreuzformen bis hin zu drei- und viersträngigen Helices stellen diese alternativen DNA-Strukturen intrinsische Herausforderungen für das Replisom dar. Eine natürliche Voraussetzung für die Bildung von Sekundärstrukturen ist die DNA-Abwicklung, die eine Voraussetzung für die DNA-Replikation ist. Dies stellt ein einzigartiges Rätsel für die Funktion des Genoms dar, da sich viele dieser Strukturen während der Replikation bilden können, was das Fortschreiten des Replizosoms behindert und letztendlich zum Stillstand der Replikationsgabel^{führt 5,6,7} oder in schweren Fällen zum Kollaps der Gabel und zum DNA-Bruch ^8,9. Es wurde gezeigt, dass sowohl der Neustart von blockierten Gabeln als auch DNA-Reparaturwege zu wiederholter Instabilität führen, wie z. B. wiederholte Expansionen^10,11 und komplexe Genomumlagerungen (CGR)^12,13. Diese Ereignisse können zur Entwicklung von etwa 60 menschlichen Krankheiten führen, die als wiederholte Expansionsstörungen bekannt sind, darunter das Fragile-X-Syndrom, die Huntington-Krankheit, die Friedreich-Ataxie und andere^14,15 sowie CGR-Erkrankungen wie das Emmanuel-Syndrom¹⁶. Um die Mechanismen menschlicher Krankheiten, die durch Wiederholungsinstabilität verursacht werden, besser zu verstehen, ist es daher unerlässlich, die Details der Progression der Replikationsgabel durch diese Wiederholungen zu untersuchen.

Mitte der 1980er Jahre entstand eine Technik zur Untersuchung des Replikationsverlaufs, als Brewer und Fangman versuchten, einen direkten Beweis dafür zu erbringen, dass die Replikationsinitiierung bei Saccharomyces cerevisiae an Elementen der autonomen Replikationssequenz (allgemein bekannt als ARS) stattfindet¹⁷. Dabei trennten sie die Strukturen von Hefereplikationszwischenprodukten in Agarose und adaptierten damit eine frühere Methode von Bell und Byers, die als 2-dimensionale Neutral/Neutral-Gelelektrophorese (2DGE)¹⁸ bekannt ist. Diese Technik nutzte die Tatsache, dass sich nichtlineare DNA in Agarosegel anders bewegt als ihr lineares Äquivalent der gleichen Masse. Genauer gesagt wird bei der 2DGE die isolierte DNA in zwei senkrechte Dimensionen getrennt, zunächst primär nach Größe und dann primär nach Form, um eine umfassende Karte der Replikation in einer bestimmten Region von Interesse zu erstellen. In ihrer ursprünglichen Arbeit zeigten Brewer und Fangman dies als einen Bogen, der aus "einfachen Y"-Strukturen oder Replikationsgabeln besteht, die nicht replizierte DNA mit ihren replizierten Gegenstücken verbinden. Sie beschreiben andere beobachtete Zwischenprodukte als "Blasen" und "doppelte Ys", die jeweils Replikationsursprünge und konvergierende Gabeln darstellen.

2DGE kann verwendet werden, um die relativen Populationen von DNA-Replikationszwischenprodukten zu einem bestimmten Zeitpunkt zu untersuchen. Wenn also eine Population von Zwischenstufen häufiger vorkommt als eine andere, würde dies bei der Visualisierung offensichtlich sein. Dies macht 2DGE zu einem besonders nützlichen Werkzeug für die Untersuchung des Replikationsfortschritts durch anspruchsvolle Sequenzen, wie z. B. strukturbildende Wiederholungen. Wenn die analysierte Region beispielsweise eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, einen Strömungsabriss der Replikationsgabel zu induzieren, würde dies als Ausbuchtung auf dem Bogen dargestellt werden (Abbildung 1A), was auf eine Anhäufung von Replikationsgabeln an diesem Ort hinweist. Dies kann bei der Replikation sowohl haarnadelbildender Wiederholungssequenzen in Hefe ^19,20,21 als auch von Triplex-bildenden Wiederholungen in menschlichen Zellen 22,23,24 beobachtet werden. Zusätzlich zum Stalling kann 2DGE verwendet werden, um DNA-Strukturen zu beobachten, die nicht mit den standardmäßigen einfachen Ys übereinstimmen, die während der Replikation gebildet werden, wie im Fall von rekombinanten Zwischenprodukten²⁵. Diese Zwischenstufen haben eine schwerere und stärker verzweigte X-förmige Struktur und bewegen sich daher sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension langsamer als Standard-Replikationsgabeln. Ähnliche Ergebnisse sind auch in Bezug auf die Replikationsgabelumkehr 20,24,26 zu beobachten. Als Reaktion auf starken Replikationsstress wurde gezeigt, dass eukaryotische Zellen die Umkehrung der Replikationsgabel nutzen, um blockierte Gabeln zu retten. Diese umgekehrten Gabeln haben ein ähnliches Molekulargewicht wie blockierte Gabeln; ihre Hühnerfußstruktur führt jedoch zu einer langsameren elektrophoretischen Beweglichkeit in der zweiten Dimension im Vergleich zu ihren Y-förmigen Komplementen, was zu einer Ausdehnung des Lichtbogens nach oben und außen führt.

