IDH1-mutierte diffuse niedriggradige Gliome sind seltene Tumoren, die schwer zu kultivieren sind. Wir stellen eine einfache, nicht-enzymatische Explantatmethode vor, die die Expression des IDH1-mutierten Proteins bewahrt und die Kulturen über Monate aufrechterhält. Wichtig ist, dass diese Technik mit kryokonservierten Tumoren funktioniert und eine wertvolle Ressource für die Gliomforschung darstellt.
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Methodenartikel
Ein Protokoll für Explantatkulturen von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diffuse Gliome, die häufigsten primären Hirntumoren, werden basierend auf histopathologischen Kriterien und genetischen Mutationen in niedrige und hohe Grade eingeteilt. Diffuse niedriggradige Gliome stellen eine Untergruppe dar, die überwiegend junge Erwachsene betrifft und für hochgradige Gliome prädisponiert. Es gibt zwei Haupttypen von diffusen niedriggradigen Gliomen: Astrozytome und Oligodendrogliome, die sich jeweils durch unterschiedliche genetische und histologische Merkmale auszeichnen. Diese Tumoren weisen charakteristischerweise eine mutierte Variante des Stoffwechselenzyms IDH1 auf, die die zelluläre Differenzierung stört. Sie sind heterogen und bestehen sowohl aus proliferativen Stammzellen als auch aus differenzierteren, ruhenden Gliazellen.
Patientenspezifische In-vitro-Tumormodelle bergen ein erhebliches Potenzial für die Entschlüsselung onkogener Mechanismen und die maßgeschneiderte Wirkstoffauswahl für eine personalisierte Therapie. Das Fehlen zuverlässiger In-vitro-Modelle speziell für IDH1-mutierte niedriggradige Gliome hat jedoch die Grundlagenforschung und die translationale Forschung behindert. In dieser Arbeit stellen wir eine einfache Methode vor, um IDH1-mutierte Tumoren als Explantate in definierten Medien zu kultivieren, ohne dass eine enzymatische Dissoziation erforderlich ist. Diese Explantate können über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten werden, wobei die Expression des IDH1-mutierten Proteins sowie Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen wie ASCL1 (MASH1), OLIG1 und OLIG2 und für Astrozyten (GFAP, SOX9) erhalten bleiben. Sie können auch aus gefrorenen Tumoren in DMSO etabliert werden. Diese Kulturen können als wertvolle Plattform für Wirkstoffscreenings, Videomikroskopie und Genstudien dienen und so Fortschritte beim Verständnis und der Behandlung dieser schwierigen Tumoren ermöglichen. Sie bieten auch das Potenzial, IDH1-mutierte Zelllinien abzuleiten.
Einleitung
Diffuse Gliome sind die häufigsten primären Hirntumoren. Diese Tumoren sind derzeit trotz sehr intensiver Behandlung (Operation, Bestrahlung und Chemotherapie) nicht heilbar1. Immer mehr Beweise stützen die Hypothese, dass die Gliomgenese von adulten Stammzellen oder glialen Vorläuferzellen stammt, die im Gehirn leben2. Obwohl Glioblastome den aggressivsten Typ darstellen, sind auch diffuse niedriggradige Gliome (DLGG, Tumoren Grad 2) weit verbreitet (15% der diffusen Gliome)1,3. DLGGs wachsen langsam und wandern entlang der Bahnen der weißen Substanz, ein Kennzeichen dieses "diffusen" Neoplasmas4. Diese DLGG rezidivieren trotz Behandlung sehr oft und entwickeln sich schließlich zu hochgradigen Malignomen (Grad 3 und 4)5.
