Methodenartikel

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

DOI:

10.3791/67234

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20. September 2024

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1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Milz-Exosomen von Mäusen vor, wobei eine Kombination aus Verdau mit Kollagenase Typ I und Ultrazentrifugation verwendet wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomen (Exo) sind Lipid-Doppelschicht-Strukturen, die von verschiedenen Zellen sezerniert werden, darunter die von Tieren, Pflanzen und Prokaryoten. Frühere Studien haben gezeigt, dass Exo, die aus humoralen oder Zellüberständen gewonnen werden, vielversprechende Ziele für neuartige diagnostische oder prognostische Biomarker sind, was ihre bedeutende Rolle bei der Pathogenese der Krankheit unterstreicht. Aus dem Gewebe gewonnenes Exo (Ti-Exo) hat aufgrund seiner Fähigkeit, die Gewebespezifität und die Mikroumgebung genau widerzuspiegeln, zunehmend Aufmerksamkeit erregt. Ti-Exo, die im interstitiellen Raum vorkommen, spielen eine entscheidende Rolle bei der interzellulären Kommunikation und der organübergreifenden Signalübertragung. Trotz ihres anerkannten Wertes bei der Aufklärung von Krankheitsmechanismen bleibt die Isolierung von Ti-Exo aufgrund der Komplexität der Gewebematrizen und der Variabilität der Extraktionsmethoden eine Herausforderung. In dieser Studie haben wir ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe von Mäusen entwickelt, das eine reproduzierbare Technik für nachfolgende Identifizierungsanalysen und funktionelle Studien bietet. Wir verwendeten den Typ-I-Kollagenase-Verdau in Kombination mit differentieller Ultrazentrifugation, um aus der Milz gewonnenes Exo zu isolieren. Die Eigenschaften des isolierten Exo wurden durch Elektronenmikroskopie, das Nano-Durchflusszytometer und den Western Blot bestimmt. Das isolierte aus der Milz gewonnene Exo wies die typische Morphologie von Lipid-Doppelschicht-Vesikeln auf, mit Partikelgrößen von 30 nm bis 150 nm. Darüber hinaus bestätigte das Expressionsprofil von Exosomenmarkern das Vorhandensein und die Reinheit von Exosomen. Insgesamt haben wir erfolgreich ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Milz-abgeleitetem Exo bei Mäusen etabliert.

Einleitung

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Exosomen (Exo) sind eine Untergruppe der extrazellulären Vesikel (EVs) mit einer Größe von 30 bis 150 nm, die eine Vielzahl von Biomolekülen verkapseln, darunter Proteine, Nukleinsäuren und Lipide1. Diese Biomoleküle stammen aus den Elternzellen und werden in den extrazellulären Raum abgegeben. Exo erleichtern den biomolekularen Informationsaustausch zwischen Zellen und ihrer umgebenden Mikroumgebung und spielen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Systemen eine Rolle2. Die Eigenschaften von Exosomen, wie Inhalt, Größe, Membrankomponenten und zelluläre Herkunft, sind sehr variabel und werden durch den ursprünglichen Zelltyp, den zellulären Zustand und die Umweltbedingungen beeinflusst.

Exosomen werden je nach Herkunft üblicherweise in drei Kategorien eingeteilt: aus Zellkulturen, aus Körperflüssigkeiten und aus Gewebe (Ti-Exo). Während aus Zellkulturen gewonnene Exosomen aufgrund ihrer Zugänglichkeit und gleichbleibenden Ausbeute ausgiebig untersucht wurden, ist ihre Verwendung durch mögliche Veränderungen der Zelleigenschaften nach längerer Kultur eingeschränkt, die ihre biologischen Funktionen falsch darstellen können 3,4,5. Darüber hinaus werden die meisten Zellkulturen in zweidimensionalen Umgebungen gehalten, die die komplexen interzellulären In-vivo-Interaktionen nicht nachahmen, was sich möglicherweise auf die Dateninterpretation auswirkt6. Umgekehrt bieten Exosomen, die aus biologischen Flüssigkeiten isoliert werden, eine minimalinvasive Möglichkeit, das Fortschreiten der Krankheit in Echtzeit zu überwachen7. Diese Proben enthalten jedoch oft eine Mischung aus Exosomen unterschiedlicher Herkunft, was die genaue Identifizierung ihrer primären Quelle erschwert8. Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein zunehmendes Interesse an Ti-Exo, die sich im extrazellulären Interstitium befinden und wichtige Mediatoren der interzellulären Signalübertragung sind.

Die Milz spielt eine entscheidende Rolle bei der Immunfunktion und der Aufrechterhaltung der inneren Homöostase. Trotz bestehender Protokolle zur Isolierung von Ti-Exo aus Organen wie Gehirn, Leber und Tumoren wird nur in begrenztem Umfang über praktische Methoden für Milz-Exosomen berichtet 9,10. Ziel dieser Studie war es, ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Exosomen aus Milzgewebe bei Mäusen zu etablieren, die gegenüber einem früheren Bericht modifiziertwurden 11. Wir beschreiben eine Methode, bei der der Kollagenaseaufschluss gefolgt von einer Ultrazentrifugation durchgeführt wird, die die Störung der Zellmembran minimiert und eine hohe Reinheit und Ausbeute von aus der Milz gewonnenem Exo gewährleistet. Die Eigenschaften von isoliertem Exo unter Verwendung dieses etablierten Protokolls wurden durch Elektronenmikroskopie (TEM), das Nano-Durchflusszytometer (Nano-FCM) und Western Blot validiert, was die Wirksamkeit des Protokolls für weitere experimentelle Forschungen bestätigt.

Protokoll

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Die Proben wurden von Mäusen gewonnen, mit ethischer Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Universität Guangdong. Detaillierte Beschreibungen der Materialien, Geräte und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Die Details der Präparation vor der Extraktion sind in Abbildung 1 dargestellt, während der Prozess der Milz-Exo-Extraktion und -Anreicherung in Abbildung 2 beschrieben ist.

1. Vorbereitung

  1. Kühle Hochgeschwindigkeits- und Ultrahochgeschwindigkeitszentrifugen auf 4 °C vor und stelle die Temperatur eines Desktop-Schüttlers auf 37 °C ein.
  2. Bereiten Sie Zellkulturschalen (figure-protocol-1100 mm), sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Eis und ein steriles Zellsieb (figure-protocol-270 μm) vor, wie in Abbildung 1A, B gezeigt.
  3. Sterilisieren Sie Scheren und Pinzetten mit 75%igem Alkoholspray, gefolgt von einer Hochtemperatursterilisation. Diese Werkzeuge sind in Abbildung 1C dargestellt.
  4. Legen Sie das Milzgewebe in eine sterile figure-protocol-3100 mm Petrischale auf Eis und waschen Sie das Oberflächenblut mit 1x eisgekühlter steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ab. Trocknen Sie das Milzgewebe mit steriler Gaze und wiegen Sie es nach dem Trocknen.
    HINWEIS: Wenn das Taschentuch gefroren ist, tauen Sie es in einer Schüssel 15 Minuten lang auf Eis auf, bevor Sie fortfahren.
  5. Befeuchten Sie das Zellsieb (figure-protocol-470 μm), indem Sie 1 ml steriles PBS mit einer sterilen Transferpipette in das Sieb geben.
  6. Bereiten Sie den Verdauungspuffer (0,1 % Kollagenase Typ I) mit 1x PBS mit einem Vortex-Mischer vor.
    HINWEIS: Verwenden Sie 10 ml Verdauungspuffer pro 100 mg Milzgewebe. Die Kollagenase-Konzentration wurde in dieser Studie auf der Grundlage der Produktanweisungen ausgewählt. Bei anderen Gewebetypen müssen Forscher diese Parameter möglicherweise basierend auf der Gewebedichte und -zusammensetzung anpassen. Es werden Vorversuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Verdauungszeiten empfohlen, um die optimalen Bedingungen für jeden Gewebetyp zu ermitteln.