Abbildung 1: 2D-Gelelektrophorese-Analyse der DNA-Replikation. (A) Schematische Darstellung einer typischen 2DGE-Replikation, die die Replikation durch eine strukturbildende Wiederholung darstellt, die in der Lage ist, einen Gabelabriss zu induzieren. Die Zwischengröße und -struktur beeinflussen die elektrophoretische Mobilität. (B) Beispiel Y-Bogen mit aufsteigenden bzw. absteigenden Armen, beschriftet. Abkürzung: 2DGE = Zweidimensionale Neutral-/Neutral-Gel-Elektrophorese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einer der wichtigsten Aspekte von 2DGE betrifft natürlich die Qualität und Quantität der Replikationszwischenprodukte. Die Auflösung der 2DGE-Analyse der Replikation durch endogene Loci in Säugetierzellen ist jedoch für eine Einzelkopien-Zielsequenz innerhalb des 6 × 10⁹ bp diploiden menschlichen Genoms unzureichend, obwohl dies für Multi-Copy-Gene wie stark amplifizierten DHFR-Locus²⁷ oder ribosomale RNA²⁸ durchgeführt wurde. Die SV40-basierte Replikation ist ein effizientes und gut charakterisiertes Mittel zur Untersuchung der Replikation in eukaryotischen Zellen²⁹. Es bietet ein zuverlässiges Modell der eukaryotischen Replikation, das den größten Teil der Wirtsreplysomenmaschinerie nutzt, um das virale Genom zu replizieren, das bei der Infektion in Nukleosomen unterteilt wird^30,31. Zwei bemerkenswerte Ausnahmen vom Replisom von Säugetieren sind, dass das T-Antigen (Tag) anstelle des CMG-Komplexes des Wirts als replikative DNA-Helikase dient und die DNA-Polymerase delta sowohl führende als auch nachlaufende DNA-Stränge synthetisiert³². Wir haben uns dieses System zunutze gemacht, indem wir pathogene Abschnitte strukturbildender Wiederholungen stromabwärts von einem SV40-Replikationsursprung in ein Plasmid platziert haben, das ursprünglich im Labor²² von Massimo Lopes entwickelt wurde. Wichtig ist, dass dieses Plasmid auch das Gen enthält, das für Tag selbst kodiert, was zu seiner konstitutiven und äußerst potenten Replikation bei der Transfektion in eine Vielzahl von kultivierten menschlichen Zellen führt. Diese Eigenschaft führt zu einer großen Menge von Produkten, die sich ideal für die 2DGE-Analyse der Zwischenprodukte eignen, die während und als Reaktion auf die Replikation pathogener Wiederholungen in menschlichen Zellen gebildet werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Visualisierung der Replikation strukturbildender Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese.

Protocol

HINWEIS: Das Plasmid, das für unsere skizzierte 2DGE-Analyse in Säugetierzellen entwickelt wurde, sollte einen SV40-Replikationsursprung mehrere kb stromaufwärts von strukturanfälligen Wiederholungen enthalten (Abbildung 2). Die führende und nachlaufende Synthese sollte bei der Wahl der Ausrichtung relativ zum Ursprung, in die die Wiederholungen in das Plasmid kloniert werden sollen, berücksichtigt werden.

Abbildung 2: Aufschluss von repeathaltigem Plasmid für die 2DGE-Analyse. Strukturanfällige Wiederholungen werden mehrere KB stromabwärts von der sich nach rechts bewegenden Replikationsgabel dargestellt. Beim Aufschluss mit den einzigartigen Fräsern 1 und 2 wird die Wiederholungssequenz auf dem absteigenden Arm des Y-Bogens platziert, wobei die Sequenz über die Hälfte des verdauten Fragments hinausgeht. Abkürzung: 2DGE = Zweidimensionale Neutral-/Neutral-Gel-Elektrophorese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Plasmidtransfektion in Säugetierzellen