DLGG sind durch eine Missense-Mutation im Isocitrat-Dehydrogenase-1- oder -2-Gen (IDH1 oder IDH2) gekennzeichnet, die zu einer aberranten Produktion des Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2HG) führt. Dies stört die Zelldifferenzierung durch epigenetische Dysregulationen6. IDH1-mutierte Gliome werden weiter in Subtypen eingeteilt: Astrozytome weisen typischerweise Mutationen in ATRX und P53 auf, während Oligodendrogliome durch 1p19q-Deletionen gekennzeichnet sind7. Diese Tumoren weisen eine Heterogenität von Tumorzellen auf. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Immuncharakterisierung haben eine vielfältige Population von Tumorzellen aufgedeckt, die stammzellähnliche, astrozytenähnliche und oligodendrozytenähnliche Phänotypen innerhalb dieser Tumoren aufweisen8,9.
Im Gegensatz zum Glioblastom, das von leicht verfügbaren, langfristigen Kulturen und Zelllinien profitiert, gibt es einen bemerkenswerten Mangel an zellulären Werkzeugen, die auf die Untersuchung von IDH1-mutierten Tumoren zugeschnitten sind1. Dies stellt ein erhebliches Hindernis für die Weiterentwicklung der therapeutischen Entwicklung und die Vertiefung unseres Verständnisses der IDH1-mutierten Gliomgenese und des Krankheitsverlaufs dar. Traditionelle, im Serum gezüchtete Zelllinien werden zwar seit langem verwendet, replizieren aber nur unzureichend die ursprünglichen Tumore und weisen veränderte Transkriptionsprofile auf. Alternativ können serumfreie Kulturbedingungen, sei es in 2D- oder 3D-Tumoroidmodellen, die Transkriptionsprofile von Tumorzellen und ihre in vivo-Phänotypen, wie z. B. die Invasion in normales Hirngewebe, effektiver erhalten10,11.
Darüber hinaus bewahren Kurzzeit-Zellkulturen, die aus einer chirurgischen Probe eines Patienten gewonnen wurden, das molekulare Profil und die zelluläre Vielfalt des Tumors und repräsentieren dadurch die biologischen Merkmale von Tumoren im Vergleich zu Zelllinien besser12. Darin stellen wir eine einfache, nicht-enzymatische Methode zur Kultivierung von IDH1-mutierten diffusen niedriggradigen Gliomkulturen als Explantate vor, die aus frischen oder gefrorenen Patientenresektionen stammen, mit dem Ziel, den Bedarf an verbesserten in vitro-Modellen für die Gliomforschung und therapeutische Entwicklung zu decken. Sie bieten auch das Potenzial, IDH1-mutierte Zelllinien abzuleiten.
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Protokoll
Die in diesem Protokoll verwendeten Tumorfragmente stammten aus einer gut charakterisierten und ethisch genehmigten Sammlung mit Zustimmung der Patienten. Diese Forschung wurde im Rahmen des Projekts mit dem Titel Gliomacult: Charakterisierung und primäre Kulturen von Gliomen niedrigen Grades (Projektnummer RECH/P722/1-5) durchgeführt und am 28. August 2023 vom wissenschaftlichen Beirat der Tumor-Biobank genehmigt.
1. Herstellung der Kulturplatten
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte unter einer sterilen Gewebekultur-Laminarströmwerkbank durch.
- Bereiten Sie mindestens 1 Stunde vor der Kultur PDL- und Laminin-beschichtete 24-Loch-Platten vor.
- Lösen Sie 10 mg PDL-Pulver in 100 mL Boratpuffer (pH 8,4), um eine Endkonzentration von 100 µg/mL zu erhalten. Filtern Sie die Lösung nach dem Auflösen (0,22 µm) zur Sterilisation. PDL ist gebrauchsfertig; stellen Sie Aliquots zu je 3 mL her und lagern Sie diese bei -20 °C.
- Tauen Sie das Laminin-Röhrchen (1–2 mg/mL) bei 4 °C auf, um Gelbildung zu vermeiden. Bereiten Sie Aliquots zu je 50 µL vor und lagern Sie diese bei -20 °C.
HINWEIS: Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. - Plattenbeschichtung
- Optional: Legen Sie sterile Deckgläser mit einem Durchmesser von 13 mm, die für Zellkulturgefäße geeignet sind, in eine 24-Loch-Platte, jeweils ein Deckglas pro Loch.
HINWEIS: Dieser Schritt dient der weiteren Immunfärbung von Gliom-Explantaten. - Mischen Sie zur Beschichtung der Löcher 3 mL der PDL-Lösung in 9 mL 1x PBS und geben Sie 50 µL Laminin hinzu. Geben Sie 500 µL dieser Lösung in jedes Loch, um eine Beschichtungskonzentration von 1–2 µg/cm² zu erreichen. Inkubieren Sie die beschichteten Platten bei Raumtemperatur, vorzugsweise mit langsamer Schüttelbewegung (15 U/min), mindestens 1 Stunde lang.
- Unmittelbar vor der Kultur entfernen Sie die PDL-Laminin-Lösung und spülen Sie zweimal mit steriler 1x PBS.
HINWEIS: Lassen Sie die Löcher nicht austrocknen.
- Optional: Legen Sie sterile Deckgläser mit einem Durchmesser von 13 mm, die für Zellkulturgefäße geeignet sind, in eine 24-Loch-Platte, jeweils ein Deckglas pro Loch.
2. Medien
- Kultivieren Sie IDH1-mutierte Explantate in einem definierten Medium, das aus DMEM/F12 mit L-Glutamin sowie einer serumfreien Zusammensetzung aus N2 und B27 ohne Vitamin A besteht. Verwenden Sie Antibiotika wie Ciprofloxacin, Gentamicin und Fungin, um bakterielle und pilzliche Kontaminationen zu verhindern. Zusätzlich sollten die Wachstumsfaktoren Heparin, EGF und FGF2 dem Medium zugesetzt werden; dieses anschließend filtrieren (0,2 µm) und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Für Einzelheiten zu den Mediumbestandteilen und der Herstellung siehe Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien.
3. Präparation der Explantate
- Bereiten Sie den Arbeitsplatz und sterile Werkzeuge vor der Probenvorbereitung wie in Abbildung 1A dargestellt vor. Desinfizieren Sie einen Kühlpack, indem Sie ihn mit 70 %igem Ethanol besprühen. Sterilisieren Sie Schere und Pinzette, indem Sie sie in 70 %igen Ethanol eintauchen und anschließend mit PBS spülen.
- Transferieren Sie die Tumorexzision idealerweise innerhalb von 2 Stunden nach der chirurgischen Entnahme rasch auf Eis zur Kultur (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Tumorprobe sollte einen Mindestdurchmesser von 9–10 mm aufweisen, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Das Gewebe wird ohne Kulturmedium transportiert, da diese Methode für histologische Zwecke bevorzugt wird. Das Fehlen von Flüssigkeit verhindert die Bildung von Eiskristallen während des Schnellgefrierens und erhält so die Gewebeintegrität für eine eventuell notwendige spätere histologische Untersuchung. - Stellen Sie die Kulturschale mit der Tumorprobe auf den Kühlpack und spülen Sie sie vorsichtig mit 1X PBS aus, um überschüssiges Blut zu entfernen.
- Die exzidierten Tumore weisen oft erhebliche Größe und Heterogenität auf und bestehen aus Tumormasse, infiltriertem Gewebe und nicht-tumoralen Bestandteilen (Abbildung 1C). Wählen Sie für die Tumorzellisolierung Anteile mit grauer Färbung und weicher oder gallertartiger Textur aus, da diese tendenziell mehr Tumorzellen enthalten. Vermeiden Sie hingegen harte und weiße Bereiche, da sie möglicherweise weniger für die Kultur geeignete Tumorzellen enthalten (Abbildung 1D), sowie verfärbte, dunkle Areale, da diese wahrscheinlich durch Elektrokauter entstanden sind und für die Analyse unzuverlässige Ergebnisse liefern könnten.