2. Verdauung des Gewebes

  1. Das Gewebe wird mit einer Schere in einer Kulturschale auf Eis in gleichmäßige kleine Stücke geschnitten (Abbildung 3A) und mit einer sterilen Transferpipette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
  2. Geben Sie Verdauungspuffer entsprechend dem Gewicht des Milzgewebes in das Röhrchen, wie oben angegeben (Abbildung 3B), und schütteln Sie das Röhrchen dann mit einem Winkel von 45° auf einem horizontalen Schüttler bei 37 °C. Überwachen Sie den Verdauungsfortschritt und stoppen Sie die Verdauung, wenn sich Gewebebrocken verteilt haben und die meisten ihre Form verloren haben. Die Verdauungszeit sollte von Gewebe zu Gewebe variieren. Unter den experimentellen Bedingungen in dieser Studie beträgt die Aufschlusszeit ca. 30 min.
  3. Die verdaute Mischung wird in ein Zellsieb (T70 μm) bei Raumtemperatur (RT) überführt, um faserige und größere Gewebereste zu entfernen.
    HINWEIS: Vollständige Filtration sofort nach dem Aufschluss.
  4. Sammeln Sie das Filtrat in einem neuen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.

3. Isolierung von Exosomen durch Differenzialzentrifugation

  1. Filtrifugenfiltrate bei 500 x g für 10 min bei 4 °C. Ein Pellet mit Restzellen, Zelltrümmern und Zellkernen ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3C gezeigt.
  2. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 3000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Ein Pellet, das apoptotische Körper und Mikrosomen enthält, ist nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3D gezeigt.
  3. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren. Pellets, die Mikrovesikel und Plasmamembran enthalten, sind nach der Zentrifugation zu sehen, wie in Abbildung 3E gezeigt.
  4. Den resultierenden Überstand bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3F gezeigt.
  5. Den Überstand verwerfen, das Pellet mit PBS waschen und erneut bei 120.000 x g für 2 h bei 4 °C ultrazentrifugieren, um Exosomen zu erhalten. Am Boden des Röhrchens ist nach der Zentrifugation ein Pellet zu sehen, wie in Abbildung 3G gezeigt.
  6. Die isolierten Exosomen werden mit sterilem PBS (200 μl pro Milz) aufgelöst und die isolierten Exosomen in einem neuen 2 mL Zentrifugenröhrchen bei -80 °C gelagert.

4. Charakterisierung von Exosomen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Es wurde TEM verwendet, um festzustellen, ob das extrahierte Exo Vesikeleigenschaften aufwies. Die elektronenmikroskopisch identifizierten Exo-Proben müssen frische Proben sein oder kurzzeitig bei 4 °C gelagert werden.

  1. Fixieren Sie Exosomen (2-6 μg/μl) mit 2 % Paraformaldehyd in Elektronenmikroskopie (EM)-Qualität bei RT für 2 h.
  2. 10 μl Exosomenlösung auf ein Kupfernetz geben, 10 Minuten bei RT inkubieren, mit sterilem destilliertem Wasser abspülen und überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier abtupfen.
  3. Das Kupfergewebe 1 min lang mit 2% Uranylacetat einfärben, überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abtupfen und 2 min unter einer Glühlampe trocknen.
  4. Betrachten Sie die vorbereitete Probe unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV.

5. Messung der Größenverteilung und Partikelkonzentration von Exosomen

  1. Laden Sie die Standard-Polystyrol-Nanopartikel (250 nm) in das Nano-Durchflusszytometer.
  2. Messen Sie die Proteinkonzentration von Exo-Proben mit einem BCA-Protein-Assay-Kit. Verdünnen Sie die Exo-Probe mit PBS gemäß den Ergebnissen des BCA-Protein-Assays (verdünnen Sie die Exosomen auf 1-10 ng/μl) und laden Sie dann die Exo-Proben in den Nano-Flow, um die Intensität der Seitenstreuung (SSI) zu messen.
  3. Berechnen Sie die Exo-Konzentration entsprechend dem Verhältnis von SSI zu Partikelkonzentration in den Standard-Polystyrol-Nanopartikeln.
    HINWEIS: Für die Größenmessung wird eine Standardkurve erstellt, indem Standard-Siliziumdioxid-Nanopartikel mit Gradientengrößen (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) in das Nano-Durchflusszytometer geladen werden. Daran schließt sich die Beladung der Exo-Probe an. Die Größenverteilung von Exo wurde nach der Standardkur berechnet.

6. Lyse und Immunoblot-Bestätigung von Exosomenproteinen

  1. Geben Sie 100 μl RIPA-Lysepuffer (Radio Immunoprecipitation Assay) für die Proteinanalyse in das Exosom-Pellet.
  2. Kräftig vortexen, mit Parafilm bedecken, 20 min bei RT rocken, dann wieder vortexen.
  3. Zur Entnahme der Probe kurz bei 1000 x g zentrifugieren, in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und bis zur Analyse bei -20 °C bis -80 °C lagern.
  4. Mischen Sie für Immunoblot die Proben mit 5x Ladepuffer, um eine 1x-Konzentration zu erreichen, und bereiten Sie die Gelelektrophorese vor.
  5. Wenn Ganzgewebe-Homogenatkontrollen gewünscht werden, verwenden Sie einen starken Lysepuffer mit einem Proteaseinhibitor, um das Gewebe zu lysieren, wie oben beschrieben. Zentrifugieren Sie dann die Proben 10 Minuten lang bei 10.000 x g und verwerfen Sie die verbleibende extrazelluläre Matrix, ganze Zellen oder intakte Zelltrümmer.
  6. Kochen Sie den Probenpuffer, der Exosomen oder Gewebehomogenat enthält, bei 95 °C für 5-10 min. Laden Sie das gleiche Protein pro Bahn in ein 10% SDS-PAGE-Gel. Laden Sie das gleiche Protein des Gewebehomogenats als Kontrolle.
  7. Die Gelelektrophorese unter einer Spannung von 80 V für ca. 2 h unter Verwendung des herkömmlichen Elektrophoresepuffers durchführen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um die Exo-Proteinexpression in den gereinigten Lysaten zu bestätigen und die relative Exo-Häufigkeit in Fraktionen zu vergleichen.

Ergebnisse

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Isolierung und Reinigung von Exosomen aus der Milz
Um Exosomen aus Milzgewebe der Maus zu isolieren, verwendeten wir eine Kombination aus Kollagenaseverdau und differentieller Ultrazentrifugation (Abbildung 2). Die ersten Schritte umfassten die Vorbehandlung des Milzgewebes, um Oberflächenblut zu entfernen, gefolgt von der Verdauung mit Kollagenase Typ I. Diese enzymatische Behandlung erleichterte den Abbau der extrazellulären Matrixkomponenten und befreite so die Exosomen unter Beibehaltung ihrer Integrität. Nach dem Aufschluss wurde eine Reihe von Zentrifugationsschritten durchgeführt, um nacheinander Zelltrümmer, apoptotische Körper und größere Vesikel zu entfernen, was in der Ultrazentrifugation des Überstands bei 120.000 x g gipfelte, um die Exosomen zu pelletieren. Nachfolgende Isolationsverfahren ergaben PBS-lösliche Pellets, die mit Milz-abgeleitetem Exo angereichert waren, wie in Abbildung 3G gezeigt.

TEM-Ergebnisse
Die Morphologie der isolierten Exosomen wurde mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie untersucht, einer Goldstandardmethode zur Untersuchung der Charakterisierung von Exosomen. TEM wird häufig verwendet, um das Vorhandensein von Exosomen zu validieren, die Qualität von Exosomen zu bewerten und die Morphologie von Exosomen zu beobachten. Die TEM-Bilder (Abbildung 4A) zeigten das Vorhandensein von becherförmigen Vesikel, die für Exosomen charakteristisch sind. Diese Vesikel wiesen eine klare Lipid-Doppelschichtstruktur auf, was die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus dem Milzgewebe bestätigt.

Größenverteilung von Spleen-Exo
Die Größenverteilung und Konzentration der Exosomen wurde mit Hilfe eines Nano-Durchflusszytometers bestimmt. Die Ergebnisse (Abbildung 4B) zeigten, dass der Durchmesser der isolierten Exosomen zwischen 30 und 150 nm lag, mit einer Spitzenkonzentration bei etwa 60 nm. Der Durchmesser der isolierten Partikel lag überwiegend zwischen 50 und 80 nm, mit einer mittleren Partikelkonzentration von 4,6 x 109 Partikeln/ml. Dieser Größenbereich stimmt mit den zuvor berichteten Eigenschaften von Exosomen überein und validiert das Isolationsprotokoll weiter.

Western-Blot-Analyse
Um das Vorhandensein von exosomalen Markern zu bestätigen, führten wir eine Western-Blot-Analyse durch. Die exosomalen Marker TSG101 und CD9 wurden in den Milz-Exo-Proben nachgewiesen, während GM130, ein Golgi-Matrixprotein, das als Negativkontrolle verwendet wurde, nicht nachgewiesen wurde (Abbildung 4C). Im Vergleich dazu wurde das Protein dieser Marker in Milzgeweben von Mäusen exprimiert (Milz-T). Dies deutet auf die hohe Reinheit der isolierten Exosomen hin, da sie frei von zellulären Verunreinigungen waren.

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Abbildung 1: Vorbereitung der Versorgung. (A) 50-ml-Zentrifugenröhrchen, Kulturschalen, Eis und chirurgische Instrumente wurden in einer Biosicherheitswerkbank untergebracht. (B) Ein steriles Zellsieb (figure-results-270 μm). (C) Sterilisierte chirurgische Instrumente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Verfahren zur Isolierung der Milz-Exo. Bereiten Sie Milzgewebe vor und schneiden Sie es in eisgekühltem PBS in kleine Stücke, gefolgt von einem Aufschluss mit Kollagenase Typ I und einer Zentrifugation wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Milz-Exo-Isolierung. (A) Kleine Milzblöcke, die für die anschließende Verdauung bereit sind. (B) Milzgewebeblöcke mit Verdauungspuffer. (C) Pellets nach 500 x g Zentrifugation. (D) Pellets nach 3.000 x g Zentrifugation. (E) Pellets nach 10.000 x g Zentrifugation. (F) Pellets nach 120.000 x g Zentrifugation. (G) Exosomenpellets nach 120.000 x g Zentrifugation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Identifizierung von Spleen-Exo. (A) TEM-Ergebnisse, die isolierte Partikel als runde oder ovale membranöse Vesikel mit becherförmiger Morphologie zeigen. Maßstabsleiste = 200 nm bzw. 50 nm. (B) Die Analyse der Größenverteilung mit dem Flow Nano Analyzer zeigte, dass der Durchmesser von Spleen-Exo überwiegend zwischen 50 nm und 80 nm lag, mit einer mittleren Partikelkonzentration von 4,6 × 109 Partikeln/ml. (C) Western-Blot-Analyse, die die Expression von Exosomen-spezifischen Markerproteinen (TSG101 und CD9) in Spleen-Exo zeigt, mit negativer Expression von GM130. Diese Marker waren in Proteinproben nachweisbar, die aus der Milz der Maus extrahiert wurden (Milz-T-Gruppe). Es wurden die repräsentativen Western-Blot-Bilder gezeigt (n = 6 Gewebe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

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Neuere Forschungen haben gezeigt, dass aus der Milz gewonnene Exosomen (Spleen-Exo) eine entscheidende Rolle bei der Behandlung von Magenkrebs spielen12. Um die Funktionen von Spleen-Exo weiter aufzuklären, ist es notwendig, eine reproduzierbare und optimale Methode für ihre Extraktion aus Milzgewebe zu etablieren. Während es Protokolle für die Isolierung von Exosomen aus Hirn- und Leberkrebs gibt13,14, sind die Methoden für andere Gewebe noch unterentwickelt und bedürfen einer weiteren Validierung. In dieser Studie haben wir eine praktische Methode zur Isolierung von Exo aus Milzgewebe skizziert.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur Extraktion von Exo in der wissenschaftlichen Forschung und Anwendung eingesetzt, darunter Ultrazentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Immunadsorption mit magnetischen Kügelchen, Ultrafiltration und Polymerfällung15. Die Ultrazentrifugation ist nach wie vor die Goldstandardmethode zur Extraktion von Exo aus verschiedenen Quellen. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Störung von Gewebestrukturen, um höhere Konzentrationen von Exo zu erhalten, das aus intrazellulären und extrazellulären Quellen von Exo16 besteht. Kollagenase minimiert die Auswirkungen auf die Integrität der Zellmembran und gewährleistet die Reinheit von Ti-Exo3. Kollagenase wurde verwendet, um extrazelluläre Vesikel aus humanem metastasierendem Melanom-, Fett-, Dickdarmkrebs- und Leberkrebsgewebe zu extrahieren 5,10,13,17. Die Konzentration und die Verdauungszeit von Kollagenase variieren jedoch zwischen verschiedenen Geweben.