1. 600.000 HEK293T Zellen vor der Transfektion in einer 10 cm großen Gewebekulturplatte aussäen. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C sich erholen.
   HINWEIS: Für dieses Experiment können viele Zelllinien verwendet werden, obwohl Zellen mit dem SV40-Tag für optimale Ergebnisse empfohlen werden. ACHTUNG: HEK293T Zellen gelten als BSL-2 und alle Kultivierungsarbeiten sollten in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung einer geeigneten aseptischen Technik und geeigneter PSA durchgeführt werden.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 % erreichen, transfizieren Sie 8 μg repeathaltige Plasmid-DNA in die ausgesäten Zellen unter Verwendung geeigneter Transfektionsreagenzien gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. Wenn zu diesem Zeitpunkt keine Zwischenprodukte isoliert werden, aspirieren Sie alte Medien und ersetzen Sie sie nach 24 Stunden durch 10 ml frisches Medium.
4. Beginnen Sie 24-48 Stunden nach der Transfektion mit der Zellentnahme.
   1. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es vorsichtig mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Lösen und sammeln Sie Zellen mit 0,5 ml Trypsin und schleudern Sie sie 4 Minuten lang bei 340 × g .
   2. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellpellets mit PBS. Nochmals bei 340 × g 4 min schleudern und den Überstand ansaugen.
      HINWEIS: Der Versuch kann hier unterbrochen werden, indem die Zellpellets bei -80 °C eingefroren werden. Wir haben die beste Auflösung bei der Isolierung von Replikationszwischenprodukten 48 Stunden nach der Transfektion gefunden; 24 h hat jedoch zu brauchbaren Ergebnissen geführt.

2. Isolierung von Replikationszwischenprodukten

1. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 mL modifiziertem Hirt-Lysepuffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)] in konischen 50 mL-Röhrchen und beginnen Sie mit der Zelllyse.
   1. Natriumdodecylsulfat (SDS) wird bis zu einer Endkonzentration von 0,6 % (ca. 650 μl Stamm 2 % SDS) und Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml (ca. 10 μl Stamm 20 mg/ml, Proteinase K) zugegeben, um Nukleasen zu entfernen.
   2. Vorsichtig durch Pipettieren mischen, bis eine homogene Masse entsteht, und die Mischung mindestens 90 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
2. Die NaCl-Konzentration auf 1 M (ca. 540 μl 5 M NaCl) erhöhen und vorsichtig mischen, bis eine homogene Masse entsteht. Über Nacht (18-24 h) bei 4 °C inkubieren, um die Ausfällung von Zelltrümmern, RNA und Proteinen durch Aussalzen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Mischung wird hochviskos sein, also seien Sie vorsichtig und haben Sie Geduld, während Sie gut mischen.
3. Trennen Sie am nächsten Tag die DNA von Zelltrümmern, RNA und Proteinen.
   1. Die Mischung bei 29.500 × g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren.
   2. Den DNA-haltigen Überstand wird übertragen, ein Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1 (v/v) zugegeben und kurz gemischt, bis eine homogene Masse entsteht.
      ACHTUNG: Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol ist ein gefährliches Material und sollte mit geeigneter PSA in einem chemischen Abzug gehandhabt werden.
   3. Erneut bei 15.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues konisches Rohr.
4. Die isolierte DNA ausfällen und waschen.
   1. Fügen Sie ein Volumen reines Isopropanol hinzu und inkubieren Sie es mindestens 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Schleudern Sie die DNA bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C herunter.
   2. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit kaltem 70%igem Ethanol, um überschüssiges Salz zu entfernen.
   3. Nochmals bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C schleudern, an der Luft trocknen lassen und das Pellet vorsichtig wieder in Tris-EDTA (TE)-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) resuspendieren.
      HINWEIS: Hier kann das Experiment pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C eingefroren werden. Frost-Tau-Zyklen sollten jedoch vermieden werden, da dies die Qualität der DNA-Replikationszwischenprodukte beeinträchtigen kann.