- Überführen Sie die ausgewählten Proben in ein 1,5-mL-Mikroröhrchen oder Kryoröhrchen zur Zerkleinerung. Geben Sie 1 mL steriles Medium in das 1,5-mL-Mikroröhrchen oder Kryoröhrchen und zerschneiden Sie die Probe mit der sterilen Schere, bis kleine Stücke (1–2 mm3) entstehen.
HINWEIS: Zum Erhalt kleiner Fragmente sind etwa 1–2 Minuten Zerkleinerung erforderlich, wobei typischerweise Fragmente von 1–2 mm3 Größe entstehen (Abbildung 1E). - Schneiden Sie mit einer sterilen Schere vorsichtig die Spitze einer blauen 1.000-µL-Pipettenspitze ab, um eine weite Öffnung von etwa 3–4 mm Durchmesser zu erzeugen. Verwenden Sie diese modifizierte Spitze, um 50–200 µL der zerkleinerten Gewebefragmente aufzupipettieren und gleichmäßig auf jede Vertiefung zu verteilen. Da die kleineren Stücke schnell absinken, homogenisieren Sie die Suspension in jeder Vertiefung vorsichtig erneut, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überbesiedlung und achten Sie darauf, nicht zu viele Fragmente in jede Vertiefung einzubringen (Abbildung 1F). - Incubieren Sie die Tumorfragmente bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator mit 100 % Luftfeuchtigkeit. Wechseln Sie das Medium täglich, falls die metabolische Aktivität des Tumors (angezeigt durch schnelle Gelbfärbung des Mediums) und die Anzahl der Fragmente pro Vertiefung dies erfordern. Achten Sie beim Mediumwechsel darauf, das Medium vorsichtig mit einer Pipette und einer 200-µL-Spitze abzusaugen, wobei Sie sicherstellen müssen, dass anhaftende Tumorfragmente nicht gestört werden.
Abbildung 1: Verfahren zur Kultur von Tumor-Explantaten. Eine diffuse Resektion eines niedriggradigen Glioms wurde von einem 44-jährigen Patienten erhalten, bei dem gemäß der WHO-Klassifikation 2021 ein Astrozytom Grad II diagnostiziert wurde. Der Tumor wies eine IDH1-Mutation (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) und eine TP53-Mutation (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis) auf, zusammen mit fehlender ATRX-Färbung. Es wurden keine Mutationen in den Ets/TCF-Bindungsstellen (C250T und C228T) des TERT-Gens nachgewiesen. (A) Die Arbeitsfläche besteht aus einer Kühleinlage, die ein Umfeld bereitstellt, das die Degradation der Probe minimiert und die Vitalität der biologischen Bestandteile erhält. Diese Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig, um die Qualität und Integrität des Gewebes zu bewahren. (B) Der Transport der Probe vom Krankenhaus ins Labor sollte auf Eis erfolgen. (C) Fragment der Tumorresektion. Pfeile zeigen die am besten geeigneten Teile für die Kultur an. (D) Die Tumordissektion dient der Auswahl des relevantesten Teils, der zerkleinert werden soll. Nach unserer Erfahrung ist weißes Markgewebe im Allgemeinen weniger geeignet, erfolgreiche Explantate zu erzeugen. (E) Tumorfragmente von etwa 1–2 mm³ Durchmesser in einem 15-mL-Röhrchen nach mechanischer Zerkleinerung mit einer Schere. (F) Die Anzahl der benötigten Tumorstücke für eine korrekte Aussaat ist für die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
4. Kryokonservierung und Auftauen von zerkleinertem Tumorgewebe
HINWEIS: Die Kryokonservierung stellt eine Sicherung im Falle einer Kontamination und des Verlusts von Explantatkulturen sicher oder ermöglicht die spätere Verarbeitung von Tumorgewebeproben.
- Kryokonservierung: Bereiten Sie das Gefriermittel (20 % v/v DMSO-Lösung) vor, indem Sie 2 mL DMSO zu 8 mL Zellkulturmedium hinzufügen.
- Vermischen Sie 1 Volumen der zerkleinerten Tumorsuspension mit einem gleichen Volumen des 20 %igen DMSO-Gefriermittels, um eine Endkonzentration von 10 % DMSO zu erreichen. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig mehrmals auf und ab, um eine gründliche Durchmischung sicherzustellen, und geben Sie anschließend etwa 1 mL in Kryoröhrchen ab.
- Überführen Sie die Kryoröhrchen unverzüglich in einen kryogenen Behälter zur schrittweisen Temperatursenkung, gefolgt von einer Übernachtinkubation bei -80 °C, bevor die endgültige Lagerung in flüssigem Stickstoff erfolgt.
ANMERKUNG: Dieser Schritt muss unmittelbar nach dem Einbringen der Zellen in das Gefriermittel durchgeführt werden, da bestimmte Kryoprotektiva wie DMSO schädlich wirken können, wenn die Zellen ihnen bei Raumtemperatur länger als notwendig ausgesetzt sind. - Auftauen: Entnehmen Sie die Kryoröhrchen dem flüssigen Stickstoff und stellen Sie sie sofort in ein 37 °C warmes Wasserbad, bis etwa 80 % der Zellen aufgetaut sind.
- Um das DMSO zu entfernen, pipettieren Sie die Suspension schnell in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen, das 5 mL vorgewärmte 1x PBS enthält, und zentrifugieren Sie 5 min bei 300 × g.
- Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Waschung mit 1X PBS, gefolgt von einer Zentrifugation (Schritt 4.5). Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzulösen, und geben Sie die geeignete Menge Medium hinzu, um die Zellen in eine vorbeschichtete PDL-Laminin-24-Well-Platte zu überführen, und stellen Sie diese in den Inkubator.
- Überprüfen Sie nach 24 Stunden, ob die Zellen angeheftet haben. Entfernen Sie nach einigen Tagen nicht-angewachsene Fragmente durch Erneuern des Kulturmediums.
5. Passagieren der Kultur
HINWEIS: Sobald sie etabliert sind, können Explantate für die Videomikroskopie oder Immunfärbung verwendet werden. Alternativ können die Explantate, falls Tumorzellen aus dem Explantat ausgewandert sind und gesund erscheinen, durch enzymatische Dissoziation weitergegeben und erneut in Mulden ausgesät werden, um weitere Experimente durchzuführen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht für wiederholte Passagierungen geeignet ist. In der Regel kann nur eine einzige Passage durchgeführt werden, bevor die Tumorzellen seneszent werden oder absterben. Nicht alle Explantatkulturen führen zu einer erfolgreichen Passagierung.
- Zum Passagieren altes Medium entfernen, mit 1X PBS spülen und (125 µL) 0,05 % Trypsin-EDTA zu den Vertiefungen geben und 3–4 min bei 37 °C inkubieren, gefolgt von der Zugabe von 6,5 µL Trypsininhibitor, 12 µL 20 mM CaCl2 (endgültige Verdünnung auf 2 mM) und 1 µL DNAse I.
HINWEIS: Die zur Dissoziation erforderliche Inkubationszeit kann je nach Kultur variieren. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Zellen nach mindestens 3 min abgelöst sind. Typischerweise ist das Gewebestückchen möglicherweise nicht vollständig in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert, und kleine Zellhaufen bleiben oft erhalten, die neue Explantatkulturen bilden können. - Mit einer P1000-Pipette, eingestellt auf 500–600 µL, vorsichtig spülen, um die Explantate zu disaggregieren. Bildung von Blasen vermeiden.
- 5 mL 1x PBS hinzufügen und 5 min bei 300 × g zentrifugieren. Überstand absaugen, das Pellet in frischem vorgewärmtem Medium resuspendieren und zur Aussaat zählen.
- Kulturen identifizieren, die potenziell Zelllinien bilden können, indem man teilende Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet. Diese teilenden Zellen weisen typischerweise eine runde Morphologie und sichtbare Chromosomen auf, wie in Abbildung 2A gezeigt.
