Ein Protokoll für Explantatkulturen von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomen

Zusammenfassung

IDH1-mutierte diffuse niedriggradige Gliome sind seltene Tumoren, die schwer zu kultivieren sind. Wir stellen eine einfache, nicht-enzymatische Explantatmethode vor, die die Expression des IDH1-mutierten Proteins bewahrt und die Kulturen über Monate aufrechterhält. Wichtig ist, dass diese Technik mit kryokonservierten Tumoren funktioniert und eine wertvolle Ressource für die Gliomforschung darstellt.

Zusammenfassung

Diffuse Gliome, die häufigsten primären Hirntumoren, werden basierend auf histopathologischen Kriterien und genetischen Mutationen in niedrige und hohe Grade eingeteilt. Diffuse niedriggradige Gliome stellen eine Untergruppe dar, die überwiegend junge Erwachsene betrifft und für hochgradige Gliome prädisponiert. Es gibt zwei Haupttypen von diffusen niedriggradigen Gliomen: Astrozytome und Oligodendrogliome, die sich jeweils durch unterschiedliche genetische und histologische Merkmale auszeichnen. Diese Tumoren weisen charakteristischerweise eine mutierte Variante des Stoffwechselenzyms IDH1 auf, die die zelluläre Differenzierung stört. Sie sind heterogen und bestehen sowohl aus proliferativen Stammzellen als auch aus differenzierteren, ruhenden Gliazellen.

Patientenspezifische In-vitro-Tumormodelle bergen ein erhebliches Potenzial für die Entschlüsselung onkogener Mechanismen und die maßgeschneiderte Wirkstoffauswahl für eine personalisierte Therapie. Das Fehlen zuverlässiger In-vitro-Modelle speziell für IDH1-mutierte niedriggradige Gliome hat jedoch die Grundlagenforschung und die translationale Forschung behindert. In dieser Arbeit stellen wir eine einfache Methode vor, um IDH1-mutierte Tumoren als Explantate in definierten Medien zu kultivieren, ohne dass eine enzymatische Dissoziation erforderlich ist. Diese Explantate können über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden, wobei die Expression des IDH1-mutierten Proteins sowie Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wie ASCL1 (MASH1), OLIG1 und OLIG2 und für Astrozyten (GFAP, SOX9) erhalten bleiben. Sie können auch aus gefrorenen Tumoren in DMSO etabliert werden. Diese Kulturen können als wertvolle Plattform für Wirkstoffscreenings, Videomikroskopie und Genstudien dienen und so Fortschritte beim Verständnis und der Behandlung dieser schwierigen Tumoren ermöglichen. Sie bieten auch das Potenzial, IDH1-mutierte Zelllinien abzuleiten.

Einleitung

Diffuse Gliome sind die häufigsten primären Hirntumoren. Diese Tumoren sind derzeit trotz sehr intensiver Behandlung (Operation, Bestrahlung und Chemotherapie) nicht heilbar¹. Immer mehr Beweise stützen die Hypothese, dass die Gliomgenese von adulten Stammzellen oder glialen Vorläuferzellen stammt, die im Gehirn leben². Obwohl Glioblastome den aggressivsten Typ darstellen, sind auch diffuse niedriggradige Gliome (DLGG, Tumoren Grad 2) weit verbreitet (15% der diffusen Gliome)^1,3. DLGGs wachsen langsam und wandern entlang der Bahnen der weißen Substanz, ein Kennzeichen dieses "diffusen" Neoplasmas⁴. Diese DLGG rezidivieren trotz Behandlung sehr oft und entwickeln sich schließlich zu hochgradigen Malignomen (Grad 3 und 4)⁵.

DLGG sind durch eine Missense-Mutation im Isocitrat-Dehydrogenase-1- oder -2-Gen (IDH1 oder IDH2) gekennzeichnet, die zu einer aberranten Produktion des Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2HG) führt. Dies stört die Zelldifferenzierung durch epigenetische Dysregulationen⁶. IDH1-mutierte Gliome werden weiter in Subtypen eingeteilt: Astrozytome weisen typischerweise Mutationen in ATRX und P53 auf, während Oligodendrogliome durch 1p19q-Deletionen gekennzeichnet sind⁷. Diese Tumoren weisen eine Heterogenität von Tumorzellen auf. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Immuncharakterisierung haben eine vielfältige Population von Tumorzellen aufgedeckt, die stammzellähnliche, astrozytenähnliche und oligodendrozytenähnliche Phänotypen innerhalb dieser Tumoren aufweisen^8,9.