3. Probenvorbereitung und 2-dimensionale Gelelektrophorese

1. Verdauen Sie die isolierten Zwischenprodukte der Plasmidreplikation.
   1. Fügen Sie der Probe 100 Einheiten der entsprechenden Restriktionsenzyme hinzu, um die Plasmid-DNA zu verdauen, und platzieren Sie die repeathaltige Sequenz spezifisch auf der ursprungsdistalen Hälfte des linearen Fragments (Abbildung 2). Fügen Sie außerdem DpnI hinzu, um die methylierte DNA zu schneiden, wodurch alle Plasmid-DNA entfernt wird, die in kultivierten menschlichen Zellen nicht vollständig repliziert wurde.
      HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten Restriktionsenzyme einzigartige Cutter sein, die ein 3-5 kb großes Fragment liefern, das die strukturanfällige Sequenz auf dem absteigenden Arm des Y-Bogens platziert.
   2. Die Proben werden 6-10 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, um einen vollständigen Plasmidaufschluss zu ermöglichen.
   3. Die DNA wird entweder mit 2,5 Volumen kaltem reinem Ethanol ausgefällt und über Nacht bei -20 °C inkubiert, oder es wird ein Volumen Isopropanol hinzugefügt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
   4. Die aufgeschlossenen und gefällten Proben werden bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
   5. Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Probe mit kaltem 70%igem Ethanol. Nochmals bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C schleudern.
   6. Dekantieren Sie den Überstand, trocknen Sie ihn 10 Minuten lang an der Luft und resuspendieren Sie die Proben in 15 μl TE-Puffer.
2. Bereiten Sie das Agarose-Gel der ersten Dimension mit 0,4-0,5% in 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) (89 mM Trisbase, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) vor. Lassen Sie die Lösung mindestens 1 h lang erstarren.
3. Beginnen Sie mit dem Laden der Proben in die erste Dimension.
   1. Laden Sie die Leiter innerhalb der ersten 3 cm relativ zum linken Rand des Gels. Laden Sie dann die Gesamtheit der vorbereiteten Proben und stellen Sie sicher, dass zwischen jedem Paar ein Abstand von 3 cm besteht.
   2. Lassen Sie das Gel in 1x FSME für 19-24 h bei 0,85 V/cm laufen, um die Zwischenprodukte in Bezug auf ihre Größe zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Kammer abgedeckt ist, um die Proben vor Licht zu schützen, das die DNA beschädigen kann.
4. Nehmen Sie am nächsten Tag das Gel aus dem Puffer und schätzen Sie die Position des verdauten linearen Fragments mit einem Lineal.
   1. Die ersten 3 cm des Gels, das die Leiter enthält, herausschneiden und das Gelsegment in 1x FSME mit 0,3 μg/ml Ethidiumbromid für 10-15 min färben. Visualisieren Sie die Leiter mit Hilfe eines Gel-Dokumentationssystems.
   2. Addieren Sie 1,3 cm zum geschätzten Standort, um den Wert a zu erhalten. Subtrahieren Sie dann 7,5 cm von Wert a, um Wert b zu erhalten. Richten Sie das Lineal gegen das Gel der ersten Dimension aus und schneiden Sie horizontal bei den Werten a und b durch. Schneiden Sie dann den für jede Probe reservierten Abstand von 3 cm vertikal ab. In Abbildung 3 finden Sie ein visuelles Schema.
   3. Drehen Sie die Segmente in einer neuen Gießschale im Uhrzeigersinn und platzieren Sie sie an der Position der Probenvertiefungen (Abbildung 3).
5. Bereiten Sie das zweitdimensionale Agarosegel in einer Konzentration von 1-1,3% in 1x FSME bei 0,3 μg/mL Ethidiumbromid vor.
   1. Nach dem Abkühlen auf ca. 55 °C wird das Gel der zweiten Dimension über die gedrehten Segmente der ersten Dimension gegossen und mindestens 1 h lang fest werden gelassen.
   2. Die zweite Dimension wird in eine Kammer mit 1x FSME bei 0,3 μg/ml Ethidiumbromid überführt und das Gel mindestens 30 Minuten lang äquilibriert.
   3. Lassen Sie das Gel, wieder abgedeckt, 9-10 h bei 4,23 V/cm bei 4 °C laufen, um die Zwischenprodukte in Bezug auf ihre Form zu trennen.

Abbildung 3: Exzision von Zwischenprodukten der ersten Dimension vor der Trennung der zweiten Dimension. Nach der Visualisierung der Leiter kann die Beweglichkeit von nicht replizierten Fragmenten abgeschätzt werden. (I) Dieser Wert kann dann verwendet werden, um die geeigneten Schnittstellen (a und b) für die Herausnahme und die replizierten Gegenstücke (II) zu bestimmen. Der Abschnitt des Gels sollte dann gedreht und in die Position von Vertiefungen für die zweitdimensionale Trennung gebracht werden. Abkürzung: CW = im Uhrzeigersinn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Southern-Blot und Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde

1. Nehmen Sie das zweitdimensionale Gel aus der Kammer und depurinieren Sie die DNA-Fragmente 10 Minuten lang in einer 0,24 M HCl-Lösung unter leichtem Schaukeln. Spülen Sie das Gel mit entionisiertem Wasser ab und weichen Sie es 10-15 Minuten lang in 0,4 M NaOH ein.
   ACHTUNG: HCl und NaOH sind korrosiv und sollten mit geeigneter PSA in einem chemischen Abzug gehandhabt werden.
2. Beginnen Sie mit dem Zusammensetzen des Southern-Blots, um die Übertragung der getrennten Zwischenprodukte vom Gel auf die Membran zu erleichtern. In Abbildung 4 finden Sie ein umfassendes Schema.
   1. Füllen Sie einen ausreichend großen Behälter mit 1 L 0,4 M NaOH.
   2. Richten Sie eine lange Glasscheibe über den Behälter aus und falten Sie (entlang der Länge) zwei lange Blätter Chromatographiepapier senkrecht über die Glasscheibe, die in den Behälter mit NaOH hineinragen.
   3. Befeuchten Sie die Oberseite des Papiers mit NaOH und entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen unter der Oberfläche.
   4. Tränken Sie drei Blatt Chromatographiepapier mit NaOH und legen Sie sie auf das gefaltete Papier, wobei Sie alle Blasen wieder entfernen.
   5. Drehen Sie das Gel der zweiten Dimension auf den Kopf und übertragen Sie es über die Papiere.
   6. Befeuchten Sie eine positiv geladene Nylonmembran (0,45 μm Porengröße) mit DI-Wasser und legen Sie diese über das Gel.
   7. Legen Sie zum Schluss drei weitere Blätter Papier, angefeuchtet mit DI-Wasser, über die Membran.
   8. Decken Sie freiliegendes NaOH im unteren Behälter mit Plastikfolie ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Lege einen Stapel Servietten oder Papiertücher über den Klecks und achte darauf, dass er 0,3-0,5 m hoch ist. Legen Sie ein Gewicht auf die Oberseite und drücken Sie den gesamten Blot zusammen, um eine straffe Kapillarwirkung zu ermöglichen. Warten Sie mindestens 2 Tage, bis die DNA auf die Membran übertragen wird.
      HINWEIS: Die Länge und Breite des Chromatographiepapiers und der Membran hängen von der Größe des Agarosegels ab, das für die zweite Dimension verwendet wird. Für eine möglichst effiziente Übertragung verwenden Sie Papier und Membran mit den gleichen Abmessungen wie das Gel.
3. Nach dem Transfer wird die DNA mit einem UV-Vernetzer bei 120 μJ/cm² für 1 min mit der Membran vernetzt.
   HINWEIS: Das Experiment kann hier unterbrochen werden, indem die Membran in einen luftdichten, trockenen und sauberen Lakenschutz bei Raumtemperatur gelegt wird.
4. Waschen Sie die Membran 2x für 5 min mit 2x Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC-Puffer) (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat).
5. Prähybridisieren Sie die Membran mit 0,18 ml/^cm2 des Hybridisierungspuffers von Church & Gilbert [1 mM EDTA, 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 M Natriumphosphat, 7 % SDS] bei 65 °C und rotieren Sie mindestens 2 Stunden lang in einem Hybridisierungsinkubator.
   HINWEIS: Die Membran kann mehrere Tage lang prähybridisieren.
6. Bereiten Sie die radioaktiv markierte Sonde mit ^α-32P, dATP oder dCTP und einem DNA-Markierungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
   VORSICHT: Radioaktiv markierte dNTPs sind gefährlich und sollten beim Umgang mit ihnen geeignete PSA getragen werden. Alle radioaktiven Arbeiten sollten hinter einer Abschirmung durchgeführt werden, und geschulte Personen sollten mit Dosimetern auf Strahlenaufnahme überwacht werden.
   1. Entwerfen Sie ein lineares DNA-Fragment mit 400-900 bp, das komplementär zur restriktionsverdauten Sequenz ist (Abbildung 2), und amplifizieren Sie das Fragment mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
      HINWEIS: Wir empfehlen ein Stamm-PCR-Fragment von 50-100 ng/μl
   2. Kombinieren Sie 100 ng des komplementären PCR-Fragments mit DNA Pol I, Klenow-Fragment (3' 5' Exo-) Puffer und zufälligen Decanukleotid-Oligos.
   3. Denaturieren Sie das Fragment bei 100 °C für 10 min.
   4. Geben Sie der Probe 5 Einheiten DNA Pol I, Klenow-Fragment (3' 5' Exo-), 50 μCi ^α-32P dNTP und 30-50 μmol dNTP-Mix, der im radioaktiv markierten dNTP-Typ defizient ist.
   5. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 °C, um die Polymerisation und den Einbau von radioaktiv markiertem dNTP zu ermöglichen.
   6. Geben Sie 30-50 μmol des zuvor fehlenden dNTP-Typs in die Probe und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 °C.
   7. Das radioaktiv markierte Fragment wird mit einer Spin-Säule bei 3.000 × g für 2 Minuten gereinigt.
7. Geben Sie eine radioaktiv markierte Sonde in 50 mL Hybridisierungspuffer und inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 65 °C in einem Hybridisierungsinkubator.
8. Am Folgetag die Sonde entfernen und die Membran 2x mit Waschpuffer 1 (0,1x SSC, 0,1 % SDS) bei 42 °C und 2x mit Waschpuffer 2 (2x SSC, 0,1 % SDS) bei 65 °C waschen.
   HINWEIS: Alle Wäschen sollten mit schnellen Umdrehungen für 15 Minuten im Inkubator durchgeführt werden.
9. Trocknen Sie die Membran 10 Minuten lang und legen Sie sie in eine dünne, transparente Schutzfolie. Lagern Sie die versiegelte Membran in einer kontrollierten, strahlungsbeständigen Kassette mit einem phosphorempfindlichen Sieb. Lassen Sie die Membran 1-10 Tage lang dem Bildschirm aussetzen.
10. Visualisieren Sie die Ergebnisse mit einem biomolekularen Imager, der auf Phosphor-Imaging eingestellt ist. Waschen und bei Bedarf erneut belichten.

