Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Milz-Exosomen von Mäusen vor, wobei eine Kombination aus Verdau mit Kollagenase Typ I und Ultrazentrifugation verwendet wird.

Zusammenfassung

Exosomen (Exo) sind Lipid-Doppelschicht-Strukturen, die von verschiedenen Zellen sezerniert werden, darunter die von Tieren, Pflanzen und Prokaryoten. Frühere Studien haben gezeigt, dass Exo, die aus humoralen oder Zellüberständen gewonnen werden, vielversprechende Ziele für neuartige diagnostische oder prognostische Biomarker sind, was ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit unterstreicht. Aus dem Gewebe gewonnenes Exo (Ti-Exo) hat aufgrund seiner Fähigkeit, die Gewebespezifität und die Mikroumgebung genau widerzuspiegeln, zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Ti-Exo, die im interstitiellen Raum vorkommen, spielen eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation und der organübergreifenden Signalübertragung. Trotz ihres anerkannten Wertes bei der Aufklärung von Krankheitsmechanismen bleibt die Isolierung von Ti-Exo aufgrund der Komplexität der Gewebematrizen und der Variabilität der Extraktionsmethoden eine Herausforderung. In dieser Studie haben wir ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe von Mäusen entwickelt, das eine reproduzierbare Technik für nachfolgende Identifizierungsanalysen und funktionelle Studien bietet. Wir verwendeten den Typ-I-Kollagenase-Verdau in Kombination mit differentieller Ultrazentrifugation, um aus der Milz gewonnenes Exo zu isolieren. Die Eigenschaften des isolierten Exo wurden durch Elektronenmikroskopie, das Nano-Durchflusszytometer und den Western Blot bestimmt. Das isolierte aus der Milz gewonnene Exo wies die typische Morphologie von Lipid-Doppelschicht-Vesikeln auf, mit Partikelgrößen von 30 nm bis 150 nm. Darüber hinaus bestätigte das Expressionsprofil von Exosomenmarkern das Vorhandensein und die Reinheit von Exosomen. Insgesamt haben wir erfolgreich ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Milz-abgeleitetem Exo bei Mäusen etabliert.

Einleitung

Exosomen (Exo) sind eine Untergruppe der extrazellulären Vesikel (EVs) mit einer Größe von 30 bis 150 nm, die eine Vielzahl von Biomolekülen verkapseln, darunter Proteine, Nukleinsäuren und Lipide¹. Diese Biomoleküle stammen aus den Elternzellen und werden in den extrazellulären Raum abgegeben. Exo erleichtern den biomolekularen Informationsaustausch zwischen Zellen und ihrer umgebenden Mikroumgebung und spielen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Systemen eine Rolle². Die Eigenschaften von Exosomen, wie Inhalt, Größe, Membrankomponenten und zelluläre Herkunft, sind sehr variabel und werden durch den ursprünglichen Zelltyp, den zellulären Zustand und die Umweltbedingungen beeinflusst.

Exosomen werden je nach Herkunft üblicherweise in drei Kategorien eingeteilt: aus Zellkulturen, aus Körperflüssigkeiten und aus Gewebe (Ti-Exo). Während aus Zellkulturen gewonnene Exosomen aufgrund ihrer Zugänglichkeit und gleichbleibenden Ausbeute ausgiebig untersucht wurden, ist ihre Verwendung durch mögliche Veränderungen der Zelleigenschaften nach längerer Kultur eingeschränkt, die ihre biologischen Funktionen falsch darstellen können ^3,4,5. Darüber hinaus werden die meisten Zellkulturen in zweidimensionalen Umgebungen gehalten, die die komplexen interzellulären In-vivo-Interaktionen nicht nachahmen, was sich möglicherweise auf die Dateninterpretation auswirkt⁶. Umgekehrt bieten Exosomen, die aus biologischen Flüssigkeiten isoliert werden, eine minimalinvasive Möglichkeit, das Fortschreiten der Krankheit in Echtzeit zu überwachen⁷. Diese Proben enthalten jedoch oft eine Mischung aus Exosomen unterschiedlicher Herkunft, was die genaue Identifizierung ihrer primären Quelle erschwert⁸. Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein zunehmendes Interesse an Ti-Exo, die sich im extrazellulären Interstitium befinden und wichtige Mediatoren der interzellulären Signalübertragung sind.