Im Gegensatz zum Glioblastom, das von leicht verfügbaren, langfristigen Kulturen und Zelllinien profitiert, gibt es einen bemerkenswerten Mangel an zellulären Werkzeugen, die auf die Untersuchung von IDH1-mutierten Tumoren zugeschnitten sind¹. Dies stellt ein erhebliches Hindernis für die Weiterentwicklung der therapeutischen Entwicklung und die Vertiefung unseres Verständnisses der IDH1-mutierten Gliomgenese und des Krankheitsverlaufs dar. Traditionelle, im Serum gezüchtete Zelllinien werden zwar seit langem verwendet, replizieren aber nur unzureichend die ursprünglichen Tumore und weisen veränderte Transkriptionsprofile auf. Alternativ können serumfreie Kulturbedingungen, sei es in 2D- oder 3D-Tumoroidmodellen, die Transkriptionsprofile von Tumorzellen und ihre in vivo-Phänotypen, wie z. B. die Invasion in normales Hirngewebe, effektiver erhalten^10,11.

Darüber hinaus bewahren Kurzzeit-Zellkulturen, die aus einer chirurgischen Probe eines Patienten gewonnen wurden, das molekulare Profil und die zelluläre Vielfalt des Tumors und repräsentieren dadurch die biologischen Merkmale von Tumoren im Vergleich zu Zelllinien besser¹². Darin stellen wir eine einfache, nicht-enzymatische Methode zur Kultivierung von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomkulturen als Explantate vor, die aus frischen oder gefrorenen Patientenresektionen stammen, mit dem Ziel, den Bedarf an verbesserten in vitro-Modellen für die Gliomforschung und therapeutische Entwicklung zu decken. Sie bieten auch das Potenzial, IDH1-mutierte Zelllinien abzuleiten.

Protokoll

Die in diesem Protokoll verwendeten Tumorfragmente wurden mit Zustimmung des Patienten aus einer gut charakterisierten und ethisch zugelassenen Sammlung gewonnen. Diese Forschung wurde im Rahmen des Projekts mit dem Titel Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Projekt-Nr. RECH/P722/1-5) und wurde am 28. August 2023 vom wissenschaftlichen Beirat der Tumorbiobank genehmigt.

1. Vorbereitung von Kulturplatten

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube für Gewebekulturen durch.

1. Bereiten Sie mindestens 1 h vor der Kultur Poly-D-Lysin (PDL) und lamininbeschichtete 24-Well-Platten vor.
   1. Verdünnen Sie 10 mg PDL-Pulver in 100 ml Boratpuffer (pH 8,4) auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml. Nach dem Auflösen filtrieren Sie die Lösung (0,22 μm) für die Sterilität. PDL ist gebrauchsfertig; Bereiten Sie 3 mL Aliquots vor und lagern Sie diese bei -20 °C.
   2. Tauen Sie das 1-2 mg/ml-Lamininröhrchen bei 4 °C auf, um Gelbildung zu vermeiden. 50 μl Aliquots vorbereiten und bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Wiederholtes Auftauen und Einfrieren sollte vermieden werden.
   3. Beschichtung von Blechen
      1. Optionaler Schritt: Sterile Deckgläser Ø, 13 mm, geeignet für Zellkulturschalen, in eine 24-Well-Platte legen, ein Deckglas pro Well.
         HINWEIS: Dieser Schritt dient der weiteren Immunfärbung von Gliom-Explantaten.
      2. Für die Beschichtung der Vertiefungen mischen Sie die 3 mL der PDL-Lösung in 9 mL 1x PBS und fügen Sie 50 μL Laminin hinzu. Geben Sie 500 μl dieser Lösung in jede Vertiefung für eine Beschichtungskonzentration von 1-2 μg/cm². Die beschichteten Platten werden bei Raumtemperatur, vorzugsweise mit langsamem Schaukeln (15 U/min), mindestens 1 h lang inkubiert.
      3. Unmittelbar vor der Kultur die PDL-Lamininlösung entfernen und zweimal mit sterilem 1x PBS.
         HINWEIS: Lassen Sie die Vertiefungen nicht austrocknen.

2. Medien

1. Kultivieren Sie IDH1-mutierte Explantate in einem definierten Medium, das DMEM/F12 enthält, ergänzt mit L-Glutamin, zusammen mit einer Serumersatzmischung aus N2 und B27 ohne Vitamin A. Verwenden Sie Antibiotika, einschließlich Ciprofloxacin, Gentamicin und Pilze, um eine bakterielle und pilzliche Kontamination zu verhindern. Zusätzlich die Wachstumsfaktoren Heparin, EGF und FGF2 in das Medium einbauen, filtrieren (0,2 μm) und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern
   HINWEIS: Einzelheiten zu den Inhaltsstoffen und der Zubereitung des Mediums finden Sie in Tabelle 1 und in der Materialtabelle.