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Ergebnisse
Nach einigen Tagen werden einige Tumorfragmente an den Wells unterlagen haften und das Auswachsen von Zellen aus den Explantaten einleiten. Die Zeitspanne zwischen der anfänglichen Aussaat und dem Auftreten wachsender Tumorzellen unterscheidet sich von Probe zu Probe. Die anfänglichen Kulturen enthalten oft erhebliche Mengen an zellulärem Detritus, wodurch die Beurteilung der Anwesenheit lebensfähiger Zellen erschwert wird. Daher sollte die Kultur mindestens 4 Wochen lang beibehalten werden. Sobald die Zellen zu wachsen ...
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Diskussion
Die Entwicklung von In-vitro- und präklinischen Modellen für IDH1-mutierte Gliome niedrigen Grades ist aufgrund des langsamen Wachstums dieser Tumoren und der Komplexität, die umfangreichen genomischen und epigenomischen Veränderungen, die durch die IDH-Mutation verursacht werden, nachzubilden, besonders herausfordernd. Darüber hinaus interagieren diese infiltrierenden Tumorzellen aktiv mit umgebenden Zellen, einschließlich Immun-, Endothel-, Glia- und Nervenzellen, und sind möglicherweise auf diese für ihr Überleben ang...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.
Danksagungen
Die hier verwendeten Tumorfragmente sind Teil der NEUROLOGY-Sammlung frischer Gewebeproben, die vom Biological Resource Center am Universitätsklinikum Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr) gepflegt wird. Diese Forschung wurde im Rahmen des Projekts mit dem Titel "Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas" unter der Leitung von Prof. J. P. Hugnot (Projekt-Nr. RECH/P722/1-5). Diese Arbeit wurde unterstützt von La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C. wird vom National Council of Humanities Science and Technology (CONAHCYT), Mexiko, und der Association for Brain Tumor Research (ARTC), Frankreich, unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-ASCL1 | BD Pharmingen&Handel; | 556604 | Verdünnung 1:500 |
| Anti-ATRX | Sigma-Aldrich | HPA001906 | Verdünnung 1:100 |
| Anti-CD68 | Agilent | M081401-2 | Verdünnung 1:500 |
| Anti-GFAP | Aves Labs | AB_2313547 | Verdünnung 1:500 |
| Anti-IBA1 | Fujifilm Wako Antikörper | 019-19741 | Dilituion 1:1000 |
| Anti-IDH1 (R132H) Maus Monoklonaler Antikörper | Dianova | DIA-H09 | |
| Anti-Ki67 | BD Österreich | 556003 | Dilituion 1:1000 |
| Anti-OLIG1 | R& D Systems® | AF2417 | Dulituion 1:300 |
| Anti-OLIG2 | Sigma-Aldrich | MABN50 | Verdünnung 1:250 |
| Anti-SOX9 | Abcam® | EPR14335-78 | Verdünnung 1:100 |
| B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | CiteAb | A-421-100 | |
| Ciprofloxacin HCl | Sigma-Aldrich | PHR1044-1G | |
| CoolCell | Corning® | 432000 | Zell-Gefrierbehälter, für 12 x 1 mL oder 2 mL Kryofläschchen |
| Deckglas & Oslash;, 13 mm | Karl Hecht & Handel; Assistent™ | ||
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM/F-12, ohne Glutamin | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale | Corning® | ||
| Falcon 24-Well Klarlack mit flachem Boden | Corning® | 353047 | TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte, mit Deckel, steril |
| Fungin | InvivoGen | ant-fn-1 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| Mensch EGF | PeproTech | AF-100-15-1MG | |
| Mensch FGF-basic | PeproTech | 100-18B-1MG | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| L-Glutamin | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| N-2 Ergänzung (100x ) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Serum Acrodisc 37 mm Spritzenfilter mit GF/0,2 & Mikro; m Supor | PALL Corporation | 4525 | |
| Trypsin-Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Zeiss Z1 Apotome 3 Mikroskop | Zeiss | gerade Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop |
Referenzen
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