Die Milz spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunfunktion und der Aufrechterhaltung der inneren Homöostase. Trotz bestehender Protokolle zur Isolierung von Ti-Exo aus Organen wie Gehirn, Leber und Tumoren wird nur in begrenztem Umfang über praktische Methoden für Milz-Exosomen berichtet ^9,10. Ziel dieser Studie war es, ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe bei Mäusen zu etablieren, die gegenüber einem früheren Bericht modifiziert^{wurden 11}. Wir beschreiben eine Methode, bei der der Kollagenaseaufschluss gefolgt von einer Ultrazentrifugation durchgeführt wird, die die Störung der Zellmembran minimiert und eine hohe Reinheit und Ausbeute von aus der Milz gewonnenem Exo gewährleistet. Die Eigenschaften von isoliertem Exo unter Verwendung dieses etablierten Protokolls wurden durch Elektronenmikroskopie (TEM), das Nano-Durchflusszytometer (Nano-FCM) und Western Blot validiert, was die Wirksamkeit des Protokolls für weitere experimentelle Forschungen bestätigt.

Protokoll

Die Proben wurden von Mäusen gewonnen, mit ethischer Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Universität Guangdong. Detaillierte Beschreibungen der Materialien, Geräte und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Die Details der Präparation vor der Extraktion sind in Abbildung 1 dargestellt, während der Prozess der Milz-Exo-Extraktion und -Anreicherung in Abbildung 2 beschrieben ist.

1. Vorbereitung

1. Kühle Hochgeschwindigkeits- und Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugen auf 4 °C vor und stelle die Temperatur eines Desktop-Schüttlers auf 37 °C ein.
2. Bereiten Sie Zellkulturschalen (100 mm), sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Eis und ein steriles Zellsieb (70 μm) vor, wie in Abbildung 1A, B gezeigt.
3. Sterilisieren Sie Scheren und Pinzetten mit 75%igem Alkoholspray, gefolgt von einer Hochtemperatursterilisation. Diese Werkzeuge sind in Abbildung 1C dargestellt.
4. Legen Sie das Milzgewebe in eine sterile 100 mm Petrischale auf Eis und waschen Sie das Oberflächenblut mit 1x eisgekühlter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Trocknen Sie das Milzgewebe mit steriler Gaze und wiegen Sie es nach dem Trocknen.
   HINWEIS: Wenn das Taschentuch gefroren ist, tauen Sie es in einer Schüssel 15 Minuten lang auf Eis auf, bevor Sie fortfahren.
5. Befeuchten Sie das Zellsieb (70 μm), indem Sie 1 ml steriles PBS mit einer sterilen Transferpipette in das Sieb geben.
6. Bereiten Sie den Verdauungspuffer (0,1 % Kollagenase Typ I) mit 1x PBS mit einem Vortex-Mischer vor.
   HINWEIS: Verwenden Sie 10 ml Verdauungspuffer pro 100 mg Milzgewebe. Die Kollagenase-Konzentration wurde in dieser Studie auf der Grundlage der Produktanweisungen ausgewählt. Bei anderen Gewebetypen müssen Forscher diese Parameter möglicherweise basierend auf der Gewebedichte und -zusammensetzung anpassen. Es werden Vorversuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Verdauungszeiten empfohlen, um die optimalen Bedingungen für jeden Gewebetyp zu ermitteln.

2. Verdauung des Gewebes

1. Das Gewebe wird mit einer Schere in einer Kulturschale auf Eis in gleichmäßige kleine Stücke geschnitten (Abbildung 3A) und mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
2. Geben Sie Verdauungspuffer entsprechend dem Gewicht des Milzgewebes in das Röhrchen, wie oben angegeben (Abbildung 3B), und schütteln Sie das Röhrchen dann mit einem Winkel von 45° auf einem horizontalen Schüttler bei 37 °C. Überwachen Sie den Verdauungsfortschritt und stoppen Sie die Verdauung, wenn sich Gewebebrocken verteilt haben und die meisten ihre Form verloren haben. Die Verdauungszeit sollte von Gewebe zu Gewebe variieren. Unter den experimentellen Bedingungen in dieser Studie beträgt die Aufschlusszeit ca. 30 min.
3. Die verdaute Mischung wird in ein Zellsieb (T70 μm) bei Raumtemperatur (RT) überführt, um faserige und größere Gewebereste zu entfernen.
   HINWEIS: Vollständige Filtration sofort nach dem Aufschluss.
4. Sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.

