Methodenartikel

Aufklärung gewebe- und plasmaspezifischer proteomischer Veränderungen bei Gesundheit und Krankheit

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DOI:

10.3791/67240

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23. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Proteomik ist eine Hochdurchsatz-Bewertung der Wechselwirkungen, Funktionen, Zusammensetzung und Strukturen von Proteinen und ihrer zellulären Aktivitäten. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die gesamten proteomischen Veränderungen in verschiedenen Bioproben, einschließlich Plasma und Geweben, zu bewerten. Die hierin beschriebene Methodik ist auf alle Bioproben anwendbar, die Proteine enthalten.

Zusammenfassung

Proteomik ist die groß angelegte Untersuchung exprimierter Proteine, die sich auf deren Struktur, Funktion, Interaktionen, Häufigkeit und posttranslationale Modifikationen innerhalb eines biologischen Systems konzentriert. Zum Beispiel ist die Phosphoproteomik, eine wichtige Teilmenge der Gesamtproteomik, die Untersuchung von Phosphorylierungsmustern und Veränderungen an Proteinen. Die hierin beschriebene Methodik veranschaulicht einen totalproteomischen Ansatz zur Aufklärung von Veränderungen in den gesamten Proteinexpressionsprofilen, einschließlich Phosphorylierungsmustern, im Plasma-, Gehirn-, Lungen-, Milz- und Lebergewebe, das aus Forschungstiermodellen (d. h. Frettchen und Mäusen) gesammelt wurde. Diese Technik ist sowohl auf andere Gewebetypen als auch auf fast jede Bioprobe anwendbar, die Proteine enthält (z. B. kultivierte Zellen). Nach der Dissektion wurden die interessierenden Gewebe schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Das Gewebe wurde dann mit einem Mörser und einem Stößel mit flüssigem Stickstoff homogenisiert, um die Proteinintegrität und Phosphorylierungsänderungen zu erhalten. Das Gesamtprotein wurde aus den Gewebehomogenaten unter Verwendung eines Lysepuffers mit einer universellen Nuklease und Protease-/Phosphatase-Inhibitoren extrahiert. Proteine, die aus Gewebe und äquivalentem Plasma extrahiert wurden, wurden durch kontrollierten Proteaseverdau mit einem kommerziellen Massenspektrometer-Probenvorbereitungskit in Gesamtpeptide umgewandelt. Die Peptide wurden direkt mit Hilfe der Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie/Orbitrap-Tribrid-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Identitäten der konstituierenden Proteine wurden aus den spektralen Massendaten des Peptids unter Verwendung von Proteomik-Bioinformatik-Software rekonstruiert und mit einer speziesspezifischen Aminosäuresequenzbibliothek abgeglichen. Danach sollte die Analyse strenge Cutoff-Kriterien umfassen, insbesondere unter Verwendung von Proteinidentifikationen mit hoher Zuverlässigkeit. Statistisch signifikante proteomische Unterschiede (>2-fache Veränderung; p < 0,05) können zwischen Kontroll- und Experimentalgruppe bestimmt werden.

Einleitung

Die Proteomik, als Kombination aus Proteomexperimenten und Datenanalyse, konzentriert sich auf die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen und deren Charakterisierung auf der Grundlage von Zusammensetzung, Interaktion, prä- und posttranslationalen Modifikationen (z. B. Phosphorylierung), subzellulärer Lokalisation und Struktur unter physiologischen Bedingungen1. Die Expressionsproteomik befasst sich mit quantitativen Vergleichen von Proteinen, die sich unter sich ändernden biologischen Bedingungen unterscheiden2. Es ist auch von großer Bedeutung für die Erstellung einer Karte der komplexen, miteinander verbundenen Wege, Netzwerke und molekularen Systeme, die die wichtigsten biologischen Funktionen wie Zellproliferation, Differenzierung, Seneszenz und Zelltodmechanismen direkt steuern. Mit der erheblichen Weiterentwicklung der experimentellen Technologie in den letzten Jahren haben sich die Proteomik-Methoden von herkömmlichen Ansätzen – einschließlich Immunhistochemie und enzymgebundenen Immunsorbent-Assays – zu Hochdurchsatztechniken wie der Flüssigkeitschromatographieentwickelt 3,4. Proteomik-basierte Ansätze gewinnen an Bedeutung bei der Bestimmung einzigartiger Krankheitsphänotypen und -subtypen sowie bei der Identifizierung neuer Zielinteraktionen für therapeutische Medikamente (Pharmakoproteomik). So hat sich beispielsweise die Patientenstratifizierung in erster Linie auf genomische Ansätze konzentriert, um homogene Gruppen zu definieren und Behandlungsschemata zu leiten. Der Transkriptionsstatus allein sagt jedoch nicht das Schicksal der translatierten Proteine danach voraus (z. B. Stabilität oder Modifikation); und somit tragen nicht-genomische Mechanismen mehr zur Krankheitsentwicklung, zum Fortschreiten, zur Schwere und zur Resistenz gegen Therapeutikabei 5,6,7.

Ein solcher Forschungsbereich, der stark von quantitativen Vergleichen der Proteinexpression und -aktivität profitiert hat, ist die Entdeckung von Biomarkern im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen und traumatischer Hirnverletzungen (TBI). Die Grundlage für die Entdeckung von Biomarkern ist die Entwicklung diagnostischer Techniken, die eine Früherkennung und potenzielle Angriffspunkte für Interventionen erleichtern. Die auf LC/MS-MS basierende quantitative Proteomik in Verbindung mit Bioinformatik hat die Entdeckung wichtiger Protein-Biomarker unterstützt, darunter das saure Gliafibrillärprotein (GFAP) und das Ubiquitin-Carboxyl-terminale Hydrolase-Isoenzym L1 (UCH-L1), die schwerwiegende Auswirkungen auf das SHThaben 8,9. Zum Beispiel erleiden Militärangehörige während ihrer Missionen häufig SHT-Vorfälle, da sie Bombenexplosionen ausgesetzt sind (d. h. Blast-TBI). Die zugrundeliegende Pathobiologie der neurologischen Defizite, die durch blasteninduziertes mildes SHT verursacht werden, bleibt jedoch unklar. Daher erfordert das Verständnis der molekularen und ultrastrukturellen Mechanismen von blasteninduzierten Hirnverletzungen eine bessere Identifizierung spezifischer Biomarker-Surrogate. Mit der Beobachtung proteomischer Veränderungen haben Studien gezeigt, dass mögliche Mechanismen von blastinduziertem oxidativem Stress im Gehirn mit mitochondrialer Dysfunktion verbunden sind, einschließlich einer beeinträchtigten Spaltungs-Fusions-Dynamik, einer verminderten oxidativen Phosphorylierung und kompensierter atmungsrelevanter Enzymaktivitäten10. Einblicke in die frühe Pathogenese der blasteninduzierten Dysregulation posttranslationaler Modifikationen wie Acetylierung, Nitrosylierung, Desaminierung und Phosphorylierung können auch eine weitere Charakterisierung ihrer Auswirkungen auf die Proteinfunktion liefern, die an axonalen Schäden, Entzündungen und Störungen der Blut-Hirn-Schranke beteiligt ist11,12. Mit der Weiterentwicklung systembiologischer Ansätze ist die Kartierung von Gesamtproteominformationen aus dem Gehirn und peripheren Geweben verschiedener Tierarten, einschließlich Nagetieren und Frettchen, zu einem Schlüsselverfahren in der Erforschung von Explosionsverletzungen geworden.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf den methodischen Workflow zur Bewertung quantitativer Aspekte der Expressionsproteomik und ihrer posttranslationalen Modifikationen ausgehend von Gewebe oder Plasma, der sowohl für die Überwachung physiologischer Phänomene als auch pathologischer Zustände ausgiebig eingesetzt wurde. Die Verwendung der folgenden Methodik ermöglicht Konsistenz und Zuverlässigkeit bei der Probenvorbereitung und Datenerfassung. Durch diese standardisierte Methodik können Vergleiche durchgeführt werden, um erhaltene proteomische Muster über Gewebetypen hinweg und Phosphorylierungsmuster zu bestimmen, die für bestimmte Gewebe einzigartig sind. Darüber hinaus kann eine Analyse mehrerer präklinischer Tiermodelle und klinischer Proben am Menschen durchgeführt werden, um konservierte Phosphorylierungsmuster zu erhalten, die möglicherweise als Biomarker dienen könnten, und um medikamentöse Behandlungsschemata anzupassen.

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Protokoll

Die Forschung wurde im Rahmen eines von der IACUC genehmigten Tierverwendungsprotokolls in einer von AAALAC International akkreditierten Einrichtung mit einer Tierschutzversicherung des öffentlichen Gesundheitsdienstes und in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz und anderen Bundesgesetzen und -vorschriften in Bezug auf Labortiere durchgeführt. Alle für dieses Verfahren erforderlichen Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Das Verfahren gliedert sich in sieben Komponenten.

VORSICHT. Stellen Sie sicher, dass bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff zur Homogenisierung des Gewebes die richtigen Sicherheitsprotokolle befolgt werden. Das Laborpersonal trug während der Homogenisierung von gefrorenem Gewebe Gefrierhandschuhe, eine Gefrierschürze, eine chirurgische Gesichtsmaske und einen Gesichtsschutz. Diese Homogenisierungstechnik kann für jeden Gewebetyp verwendet werden, auch für extrem zähe Substanzen wie Knochen, indem einfach die Größe des Mörsers und des Stößels entsprechend angepasst wird. In Abbildung 1A finden Sie die Ersteinrichtung der Workbench. In der Materialtabelle finden Sie die Größen, die bei der Homogenisierung von Maus- und Frettchengewebe verwendet werden.