Wir haben ein spezifisches Protokoll für die Isolierung von Spleen-Exo unter Verwendung von Typ-I-Kollagenase für den Aufschluss entwickelt, gefolgt von einer Filtration durch differentielle Ultrazentrifugation, um qualitativ hochwertiges Spleen-Exo zu erhalten. Die Ultrazentrifugation kann Restzellen, große Vesikel, Zelltrümmer und apoptotische Körper effektiv aus den Proben entfernen16. Crescitelli et al. verwendeten Kollagenase D und Gradientenultrazentrifugation, um kleine extrazelluläre Vesikel mit einer mittleren Größe von 75 nm Durchmesser5 zu isolieren. Im Vergleich zu ihrem Protokoll verwendete unser Protokoll Typ-I-Kollagenase und einen zusätzlichen Ultrazentrifugationsschritt bei 120.000 x g, um eine optimale Reinheit der Exosomen zu erreichen. Im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen die Gewebehomogenisierung zur Gewinnung einer Gewebesuspension verwendetwurde 14,18, bewahrt unser Ansatz die Membranintegrität von Zellen in Geweben. Darüber hinaus wandten Vella et al. die Dichtegradientenzentrifugation (einen dreifachen Saccharosegradienten) an, um drei Partikelgruppen zu erzeugen, was zusätzliche Zeit für den Vorgangerforderte 10. Dieser Ansatz erzeugte große Vesikel mit einer Größe von über 200 nm, eine heterogene Population von Vesikeln mit Größen von 50 nm bis 200 nm und kleine Vesikel mit einer Größe von etwa 20 nm. Das in diesem Studienprotokoll beschriebene Protokoll umfasst eine Reihe von Ultrazentrifugationsschritten, um verbleibende Zellen, Zelltrümmer, apoptotische Körper und größere Vesikel methodisch zu eliminieren und so die Reinheit des erhaltenen Exo zu verbessern. Wir legen Wert auf eine sorgfältige Handhabung bei der Sammlung von Überständen, um eine Störung der sedimentierten Pellets zu vermeiden.

Wir beurteilen die Morphologie und Reinheit des isolierten Spleen-Exo durch TEM- und Nanopartikel-Tracking-Analyse. Beide Assays zeigten, dass die aus der Milz stammenden Partikel, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, eine Lipiddoppelschicht und becherförmige Vesikel mit Größen von 30 nm bis 150 nm aufwiesen, was die typischen Merkmale von Exosomensind 19. CD9 und TSG101 sind Exosomenmarker19, und GM130, ein Golgi-Protein, wird als negativer Marker für die Exosomenidentifikation verwendet20. Die Ergebnisse zeigten, dass Milz-Exo positiv für CD9 und TSG101 war, während GM130 nicht nachgewiesen wurde, was die erfolgreiche Isolierung von hochwertigem, aus Gewebe gewonnenem Exo aus der Milz bestätigt.

Um eine hohe Qualität von Ti-Exo zu erreichen, ist die Auswahl des geeigneten Enzymtyps, der Konzentration und der Verdauungsdauer sowie die richtige Gewebelagerung unerlässlich. Wir beobachteten keinen signifikanten Unterschied in den Proteinkonzentrationen zwischen Exo, das aus frischem und gefrorenem Milzgewebe gewonnen wurde (Daten nicht gezeigt), was auf die Machbarkeit der Verarbeitung großer Mengen gefrorener Gewebe zur Reduzierung des Arbeitsablaufs hinweist. Die Isolierung von Ti-Exo erfordert eine lange Betriebszeit für die Ultrazentrifuge, so dass es unpraktisch ist, das gesamte Protokoll innerhalb eines angemessenen Zeitraums durchzuführen, wenn frisches Gewebe in klinischen Anwendungen verwendet wird. Daher wäre die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die Isolierung von Exosomen eine bessere Option. Das Auftauen bei 37 °C ist für gefrorenes Gewebe nicht geeignet, da Kryoprotektiva nur unvollständig in das Gewebe eindringen. Es wurde berichtet, dass bei der Exosomenisolierung mit gefrorenem Gewebe, das auf Eis aufgetaut wurde, die Ausbeute an Exosomen im Vergleich zu frischem Gewebe keine signifikante Bedeutung im Gehalt zeigte21. Daher tauten wir das gefrorene Milzgewebe auf Eis auf, um eine Exosomenisolierung durchzuführen, wenn die Lagerproben bei -80 °C verwendet wurden.

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll weist jedoch mehrere Einschränkungen auf. Die umfangreichen Schritte der Extraktion und Identifizierung sind zeitintensiv. Angesichts des ultimativen Ziels, die Exo-Forschung auf die klinische Behandlung von Krankheiten anzuwenden, werden schnellere und kostengünstigere Methoden immer wichtiger. Obwohl die Ergebnisse auf Gewebeproben von Mäusen basieren, muss die Anwendbarkeit auf menschliches Gewebe noch bestimmt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll eine Methode zur Extraktion von hochreinem Exo aus Milzgewebe bietet, die für eine detaillierte nachgelagerte Analyse geeignet ist. Aus Gewebe gewonnene Exo spiegelt die Mikroumgebung ihrer Herkunft genauer wider und birgt ein erhebliches Potenzial zur Aufklärung physiologischer und pathologischer Prozesse in lebenden Organismen. Zukünftige Studien könnten dieses Protokoll an menschliches Gewebe anpassen und so die Extraktion klinisch relevanter Exosomen für diagnostische und therapeutische Zwecke ermöglichen. Diese Technik könnte besonders nützlich sein, um die Rolle von Exosomen bei Immunreaktionen zu untersuchen, da die Milz eine entscheidende Funktion im Immunsystem hat. Darüber hinaus könnte das Protokoll so modifiziert werden, dass Exosomen aus anderen Geweben isoliert werden, was möglicherweise bei der Entwicklung gewebespezifischer Biomarker und zielgerichteter Therapien helfen könnte. Durch die Verbesserung unseres Verständnisses der Exosomenbiologie kann dieses Protokoll zu Fortschritten in der Präzisionsmedizin und zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien beitragen.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82370281, 81870222), der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2022A1515012103) und dem Science, the Technology Development Special Fund Competitive Allocation Project der Stadt Zhanjiang (2021A05086) und der Startup Foundation des Second Affiliated Hospital der Guangdong Medical University (23H03).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70 & Mikro; m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Anti CD9 AntikörperCell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Anti GM130 AntikörperProteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Anti TSG101 AntikörperAbcam Plc, UK125011
ZellkulturschaleWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China704001
ZentrifugenröhrchenWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China788211
Kollagenase Typ ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Desktop-ThermostatschüttlerShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
ElektrophoresepufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2081-1L
Erweitertes BCA-Protein-Assay-KitShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., ChinaN30E
Fluoreszenz-/Chemilumineszenz-Bildgebungssystem Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinaGelView 6000Plus
HRP Ziege Anti-MausIgG Proteintech Group, Inc.China 15014
HRP Ziege Anti-KaninchenIgG Proteintech Group, Inc.China 15015
Mikroplatten-ReaderMolecular Devices, USACMax Plus
MikroschereShanghai Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,ChinaWA1010
Mikroskopische PinzetteShanghai  Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,ChinaWA3010
Multifuge X1R Pro ZentrifugeThermo Fisher Scientific, USA75009750
Ophthalmologische SchereShanghai  Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,ChinaY00030
Ophthalmische PinzetteShanghai  Medizin  Instruments (Gruppe) Co., Ltd., China JD1060
Optima XPN-100 UltrafiltrationszentrifugeBeckman Coulter, USAA94469
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., ChinaP1003
RIPA-Lysepuffer (stark, ohne Inhibitoren)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0013K
LinealDeli  Fertigung  Unternehmen, China
SDS-PAGE Probenladepuffer, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China P0015
TransferpipetteBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
TransmissionselektronenmikroskopHitachi, JapanH-7650
UltrazentrifugationsröhrchenBeckman Coulter, USA355618
Western Transfer Puffer Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2028-1L

Referenzen

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