3. Vorbereitung der Explantation

1. Bereiten Sie vor der Probenverarbeitung den Arbeitsbereich und die sterilen Werkzeuge vor, wie in Abbildung 1A dargestellt. Desinfizieren Sie ein Kühlakku, indem Sie es mit 70 % Ethanol besprühen. Sterilisieren Sie Scheren und Pinzetten, indem Sie sie in 70%iges Ethanol tauchen und mit PBS spülen.
2. Übertragen Sie die Tumorresektion für die Kultur unverzüglich auf Eis, idealerweise innerhalb von 2 Stunden nach der chirurgischen Extraktion (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Die Tumorprobe sollte einen Mindestdurchmesser von 9-10 mm haben, um bessere Ergebnisse zu gewährleisten. Das Gewebe wird ohne Nährmedium transportiert, da diese Methode für histologische Zwecke bevorzugt wird. Das Fehlen von Flüssigkeit verhindert die Bildung von Eiskristallen während des Schockfrostens und bewahrt so die Integrität des Gewebes für eine spätere histologische Untersuchung, falls erforderlich.
3. Stellen Sie die Kulturschale mit der Tumorprobe über die Kühlakku und spülen Sie sie vorsichtig mit 1X PBS aus, um überschüssiges Blut zu entfernen.
4. Der resezierte Tumor weist oft eine signifikante Größe und Heterogenität auf und besteht aus Tumormasse, infiltriertem Gewebe und nicht-tumoralen Komponenten (Abbildung 1C). Wählen Sie Teile aus, die eine graue Farbe mit einer weichen oder geleeartigen Textur für die Isolierung von Tumorzellen aufweisen, da sie tendenziell mehr Tumorzellen enthalten. Vermeiden Sie dagegen harte und weiße Bereiche, da sie möglicherweise weniger Tumorzellen enthalten, die für die Kultur geeignet sind (Abbildung 1D), sowie geschwärzte Bereiche, da sie wahrscheinlich das Ergebnis von Elektrokauterisation sind und möglicherweise keine zuverlässigen Ergebnisse für die Analyse liefern.
5. Übertragen Sie die ausgewählten Proben zum Zerkleinern in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen oder Kryofläschchen. Geben Sie 1 ml steriles Medium in das 1,5-ml-Mikroröhrchen oder Kryoröhrchen und zerkleinern Sie die Probe mit der sterilen Schere, bis kleine Stücke (1-2 mm³) erhalten werden.
   HINWEIS: Etwa 1-2 Minuten Zerkleinern sind erforderlich, um winzige Fragmente zu erhalten, typischerweise 1-2 mm groß 3 (Abbildung 1E).
6. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere vorsichtig das Ende einer blauen 1.000-μl-Pipettenspitze ab, um eine breite Öffnung von etwa 3-4 mm Durchmesser zu erhalten. Mit dieser modifizierten Spitze pipettieren Sie 50-200 μl der zerkleinerten Gewebefragmente und verteilen sie gleichmäßig über jede Vertiefung. Da die kleineren Stücke dazu neigen, sich schnell abzusetzen, sollten Sie die Suspension in jeder Vertiefung vorsichtig rehomogenisieren, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überfüllung und halten Sie ein Gleichgewicht, indem Sie nicht eine übermäßige Anzahl von Fragmenten in jede Vertiefung einführen (Abbildung 1F).
7. Inkubieren Sie die Tumorfragmente bei 37°C in einem 5%igen CO2-Inkubator mit 100% Luftfeuchtigkeit. Wechseln Sie das Medium täglich, wenn die Stoffwechselaktivität des Tumors (angezeigt durch eine schnelle Gelbfärbung des Mediums) und die Anzahl der Fragmente in jeder Vertiefung dies erfordern. Seien Sie beim Medienwechsel vorsichtig, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette absaugen, die mit einer 200-μl-Spitze ausgestattet ist, um sicherzustellen, dass anhaftende Tumorfragmente nicht gestört werden.