1. Kryogene Zerkleinerung von Geweben mit einem Mörser und Stößel

  1. Nehmen Sie das Gewicht eines leeren Auffangröhrchens und notieren Sie es. Während Sie sich im Entnahmeröhrchen befinden, wiegen Sie das Gewebe mit einer Analysenwaage und notieren Sie das Gewicht in einem Labornotizbuch. Subtrahieren Sie das Gewicht eines leeren Röhrchens vom Taschentuch plus das Gewicht des Röhrchens, um das verwendete mg Gewebe zu erhalten.
    HINWEIS: Zu den Geweben, die für proteomische Studien untersucht wurden, gehören Gehirn, Lunge, Leber und Milz. Das gesamte Gewebe wurde mit einem Mörser und Stößel kryogenisch in Pulverform gemahlen.
  2. Gießen Sie flüssigen Stickstoff in den Kryopoden, aber stellen Sie sicher, dass er weniger als zur Hälfte gefüllt ist.
  3. Übertragen Sie das Röhrchen mit der Probe und die leeren, zuvor autoklavierten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf das Röhrchengestell im Kryopoden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe während des Abkühlens des Mörsers und des Stößels gefroren bleibt, und verhindert, dass die Probe auftaut, wenn das homogenisierte Gewebe in die leeren 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt wird.
  4. Gießen Sie flüssigen Stickstoff auf den Mörser und den Stößel, um diese Instrumente vor dem Gebrauch zu kühlen. Der Mörser und der Stößel befinden sich außerhalb des Kryopodens (Abbildung 1A,B).
  5. Übertragen Sie das Gewebe in den abgekühlten Mörser, der flüssigen Stickstoff enthält (Abbildung 1B).
  6. Üben Sie mit dem Stößel wiederholt Druck auf das gefrorene Gewebe aus und führen Sie mit dem Stößel eine rotierende, mahlende Bewegung gegen das Gewebe aus, bis das Gewebe zu einem feinen Pulver zermahlen ist (Abbildung 1C).
    1. Stellen Sie sicher, dass keine übermäßige Kraft ausgeübt wird, da sonst die Gefahr besteht, dass Proben aus dem Mörtel austreten. Stellen Sie sicher, dass Sie den Stößel fest unter Kontrolle haben.
    2. Fügen Sie dem Mörser zusätzlichen flüssigen Stickstoff hinzu, während Sie große Gewebe homogenisieren, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass die Probe beim Mahlen auftaut.
    3. Vergewissern Sie sich beim Schleifen des Taschentuchs, dass es nicht auftaut. Wenn er auftaut, geben Sie zusätzlichen flüssigen Stickstoff in den Mörtel.
  7. Tauchen Sie die Enden der Metallspatel in den flüssigen Stickstoff, um sie zu kühlen. Dies hilft dabei, das homogenisierte Gewebe leicht in das 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. Dadurch wird verhindert, dass das Gewebe während des Transfers auftaut und am Spatel klebt.
  8. Sobald das Gewebe zu einem feinen Pulver homogenisiert und die Metallspatel gekühlt sind, füllen Sie das homogenisierte Gewebepulver vorsichtig in die neuen 1,5-ml-Röhrchen um.
    1. Teilen Sie die Probe in Aliquote auf, abhängig von der Anzahl der durchzuführenden Assays.
      HINWEIS: Zum Beispiel sollten für die Proben in dieser Studie vier Assays durchgeführt werden, so dass das homogenisierte Gewebe zu gleichen Teilen in vier 1,5-ml-Röhrchen aliquotiert wurde.
    2. Lagern Sie überschüssiges homogenisiertes Gewebe in einem autoklavierten 5-ml-Entnahmeröhrchen mit Schnappverschluss.
  9. Lagern Sie das aliquotierte Gewebe bis zur zukünftigen Analyse in einem -80 °C-Gefrierschrank, mit einer realistischen Verwendung innerhalb von 1 Jahr, um die Luft- und Lichtoxidation von Proteinen zu minimieren.
  10. Wiegen Sie das leere Auffangröhrchen.
  11. Subtrahieren Sie das Gewicht des leeren Entnahmeröhrchens von der anfänglichen Messung (Entnahmeröhrchen plus Probe), um das Gewicht der Gewebeprobe zu erhalten.

2. Gewebelyse zur Proteinisolierung

  1. Schöpfen Sie Trockeneis in einen Eisbehälter.
  2. Legen Sie ein Röhrengestell in das Trockeneis und lassen Sie es abkühlen.
  3. Nehmen Sie homogenisierte Gewebeproben aus dem -80 °C Gefrierschrank und legen Sie sie in das Gestell der Kühlröhrchen. Dadurch wird verhindert, dass die Proben auftauen, was während des Wägeprozesses zu einem Proteinabbau und/oder Phosphorylierungsänderungen führen könnte.
    1. Stellen Sie sicher, dass die 1,5-ml-Röhrchen mit der Probe auf dem Röhrchengestell in Trockeneis eingefroren bleiben.
  4. Legen Sie ein neues 50-ml-Kanonenröhrchen in das Trockeneis.
  5. Entfernen Sie die Kappe von der kanonischen 50-ml-Tube und legen Sie Einweg-Plastikspatel in die kanonische 50-ml-Tube, um sie kühl zu halten. Dadurch wird verhindert, dass die Probe während des Transfers in die Homogenisierungsröhrchen an den Spateln kleben bleibt.
  6. Für die Gewebelyse und Proteinisolierung verwenden Sie 2-ml-Röhrchen mit fünf 2,8-mm-Keramikkügelchen (in diesem Protokoll als Homogenisierröhrchen bezeichnet).
  7. Beschriften Sie die Kappe und die Seite des Homogenisierröhrchens mit der Proben-ID mit einem permanent eingefärbten Markierungsstift.
  8. Legen Sie die beschrifteten Homogenisierröhrchen in das Röhrchengestell im Trockeneis, um die Röhrchen kalt zu halten und ein Auftauen der Probe zu verhindern.
  9. Stellen Sie ein Homogenisierröhrchen auf eine Analysewaage und tarieren Sie die Waage.
  10. Stellen Sie das Homogenisierröhrchen wieder auf Trockeneis in das Röhrchengestell.
  11. Entfernen Sie den Deckel von dem Homogenisierungsröhrchen, das die Kügelchen enthält, und geben Sie mit einem der gekühlten Kunststoffspatel 5 mg bis 10 mg pulverförmige Gewebeprobe in das entsprechende Homogenisierröhrchen.
  12. Setzen Sie den Deckel wieder auf das Homogenisierrohr.
  13. Wiegen Sie das Homogenisatorröhrchen auf der Analysenwaage und notieren Sie die Probenmenge im Homogenisierröhrchen.
    1. Verwenden Sie dieses Gewicht, um die Menge an Lysepuffer zu bestimmen, die für eine effektive Gesamtproteinextraktion erforderlich ist.
  14. Sobald das Gewicht aufgezeichnet wurde, legen Sie das Homogenisierröhrchen mit der Probe zurück in das Röhrchengestell auf Trockeneis, um es kalt zu halten.
  15. Entsorgen Sie den gebrauchten Kunststoffspatel.
  16. Verwenden Sie für jede zu übertragende und zu wiegende Probe einen neuen, sauberen Kunststoffspatel, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Wiederholen Sie die Schritte 2.9 bis 2.15 für alle Proben.
  17. Nachdem Sie alle Proben in einzelne Homogenisierröhrchen überführt haben, berechnen Sie die benötigte Menge an Protein Lysis Master Mix.
    1. Bereiten Sie das erforderliche Volumen des Protein Lysis Master Mix vor, das auf der Grundlage der Anzahl der zu verarbeitenden Proben und des Gewichts jeder pulverförmigen Probe berechnet wird. Geben Sie 100 μl Protein Lysis Master Mix pro 5 mg Gewebe in jedes Röhrchen.
    2. Beachten Sie die Unternehmensrichtlinien für Reagenzienvolumina zur Herstellung des Proteinlyse-Mastermixes (siehe Materialtabelle).
  18. Die Homogenisierröhrchen mit den homogenisierten, pulverförmigen Proben werden in einen 4 °C kalten Block gelegt. Die Homogenisierrohre können nicht mehr auf Trockeneis verbleiben. Durch das Aufstellen der Homogenisierröhrchen auf den Kaltblock wird ein Einfrieren der Lyselösung verhindert.
  19. Entfernen Sie den Deckel von den Homogenisierröhrchen und übertragen Sie die berechnete Menge des benötigten Protein Lysis Master Mix mit der entsprechenden Pipette in das entsprechende Homogenisierröhrchen.
    1. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Homogenisierröhrchen und drehen Sie die Deckel, bis sie fest sitzen.
  20. Legen Sie die Probenröhrchen in den Homogenisator und stellen Sie ihn für die Homogenisierung auf ein Weichgewebeprogramm (Drehzahl 4500 U/min, 2 x 30 s pro Zyklus, 30 s Pause) bei 4 °C ein.
  21. Sobald der Homogenisierungszyklus abgeschlossen ist, entfernen Sie die Röhrchen aus dem Gerät und legen Sie sie wieder in den 4 °C kalten Block.
    1. Prüfen Sie die Probenröhrchen visuell. Stellen Sie sicher, dass keine pulverförmige Probe mehr sichtbar ist. Wenn die Probe immer noch im gesamten Protein Lysis Master Mix visualisiert ist, führen Sie die Gewebelyse erneut auf dem Gerät durch.
    2. Optimieren Sie die Einstellungen für die Art des verwendeten Gewebes. Zum Beispiel kann pulverisiertes Gewebe, das aus fibrösen Organen (z. B. Herz) gewonnen wird, zusätzliche Zyklen oder eine höhere Drehzahl benötigen.
  22. Übertragen Sie die Homogenisierröhrchen in eine Zentrifuge. Nehmen Sie die folgenden Einstellungen an der Zentrifuge ein: 16.000 g für 10 min bei 4 °C und drücken Sie Start an der Zentrifuge.
  23. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, werden die Homogenisierröhrchen vorsichtig wieder in den 4 °C kalten Block zurückversetzt.
  24. Beschriften Sie neue 1,5-ml-Röhrchen auf dem Deckel und an der Seite mit der Proben-ID und allen anderen relevanten Informationen. Legen Sie diese 1,5-ml-Röhrchen nach der Etikettierung in einen 4 °C kalten Block.
    HINWEIS: Die Röhrchen wurden mit mindestens den folgenden Angaben beschriftet: Tier-ID, Studienzeitpunkt, Tiertyp und Gewebetyp.
  25. Übertragen Sie das entsprechende Proteinlysat aus den Homogenisierröhrchen in die jeweils markierten 1,5 mL-Röhrchen, die auf einem 4 °C kalten Block aufbewahrt werden.
  26. Lagern Sie die Proben für die weitere Analyse bei -80 °C. Dies ist ein sicherer Haltepunkt.