3. Isolierung von Exosomen durch Differenzialzentrifugation

1. Filtrifugenfiltrate bei 500 x g für 10 min bei 4 °C. Ein Pellet mit Restzellen, Zelltrümmern und Zellkernen ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3C gezeigt.
2. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 3000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Ein Pellet, das apoptotische Körper und Mikrosomen enthält, ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3D gezeigt.
3. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Pellets, die Mikrovesikel und Plasmamembran enthalten, sind nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3E gezeigt.
4. Den resultierenden Überstand bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3F gezeigt.
5. Den Überstand verwerfen, das Pellet mit PBS waschen und erneut bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren, um Exosomen zu erhalten. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3G gezeigt.
6. Die isolierten Exosomen werden mit sterilem PBS (200 μl pro Milz) aufgelöst und die isolierten Exosomen in einem neuen 2 mL Zentrifugenröhrchen bei -80 °C gelagert.

4. Charakterisierung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Es wurde TEM verwendet, um festzustellen, ob das extrahierte Exo Vesikeleigenschaften aufwies. Die elektronenmikroskopisch identifizierten Exo-Proben müssen frische Proben sein oder kurzzeitig bei 4 °C gelagert werden.

1. Fixieren Sie Exosomen (2-6 μg/μl) mit 2 % Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopie (EM)-Qualität bei RT für 2 h.
2. 10 μl Exosomenlösung auf ein Kupfernetz geben, 10 Minuten bei RT inkubieren, mit sterilem destilliertem Wasser abspülen und überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier abtupfen.
3. Das Kupfergewebe 1 min lang mit 2% Uranylacetat einfärben, überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abtupfen und 2 min unter einer Glühlampe trocknen.
4. Betrachten Sie die vorbereitete Probe unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV.

5. Messung der Größenverteilung und Partikelkonzentration von Exosomen

1. Laden Sie die Standard-Polystyrol-Nanopartikel (250 nm) in das Nano-Durchflusszytometer.
2. Messen Sie die Proteinkonzentration von Exo-Proben mit einem BCA-Protein-Assay-Kit. Verdünnen Sie die Exo-Probe mit PBS gemäß den Ergebnissen des BCA-Protein-Assays (verdünnen Sie die Exosomen auf 1-10 ng/μl) und laden Sie dann die Exo-Proben in den Nano-Flow, um die Intensität der Seitenstreuung (SSI) zu messen.
3. Berechnen Sie die Exo-Konzentration entsprechend dem Verhältnis von SSI zu Partikelkonzentration in den Standard-Polystyrol-Nanopartikeln.
   HINWEIS: Für die Größenmessung wird eine Standardkurve erstellt, indem Standard-Siliziumdioxid-Nanopartikel mit Gradientengrößen (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) in das Nano-Durchflusszytometer geladen werden. Daran schließt sich die Beladung der Exo-Probe an. Die Größenverteilung von Exo wurde nach der Standardkur berechnet.