Abbildung 4: Assemblierung des Southern Blot. Umfassendes Schema einer typischen Apparatur, die für den Southern-Blot-Transfer von Zwischenprodukten aus der zweiten Dimension auf eine Nylonmembran verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Results

Bei erfolgreicher Visualisierung kann ein scharfer Bogen von Replikationsgabeln beobachtet werden, der sich vom massiven 1n-Punkt nach oben und außen erstreckt (Abbildung 5A). Die Größe eines Fragments oder der Prozentsatz, der repliziert wird, bestimmt die Mobilität des Fragments in der ersten Dimension. Wenn die Zwischenstufen eine stärker gegliederte Struktur entwickeln, werden sie beginnen, sich langsamer in der zweiten Dimension zu bewegen. Wenn sich ein Zwischenprodukt in beiden Dimensionen langsam bewegt hat, kann daher behauptet werden, dass es sich um ein hochrepliziertes Molekül mit signifikanter Verbindungsvariation von herkömmlichen Replikationsgabeln handelt. Im Falle der Spätschichtstrangsynthese der (GAA)_{100-Wiederholung} wird der Gabelabriss durch einen abgedunkelten definierten Fleck auf dem Bogen (I) angezeigt, der eine Akkretion von Replikationsgabeln beim Zusammentreffen mit der Wiederholung darstellt (Abbildung 5B), wahrscheinlich aufgrund der Triplexbildung. Dies wird von schwereren, stärker verzweigten Zwischenprodukten (II und III) oberhalb des Stallplatzes begleitet. Wir haben die Natur dieser Zwischenprodukte in Rastokina et al. 2023²⁴ ausführlicher beschrieben. Kurz gesagt, diese stellen wahrscheinlich eine Kombination von Gabeln dar, die als Reaktion auf den Strömungsabriss (II) umkehren, zusätzlich zum Aufkommen der konvergierenden Gabel (Abbildung 5B) (III).

Eine Beobachtung, die bei der Visualisierung gemacht werden kann, ist ein nicht idealer, breiter Bogen. Im schlimmsten Fall kann dies zu einer vollständigen Verdoppelung des Lichtbogens führen. In der Regel stellt dies eine schlechte Trennung von Zwischenprodukten in der ersten Dimension dar. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, von denen der wahrscheinlichste entweder eine Salz- oder Proteinkontamination in der Replikationszwischenprobe ist. Eine Phenol:Chloroform-Reinigung nach dem Aufschluss von Zwischenprodukten, gefolgt von einer ausgiebigen Reinigung mit 70%igem Ethanol, kann dieses Risiko minimieren. Es sollte jedoch beachtet werden, dass eine zusätzliche Phenolexposition die Wahrscheinlichkeit denaturierender Zwischenprodukte erhöhen kann, die sich als abgedunkelte Intensität linearer DNA unter dem Lichtbogen darstellen können, was kollabierte Replikationszwischenprodukte darstellt (Abbildung 5C).

Im schlimmsten Fall kann die Visualisierung zu einem völligen Fehlen von Replikationszwischenprodukten führen, was sich durch das Fehlen eines Lichtbogens zeigt (Abbildung 5D). Es ist unwahrscheinlich, dass das Fehlen eines Lichtbogens auf denaturierte Replikationszwischenprodukte zurückzuführen ist, da sich unter dem erwarteten Bereich des Lichtbogens kein dunkler Fleck befindet. Angesichts des Vorhandenseins eines besonders kleinen 1n-Spots (IV) ist die Gesamtmenge an DNA, die in diesem dargestellten Beispiel vorhanden ist, minimal, und daher kann dieses Problem durch eine Unterreplikation des Plasmids oder eine insgesamt schlechte Transfektion oder Isolierung der DNA verursacht werden.

Abbildung 5: Mögliche Ergebnisse der 2DGE-Analyse. (A) Erfolgreiche 2DGE-Analyse der Replikation durch die strukturbildende (GAA)_{100-Wiederholung} in HEK293T Zellen. (I) bezieht sich auf Gabeln, die bei der Wiederholung blockiert werden, während sich (II) und (III) auf strukturiertere Zwischenprodukte beziehen, die als Reaktion auf den Stillstand entstehen. Eine Abbildung des 2,7 kb großen Fragments ist oben dargestellt. (B) Repräsentative Zwischenprodukte, die während der Replikation der (GAA)_{100-Wiederholung} entstehen. Unter Verwendung von siRNA-Knockdowns von Genen für die Umkehrung und den Neustart der Replikationsgabel wurden genetische Kontrollen etabliert, um die Art dieser Zwischenprodukte zu identifizieren. (C) Darstellung von unaufgelösten Replikationszwischenprodukten, die auftreten können, wenn Gabeln während der Isolierung denaturiert werden. (D) Ein erfolgloses 2DGE-Experiment, das sich in der völligen Abwesenheit von Replikationszwischenprodukten zeigt. IV stellt lineare, nicht replizierte Fragmente des verdauten Plasmids dar. Abkürzung: 2DGE = Zweidimensionale Neutral-/Neutral-Gel-Elektrophorese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

2DGE liefert ein semiquantitatives und umfassendes Bild der relativen Populationen von Zwischenstufen, die während der Replikation einer bestimmten Sequenz entstehen. Da die fragilen molekularen Strukturen der Replikationsgabeln während dieses Verfahrens erhalten bleiben müssen, sollte große Sorgfalt walten gelassen werden, um physikalisches Scheren und chemische Denaturierung zu verhindern. Daher wird dringend empfohlen, während der Plasmidisolierung auf eine alkalische Behandlung zu verzichten. Um dies zu vermeiden, haben wir und andere eine modifizierte Form der Hirt-Isolierung der DNA eingeführt, die Hirt 1967 etabliert hat³³. Hier wird die DNA von Proteinen, RNA und anderen zellulären Trümmern getrennt, indem das Zelllysat über Nacht mit 1 M NaCl bei 4 °C behandelt wird. Obwohl sich diese Methode als außergewöhnlich erwiesen hat, um die Qualität von Replikationszwischenprodukten zu erhalten, scheint sie die Plasmid-DNA nicht vollständig von der genomischen DNA zu trennen. Dies sollte bei der Entwicklung der Sequenz für die radioaktiv markierte Sondierung berücksichtigt werden, da die entworfene Sonde keine hohe Sequenzähnlichkeit mit genomischer DNA aufweisen sollte, um eine Off-Target-Bindung bestmöglich zu vermeiden. Weiterhin kann die Integrität von Replikationszwischenprodukten durch UV-Psoralen-Vernetzung stark erhöht werden. Hier können Zellen mehrere Minuten lang im Dunkeln mit Psoralen inkubiert werden, bevor sie bei 366 nm³⁴ UV-bestrahlt werden, wodurch kovalente Bindungen zwischen den DNA-Molekülen entstehen. Dies stärkt nicht nur die Kohäsivität der Zwischenstrukturen, sondern kann auch die Besorgnis zerstreuen, dass sich Strukturen während der Isolierung und nicht in vivo bilden.

Ein Aspekt, der bei der Planung dieses Experiments berücksichtigt werden sollte, ist die wiederholte Platzierung auf dem aufgelösten Endbogen. Die erste Hälfte des Bogens, die sich vom 1n-Punkt aus erstreckt, wird als aufsteigender Arm bezeichnet, während die zweite Hälfte als absteigender Arm bezeichnet wird (Abbildung 1B). Um ein Stillstand der Replikationsgabel zu beobachten, sollte eine wiederholte Platzierung an einem der Arme des Lichtbogens ausreichend sein. Um jedoch strukturiertere Zwischenprodukte zu beobachten, die an Wiederholungssequenzen entstehen, wie z. B. postreplikative Übergänge, empfehlen wir, die Wiederholungssequenz auf dem absteigenden Arm zu platzieren. Dies ist hauptsächlich auf die langsamere elektrophoretische Mobilität dieser Zwischenprodukte in beiden Dimensionen zurückzuführen, was zu einer Co-Migration mit einfachen Ys-Strukturen führen kann, die weiter in ihrem Verlauf fortgeschritten sind, wenn die repeat-enthaltende Sequenz auf dem aufsteigenden Arm platziert würde, was eine detaillierte Analyse erschwert. Um die beste Auflösung zu erzielen, empfehlen wir, die Wiederholungssequenz zwischen 60 % und 90 % innerhalb des interessierenden Fragments relativ zum Ursprung der Replikation zu platzieren.

Während des DNA-Transferschritts und der anschließenden Behandlung der Membran sollte auf Details geachtet werden. Es ist äußerst wichtig, dass der Southern-Blot so zusammengesetzt wird, dass ein gleichmäßiger und fester Transfer der DNA zur Membran möglich ist. Das bedeutet, dass alle Komponenten auf dem Transfer frei von Luftblasen sind und dass das Gerät auf seiner Oberfläche gleichmäßig ist. Um dies zu unterstützen, ist es üblich, das Gel der zweiten Dimension umzudrehen, bevor es zum Southern Blot hinzugefügt wird. Es wird davon ausgegangen, dass die Unterseite des Gels flacher ist als die Oberseite; Daher gewährleistet das Umdrehen des Gels einen möglichst reibungslosen Transfer der DNA auf die Membran.

Wenn ein starker Hintergrund in der endgültigen Auflösung des Blots vorhanden ist, kann dies auf eine unspezifische Bindung der radioaktiv markierten Sonde hinweisen. Dies kann auf verschiedene Weise gemildert werden. Zunächst sollte überprüft werden, dass die Sonde keine hohe Sequenzähnlichkeit mit irgendeiner genomischen DNA aufweist. Dies kann leicht mit dem Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) überprüft werden, das über die NIH-Website³⁵ verfügbar ist. Andernfalls können unspezifisch gebundene Sonden durch zusätzliche strenge Waschungen entfernt werden. Wir empfehlen, mit zwei zusätzlichen Waschgängen von Puffer 1 (0,1x SSC, 0,1 % SDS) bei 42 °C im Abstand von jeweils 15 Minuten zu beginnen; Es kann jedoch sein, dass mehr Waschgänge erforderlich sind. Schließlich kann auch die Temperatur, bei der die Hybridisierung stattfindet, verändert werden. Für die meisten Sonden mit einem G/C-Gehalt von 40-60 % sind 65 °C ausreichend, obwohl dies kein statischer Wert ist. Eine effiziente Bindung der Sonde hängt von ihrer Schmelztemperatur ab und kann daher Änderungen der Hybridisierungstemperatur erfordern.

Angesichts der Tatsache, dass 2DGE einen Überblick über die relativen Populationen von Replikationszwischenprodukten zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, besteht einer seiner größten Nachteile darin, dass es kein aussagekräftiges Maß für das Timing der Replikationsprogression liefert. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Verwendung von Einzelmolekülanalysen wie DNA-Kämmen. Während 2DGE die Analyse der Replikationszwischenprodukte ermöglicht, die als Reaktion auf das Stalling entstehen, müssen genetische Kontrollen eingerichtet werden, um ihre genaue Identität aufzudecken, was zeitnah sein kann. Die Elektronenmikroskopie ist zwar kostspielig, aber nach wie vor überlegen, wenn es darum geht, die genaue Struktur von DNA-Molekülen zu identifizieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE Puffer	Bio Rad	1610733
20x SSC Puffer	Fisher Scientific	BP1325-1
293T Zellen	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS Storage Phosphor Screens	Fisher Scientific	28956482
- und Gibert's Hybriddisierungspuffer	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA-Markierung Kit	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, hoher Gluktosegehalt, GltaMAX Supplement, Pyruvat	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Zusätzliche Restriktionsenzyme müssen ebenfalls gekauft werden
EDTA 0,5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
Ethanol, 70%	Fisher Scientific
Fötales Rinderserum	VWR	97068-085
Salzsäurelösung, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
Isopropanol	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA- und siRNA-Transfektionsreagenz mit Puffer	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	3139-0050
Phosphatpuffer Kochsalzlösung, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
Phosphatpuffer Kochsalzlösung, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	10010024
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0491
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	EO0492
Chromatographie-Papier aus reiner Zellulose	Fisher Scientific	05-714-4
Chromatographie-Papier aus reiner Zellulose	Fisher Scientific	05-714-5
Lineal	Fisher Scientific	09-016
Skalpell	Fisher Scientific	12-460-451
Natriumdodecylsulfat	Millipore Sigma	436143-25G
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 Superspeed Zentrifuge	ThermoFisher Scientific	75006580
Unterzelle Horizontales Elektrophoresesystem	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 Ausschwingrotor	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7,5	Fisher Scientific	BP1757-500
Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot	ThermoFisher	Scientific 25200056