3. Quantifizierung des Gesamtproteins

  1. Nehmen Sie die Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie die Proben auf nassem Eis in einem Eiskübel auf.
  2. Nach dem Auftauen werden alle Proben und Standards aus dem Proteinquantifizierungskit mindestens 3 s lang vortext.
  3. Geben Sie 10 μl jedes Replikats von Standard-, Proben- und Leerproben in eine 96-Well-Mikrotiterplatte, die auf dem schematischen Layout basiert (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Für jede Gewebeprobe wird eine 1:100-Verdünnung des Proteinlysats in vorzugsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei der Proteinassay-Analyse verwendet. Das schematische Layout kann je nach Anzahl der im Proteinassay verwendeten Proben geändert werden. Die Proben, Standards und entsprechenden Leerproben werden in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte geladen, um die Genauigkeit der Proteinkonzentration zu beurteilen. Wenn jedoch viele Proben auf eine Platte passen müssen, sind Duplikate akzeptabel.
    1. Für die Proben mit einer geringen Menge an Ausgangsgewebe (d. h. weniger als 5 mg) verwenden Sie nur ein einzelnes Replikat oder Duplikate für den Proteinassay, um die Menge an Proteinlysat zu maximieren, die für den nachfolgenden Proteinverdau zur Verfügung steht.
    2. Stellen Sie sicher, dass genaues Pipettieren und kalibrierte Pipetten verwendet werden.
  4. Drehen Sie die Flasche des Proteinassay-Reagenzes mehrmals um, um sie gut zu mischen, und gießen Sie sie dann in ein 10-ml-Reagenzreservoir.
  5. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette mit einer maximalen Kapazität von 200 μl 150 μl des Proteinassay-Reagenzes in Spalte 1.
  6. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Protein-Assay-Reagenz mit den 10 μl Inhalt, die sich bereits in der Vertiefung befinden, zu mischen und so die Ausfällung in den Vertiefungen zu reduzieren.
  7. Entsorgen Sie die Pipettenspitzen und setzen Sie neue Spitzen auf die Mehrkanalpipette mit maximaler Kapazität von 200 μl.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 bis 3.7, bis das Proteinassay-Reagenz auf die gesamte 96-Well-Platte gegeben wurde.
    1. Verwenden Sie für jede Well-Säule frische Pipettenspitzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
    2. Stellen Sie sicher, dass mindestens eine Vertiefung leer bleibt und keine Reagenzien oder Proben hinzugefügt werden, die als Blanko-Absorptionswert für die Proteinquantifizierung verwendet werden können.
  9. Nachdem das Proteinassay-Reagenz in alle erforderlichen Vertiefungen gegeben wurde, decken Sie die 96-Well-Platte mit einer Aluminiumfolienplattenversiegelung ab.
  10. Wirbeln Sie die 96-Well-Platte auf einem Vortex-Instrument 1 Minute lang bei mittlerer Geschwindigkeit vor und inkubieren Sie sie dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), bevor Sie die Platte ablesen.
  11. Überprüfen Sie die 96-Well-Platte und die Aluminiumfolienversiegelung. Wenn das Reagenz an der Siegelung der Aluminiumfolie kleben bleibt, legen Sie es mit einer geeigneten Waage in eine Zentrifuge.
    1. Halten Sie die Schnelldrehung gedrückt, bis sie etwa 200 g erreicht.
    2. Nehmen Sie die 96-Well-Platte heraus und überprüfen Sie die Aluminiumfolienversiegelung, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit auf der Folie verbleibt.
  12. Entfernen Sie langsam die Aluminiumfolienversiegelung, und setzen Sie den durchsichtigen Deckel wieder auf die 96-Well-Platte (Abbildung 2B).
  13. Lesen Sie die 96-Well-Platte auf einem Spektralphotometer bei 660 nm ab, nachdem Sie die kolorimetrische Reaktion 5 Minuten lang haben entwickeln lassen.
    HINWEIS: Die Absorptionswerte mit einem UV/sichtbaren Spektralphotometer werden bei Raumtemperatur gemessen. Der 660-nm-Protein-Assay basiert auf der Bindung eines proprietären Farbstoff-Metall-Komplexes an das Protein unter sauren Bedingungen, der eine Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs bewirkt, das bei 660 nm gemessen wird.
  14. Verwenden Sie die Absorptionswerte der bekannten Standards, um die Standardkurve mit Hilfe einer Grafiksoftware (Abbildung 2C-E) zu erstellen, die weiter zur Berechnung der Proteinkonzentrationen für alle Proben angewendet wird.

4. Proteinverdauung

VORSICHT. Stellen Sie sicher, dass bei der Arbeit mit den gefährlichen Chemikalien, die im folgenden Protokoll verwendet werden, die richtigen Sicherheitsprotokolle befolgt werden. Das Laborpersonal trug eine persönliche Schutzausrüstung (PSA) und führte diese Schritte in einem chemischen Abzug aus. Lesen Sie alle Sicherheitsdatenblätter, bevor Sie mit diesen Chemikalien arbeiten.

  1. Beschriften Sie einen neuen Satz 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Proben-IDs auf dem Deckel und an der Seite der Röhrchen mit permanenter Tinte. Fügen Sie alle anderen relevanten Informationen hinzu.
    1. Basierend auf der Standardkurvengleichung, den Absorptionswerten der Probe und dem Verdünnungsfaktor berechnen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe in Mikrogramm pro Mikroliter (μg/μL). Verwenden Sie diesen Wert, um das erforderliche Volumen des Probenlysats mit 100 μg Protein zu berechnen (Abbildung 2C-E). Dieses berechnete Volumen des Probenlysats wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  2. Das Endvolumen mit dem Lysepuffer auf 100 μl auffüllen; Dies ist das Ausgangsvolumen, das für das Aufschlussprotokoll benötigt wird.
    HINWEIS: Das endgültige Volumen der Proteinprobe plus Lysepuffer sollte 100 μl betragen.
  3. Laut zuvor veröffentlichter Literatur sollten Sie 1,5 μl des Plasmas für die Verdauung verwenden, was ungefähr 100 μg Protein entspricht.
  4. Geben Sie 50 μl Reduktionslösung (10 mM Dithiothreitol) in jedes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, schließen Sie die Deckel und wirbeln Sie 3 s lang kurz ein. Geben Sie dann 50 μl Alkylierungslösung (30 mM Iodacetamid) zu jeder Probe, schließen Sie die Spitzen und wirbeln Sie sie 3 s lang ein.
  5. Inkubieren Sie die Proben bei 95 °C mit einem Wärmeblock für 11 Minuten, um die Proteinprobe zu reduzieren bzw. zu alkylatieren. Dadurch werden alle Disulfidbrücken gespalten und mit einer Acetamidgruppe verschlossen, wodurch ihre Neubildung verhindert wird, wodurch das Protein in einen vollständig entfalteten Zustand denaturiert und die Freilegung der Peptidverdauungsstellen maximiert wird.
  6. Nehmen Sie nach der Inkubation Proben aus dem Heizblock und lassen Sie sie auf RT abkühlen.
  7. Während Sie darauf warten, dass die Proben abgekühlt sind, rekonstituieren Sie den lyophilisierten Trypsin/Lys-C-Protease-Mix (Verhältnis 1:1, je 50 μg) mit einer Enzymrekonstitutionslösung, indem Sie 515 μl der Flüssigkeit in 1 Durchstechflasche des festen Reagenzes geben, d. h. jeweils 0,1 μg/μl. Vermeiden Sie den direkten Hautkontakt mit der Proteaselösung und alle Schritte danach, da Trypsin ein starkes Reizmittel und Allergen sein kann.
  8. Sobald die Proben auf RT abgekühlt sind, geben Sie 50 μl rekonstituierten Trypsin/Lys-C-Protease-Mix (je 2,5 μg) in die reduzierte und alkylierte Proteinprobenlösung und wirbeln Sie sie kurz ein.
  9. Inkubieren Sie auf einem Thermomixer bei 37 °C und stellen Sie ihn 3 Stunden lang auf 1000 U/min ein, um die Proteinprobe zu verdauen.
    HINWEIS: Die Lys-C-Protease ist im Lieferumfang enthalten, um die Spaltung von Stellen zu unterstützen, die aufgrund von Faltung oder Aminosäuresequenz (z. B. Lys-Pro-Bindungen) resistent gegen die Verdauung durch Trypsin sind. Dies reduziert nicht nur jedes Protein in zahlreiche erkennbare Peptide von relativ geringer Größe und Gesamtladung, sondern ist auch hochgradig reproduzierbar, wenn die gleichen Verdauungsbedingungen genau befolgt werden. Die Inkubationszeit von 3 h während des Aufschlusses ist die minimale Zeit, die wir empfehlen, um die vollständige Spaltung aller Proteine zu gewährleisten.
  10. Nach der 3-stündigen Inkubation mit einer Pinzette aus dem Thermomixer nehmen, um Verbrennungen an den Fingern zu vermeiden.
  11. 50 μl Aufschlussstopplösung (6 % Trifluoressigsäure oder Ameisensäure in Wasser) in die Probe geben und kurz vortexen.
    HINWEIS: Dies hemmt die Reaktion, da die beiden Proteasen bei einem neutralen pH-Wert von 7-8 maximale Aktivitäten aufweisen.
  12. Lagern Sie die Proben in einem -80 °C-Gefrierschrank, da dies auch die verbleibende Proteaseaktivität stoppt. Dies ist ein sicherer Haltepunkt.

5. Peptidreinigung, Trocknung und Resuspension

HINWEIS: Dieses Verfahren dient hauptsächlich dazu, die Aufschlussreagenzien zu entfernen, insbesondere nichtflüchtige Salze, die das LC/MS-MS-Instrument leicht beschädigen können, sowie die Isolierung und Konzentration der produzierten Peptide zu unterstützen. Die Peptidreinigung wird mit Hilfe von Entsalzungs-Spin-Säulen durchgeführt, die mit einem Größenausschlussharz (Gelfiltration) vorgepackt sind, das die Peptide zunächst auffängt und dann das Durchspülen von Salzen ermöglicht. Vollständiger Transfer der Kit-Reagenzien in die Spin-Säulen in einem chemischen Abzug, da sie giftige organische Lösungsmittel enthalten.

VORSICHT. Stellen Sie sicher, dass bei der Arbeit mit den gefährlichen Chemikalien im folgenden Protokoll die ordnungsgemäßen Sicherheitsverfahren eingehalten werden, einschließlich des Tragens von PSA und der Vorschriften zur Eindämmung gefährlicher Abfälle. Führen Sie diese Schritte in einem chemischen Abzug durch und lesen Sie alle Sicherheitsdatenblätter, bevor Sie mit diesen Chemikalien arbeiten.

  1. Nehmen Sie die Proben aus dem -80 °C-Gefrierschrank und lassen Sie die Proben zum RT kommen.
  2. Entfernen Sie die weiße Kappe am unteren Rand der Peptid-Aufreinigungssäule, lösen Sie die grüne obere Kappe und legen Sie sie in ein 2-ml-Sammelröhrchen.
  3. Legen Sie diese in die Zentrifuge, schließen Sie den Deckel, drücken Sie auf Start und zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 3000 g , um die gesamte Konditionierungsflüssigkeit vor dem Versand zu entfernen.
  4. Entsorgen Sie den Durchfluss in einem Sonderabfallbehälter und setzen Sie die Peptidreinigungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein.
  5. Beschriften Sie die grünen Deckel der Peptidaufreinigungssäule mit den Proben-IDs mit einem permeant Ink Markierungsstift.
  6. Übertragen Sie das Proteinverdaupräparat, das ein Volumen von etwa 300 μl hat, vorsichtig in die trockene Peptidreinigungssäule, indem Sie eine 200-μl-Pipette verwenden (z. B. 150 μl zweimal).
    1. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen an der Oberseite des Harzes der Spin-Säule zu sehen sind. Wenn Blasen beobachtet werden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie vorsichtig auf die Säule klopfen oder eine saubere 10-μl-Pipettenspitze verwenden, um die Blase(n) zu dispergieren.
      HINWEIS: Eingeschlossene Luftblasen können den reibungslosen Übergang der Probe in das Harz behindern und sich somit negativ auf die Effizienz der Peptidreinigung und -ausbeute auswirken.
  7. Diese in die Zentrifuge geben, den Deckel schließen, Start drücken und bei 1.500 g 2 min zentrifugieren.
  8. Entsorgen Sie den Durchfluss in einem Sonderabfallbehälter und setzen Sie die Peptidreinigungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein.
  9. Geben Sie 300 μl der Waschlösung A (Wasser, 0,1 % Trifluoressigsäure / TFA) auf das Säulenharz, erneut mit einer 200-μl-Pipette.
    1. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen an der Oberseite des Harzes der Spin-Säule zu sehen sind. Wenn Blasen beobachtet werden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie vorsichtig auf die Säule klopfen, oder verwenden Sie eine saubere 10-μl-Pipettenspitze, um die Blase(n) zu dispergieren.
  10. Diese in die Zentrifuge geben, den Deckel schließen, Start drücken und bei 1.500 g 2 min zentrifugieren.
  11. Entsorgen Sie den Durchfluss in einem Sonderabfallbehälter und setzen Sie die Peptidreinigungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein.
  12. Geben Sie 300 μl Waschlösung B (5 % Methanol, 0,1 % TFA) auf das Säulenharz, erneut mit einer 200 μl Pipette.
    1. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen an der Oberseite des Harzes der Spin-Säule zu sehen sind. Wenn Blasen beobachtet werden, entfernen Sie die Blasen durch leichtes Klopfen auf die Säule oder verwenden Sie eine saubere 10-μl-Pipettenspitze, um die Blase(n) zu dispergieren.
  13. Diese in die Zentrifuge geben, den Deckel schließen, Start drücken und bei 1.500 g 2 min zentrifugieren.
  14. Entsorgen Sie den Durchfluss in einem Sonderabfallbehälter und setzen Sie die Peptidreinigungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen ein.
  15. Wiederholen Sie die Schritte 5.12-5.14 noch einmal, so dass die Säule zweimal mit Waschlösung B gewaschen wird.
  16. Übertragen Sie die Peptidaufreinigungssäule in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    1. Stellen Sie sicher, dass es sich bei den 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die in diesem Schritt verwendet werden, um die im Kit bereitgestellten Sammelröhrchen mit geringer Proteinbindung handelt.
    2. Um die verfügbare Menge an Sammelröhrchen mit geringer Proteinbindung zu sparen, verwenden Sie für die vorherigen Waschschritte Standard-Laborröhrchen.
  17. Geben Sie 300 μl Elutionslösung (50 % Acetonitril, 0,1 % TFA) auf das Säulenharz, wieder mit einer 200 μl Pipette.
    1. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen an der Oberseite des Harzes der Spin-Säule zu sehen sind. Wenn Blasen beobachtet werden, entfernen Sie die Blasen, indem Sie vorsichtig auf die Säule klopfen, oder verwenden Sie eine saubere 10-μl-Pipettenspitze, um die Blase(n) zu dispergieren.
  18. Legen Sie diese in die Zentrifuge, schließen Sie den Deckel, drücken Sie Start und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 1.500 g , um die saubere Peptidprobe in dem neuen 2-ml-Sammelröhrchen mit geringer Proteinbindung zu sammeln.
    1. Falls gewünscht, 125 μl (etwa die Hälfte) der eluierten sauberen Peptidlösung mit einer 200-μl-Pipette in ein 1-ml-Glasfläschchen überführen und bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses Aliquot kann später für zusätzliche Analysen verwendet werden, wie z. B. die Tandem-Mass-Tag-Markierung (TMT) der Peptide, wie sie von einem kommerziell erhältlichen Kit durchgeführt wird, um eine genauere Quantifizierung über Proben hinweg zu ermöglichen, insbesondere bei unabhängig hergestellten Sets.
  19. Lagern Sie die verbleibende Probe, ca. 175 μl, bei -30 °C in den 2-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung, bis sie mit der Trocknung und Rekonstitution fortfahren können. Dies ist ein sicherer Haltepunkt.
  20. Um die Probe zu trocknen, tauen Sie die Peptidprobe von -30 °C auf RT auf. Wenn Sie direkt nach der Peptidreinigung mit dem Trocknen und Rekonstituieren fortfahren, ignorieren Sie diesen Schritt.
  21. Öffnen Sie die 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in einen Vakuumzentrifugenkonzentrator.
    1. Stellen Sie sicher, dass der Vakuumzentrifugenkonzentrator ausbalanciert ist, wenn eine ungerade Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet wird.
    2. Schließen Sie den Deckel des Vakuumzentrifugenkonzentrators und drücken Sie Start.
    3. Lassen Sie die Proben 3 Stunden lang ohne Erwärmung auf dem Vakuumzentrifugenkonzentrator laufen.
    4. Überprüfen Sie die Röhrchen regelmäßig, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit im Inneren verbleibt, da dies die Bindung der Peptide an die Trennsäule des LC/MS-MS-Instruments beeinträchtigen kann.
    5. Wenn immer noch Flüssigkeit beobachtet wird, drehen Sie die Proben für weitere Zeit weiter.
    6. Prüfen Sie zwischen 30 min und 1 h, ob sich Flüssigkeit im Röhrchen befindet.
      HINWEIS: Die Peptide sind während dieses Prozesses sehr stabil, da sie unter Vakuumbedingungen stehen, und werden nicht durch eine kurze Trockenperiode oder mäßige Wärme beeinträchtigt, die allein durch den Betrieb des Vakuumzentrifugenkonzentrators erzeugt wird.
  22. Nach dem Trocknen wird die Probe sofort in 50 μl 0,1 % Ameisensäure in MS-fähigem Wasser resuspendiert (z. B. 5 μl 100 % Ameisensäure in 5 ml Wasser).
    1. Geben Sie 50 μl 0,1 % Ameisensäure mit einer 200-μl-Pipette auf den Boden des 2-ml-Röhrchens mit geringer Proteinbindung, das die getrocknete Peptidprobe enthält.
  23. Schließen Sie die Kappen und wirbeln Sie sie 15 s lang.
  24. Übertragen Sie die rekonstituierten Proben mit einer 200-μl-Pipette in die entsprechenden 1-ml-Glasfläschchen.
  25. Lagern Sie die Glasfläschchen mit den rekonstituierten Proben bei -30 °C und analysieren Sie sie so bald wie möglich mit einem LC-MS/MS-basierten Ansatz.
    HINWEIS: Die gefrorenen Peptidproben sind bei -30 °C für die kurzfristige Lagerung und -80 °C für eine längere Lagerung stabil.

6. Datenerfassung von Peptidproben auf einem UHPLC/MS-MS-Gerät

VORSICHT. Stellen Sie sicher, dass bei der Arbeit mit einem Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-/Orbitrap-Tribrid-Tandem-Massenspektrometersystem die richtigen Sicherheitsprotokolle befolgt werden. Das Laborpersonal trug PSA und absolvierte eine formelle, praktische Geräteschulung, die vom UHPLC/MS-MS-Hersteller angeboten wurde. Die wichtigsten Vorsichtsmaßnahmen betreffen den ordnungsgemäßen Umgang mit den sauren und organischen Lösungsmittel-Mobilphasen für die UHPLC und die Hochspannungs-Ionisationsquelle für die MS.

  1. Führen Sie Peptidtrennungen mit einem Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System (UHPLC) durch. Bei der LC-Säule handelt es sich um eine Elektrospray-fähige C18-Umkehrphasen-Schnelltrennung (RSLC) mit den Abmessungen 2 μm, 100 Å, 50 μm x 15 cm, die in Reihe nach einer Vorsäule aus demselben Material platziert wird.
  2. Verwenden Sie die folgenden mobilen UHPLC-Phasen: 0,1 % Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A), 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (Lösungsmittel B) und 0,1 % Ameisensäure in 90 % Wasser und 10 % Methanol (Lösungsmittel C).
    HINWEIS: Alle Lösungsmittel sowie Ameisensäure, die zur Vorbereitung der mobilen Phasen verwendet werden, sind LC/MS-zertifiziert und werden nur bei Bedarf hergestellt. Die UHPLC verfügt über eine Filtrations- und Entgasungseinheit vor den Pumpen, so dass die mobilen Phasen nicht manuell gefiltert und von Luft gespült werden.
  3. Legen Sie programmierte Injektionen der Gesamtpeptide, die für die Plasma- und Gewebeproben vorbereitet wurden, zunächst auf 3 μl fest, was ~3 μg Peptidmaterial entspricht, bestimmt durch die Ausgangsmenge des verwendeten Proteins.
    HINWEIS: Dies sollte eine ideale MS-Signalintensität für eine maximale Proteinidentifikation erzeugen. Das Injektionsvolumen kann auf bis zu 15 μl erhöht werden, um die Signalausgabe weiter zu verstärken, oder auf bis zu 1 μl verringert werden, wenn eine Überlastung offensichtlich ist.
  4. Halten Sie die Säule und den Autosampler bei 40 °C bzw. 10 °C.
  5. Stellen Sie die Lösungsmittelflussrate für die Proteomik-Erfassung mit den UHPLC-Nanopumpen auf eine konstante Konstante von 0,3 μl/min ein, mit einem linearen Trenngradienten der mobilen Phasen Wasser (A) zu Acetonitril (B).
  6. Die Injektionsspritze und der Probenkreislauf (20 μl Kapazität) sind mit der mobilen Phase (C) aus Wasser und Methanol zu waschen, wobei die UHPLC-Ladepumpe zunächst auf 5 μl/min eingestellt ist.
  7. Während der Probentrennung über insgesamt 80 Minuten ist der LC-Gradient (lineare Kurven) wie folgt einzustellen: Anfangs - 5 % B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 min - 95% B; 65-66 min - 2% B; und 66-80 min - 2% B. Lassen Sie die Ladepumpe ebenfalls mit einer konstanten A-Konstante von 100% laufen, aber stellen Sie die Durchflussmenge linear wie folgt ein: Anfangs - 5 μL/min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; und 61-80 min - 5 μL/min (Abbildung 3A).
  8. Injizieren Sie unbekannte Peptidproben als sequenzielle Duplikatläufe.
  9. Um eine Verschleppung zu vermeiden, führen Sie mindestens zwei aufeinanderfolgende Blindinjektionen von 0,1 % Ameisensäure in Wasser zwischen den Proben unter Verwendung eines verkürzten LC-Gradienten (lineare Kurven) über insgesamt 35 Minuten wie folgt durch: Initial - 5 % B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; und 31-35 min - 2% B (Abbildung 3B).
    1. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für die Steigung der Ladepumpe LC unverändert bleiben.
    2. Bei Peptidproben mit einem hohen Gehalt an endogenen Verunreinigungen, wie z. B. Leber (z. B. Gallensäuren), fügen Sie alle 3 bis 5 Proben und am Ende des Laufs eine dritte Leerprobe hinzu, um die Reinigung der LC-Säule zu unterstützen. Dies besteht aus der Injektion von 1 bis 2 μl Lösung, die jeweils 25 % Acetonitril, Isopropanol, Methanol und Wasser enthält.
    3. Alternativ oder in Kombination mit dem obigen Schritt können Sie einen prozentualen Änderungs-verstärkten LC-Gradienten (d. h. Wippen) über insgesamt 35 Minuten als Systemauswaschung wie folgt durchführen: Anfänglich - 2 % B; 0-3 min - 2% B; 3-4 min - 95% B; 4-10 min - 95% B; 10-11 min - 2% B; und 11-15 min - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 min - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; und 31-35 min - 2% B (Abbildung 3C).
  10. Führen Sie die Detektion der Peptide, d.h. der entsprechenden Molekülmassen, wie sie durch die LC-Säule getrennt und von ihr eluiert werden, mit einem Orbitrap- und einem Ionenfallen-Kombinations-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer-System (MS-MS) durch.
    1. Bevor Sie die Probeläufe durchführen, stecken Sie die LC-Säule direkt in die Vorderseite der austauschbaren Nano-Spray-Ionisationsquelle (NSI) des MS-Instruments, die sich in der oberen linken vorderen Ecke des Geräts befindet.
      HINWEIS: Dadurch wird die eingebaute Elektrospray-Nadel der LC-Säule freigelegt, die die Peptide, die in geladenen Mikrotröpfchen des LC-Lösungsmittels für die mobile Phase suspendiert sind, in den Einlass des Ionentransferrohrs des Detektors abgibt.
    2. Um die Effizienz der Elektrospray-Verflüchtigung zu verbessern, schalten Sie außerdem die eingebaute Heizeinheit der NSI-Quelle ein und stellen Sie sie auf 40 °C ein.
  11. Überprüfen Sie vor dem Probenlauf auch, ob ein zufriedenstellender externer Eintrag von komprimiertem Stickstoff und Heliumgas in das MS-Gerät erfolgt. Erreichen Sie dies mit ultrahochreinen Stahlflaschentanks der Größe 300 für jedes Gas, bei denen die Reglermanometer auf einen statischen Durchflussdruck von 60 bzw. 40 psi eingestellt sind.
  12. Wenn das MS-Gerät Warnungen über eine Instabilität des Stickstoffgaseintrags ausgibt, erhöhen Sie den Druck auf maximal 100 psi. Stellen Sie sicher, dass die Tanks mindestens 10-20% gefüllt sind, was einem oberen Ventilmanometerwert von ~250-500 psi entspricht; Und wenn nicht, tauschen Sie sie gegen frische aus. Bei einem Absinken unter 10 % der vollen Kapazität besteht die Gefahr, dass Verunreinigungen in das MS-Gerät gezogen werden, die sich am Boden der Gastanks absetzen können.
  13. Führen Sie die Massenspektrometer-Methode im Voraus unter Verwendung einer von der Steuerungssoftware bereitgestellten Vorlage durch, die für den optimalen Nachweis von Peptiden und deren posttranslationalen Modifikationen ausgelegt ist (Abbildung 3D-H), und geben Sie die folgenden Standardbedingungen ein:
    1. Stellen Sie den Gesamterkennungszeitraum auf 80 Minuten ein.
    2. Legen Sie den allgemeinen Nachweismodus auf Peptide fest.
    3. Stellen Sie die NSI-Quelle auf den positiven Modus (d. h. die Ladung der Peptidionen).
    4. Stellen Sie die Spannung der Nano-Spray-Nadel auf 2000 V ein und halten Sie sie als statisch.
    5. Stellen Sie den Stickstoffgaseingang auf den NSI und die Detektoren auf statisch ein.
    6. Stellen Sie die Temperatur des Ionentransferrohrs auf 275 °C ein.
    7. Erkennen Sie die Massen der gesamten Peptide (d. h. Mutterionen; MS1), indem Sie den Scanbereich auf 350-2000 m/z, das HF-Objektiv auf 30 %, die maximale Injektionszeit auf Auto und den Orbitrap-Massenanalysator auf eine Auflösung von 120.000 einstellen.
      HINWEIS: Die alternative Ionenfallenfunktion des Instruments wird hier nicht zum Screening nach Peptidmassen verwendet, da sie für die Überwachung dieser Art von Molekülen im Vergleich zum Orbitrap weniger empfindlich ist.
    8. Stellen Sie die Ionenfilter so ein, dass zwischen Peptiden mit mehreren Ladungszuständen in einem Bereich von 2 bis 7 unterschieden wird. Auf diese Weise kann das Gerät während der Aufzeichnung der Daten die inhärent detektierten Masse-über-Ladungs-Verhältnisse (m/z) der Moleküle automatisch in ihre exakten Massen umrechnen. Ebenso benötigt ein Peptid mit nur einem einzigen Ladungszustand (m/z = 1) keinen Umrechnungsfaktor, um seine genaue Masse zu erhalten.
    9. Stellen Sie die dynamischen Ausschlussgates für die Ionen auf 1 Durchgang bei einer Dauer von 60 s und einer Massentoleranz von ±10 ppm ein und lassen Sie alle Moleküle mit natürlichen Isotopenatomen (z. B. 14C) aus.
    10. Erkennen Sie die Massen an Identitätsbestätigungsfragmenten, die für die Peptide erzeugt wurden (d. h. Tochterionen; MS2), indem Sie das Gerät auf die datenabhängige Erfassung (DDA-Modus) einstellen.
    11. Erfassen Sie die gesamten Peptide (d. h. Elternionen) durch Quadrupolisolierung, wobei eine Einstellung für das Toleranzfenster für die Massenvariabilität von m/z = 1,6 verwendet wird.
    12. Führen Sie die Fragmentierung der eingefangenen Peptide durch, indem Sie den Elektronenaufprallmodus auf HCD (d. h. Kollisionsdissoziation mit höherer Energie unter Verwendung von Stickstoff und Heliumgas als Elektronentransfermittel), die Kollisionsenergie auf 30 %, den Scanbereich auf Auto, die maximale Injektionszeit auf Auto und den Orbitrap-Massenanalysator auf eine Auflösung von 30.000 einstellen.
    13. Erfassen Sie die endgültigen Daten (MS1- und MS2-Ionen), indem Sie die Form des Signalpeaks auf ein Schwerpunktformat einstellen.
  14. Gewährleisten Sie genaue Massenbestimmungen für detektierte Peptide, indem Sie das Gerät routinemäßig kalibrieren, in der Regel vor jedem Probenchargenlauf, wie unten beschrieben.
    1. Versetzen Sie das MS-Gerät mithilfe der Steuerungssoftware in den ausgeschalteten Zustand einer Ionenquelle und schalten Sie die NSI-Quelle gegen die alternative intern beheizte Elektrospray-Ionisationsquelle (HESI) des Geräts aus. Dies ist die Quelle für Anwendungen, die sehr große Probeninjektionsvolumina und eine entsprechend hohe Durchflussrate (1-2500 μl/min) für die LC-Pumpe erfordern können, z. B. Metabolomics- und Pharmakokinetik-Experimente.
    2. Wählen Sie die Option für die vollständige Kalibrierungsprüfung in der Steuerungssoftware.
    3. Füllen Sie eine 500-μl-Glasspritze mit einem teflonbeschichteten Kolben und einer stumpfen Nadel aus Edelstahl mit einer handelsüblichen MS-Standardlösung und verbinden Sie dann die PTFE-Kapillarschlauchleitung mit der HSEI-Quelle (bei ausgeschaltetem Zustand).
      HINWEIS: Der hier verwendete Standard enthält eine Mischung aus natürlichen und synthetischen Molekülen (insgesamt 16, z. B. Koffein), die einen Massenbereich von m/z = 50-2800 abdecken und ein breites Spektrum möglicher chemischer Bindungstypen abdecken, insbesondere solche, die mit Peptiden assoziiert sind (z. B. Amidgruppen).
    4. Initiieren Sie eine konstante Infusion des MS-Standards in die HSEI-Quelle (im eingeschalteten Zustand) mit einer Rate von 3-5 μl/min, wie dies mit einer Spritzenpumpe geschieht. Sobald ein stabiles Muster von Standard-Peaks im Live-View-Fenster der Steuerungssoftware festgestellt wird, aktivieren Sie die automatische Kalibrierungsprüfung.
      HINWEIS: Wenn keine Probleme mit der Empfindlichkeit und Genauigkeit der Massenbestimmungen für das Normal festgestellt werden, dauert eine erfolgreiche vollständige Kalibrierung in der Regel < 40 Minuten. Ebenso gilt das Gerät nur dann als zuverlässig für die Durchführung von Proben, wenn es alle überprüften MS-Hardwareparameter erfüllt.
    5. Bestätigen Sie den Erfolg der Kalibrierung, indem Sie die NSI-Quelle und die LC-Säule neu einrichten und dann eine Standardlösung aus humanem [Glu 1]-Fibrinopeptid B (Glu-Fib) in injizierten Gesamtmengen von 1-10 ng (z. B. 1, 2, 6 und 10 ng) ausführen. Es sind die gleichen LC-Trennungs- und MS-Nachweismethoden zu verwenden, die oben für die unbekannten Proben beschrieben wurden.
    6. Überprüfen Sie den Glu-Fib-Standard auf eine angemessene LC-Retentionszeit (~20 min), das Vorhandensein von MS1- und MS2-Ionen (m/z = 1285,54, 813,39, 785,84, 445,12, 333,19 und 175,12) und die Linearität der zunehmenden Peakbereiche mit der injizierten Menge.
    7. Generieren Sie dann mit der Steuerungs- und Datenerfassungssoftware Sequenztabellen zum Ausführen der unbekannten Peptid- und Leerproben, die Spalten zur Eingabe des Probentyps, des Dateinamens, der Proben-ID, des Datenpfads, der LC/MS-Instrumentenmethode, der Fläschchenposition und des Injektionsvolumens enthalten (Abbildung 3D-E).
    8. Speichern Sie die resultierenden MS-Datendateien (Erweiterung: RAW; je 500 - 800 GB) im dafür vorgesehenen Pfadordner auf der Festplatte des Instrumentencomputers. Übertragen Sie diese Dateien dann auf einen Workstation-Computer, der leistungsfähig genug ist, um die Bioinformatik-Software zu steuern, wie später beschrieben, die die extrem umfangreichen und komplexen Peptid-Massenspektraldaten (d. h. MS1- und MS2-Signale) in entsprechende Gesamtproteinzusammensetzungsprofile umwandelt.

7. Umwandlung von MS-Rohdaten in repräsentative Gesamtproteomergebnisse

HINWEIS: Die für Peptidproben erfassten MS-Rohdaten werden mit Hilfe von Bioinformatik-Software zu Gesamtproteinzusammensetzungsprofilen (Proteom) verarbeitet. Kurz gesagt, die bioinformatische Software rekonstruiert die ursprünglichen Proteine in der Probe, indem sie die MS-Rohdaten mit ihren bekannten Peptid-MS1- und MS2-Spektren abgleicht, die in einer webbasierten speziesspezifischen Proteom-Referenzbibliothek zu finden sind, und zwar durch eine umfangreiche und einzigartige Abdeckung der Aminosäuresequenz des Proteins. Die relativen Häufigkeiten jedes identifizierten Proteins werden vom Programm unter Verwendung der MS1-Signalintensitäten seiner übereinstimmenden einzigartigen Peptide bestimmt. Die ermittelten Häufigkeiten können zuverlässig über Proben hinweg verglichen werden, jedoch nur, wenn sie innerhalb derselben Vorbereitungscharge und mit identischen LC- und MS-Einstellungen durchgeführt werden. Andernfalls müssen die zuvor erwähnten absoluten quantitativen Techniken, die auf internen Standard-/Reporter-Ionen-Rückgewinnungen basieren, wie z. B. die selektive TMT-Markierung der Peptide in jeder Probe, eingesetzt werden.

  1. Laden Sie die Proteom-Referenzdatei aus der webbasierten Bibliothek auf die Festplatte des Workstation-Computers herunter.
    1. Diese finden Sie in der Datenbank auf der Uniprot-Website für die interessierenden Beispielarten (z. B. Frettchen / Mustela furo). Dies wird als FASTA-Datei bezeichnet. Verwenden Sie das Proteome-Suchwerkzeug und die Tabellenansicht , um die Proteom-Referenzdatei zu suchen und dann herunterzuladen.
    2. Um die mögliche Anzahl der generierten Proteinidentifikationen zu maximieren, wählen Sie bei der Erstellung der FASTA-Datei sowohl die vom Komitee begutachteten (Swiss-Prot) als auch die ungeprüften (TrEMBL) Einträge in der Uniprot-Datenbank aus. Wählen Sie ebenfalls die Option, alle überprüften Isoformen für die Proteine einzubeziehen.
  2. Öffnen Sie die Bioinformatik-Software, d. h. Proteome Discoverer, auf der Registerkarte Startseite und wählen Sie dann die Registerkarte Administration .
  3. Gehen Sie zur Unterregisterkarte FASTA-Dateien pflegen und laden Sie dann die oben genannte speziesspezifische FASTA-Datei, die für Ihre Experimente generiert wurde, in das Programm herunter.
  4. Gehen Sie zurück zur Registerkarte Startseite , klicken Sie auf Neue Studie/Analyse, geben Sie im Dialogfeld einen Studiennamen in das Feld Studienname ein und wählen Sie im Feld Studienstammverzeichnis einen Dateiordner zum Speichern der Studie aus.
  5. Lassen Sie die Felder "Verarbeitungs-Workflow " und "Konsens-Workflow " vorerst leer, da sie für später ausgewählt werden.
  6. Klicken Sie auf OK , um das Dialogfeld zu speichern und zu verlassen, woraufhin die Seite Studiendefinition angezeigt wird.
  7. Gehen Sie zur Registerkarte Studiendefinition und geben Sie die Details des Projekts in das Feld Studienbeschreibung ein, das sich in der Mitte links befindet.
  8. Gehen Sie zur Registerkarte Eingabedateien und klicken Sie auf Dateien hinzufügen.
    1. Daraufhin wird ein Dialogfeld geöffnet, in dem die erforderlichen Rohdatendateien, die zu den Ergebnissen des Gesamtproteinzusammensetzungsprofils (Proteom) verarbeitet werden sollen, ausgewählt und von der Festplatte des Computers heruntergeladen werden können.
  9. Klicken Sie auf die MS-Rohdatendateien, die nun unter dem Reiter Eingabedateien aufgelistet sind, die einzeln oder alle auf einmal ausgewählt und hervorgehoben werden können.
  11. Gehen Sie zur Registerkarte Workflows und klicken Sie auf Bearbeiten, die sich neben der Überschrift Verarbeitungsschritt des Analysefelds in der Mitte rechts befindet.
  12. Klicken Sie auf Open Common und wählen Sie aus dem Ordner ProcessingWF_Tribrid die Verarbeitungs-Workflow-Datei aus, die speziell für Phosphoprotein-Subidentifikationen vorgesehen ist, wie sie unter HCD-fragmentierungsbasierter MS-Nachweis erhalten wurde (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Ein Verarbeitungsschrittdiagramm mit bearbeitbaren Knoten wird dann im Feld Workflow-Baum angezeigt. Es gibt zwei Knoten, wie unten beschrieben, die mit Ausrufezeichen gekennzeichnet sind, die darauf hinweisen, dass eine erforderliche Eingabe von experimentspezifischen Informationen durch den Benutzer erforderlich ist.
  13. Klicken Sie im Baumdiagramm des Verarbeitungsworkflows auf den Knoten Spectrum Files RC und öffnen Sie ihn.
    1. In der Kategorie Parameter der Spektrumdateien RC suchen und wählen Sie unter dem Parameter Proteindatenbank die FASTA-Datei aus, die zuvor über die Uniprot-Website erstellt wurde, für die speziesspezifische Referenzbibliothek der Peptid-MS-Spektren, die durchsucht werden, um die Proteine von experimentellem Interesse zu identifizieren.
  14. Klicken Sie auf und öffnen Sie den Sequest HT-Knoten und nehmen Sie die folgenden drei Änderungen vor:
    1. Wählen Sie unter dem Parameter Proteindatenbank die gleiche FASTA-Datei aus, wie oben beschrieben.
    2. Wählen Sie unter dem Parameter Enzymname die Option Trypsin (voll) oder alternativ Lys-C aus, die Haupt- und Backup-Proteasen, die zur Vorbereitung des ursprünglichen Peptidverdaus verwendet werden.
    3. Stellen Sie sicher, dass unter dem Parameter Dynamische Modifikationen mindestens Phospho / +79,966 Da (S, T, Y) ausgewählt wurde.
      1. Verwenden Sie die letztere Einstellung, um Peptide aufzudecken, die mit Proteinen assoziiert sind, die posttranslational durch Phosphorylierung modifiziert sind, indem Sie nach entsprechenden MS-Spektrenverlusten einer oder mehrerer Phosphatgruppen suchen (m/z = 79,97).
      2. Finden Sie die phosphatbesetzten Aminosäurestellen (d. h. Serin, Threonin oder Tyrosin) anhand der erwarteten Veränderungen in ihren MS2-Fragmentierungsmustern.
      3. Fügen Sie an dieser Stelle andere posttranslationale Proteinmodifikationen von routinemäßigem Interesse auf die gleiche Weise zum Sequest-HT-Knoten hinzu, z. B. Methylierung, Acetylierung, Myristylierung, wenn der genaue Massenverlust der verwandten Gruppen bekannt ist. Ebenso sollte die Suche nach den Phosphorylierungsstellen auf andere, weniger häufig berichtete Aminosäuren, z. B. Histidin, ausgeweitet werden.
        HINWEIS: Die Knoten Spectrum Files RC und Sequest HT des Workflow-Baums für den Verarbeitungsschritt sind die einzigen beiden, bei denen Parameter angepasst werden müssen.
    4. Belassen Sie den Rest als Standardeinstellungen, da diese bereits vom Hersteller optimiert wurden, um die höchste Anzahl von ausgewiesenen Proteinidentifikationen von Interesse zu erzeugen. Dies gilt auch für alle anderen Knoten im Workflow-Baum.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Knoten Percolator und IMP-ptmRS am Ende der Workflow-Struktur enthalten sind.
      HINWEIS: Der Perkolator verwendet eine wiederholte Anpassung, um das Endergebnis stark zu verfeinern. IMP-ptmRS ist essentiell für die Berichterstattung über die angemessene Identifizierung und Lokalisierung aller posttranslationalen Proteinmodifikationen, einschließlich der Phosphorylierung.
  15. Gehen Sie zurück zur Registerkarte Workflows und klicken Sie auf Bearbeiten, die sich neben der Überschrift Konsensschritt des Analysefelds oben rechts befindet. Dadurch wird das Workflow-Baumdiagramm für den Konsensschritt angezeigt.
  16. Klicken Sie auf Open Common und wählen Sie aus dem Ordner ConsensusWF die Konsensus-Workflow-Datei aus, die das gewünschte Ausgabeformat für die Ergebnisse des Proteinzusammensetzungsprofils (Proteom) erzeugt (Abbildung 4B).
    HINWEIS: Ein Konsensschrittdiagramm mit bearbeitbaren Knoten wird im Feld Workflow-Baum geöffnet. Das Diagramm, das für die Verarbeitung der Daten verwendet wird, wird durch Modifikation des grundlegenden Konsensus-Workflows generiert, bei dem Inline-Feature-Mapper- und Precursor-Ionen-Quantifizierer-Knoten als Zweig vom ursprünglichen MSF-Dateien-Knoten hinzugefügt wurden, um die Quantifizierung der relativen Proteinhäufigkeiten zu erleichtern. Während alle Knoten im Workflow bereits optimierte Parameter enthalten, die vom Hersteller festgelegt wurden, gibt es einige mit sehr wichtigen Einträgen, die auf die richtige Auswahl überprüft werden müssen, wie unten beschrieben.
  17. Klicken Sie im Workflow-Baumdiagramm auf den Knoten Präcursor-Ionen-Quantifizierer und öffnen Sie ihn. Dies ist der Knoten, der für die Quantifizierung der relativen Häufigkeiten jedes identifizierten Proteins unerlässlich ist.
    1. Suchen Sie in der Kategorie Allgemeine Quantifizierungseinstellungen die Option Unique + Razor, und wählen Sie unter dem Parameter Zu verwendende Peptide die Option Unique + Razor aus.
      HINWEIS: Einzigartige Peptide sind solche, die Aminosäuresequenzen enthalten, die exklusiv für ein einzelnes Protein sind; und werden daher verwendet, um seine Menge auf der Grundlage der MS-Signalintensitäten spezifisch zu bestimmen. Rasierklingenpeptide sind solche, die von Gruppen von Proteinen gemeinsam genutzt werden. und werden daher verwendet, um die berechneten relativen Häufigkeiten in Übereinstimmung zu bringen.
    2. Ändern Sie in der Kategorie Normalisierung und Skalierung sowohl die Parameter Normalisierungsmodus als auch Skalierungsmodus in die Option Keine , da diese Art der Anpassung für eine zuverlässige Anwendung auf das gesamte Proteom zu eingeschränkt ist.
      HINWEIS: Diese Einstellungen sind nur aktiviert, wenn es gewünscht ist, die berechneten relativen Häufigkeiten ausgewählter Proteine von Interesse gegenüber denjenigen zu normalisieren, die der Zelle stabil intrinsisch sind, z. B. Haushaltsgene, und dann die resultierenden Werte als skaliertes Verhältnis auszudrücken.
    3. Klicken Sie anschließend auf und öffnen Sie den Knoten Peptid- und Proteinfilter und ändern Sie in der Kategorie Peptidfilter die Parameter Peptide Confidence At Least und Keep Lower Confident PSM in die Optionen High bzw. False . Dadurch werden die Peptidübereinstimmungen, die bei der Proteinidentifizierung verwendet werden, auf die größte Passungssignifikanz (d. h. ≥ 95 %) gesetzt.
      HINWEIS: Alternativ kann der erste Parameter auf Medium gesetzt werden, um die Stringenz der Peptid-Matches zu lockern und so die Ausgabe von Proteintreffern stark zu erhöhen; Dies führt aber im Umkehrschluss zu einem sehr hohen Risiko, viele falsche Identifikationen zu erzeugen. Ebenso sollte es nie der Fall sein, dass für beide Parameter ein "Low"-Wert als akzeptable Option verwendet wird.
    4. Dies sind die einzigen Knoten des Konsensschritts, an die die Parameter angepasst werden müssen, der Rest wird in den Standardeinstellungen beibehalten.
      HINWEIS: Insgesamt behandelt der Konsensus-Schritt-Workflow die gesamte Post-hoc-Analyse, d. h. die Bestimmung der relativen Proteinhäufigkeiten, der Identifikationskonfidenzen (d. h. der False Discovery Rates und der spektralen Übereinstimmungswerte der Peptide) und der kartierten Peptidabdeckung. Ergebnisstatistiken und Datenverteilungen werden ebenfalls als Endpunkttabellen zur Verfügung gestellt.
  18. Sobald die oben genannten Arbeitsabläufe für die Verarbeitung und den Konsensschritt eingerichtet sind, speichern Sie die gesamte Studie und klicken Sie dann auf das Symbol Ausführen (Zahnräder) oben im Analysefeld . Wenn mehrere MS-Rohdatendateien gleichzeitig verarbeitet werden, klicken Sie vor dem Start des Verarbeitungslaufs auf das Symbol "Nach Datei" (Quadrat) in der Nähe und aktivieren Sie es.
    HINWEIS: Die Verarbeitung einer MS-Rohdatendatei zu einer Gesamtproteom-Ergebnisdatei dauert in der Regel 20 bis 40 Minuten, kann jedoch eine fortlaufende Liste von vielen Tausenden von Proteinidentifikationen liefern, die von Übereinstimmungen mit niedriger, mittlerer bis hoher Zuverlässigkeit (d. h. mit einer Gewichtung in Richtung hoher Treffer) reichen, zusammen mit den Phosphatmodifikationen, die in jeder Entität vorhanden sind (Abbildung 4C). Die wichtigsten Ausgabeparameter für die identifizierten Proteine sind FDR (Konfidenz), Master (wenn die FASTA-Datei / der Bibliothekseintrag überprüft wurde), Beitritt #, Beschreibung, Abdeckung %, Sequenzabdeckung, Peptid-Spektralübereinstimmungen (z. B. Anzahl einzigartiger Peptide), physikalische Eigenschaften (z. B. MW in kDa), relative Häufigkeiten und Modifikationen (d. h. Phosphorylierungsgruppen).
    1. Ordnen Sie die gesamten Proteomergebnisse in aufsteigender oder absteigender Reihenfolge oder vollständig gefiltert an, indem Sie das Trichtersymbol in der Symbolleiste (Abbildung 4C) verwenden, je nach Forschungsinteresse, z. B. zeigen Sie nur diejenigen mit einer hohen Zuverlässigkeitsidentifikation (Protein-FDR) oder einem hohen Grad an Peptidübereinstimmung (z. B. nach Abdeckungsprozentsatz und/oder Anzahl der gefundenen eindeutigen Ergebnisse).
    2. Wenn posttranslationale Modifikationsinformationen speziell gewünscht werden, filtern Sie identifizierte Proteine mit Phosphorylierung für die weitere Analyse heraus.
    3. Speichern Sie die gefilterten Ergebnisse ohne Änderung des Dateinamens, da sie in der ursprünglichen Ausgabe wiederhergestellt werden können, indem Sie einfach die angewendeten Filter entfernen und das Fenster aktualisieren.

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Ergebnisse

Visualisierung der Gesamtproteomergebnisse durch optionale Verarbeitung in Vulkandiagramme
Die Gesamtproteomergebnisse für jede Probe können leicht durch Beitritt # oder Beschreibung nach spezifischen Proteinen von Forschungsinteresse durchsucht werden, und die zugehörigen relativen Häufigkeiten werden gemittelt und dann zwischen den Behandlungsgruppen auf signifikante Unterschiede verglichen (z. B. wie durch t-Test-abgeleitete p-Werte). Alternativ kann es von großem explorativen Wert sein, nach globa...

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Diskussion

Bei der oben genannten Methode wurden Gewebe verwendet, die in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurden, um sofort alle biologischen Aktivitäten zu stoppen, bevor sie zur Langzeitlagerung auf -80 °C übertragen wurden. Nachdem alle Proben entnommen waren, fand die Homogenisierung des Gewebes statt. Während der Homogenisierung ist es wichtig, alle Gewebe und Werkzeuge kalt zu halten, um eine Reaktivierung oder einen Abbau der Proteine zu verhindern. Außerdem werden die Proben während der...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde zum Teil durch eine Berufung in das National Research Council Associateship Program unterstützt, das vom Fellowships Office der National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine verwaltet wird, und das Oak Ridge Institute of Science and Education Program am Walter Reed Army Institute of Research.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
660 nm Protein-Assay-KitPierce / Thermo Scientific22662Für BCA zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen von Proben, enthält Pierce 660nm Protein Assay Reagenz und vorverdünnte Protein Assay Standards
Acetonitril, Optima LC/MS-QualitätThermo Fisher Scientific047138.K2Reinstes Acetonitril für die Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie
Aluminiumfolie Platten-SiegelBeckman Coulter538619Dichtung, die bei der Entwicklung von Protein-Assay-Platten verwendet wird
BioTek Synergy Neo2 Multimode-Reader / UV-Vis-SpektrometerAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195Spektralphotometer/Assay-Plattenlesegerät zur Durchführung von 660-nm-Absorptionsmessungen zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen 
ChromaCare LC-MS Spüllösung für InstrumenteThermo Fisher ScientificT111101000Eine Lösung, die jeweils 25 % Acetonitril, Isopropranol, Methanol und Wasser enthält, wird verwendet, um das LC-System nach der Probenentnahme zu reinigen
CK28 Precellys SchlauchBertin Corp / TechnologienP000911LYSK0A,0In diese Röhrchen wird homogenisiertes Gewebe für die Gewebelyse und Proteinisolierung mit dem Precellyis-Instrument gegeben. Dies sind die Röhrchen, die von unserem Labor verwendet werden und im Protokoll als "Homogenisierröhrchen" bezeichnet werden.
KryopodeBrooks / Azenta Biowissenschaftenhttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierBehälter zur Aufnahme von flüssigem Stickstoff zum Kühlen von Mörtel während der Tisuse-Homogenisierung
EasyPep Mini MS ProbenvorbereitungskitThermo Fisher ScientificNr. A40006Ein Kit kann 20 Proben verarbeiten, der Inhalt umfasst die Lyselösung für die Proteinextraktion, die in der Extraktionslösung ergänzte Universalnuklease und die für die Schritte 1.4 und 1.5 benötigten Regeanten
EASY-Spray C18 LC Säule (15 cm L, 50 & Mikro; m Dia und 2 µ m Partikelgröße)Thermo Fisher ScientificES901Elektrospray-LC-Säule zur Trennung von Peptiden vor dem MS-Nachweis
FlexMix-KalibrierlösungPierce / Thermo ScientificNr. A39239Mischung aus 16 Standardmolekülen, die zur Kalibrierung der Detektorgenauigkeit und -empfindlichkeit des MS-Instruments vor Probenläufen verwendet wird
Ameisensäure, LC/MS-QualitätThermo Fisher Scientific85178Hochreine Ameisensäure zur Akzimatisierung aller LC-Lösungen und -Proben mit einer Endkonzentration von 0,1 % (v/v)
Protease stoppen & Phosphotase Einmal-Inhibitor-Cocktail (100x)Thermo Fisher Scientific78442Ergänzt im Extraktionspuffer, um den Abbau von Proteinen und Phosphoproteinen in der Probe zu verhindern
Methanol, Optima LC/MS-QualitätThermo Fisher Scientific047192.K2Reinstes Methanol für die Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie
Porzellan-Mörser, 150 mLThermo Fisher ScientificFB961C150 ml Kapazität, zur Homogenisierung kleinerer Frettchengewebe (z. B. Gehirn)
Porzellan-Mörser, 275 mLThermo Fisher ScientificFB961D275 ml Kapazität, zur Homogenisierung von großen Frettchengeweben (z. B. Leber)
Porzellan-Mörser, 50 mLThermo Fisher ScientificFB961A50 ml Fassungsvermögen, zur Homogenisierung von Mausgewebe
Porzellan Pestl, 50 mLThermo Fisher ScientificFB961KZur Verwendung mit 50 mL Mörtel
Porzellan-Stößel, 150 mLThermo Fisher ScientificFB961MZur Verwendung mit 150 mL Mörtel
Porzellan-Stößel, 275 mLThermo Fisher ScientificFB961NZur Verwendung mit 275 mL Mörtel
PrecellysBertin Corp / Technologienhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/Instrument zur Homogenisierung von Gewebeproben. Folgende Einstellungen wurden verwendet: 4500 U/min, 2 x 30 s pro Zyklus, 30 s Pause.
Reagenz für ProteinassaysPierce / Thermo Scientific22662In den Schritten 3.4 verwendetes Protein-Assay-Reagenz 3.8
Proteom-EntdeckerThermo Fisher ScientificCSW0064764Bioinformatik-Software zur Analyse von Proteomik-/Phosphoproteomik-Daten
SureSTART MSCERT LC-Injektionsfläschchen mit Schraubverschluss (0,02– 1,5 mL Fassungsvermögen)Thermo Fisher Scientific6PMCK39TRZertifizierte Glasfläschchen mit Schraubverschluss (PTFE, vorgeschlitzte Septen) mit hoher Leistungsfähigkeit, die zur Aufnahme von Proben für die Injektion auf dem LC/MS-Instrument verwendet werden.    
Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS) SystemThermo Fisher ScientificLC: rabattiert / MS: FETD2-10002, auf SonderwunschFlüssigchromatographie/Massenspektrometrie-Instrument (LC/MS) mit ultrahoher Leistung, das zum Abtrennen und anschließenden Nachweis der Peptide in den Proben nach Molekulargewicht verwendet wird
Universelle Nuklease für die Zelllyse, 100 kU, 400 & Mikro; LPierce / Thermo Scientific88702Zusätzliche universelle Nuklease wurde gekauft 
Vacufuge PlusEppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748Vakuum zum Trocknen von Peptidproben vor der Rekonstitution.
Wasser, Optima LC/MS-QualitätThermo Fisher Scientific047146.K2Reinstwasser für die Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie

Referenzen

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

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