6. Lyse und Immunoblot-Bestätigung von Exosomenproteinen

1. Geben Sie 100 μl RIPA-Lysepuffer (Radio Immunoprecipitation Assay) für die Proteinanalyse in das Exosom-Pellet.
2. Kräftig vortexen, mit Parafilm bedecken, 20 min bei RT rocken, dann wieder vortexen.
3. Zur Entnahme der Probe kurz bei 1000 x g zentrifugieren, in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und bis zur Analyse bei -20 °C bis -80 °C lagern.
4. Mischen Sie für Immunoblot die Proben mit 5x Ladepuffer, um eine 1x-Konzentration zu erreichen, und bereiten Sie die Gelelektrophorese vor.
5. Wenn Ganzgewebe-Homogenatkontrollen gewünscht werden, verwenden Sie einen starken Lysepuffer mit einem Proteaseinhibitor, um das Gewebe zu lysieren, wie oben beschrieben. Zentrifugieren Sie dann die Proben 10 Minuten lang bei 10.000 x g und verwerfen Sie die verbleibende extrazelluläre Matrix, ganze Zellen oder intakte Zelltrümmer.
6. Kochen Sie den Probenpuffer, der Exosomen oder Gewebehomogenat enthält, bei 95 °C für 5-10 min. Laden Sie das gleiche Protein pro Bahn in ein 10% SDS-PAGE-Gel. Laden Sie das gleiche Protein des Gewebehomogenats als Kontrolle.
7. Die Gelelektrophorese unter einer Spannung von 80 V für ca. 2 h unter Verwendung des herkömmlichen Elektrophoresepuffers durchführen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um die Exo-Proteinexpression in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative Exo-Häufigkeit in Fraktionen zu vergleichen.

Ergebnisse

Isolierung und Reinigung von Exosomen aus der Milz
Um Exosomen aus Milzgewebe der Maus zu isolieren, verwendeten wir eine Kombination aus Kollagenaseverdau und differentieller Ultrazentrifugation (Abbildung 2). Die ersten Schritte umfassten die Vorbehandlung des Milzgewebes, um Oberflächenblut zu entfernen, gefolgt von der Verdauung mit Kollagenase Typ I. Diese enzymatische Behandlung erleichterte den Abbau der extrazellulären Matrixkomponenten und befreite so die Exosome...

Diskussion

Neuere Forschungen haben gezeigt, dass aus der Milz gewonnene Exosomen (Spleen-Exo) eine entscheidende Rolle bei der Behandlung von Magenkrebs spielen¹². Um die Funktionen von Spleen-Exo weiter aufzuklären, ist es notwendig, eine reproduzierbare und optimale Methode für ihre Extraktion aus Milzgewebe zu etablieren. Während es Protokolle für die Isolierung von Exosomen aus Hirn- und Leberkrebs gibt^13,14, si...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
70 & Mikro; m Cell Strainer	Biologix Group Co., Ltd.USA	15-1070
Anti CD9 Antikörper	Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA	983275
Anti GM130 Antikörper	Proteintech Group, Inc.China	66662-1-lg
Anti TSG101 Antikörper	Abcam Plc, UK	125011
Zellkulturschale	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China	704001
Zentrifugenröhrchen	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China	788211
Kollagenase Typ I	Sigma-Aldrich Corp., USA	C2674
Desktop-Thermostatschüttler	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd., China	THZ-100
Elektrophoresepuffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2081-1L
Erweitertes BCA-Protein-Assay-Kit	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0010S
Flow NanoAnalyzer	NanoFCM Inc., China	N30E
Fluoreszenz-/Chemilumineszenz-Bildgebungssystem	Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China	GelView 6000Plus
HRP Ziege Anti-Maus	IgG Proteintech Group, Inc.China	15014
HRP Ziege Anti-Kaninchen	IgG Proteintech Group, Inc.China	15015
Mikroplatten-Reader	Molecular Devices, USA	CMax Plus
Mikroschere	Shanghai Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,China	WA1010
Mikroskopische Pinzette	Shanghai  Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,China	WA3010
Multifuge X1R Pro Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	75009750
Ophthalmologische Schere	Shanghai  Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,China	Y00030
Ophthalmische Pinzette	Shanghai  Medizin  Instruments (Gruppe) Co., Ltd., China	JD1060
Optima XPN-100 Ultrafiltrationszentrifuge	Beckman Coulter, USA	A94469
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., China	P1003
RIPA-Lysepuffer (stark, ohne Inhibitoren)	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0013K
Lineal	Deli  Fertigung  Unternehmen, China
SDS-PAGE Probenladepuffer, 5x	Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China	P0015
Transferpipette	Biologix Group Co., Ltd.USA	30-0238A1
Transmissionselektronenmikroskop	Hitachi, Japan	H-7650
Ultrazentrifugationsröhrchen	Beckman Coulter, USA	355618
Western Transfer Puffer	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China	G2028-1L