Abbildung 1: Verfahren der Tumorexplantatkultur. Eine diffuse niedriggradige Gliomresektion wurde von einem 44-jährigen Patienten durchgeführt, bei dem ein Astrozytom Grad II gemäß der WHO-Klassifikation 2021 diagnostiziert wurde. Der Tumor wies eine IDH1-Mutation (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) und eine TP53-Mutation (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis) auf, zusammen mit dem Fehlen einer ATRX-Färbung. Es wurden keine Mutationen in den Ets/TCF-Bindungsstellen (C250T und C228T) des TERT-Gens nachgewiesen. (A) Die Arbeitsfläche besteht aus einer Kühlpackung, die eine Umgebung bietet, die den Probenabbau minimiert und die Lebensfähigkeit der biologischen Komponenten aufrechterhält. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig, um die Qualität und Integrität des Gewebes zu erhalten. (B) Der Transport der Probe vom Krankenhaus zum Labor sollte auf Eis erfolgen. (C) Fragment der Tumorresektion. Pfeile zeigen die am besten geeigneten Teile für die Kultur. (D) Die Dissektion des Tumors wird durchgeführt, um den relevantesten Teil auszuwählen, der zerkleinert werden soll. Unserer Erfahrung nach ist es in der Regel weniger wahrscheinlich, dass die weiße Substanz erfolgreiche Explantate hervorbringt. (E) Tumorfragmente mit einem Durchmesser von ca. 1-2 mm³ in einem 15-ml-Röhrchen nach mechanischem Zerkleinern mit einer Schere. (F) Die Anzahl der Tumorstücke, die für die korrekte Aussaat erforderlich sind, wird für Vertiefungen auf einer 24-Well-Platte angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Kryokonservierung und Auftauen von zerkleinerten Tumoren

HINWEIS: Die Kryokonservierung gewährleistet ein Backup im Falle einer Kontamination und eines Verlusts von Explantatkulturen oder zur späteren Verarbeitung der Tumorproben.

1. Kryokonservierung: Bereiten Sie das Gefriermedium (20 % v/v DMSO-Lösung) vor, indem Sie 2 mL DMSO zu 8 mL Zellkulturmedium hinzufügen.
2. Kombinieren Sie 1 Volumen der zerkleinerten Tumorsuspension mit einem gleichen Volumen des 20%igen DMSO-Gefriermediums, um eine Endkonzentration von 10% DMSO zu erreichen. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, um eine gründliche Mischung zu gewährleisten, und geben Sie dann ca. 1 ml in Kryoröhrchen ab.
3. Bringen Sie die Kryofläschchen schnell in einen kryogenen Behälter, um die Temperatur allmählich zu senken, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei -80 °C, bevor Sie sie schließlich in flüssigem Stickstoff lagern.
   HINWEIS: Dieser Schritt muss sofort durchgeführt werden, nachdem die Zellen in das Gefriermedium gelegt wurden, da bestimmte Kryoprotektiva wie DMSO schädlich sein können, wenn die Zellen ihnen länger als nötig bei Raumtemperatur ausgesetzt werden.
4. Auftauen: Entfernen Sie die Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie sofort in ein 37 °C warmes Wasserbad, bis etwa 80 % der Zellen aufgetaut sind.
5. Um das DMSO zu entfernen, pipettieren Sie die Suspension schnell in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml vorgewärmtem 1x PBS und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 × g.
6. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche mit 1X PBS und anschließender Zentrifugation (Schritt 4.5). Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, und fügen Sie die entsprechende Menge des Mediums hinzu, um es in eine vorbeschichtete PDL-Laminin 24-Well-Platte zu überführen und in den Inkubator zu stellen.
7. Überprüfen Sie nach 24 Stunden, ob sich die Zellen angeheftet haben. Entfernen Sie nach einigen Tagen nicht anhaftende Fragmente, indem Sie den Nährboden austauschen.

5. Übergang der Kultur

HINWEIS: Einmal etabliert, können Explantate für die Videomikroskopie oder Immunfärbung verwendet werden. Alternativ, wenn Tumorzellen aus dem Explantat gewandert sind und gesund erscheinen, kann das Explantat durch enzymatische Dissoziation geleitet und für weitere Experimente in Vertiefungen neu ausgesät werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht für die wiederholte Übergabe ausgelegt ist. In der Regel kann nur eine einzige Passage versucht werden, bevor die Tumorzellen seneszent werden oder absterben. Nicht alle Explantatkulturen führen zu einer erfolgreichen Passage.

1. Zum Durchgang alte Medien entfernen, mit 1X PBS spülen und (125 μl) 0,05 % Trypsin-EDTA in die Vertiefungen geben und 3-4 Minuten bei 37 °C inkubieren, gefolgt von der Zugabe von 6,5 μl Trypsin-Inhibitor, 12 μl 20 mM CaCl₂ (endgültige Verdünnung auf 2 mM) und 1 μl DNAse I.
   HINWEIS: Die für die Dissoziation benötigte Inkubationszeit kann je nach Kultur variieren. Es ist wichtig zu überprüfen, ob sich die Zellen nach mindestens 3 min ablösen. Typischerweise kann es sein, dass das Explantat nicht vollständig in eine einzellige Suspension dissoziiert wird, und kleine Cluster werden oft zurückgehalten, wodurch neue Explantatkulturen erzeugt werden können.
2. Mit einem p1000 auf 500-600 μl spülen Sie sanft, um Explantate zu disaggregieren. Vermeiden Sie Blasenbildung.
3. 5 mL 1x PBS zugeben und 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Den Überstand ansaugen, das Pellet in frischem, vorgewärmtem Medium resuspendieren und für die Aussaat zählen.
4. Identifizieren Sie Kulturen, die das Potenzial haben, Zelllinien zu erzeugen, indem Sie sich teilende Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachten. Diese sich teilenden Zellen haben typischerweise eine abgerundete Morphologie und sichtbare Chromosomen, wie in Abbildung 2A gezeigt.

Ergebnisse

Nach ein paar Tagen haften einige Tumorfragmente an den Vertiefungsoberflächen und initiieren das Auswachsen von Zellen aus den Explantaten. Die Zeit zwischen der ersten Beschichtung und dem Auftreten von tumorwachsenden Zellen ist von Probe zu Probe unterschiedlich. Die ersten Kulturen enthalten oft erhebliche zelluläre Trümmer, was es schwierig macht, das Vorhandensein lebensfähiger Zellen zu beurteilen. Folglich sollte die Kultur mindestens 4 Wochen lang aufbewahrt werden. Sobald die Zellen zu wachsen beginnen, werden...

Diskussion

Die Entwicklung von in vitro und präklinischen Modellen für IDH1-mutierte niedriggradige Gliome ist aufgrund des langsamen Wachstums dieser Tumoren und der Komplexität der Replikation der umfangreichen genomischen und epigenomischen Veränderungen, die durch die IDH-Mutation verursacht werden, eine besondere Herausforderung. Darüber hinaus interagieren diese infiltrativen Tumorzellen aktiv mit umgebenden Zellen, einschließlich Immun-, Endothel-, Glia- und Neuronalzellen, und sind möglicherweise für ihr Überleben auf sie a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-ASCL1	BD Pharmingen&Handel;	556604	Verdünnung 1:500
Anti-ATRX	Sigma-Aldrich	HPA001906	Verdünnung 1:100
Anti-CD68	Agilent	M081401-2	Verdünnung 1:500
Anti-GFAP	Aves Labs	AB_2313547	Verdünnung 1:500
Anti-IBA1	Fujifilm Wako Antikörper	019-19741	Dilituion 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) Maus Monoklonaler Antikörper	Dianova	DIA-H09
Anti-Ki67	BD Österreich	556003	Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1	R& D Systems®	AF2417	Dulituion 1:300
Anti-OLIG2	Sigma-Aldrich	MABN50	Verdünnung 1:250
Anti-SOX9	Abcam®	EPR14335-78	Verdünnung 1:100
B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Rinderserumalbumin (BSA)	CiteAb	A-421-100
Ciprofloxacin HCl	Sigma-Aldrich	PHR1044-1G
CoolCell	Corning®	432000	Zell-Gefrierbehälter, für 12 x 1 mL oder 2 mL Kryofläschchen
Deckglas & Oslash;, 13 mm	Karl Hecht & Handel; Assistent™
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM/F-12, ohne Glutamin	Thermo Fisher Scientific	21331020
DNAse I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale	Corning®
Falcon 24-Well Klarlack mit flachem Boden	Corning®	353047	TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte, mit Deckel, steril
Fungin	InvivoGen	ant-fn-1
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-100KU
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3375
Mensch EGF	PeproTech	AF-100-15-1MG
Mensch FGF-basic	PeproTech	100-18B-1MG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	25030-024
N-2 Ergänzung (100x )	Thermo Fisher Scientific	17502-048
PDL	Sigma-Aldrich	P7886
Serum Acrodisc 37 mm Spritzenfilter mit GF/0,2 & Mikro; m Supor	PALL Corporation	4525
Trypsin-Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	17075-029
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 Mikroskop	Zeiss		gerade Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop