Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung einer technisch hergestellten Blue-Light-aktivierten allosterischen Schalterdomäne (LightR) zur reversiblen raumzeitlichen Kontrolle der Proteinaktivität. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell bietet diese Studie ein ausgeklügeltes Protokoll zur Entwicklung und Charakterisierung von lichtreguliertem Src (LightR-Src). Es zeigt die Vielseitigkeit dieses Ansatzes über Enzymklassen hinweg.

Zusammenfassung

Die Optogenetik bietet das Potenzial, eine komplexe raumzeitliche Steuerung der Enzymaktivität bis hin zu einer subzellulären Auflösung nachzuahmen. Die meisten optogenetischen Ansätze stehen jedoch oft vor erheblichen Herausforderungen, wenn es darum geht, mehrere Fähigkeiten in einem einzigen Werkzeug zu integrieren, das auf eine Vielzahl von Zielproteinen anwendbar ist. Die präzise Kontrolle der EIN/AUS-Kinetik, die Gewährleistung minimaler Leckagen im Dunkeln und der Nachweis einer effizienten Leistung in Säugetierzellen mit subzellulärer Präzision sind einige der häufigsten Herausforderungen in diesem Bereich. Eine vielversprechende Lösung liegt in der Anwendung von rational gestalteten lichtempfindlichen Domänen zur allosterischen Kontrolle der Proteinaktivität. Mit dieser Strategie haben wir eine optogenetische Methode entwickelt, die alle gewünschten Merkmale kombiniert. Der Ansatz beinhaltet den Einbau des lichtregulierten allosterischen Schaltmoduls (LightR) in das Zielprotein, um die Enzymaktivität mit blauem (465 nm) Licht zu regulieren. Die LightR-Domäne wird durch die Verknüpfung von zwei Vivid-Photorezeptordomänen (VVD) erzeugt, wodurch eine lichtempfindliche Klemme entsteht, die in eine kleine flexible Schleife innerhalb der katalytischen Domäne eines Enzyms eingebaut werden kann. Im dunklen Zustand ist die LightR-Klemme offen, wodurch die katalytische Domäne des Enzyms verzerrt und inaktiviert wird. Bei Einwirkung von blauem Licht schließt sich die LightR-Domäne und stellt die Struktur und Enzymaktivität der katalytischen Domäne wieder her. In diesem Manuskript diskutieren wir Designstrategien zur Erzeugung einer lichtregulierten Proteinkinase und demonstrieren ihre Kontrolle durch blaues Licht, Reversibilität, Kinetik und präzise Regulation auf subzellulärer Ebene, was eine enge räumlich-zeitliche Präzision ermöglicht. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell präsentieren wir ein Protokoll zur effektiven Regulierung der LightR-Src-Kinase-Aktivität. Wir demonstrieren auch die Anwendbarkeit von LightR über verschiedene Enzymklassen hinweg, was den Nutzen des Werkzeugsystems bei der Beantwortung mechanistischer Fragen der Signalwege bei verschiedenen Krankheiten erweitert.

Einleitung

Die Fähigkeit der Zelle, externe Signale zu interpretieren und sie in physiologischen oder pathologischen Kontexten in spezifische Reaktionen umzuwandeln, wird durch spezielle Gruppen von Proteinen gesteuert. Der Beitrag eines Proteins zu solch komplexen Reaktionen wird oft durch seine subzelluläre Lokalisation, das Expressionsniveau und den Zeitpunkt der vorübergehenden, anhaltenden oder oszillatorischen Aktivierung definiert. Um die Rolle dieser einzelnen Parameter bei der Regulation der Signalübertragung zu untersuchen, sind Methoden erforderlich, die in der Lage sind, eine komplexe raumzeitliche Kontrolle der Proteinaktivität auf subzellulärer Ebene zu replizieren. Traditionelle Techniken wie genetische Manipulation und niedermolekulare Inhibitoren greifen in dieser Hinsicht zu kurz. Im Gegensatz dazu versprechen optogenetische Verfahren das Potenzial für die Zerlegung biologischer Prozesse, indem physiologische und pathologische Prozesse manipuliert oder nachgeahmt werden. Aktuellen Tools fehlt es jedoch oft an breiter Anwendbarkeit oder subzellulärer Kontrolle. Mehrere bestehende Strategien erreichen eine strenge Regulierung der Proteinlokalisierung und -interaktionen; aber es fehlt die direkte Kontrolle über die enzymatische Aktivität 1,2,3,4. Andere ermöglichen die Regulierung der enzymatischen Aktivität, können aber keine subzelluläre Kontrolle haben oder sind nur begrenzt anwendbar über verschiedene Enzymklassen^hinweg 5,6,7,8,9. In diesem Protokollpapier beschreiben wir eine neuartige Protein-Engineering-Methode, die die Vorteile der Optogenetik in einem Werkzeug vereint: strenge zeitliche Regulierung, einstellbare Kinetik, subzelluläre Kontrolle und breite Anwendbarkeit von^{Enzymen 10}. Wir haben eine lichtregulierte (LightR) Domäne entwickelt, die als allosterischer Schalter fungiert, wenn sie in das Zielprotein von Interesse eingefügt wird. Diese Strategie ermöglicht eine enge raumzeitliche Kontrolle der Aktivierung und Deaktivierung eines Proteins von Interesse in lebenden Zellen.

Hier wird die Design- und Anwendungsstrategie für das optogenetische LightR-Werkzeug über mehrere Enzymklassen hinweg diskutiert. Diese Studie bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung der lichtregulierten Tyrosinkinase Src (LightR-Src). Die Studie zeigt außerdem die Abstimmbarkeit der Inaktivierungskinetik von LightR-Schaltern. Der langsam inaktivierende LightR-Schalter kann die Enzymaktivität bei reduzierter Beleuchtungsfrequenz aufrechterhalten, während die schnell zyklische Version, FastLightR, eine häufigere Beleuchtung zur Aktivierung erfordert, aber eine schnelle Inaktivierung anzeigt, wenn die Beleuchtung ausgeschaltet ist. Die Aktivierung/Inaktivierung von FastLightR-Src in lebenden Zellen induziert Zyklen der Zellausbreitung und -retraktion. Die FastLightR-Src-induzierte Zellausbreitung stimmt mit der physiologischen Rolle der Src-Kinase^{überein 11,12}. Aufgrund der schnellen Inaktivierungskinetik kann FastLightR-Src auch auf subzellulärer Ebene reguliert werden, was zu einer Stimulation lokaler Vorsprünge und der Zellpolarisation führt. Um die Anwendbarkeit des LightR-Tools auf andere Arten von Enzymen zu demonstrieren, führen wir die Leser kurz durch einen ähnlichen Erfolg mit der manipulierten lichtregulierten Kinase bRaf (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) und einer ortsspezifischen DNA-Rekombinase Cre (LightR-Cre). Insgesamt hat dieser Ansatz das Potenzial, unser Verständnis der komplexen Signalwege, die die Pathophysiologie verschiedener Krankheiten prägen, zu verbessern.

Protokoll

1. Design und Entwicklung von LightR ( Abbildung 1)

1. Strategische Planung
   HINWEIS: Die LightR-Domäne besteht aus zwei tandemartig verbundenen Vivid (VVD) Photorezeptordomänen von Neurospora crassa^13,14,15,16. VVDs homodimerisieren in Gegenwart von Licht, und eine solche Dimerisierung beinhaltet eine Konformationsänderung, die den N-Terminus eines VVD-Monomers neben den C-Terminus eines anderen VVD-Monomers bringt (Abbildung 1A). Durch die Verbindung von zwei VVD-Domänen mit einem flexiblen Linker entsteht eine clamp-artige Domäne, die im Dunkeln offen und bei Beleuchtung mit blauem Licht geschlossen ist. Die Integration dieser Klemme in die katalytische Domäne eines Enzyms ermöglicht eine lichtvermittelte Regulation der Aktivität. Bei Dunkelheit verzerrt die offene Klemme die Domäne und deaktiviert das Enzym; Die Beleuchtung mit blauem Licht bewirkt, dass sich die Klemme schließt, wodurch die Aktivität des Enzyms wiederhergestellt wird (Abbildung 1B). Dieses Konzept kann auf Enzyme aus verschiedenen Familien angewendet werden, darunter Proteinkinasen und DNA-Rekombinasen¹⁰ (Abbildung 1C).
   1. Aufbau von LightR
      1. Um zwei VVD-Moleküle zu verbinden, verwenden Sie einen flexiblen 22-Aminosäure-Linker (GGS)4G(GGS)3 zwischen jedem Monomer.
         HINWEIS: Der Linker bietet ausreichend Flexibilität und Länge, um die Assoziation und Dissoziation von VVD-Monomeren zu ermöglichen.
      2. Fügen Sie GPGGSGG- und GSGGPG-Linker zu den N- bzw. C-Termini der LightR-Domäne hinzu.
         HINWEIS: Die Länge und die Zusammensetzung der Linker müssen möglicherweise für ein bestimmtes Protein angepasst werden. Kürzere GSG- und Single-Gly-Linker werden routinemäßig verwendet, wenn eine strengere Regulierung erforderlich ist. Die Größe der Insertionsschleife und ihre Nähe zu katalytischen Rückständen beeinflussen ebenfalls den dynamischen Bereich der Regelung. Kürzere Schleifen bieten mit größerer Wahrscheinlichkeit eine strengere Regulierung der katalytischen Aktivität, können jedoch zu einer geringeren Aktivität nach der Beleuchtung führen. Die Sequenz der LightR-Domäne ist in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Einfügen von LightR
      HINWEIS: Eine geeignete LightR-Insertionsstelle ermöglicht eine strenge Regulierung der Zieldomänenfunktion, ohne ihre Wechselwirkungen sterisch zu blockieren oder irreversible strukturelle Veränderungen zu verursachen, die ihre biologische Rolle beeinträchtigen. Eine Kristallstruktur des Zielproteins ist ein idealer Anhaltspunkt bei der Identifizierung solcher flexiblen Schleifenbereiche für die Insertion von LightR. Falls erforderlich, kann die Kristallstruktur eines engen Homologs ausreichen. Im Folgenden finden Sie einige allgemeine Kriterien, die zu berücksichtigen sind.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Insertionsschleife strukturell an die kritischen katalytischen Elemente des Enzyms gekoppelt ist. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählte Insertionsschleife keine vorhandene Bindungsstelle für das Protein ist und dass die Insertion von LightR möglicherweise keine funktionellen Wechselwirkungen aufgrund sterischer Effekte stört.
      2. Als erste Strategie ersetzen Sie beim Einführen von LightR eine Aminosäure in der Einführschlaufe. Zielt auf die Mitte der Insertionsschleife ab, die eine polare oder kleine Aminosäure (z. B. Glu, Arg, Lys, Gly) enthält, die dem Lösungsmittel ausgesetzt und nicht an intramolekularen Wechselwirkungen beteiligt ist.
         HINWEIS: Wenn ein Aminosäureersatz nicht zu einem funktionsfähigen Protein führt, erfordert die Optimierung des LightR-Konstrukts den Ersatz mehrerer Aminosäuren oder der gesamten Insertionsschleife. Evaluieren Sie die Funktionalität mehrerer Einfügestellen für LightR innerhalb der definierten Schleife.
      3. Stellen Sie sicher, dass das Zielenzym unabhängig von der endogenen Regulation arbeitet. Dies wird erreicht, indem eine konstitutiv aktive mutierte Version des Enzyms für die Insertionsvorlage verwendet wird.
         HINWEIS: Wildtyp-Enzyme können auch zur Erzeugung von LightR-Konstrukten verwendet werden, aber dies kann zu einem AND-gesteuerten System führen, das durch endogene Mechanismen und Licht reguliert wird.
      4. Positiv- und Negativkontrollen sind für die Analyse der LightR-Enzymaktivität von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie konstitutiv aktive Mutanten endogener Proteine als Positivkontrollen und katalytisch inaktive mutierte Versionen des Ziel-LightR-Enzyms als Negativkontrollen.
         HINWEIS: Bei der Auswahl inaktivierender Mutationen ist es wichtig sicherzustellen, dass die Mutation ausreichend von der LightR-Insertionsstelle entfernt ist, um eine Störung der Irreversibilität der LightR-Enzymfaltung zu vermeiden. Basierend auf den oben genannten Kriterien wird die LightR-Insertionsstelle in der Src-Kinase in einer flexiblen Schleifenregion ausgewählt, die strukturell über einen Beta-Strang an das hochkonservierte GXGXXG-Motiv in der ATP-bindenden G-Schleife/glycinreichen Schleifenregion gekoppelt ist. Wichtig ist, dass es von der ATP-Bindungstasche und der Substratbindungsregion^10,17 entfernt positioniert ist (Abbildung 1C (i)).
         HINWEIS: Aufgrund der strukturellen Homologie zwischen den Kinasen wird die LightR-Insertionsstelle in bRaf in derselben strukturellen Schleife wie die Insertionsstelle in Src ausgewählt (Abbildung 1C (ii)).
         ANMERKUNG: Basierend auf den in Abschnitt 1.1.2 beschriebenen Grundsätzen wird die LightR-Insertionsstelle in Cre-Rekombinase, einer Nicht-Kinase, in einer der flexiblen Schleifen ausgewählt, die vom katalytischen Kern entfernt ist, d. h. an der DNA-Bindungsstelle. Die Insertionsschleife ist jedoch immer noch strukturell über eine α-Helix an kritische katalytische Reste innerhalb der DNA-Bindungsdomäne gekoppelt, um den Erfolg der LightR-Cre-Funktionalität sicherzustellen (Abbildung 1C (iii)). Alle im aktuellen Protokoll beschriebenen Insertionsstellen mit Positiv- und Negativkontrollen für verschiedene Enzyme sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.
   3. Entwicklung von FastLightR.
      HINWEIS: Die Einführung einer I85V-Mutation in beide VVDs in LightR ermöglicht eine schnellere Aktivierungs-Inaktivierungsdynamik, die auf die schnelle Umwandlung der Mutante in den dunklen Zustand^{zurückzuführen ist 18,19}. Die Generierung von FastLightR-Src und FastLightR-bRaf mit schneller Inaktivierungskinetik ermöglicht eine enge zeitliche Kontrolle von Aktivierung und Inaktivierung. Es ermöglicht die subzelluläre Regulation von LightR-Src in lebenden Zellen.
      HINWEIS: Die Aktivität der Cre-Rekombinase führt zu einer irreversiblen DNA-Rekombination; Daher sind die Reversibilitätseigenschaften von LightR nicht anwendbar.
      HINWEIS: Um die Detektion des LightR-Konstrukts zu vereinfachen, kann ein fluoreszierendes Protein oder ein anderer geeigneter Tag an den N- oder C-Terminus des Zielproteins angehängt werden. In dieser Studie wurde mCherry-myc für LightR-Src, Venus für LightR-bRaf und miRFP670 für LightR-Cre-Rekombinase verwendet.
2. Strategie zum Klonen
   HINWEIS: Der Klonierungsansatz basiert im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen auf einer ortsgerichteten Mutagenese, die nicht auf spezifischen Restriktionsstellen beruht^10,20.
   1. Generierung eines "Megaprimers"
      1. Codon-Optimierung der LightR-Gene, um eine stabile Expression der beiden Tandem-VVD-DNA-Sequenzen pilzlichen Ursprungs in Säugetierzellen zu gewährleisten und die Sequenzen für eine fehlerfreie Klonierung mittels PCR so unterschiedlich wie möglich zu machen. Um die Codon-Optimierung durchzuführen, führen Sie die Schritte 1.2.1.2-1.2.1.3 aus.
      2. Richten Sie die Aminosäuresequenz von VVDs und die ausgewählten Linker nebeneinander aus, um die theoretische Sequenzkarte von LightR zu erstellen.
      3. Fügen Sie die Sequenz in eine beliebige Online-Codon-Optimierungsplattform ein, die einen fortschrittlichen Algorithmus für die Codon-Optimierung verwendet, um die beste Sequenzoption mit minimaler Komplexität zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass der Zielorganismus ausgewählt ist, der Leserahmen beibehalten wird und die VVD-Sequenzen für die Optimierung ausgewählt sind.
      4. Gewinnung von LightR-DNA als benutzerdefiniertes synthetisiertes Fragment (siehe Ergänzende Tabelle 1) oder aus einem zuvor veröffentlichten LightR-Konstrukt¹⁰.
      5. Amplifizieren Sie das LightR-Gen, um einen "Megaprimer" zu erzeugen, indem Sie die zuvor beschriebene^20-Strategie verwenden, die in Abbildung 1D dargestellt ist. Synthetisieren Sie den LightR "Megaprimer" mittels PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die spezifische DNA-Polymerase und unter Verwendung des folgenden PCR-Reaktionsgemisches:
         5x DNA-Polymerase-kompatibler Puffer: 10 μL
         100 μM Vorwärts-Megaprimer: 0,5 μL
         100 μM Reverse Megaprimer: 0,5 μL
         10 nM dNTP-Mix: 2 μL
         DNA-Polymerase (2000 Einheiten/ml): 1 μl (0,02 U/μl)
         50 ng Template-DNA: 1 μL
         Wasser in PCR-Qualität: 35 μL
         HINWEIS: Hier wird eine hochgenaue Heißstart-DNA-Polymerase mit universellen Primer-Glühtemperaturen verwendet.
      6. Trennen Sie den resultierenden Megaprimer durch Agarose-Gelelektrophorese. Das Produkt wird eine Länge von etwa 1000 Nukleotiden haben. Schneiden Sie den Megaprimer aus dem Agarosegel heraus und reinigen Sie ihn mit einem Gelextraktionskit, gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder mit einer analogen Technik.
   2. Insertion des LightR-Gens mittels ortsgerichteter Mutagenese: Setzen Sie das LightR ein und ersetzen Sie eine gewünschte Aminosäure oder eine Länge von Aminosäuren. Das Template-Plasmid ist dasjenige, in das die LightR-Domäne eingefügt wird. Führen Sie die PCR-Reaktion wie zuvor beschrieben²⁰ mit der folgenden Mischung durch.
      5x DNA-Polymerase-kompatibler Puffer: 5 μL
      10 nM dNTP-Mix: 1 μL
      DNA-Polymerase (2000 Einheiten/ml): 1 μl (0,02 U/μl)
      50 ng Ziel-Template-DNA: 1 μL
      Extrahierter Megaprimer (berechnete Masse): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Wasser in PCR-Qualität: 2,5 μl
      HINWEIS: Megaprimer-Masse (ng) = gewünschtes Einsatz-/Vektormolverhältnis x Masse des Vektors x Verhältnis von Einsatz- zu Vektorlängen. Das gewünschte Verhältnis von Einsatz zu Vektor beträgt 3/1.
   3. Nach Abschluss der PCR-Reaktion wird 1 μl DpnI-Enzym (2000 Einheiten/ml) hinzugefügt, um selektiv nur die überschüssige und methylierte DNA zu verdauen, und das Gemisch bei 37 °C für 1-1,5 h inkubieren. Dadurch wird die Ausbeute des modifizierten Konstrukts deutlich erhöht.
   4. Transformieren Sie 1-2 μl der PCR-Reaktion in DH5α-kompetente Zellen gemäß den Herstellerprotokollen.
   5. Platte transformierte Bakterien auf Luria Broth (LB)-Agarplatte mit geeignetem Antibiotikum zur Selektion. Die Platte über Nacht bei 37 °C oder 72 h bei Raumtemperatur (RT; 25-30 °C) inkubieren.
      HINWEIS: LB-Platten mit darauf gewachsenen Bienenvölkern können bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden, und das Protokoll kann pausiert werden.
   6. Kolonie-Screening-PCR
      1. Für das PCR-basierte Kolonie-Screening entwerfen Sie Primer, die im LightR-Insert und in der Ziel-DNA annehmen, um etwa 400-700 bp-Fragmente zu erzeugen.
      2. Geben Sie eine kleine Menge einer Kolonie aus der LB-Platte in den unten angegebenen PCR-Mix und fahren Sie mit dem Thermocycling gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die spezifische DNA-Polymerase fort.
         2x Taq RED Mastermix: 5 μL
         Wasser in PCR-Qualität : 5 μL
         100 μM Vorwärts-Grundierung : 0,5 μL
         100 μM Reverse Primer: 0,5 μL
      3. Prüfung auf positive Kolonien durch Agarose-Gelelektrophorese.
      4. Wählen Sie die Kolonien aus, die die gewünschte PCR-Produktgröße erzeugt haben, und impfen Sie sie einzeln in 3 ml LB-Bouillon mit dem Antibiotikum, passend zur Antibiotikaresistenz im Plasmidrückgrat. Dann inkubieren und über Nacht bei 37 °C schütteln.
      5. Extrahieren Sie Plasmid-DNA aus der Flüssigkultur gemäß den Anweisungen des Herstellers des Plasmid-Aufreinigungskits für die Plasmid-DNA-Extraktion und überprüfen Sie das Vorhandensein des Inserts durch Sequenzierung.
         HINWEIS: Klonierungsprimer sind in der ergänzenden Tabelle 3 zusammengefasst.

2. Zellplattierung und biochemische Analyse der LightR-Enzymaktivität (Abbildung 2A)

1. Für die biochemische Analyse von LightR-Kinasen (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) wird für jede Versuchsgruppe 1 x 10⁶ LinXE-Zellen pro 3,5 cm Zellkulturschale platte. Siehe Ergänzende Tabelle 4.
2. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO₂ 16-18 h inkubiert.
3. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit dem ausgewählten DNA-Konstrukt unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsreagenzes gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Ergänzende Tabelle 4).
   HINWEIS: Das optimale Transfektionsreagenz hängt vom Konstrukt, dem Vektor und dem Typ der verwendeten Zellen ab. In dieser Studie wurden 2 μg DNA in einer 3,5 cm großen Schale unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes verwendet. Es sollten empirische Tests durchgeführt werden, um das optimale Transfektionsreagenz zu bestimmen. Da transfizierte Konstrukte Proteine exprimieren, die durch blaues Licht reguliert werden, müssen alle nachfolgenden Schritte, die mit transfizierten Zellen umgehen, unter rotem Licht durchgeführt werden. Wickeln Sie die Platten mit durchtrennten Zellen mit Aluminiumfolie ein, bevor Sie sie in den Inkubator legen, um ein versehentliches Aufleuchten zu vermeiden.
4. Nach 16-18 h Transfektion werden die Zellen blauem Licht^{ausgesetzt 10}. Platzieren Sie dazu ein 465-nm-Leuchtdiodensystem (LED) in den Gewebekultur-Inkubator. Platzieren Sie eine perforierte Plexiglasscheibe 10 cm über der Lampe, um die gewünschte Ausleuchtung von 3 mW/cm² zu erhalten (Zusatzdatei 1). Eine perforierte Platte wird benötigt, um eine ununterbrochene Luftzirkulation im Inkubator aufrechtzuerhalten. Beleuchten Sie Zellen für den gewünschten Zeitraum.
5. Verwenden Sie für die Aktivierung von LightR-Src und LightR-bRaf eine kontinuierliche Beleuchtung. Für eine kontinuierliche Beleuchtung schalten Sie das LED-Panel manuell ein und aus.
6. Um den Aktivierungs-/Inaktivierungszyklus von FastLightR Src aufrechtzuerhalten, verwenden Sie EIN/AUS-Zyklen, die entweder manuell oder von einem Mikrocontroller gesteuert werden.
   HINWEIS: Es können mehrere Software-Toolkits verwendet werden, die eine integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) zum Schreiben und Hochladen des erforderlichen Codes bereitstellen. Diese Toolkits unterstützen die C/C++-Programmierung und bieten einen GPIO-Zugriff (General Purpose Input/Output), der für die Steuerung der gepulsten Beleuchtung unerlässlich ist. Eine detaillierte Beschreibung der zu diesem Zweck verwendeten Protokolle und Codes ist in der Zusatzdatei 1 beschrieben.
7. Am Ende der jeweiligen Zeitpunkte des Versuchs (Ergänzende Tabelle 4) ernten Sie die Zellen unter sicherem rotem Licht. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS.
8. Um das Protein zu isolieren, lysieren Sie die Zellen mit 500 μl 2x Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit 5 % v/v 2-Mercaptoethanol. Inkubieren Sie das Lysat 5 Minuten lang bei 100 °C. Analyse von Zelllysaten mittels Protein-Gelelektrophorese und Western Blot²¹.
   HINWEIS: Die Zusammensetzung von 2x Laemmli-Puffer ist wie folgt: Für 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml Glycerin, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g Bromphenolblau, endgültiger pH-Wert 6,8.
9. Beurteilen Sie die LightR-Src-Aktivität durch Bewertung des Phosphorylierungsniveaus von endogenen p130cas auf Tyr249 und Paxillin auf TyrY118^22,23 (Abbildung 2). Bewertung der LightR-bRaf-Aktivität durch Bewertung des Phosphorylierungsgrades von MEK1 auf Ser217/221 und ERK1/2 auf TyrY202/204^24,25.

3. Funktionelle Analyse der LightR-Cre-Aktivität

1. Für die funktionelle Analyse der LightR-Cre-Aktivität wird 1 x 10⁶ LinXE-Zellen pro 3,5 cm Zellkulturschale platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ für 16-18 h.
2. Transfizieren Sie die Zellen gemäß dem in Abschnitt 2, Abbildung 2A und ergänzender Tabelle 5 beschriebenen Protokoll. Co-transfizierte insgesamt 2 μg DNA mit einem Verhältnis von 1:9 aus LightR-Cre-iRFP670 und einem Reporter-Plasmid Floxed-STOP-mCherry².
3. Nach 16-18 Stunden nach der Transfektion die Zellen beleuchten. Eine effiziente LightR-Cre-Aktivierung erfordert eine längere Beleuchtung. Um Phototoxizität zu vermeiden, verwenden Sie daher eine gepulste Beleuchtung für 8 Stunden mit 2 s EIN- und 20 s AUS-Zyklen unter Verwendung eines 465-nm-LED-Flächenlampensystems, das von einem Mikrocontroller gesteuert wird, wie in Abschnitt 2 und Ergänzende Datei 1 beschrieben.
4. Führen Sie die Bildgebung mittels Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 20-fach-Luftobjektiv durch. Für die Visualisierung von LightR-Cre-iRFP670 verwenden Sie den Cy5-Filtersatz, und für die Visualisierung von mCherry aus dem Floxed-mCherry-Ausdruck verwenden Sie den RFP-Filtersatz.
   HINWEIS: Für die Bildgebung wird ein Epifluoreszenzmikroskop verwendet, das mit Cy5/RFP-Lichtwürfeln ausgestattet ist.

4. Vorbereitung der Proben für die Bildgebung lebender Zellen

1. 2 x 10⁵ HeLa-Zellen pro 35 mm Gewebekulturschale in Zellkulturmedien laben und 2 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
2. Sobald sich die Zellen anheftet haben und die Konfluenz etwa 60 % bis 70 % beträgt, werden die HeLa-Zellen mit einer der folgenden Mischungen co-transfiziert: (i) 0,85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg Stargazin-iRFP oder (ii) 0,75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg mCherry-ERK2
   HINWEIS: In FastLightR-Src-Experimenten wird das Stargazin-iRFP verwendet, um die Plasmamembran für die Zellausbreitungsanalyse zu markieren. Wenn eine höhere FastLightR-Src-Expression gewünscht wird, kann stargazin-iRFP weggelassen und stattdessen 1 μg FastLightR-Src verwendet werden. In diesen Fällen sollte ein Membranfarbstoff verwendet werden, um die Zellen sichtbar zu machen. Plasmamembranfärbungen werden routinemäßig zur Markierung von Zellmembranen verwendet.
3. Decken Sie die Schale mit Alufolie ab, um ein versehentliches Aufleuchten der Zellen zu vermeiden, und inkubieren Sie sie 16-18 h bei 37 °C und 5 % CO₂.
4. Führen Sie alle folgenden Schritte unter roter Lichtbeleuchtung aus, um eine versehentliche Aktivierung der Konstrukte zu vermeiden. Die Exposition gegenüber weißem Licht induziert die Aktivierung von LightR-Kinasen und kann die nachfolgenden Ergebnisse beeinflussen.
5. Am selben Tag 3 runde Glasdeckgläser (25 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke) über Nacht mit 5 mg/L Fibronektin in PBS bei 37 °C bestreichen.
6. Spülen Sie die Deckgläser 16-18 h nach der Transfektion mit PBS aus und geben Sie ~1 x 10⁵ transfizierte HeLa-Zellen auf jedes Deckglas. 2 h in Zellkulturmedien bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Die niedrige Seeding-Dichte ist notwendig, um sicherzustellen, dass sich die Zellen im Sichtfeld nicht berühren.
7. Bereiten Sie das Bildgebungsmedium vor, indem Sie FBS zu den L-15-Bildgebungsmedien von Levobitz bis zu einer Endkonzentration von 5 % hinzufügen. Die Lösung durch einen 0,22 μm Filter filtrieren und auf 37 °C erwärmen.
8. Mineralöl auf 37 °C vorwärmen.
9. Waschen Sie die Deckgläser mit den Zellen zweimal mit PBS. Wenn Sie einen Membranfarbstoff verwenden, färben Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers, bevor Sie die Deckgläser waschen.
10. Legen Sie das Deckglas vorsichtig in eine Bildgebungskammer für lebende Zellen. Geben Sie 1 ml L-15-Bildgebungsmedium in die Kammer.
11. Geben Sie 1 ml Mineralöl auf das Medium, um eine Verdunstung während des Bildgebungsprozesses zu verhindern.
12. Bewahren Sie die Kammer bis zur Vorbereitung des Bildes vor Licht bei 37 °C auf.

5. Globale Aktivierung und Bildgebung von FastLightR-Src (Abbildung 3)

1. Befestigen Sie ein blaues LED-Mikroskopie-Ringlicht an dem Mikroskopkondensor und positionieren Sie es ca. 1,5 cm über dem Probenhalter. Verbinden Sie das AC/DC-Steuerrelais für das Ringlicht mit dem Mikroskopcomputer.
   HINWEIS: Für die Experimente in dieser Studie wurde die Beleuchtung über eine Transistor-Transistor Logic (TTL)-Schnittstelle über die Bildgebungssoftware gesteuert. Epifluoreszierende Beleuchtung kann auch verwendet werden, um LightR-Konstrukte global zu aktivieren, wenn keine externe Beleuchtungsquelle verfügbar ist. GFP-Anregungswellenlängen, wie z. B. der 490/20-nm-Anregungsfilter, sind wirksam bei der Aktivierung von LightR.
2. Stellen Sie die Kammer auf einen auf 37 °C vorgeheizten Mikroskoptisch und wählen Sie Zellen aus, die FastLightR-Src-mCherry und Stargazin-iRFP exprimieren (Abbildung 3B) oder FastLightR-bRaf-Venus und mCherry ERK-2 (Abbildung 5B).
3. Verwenden Sie für die Untersuchung von globalen Beleuchtungs- und Bildgebungsexperimenten mikroskopkompatible Hochleistungsobjektive (40x) mit apochromatischer Korrektur, Flat-Field-Korrektur und hoher numerischer Apertur.
   1. Für globale beleuchtungsbasierte Studien der Src-Kinase verwenden Sie 561/10 nm Anregungs- und 595/40 nm Emissionsfilter, um FastLightR-Src-mCherry zu visualisieren, und verwenden Sie 640/20 nm Anregung und 655LP Emissionsfilter, um Stargazin-iRFP zu visualisieren.
   2. Für globale beleuchtungsbasierte Studien der bRaf-Kinase verwenden Sie 514/10 nm Anregungs- und 540/21 nm Emissionsfilter, um FastLightR-bRaf-Venus zu visualisieren, und verwenden Sie 561/10 nm Anregungs- und 595/40 nm Emissionsfilter, um mCherry-ERK-2 zu visualisieren.
   3. Verwenden Sie einen polychroitischen Multiband-Spiegel in allen fluoreszierenden Bildgebungskanälen.
4. Berücksichtigen Sie je nach Versuchsbedingungen die folgenden Empfehlungen.
   1. Bilden Sie die Zellen mindestens 10 Minuten vor der Beleuchtung ab, um eine Ausgangsaktivität der Zellen zu ermitteln.
      HINWEIS: Diese Baseline ist erforderlich, um zu bestimmen, ob die Aktivierung der FastLightR-Kinase durch Beleuchtung Veränderungen im Zellverhalten oder in der Proteinlokalisierung hervorruft. Man kann auch längere Zeiträume der basalen Bildgebung durchführen, um eine größere statistische Signifikanz zu erzielen.
   2. Aufgrund der schnellen Inaktivierungskinetik von FastLightRs kann die Einbeziehung vieler Zellen für die Bildgebung zur Deaktivierung von Src/bRaf zwischen den Stadienpositionen führen und seine Reaktion abschwächen. Um einen solchen Fehler zu vermeiden, bilden Sie 4 Zellen/min ab, während Sie die FastLightR-Kinase-Aktivität im beschriebenen Protokoll analysieren, und bilden Sie jede ausgewählte Zelle jede Minute für insgesamt 110 Minuten ab (Ergänzende Datei 2).
   3. Verwenden Sie gepulste Beleuchtung anstelle von Dauerbeleuchtung, um die potenziellen phototoxischen Auswirkungen von blauem Licht zu reduzieren. Eine Beleuchtung von 12 s für jede der 4 Zellen/min ist wirksam (Zusatzdatei 2, Abbildung 3A).
      HINWEIS: Die Beleuchtungszyklen sollten für verschiedene Konstrukte und Beleuchtungsquellentypen empirisch bestimmt werden.
   4. Schalten Sie die Beleuchtung während der Zellbildgebung aus, um ein Durchscheinen in den Fluoreszenzkanälen zu vermeiden.
      HINWEIS: Die gleichzeitige Bildgebung von zu vielen Zellen verringert die für die Probe verfügbare Gesamtbeleuchtungszeit, was zu einer abgeschwächten Reaktion durch unzureichende Aktivierung führt.
5. Speichern Sie die Filme nach dem Imagevorgang als . TIF-Stack-Dateiformat für die Analyse.
   HINWEIS: Aufgrund der weniger gleichmäßigen Beleuchtung mit GFP-Epifluoreszenz im Vergleich zu Ringlicht erfordern Experimente mit GFP-Epifluoreszenz eine häufigere Beleuchtung. Dies führt dazu, dass weniger Zellen pro Experiment abgebildet werden.

6. Subzelluläre Aktivierung und Bildgebung von FastLightR-Src (Abbildung 4)

1. Stellen Sie die Kammer auf einen auf 37 °C vorgeheizten Mikroskoptisch und wählen Sie eine einzelne Zelle aus, die sowohl FastLightR-Src-mCherry als auch Stargazin-iRFP exprimiert.
2. Wählen Sie die spezifischen Bereiche (ROI) innerhalb der Zelle aus, die beleuchtet werden sollen. In dieser Studie wird ein kleiner Bereich an der Peripherie der ausgewählten Zelle ausgewählt.
   HINWEIS: Für die lokale Beleuchtung wird ein 445-nm-Laser verwendet, der von einem TIRF-Modul im FRAP-Modus fokussiert wird, oder ein Mikrospiegelgerät, das über die TTL-Schnittstelle über die Bildgebungssoftware gesteuert wird. Jedes gemusterte Beleuchtungssystem funktioniert für diese Experimente. Wenn ein scanbasiertes System verwendet wird, bestimmen Sie die Laserintensität und -homogenität für eine ausreichende Aktivierung ohne Beschädigung der Zelle.
3. Bilde die ausgewählte Zelle jede Minute für 20 Minuten im basalen Zustand vor der Beleuchtung, 50 Minuten bei lokaler Beleuchtung und dann 20 Minuten nach der Aktivierung für insgesamt 90 Minuten ab (Ergänzungsdatei 2).
4. Für die Aktivierung und Deaktivierung ist eine angemessene Zeitspanne für das Zielprotein bereitzustellen, um eine vollständige Deaktivierung des LightR-Proteins zu ermöglichen. Für FastLightR-Src ist eine Deaktivierung von mindestens 10 Minuten für die Abtragung der Restaktivität und eine Deaktivierung von 20 Minuten im demonstrierten Versuchsaufbau für die lokale Beleuchtung zu ermöglichen.
5. Speichern Sie die Filme nach dem Imaging unter . TIF-Stack-Dateiformat für die Analyse.

7. Analyse der Zellausbreitung

1. Bereiten Sie Bilder für die Datenverarbeitung und -analyse vor. Stellen Sie sicher, dass sich die Bilder in einer . TIF-Stack-Format. Speichern Sie diese direkt aus der Imaging-Software oder konvertieren Sie sie mit einem Open-Source-Programm.
2. Laden Sie das CellGeo-Skriptpaket aus den ergänzenden Daten-ZIP-Dateien²⁶ herunter.
   HINWEIS: Das CellGeo-Paket enthält mehrere verschiedene Skripte. Wählen Sie das gewünschte Paket aus der Liste aus, basierend auf der Art der Analyse, die in den Protokollabschnitten 7-9 behandelt wird.
3. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen MovThresh , und führen Sie es aus, um eine Maske der Zelle zu erstellen.
   1. Wählen Sie Datei > Importieren (.tif) und wählen Sie die Stargazin-iRFP-Bilder der Zellen aus.
   2. Durchsuchen Sie die Frames mit der Bildlaufleiste in der unteren linken Ecke. Wenn der vorgeschlagene Schwellenwert angemessen ist, fahren Sie mit Schritt 7.4 fort.
   3. Wenn der vorgeschlagene Schwellenwert nicht mit dem Verhalten der Zelle übereinstimmt, wählen Sie unter "Kurvenauswahl" die Option "Geglättete oder benutzerdefinierte Kurven" aus. Erstellen Sie die benutzerdefinierte Kurve, indem Sie durch die Frames scrollen und dann den Schwellenwert auf der rechten Seite des Fensters anpassen.
   4. Klicken Sie auf Schwellenwert zurücksetzen.
   5. Klicken Sie auf Datei > Speichern unter Masken, ändern Sie den Namen der Datei und speichern Sie sie mit der Option Speichern unter .
4. Öffnen Sie die neu erstellte Stack-Datei in einem Open-Source-Bildanalyseprogramm.
5. Wählen Sie Bild aus > passen Sie > Schwellenwert an > Anwenden an.
6. Wählen Sie Analysieren > Partikel analysieren > Anzeigeergebnisse überprüfen -> OK.
7. Berechnen Sie die Flächenänderung für jede Zelle, indem Sie die Fläche zu einem bestimmten Zeitpunkt durch die durchschnittliche Fläche derselben Zelle vor der Bestrahlung mit blauem Licht dividieren.
8. Stellen Sie die Flächenänderung als Linien- oder Balkendiagramm dar.
9. Berechnen Sie den Durchschnittswert und die 90 %-Konfidenzintervalle für jeden Zeitpunkt aller Zellen, die unter denselben Bedingungen behandelt wurden.

8. Analyse der Zellkantendynamik

1. Bereiten Sie die Stack-Dateien mit den in Protokollabschnitt 7 beschriebenen Schritten vor.
2. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen ProActive, und führen Sie es aus.
   1. Wählen Sie Datei > Importieren > Masken (.tif) und wählen Sie die Maske aus, die mit dem MovThresh-Skript erstellt wurde.
   2. Wählen Sie in der unteren rechten Ecke die Aktivität aus, die bei der Analyse relevant ist (Vorstehend, Retraktiv oder Gesamt).
   3. Wählen Sie den Typ der Normalisierung aus. In der Regel wird für diese Analysen die Flächennormalisierung verwendet.
   4. Wählen Sie den Anfangsbezugsrahmen mit dem Schieberegler auf der linken Seite aus. Der Schieberegler für die Verzögerung auf der rechten Seite bestimmt die Zeitverzögerung zwischen zwei Zeitpunkten, die zur Messung der von der Zelle gewonnenen und verlorenen Fläche verwendet wird.
   5. Wenn die ausgewählte Bild- und Verzögerungszahl additiv größer ist als die Anzahl der Bilder im Film, wird das Vorschaubild nicht angezeigt. Setzen Sie diese Werte auf einen Wert zurück, der kleiner als die Gesamtzahl der Frames ist.
3. Ändern Sie den Schwellenwert für Protrusion oder Retraktion, indem Sie das Kontrollkästchen für Kurve glätten im Abschnitt Ergebnisse aktivieren. Dadurch werden die Schwellenwerte über ein bestimmtes Fenster gemittelt, wodurch Probleme behoben werden können, bei denen geringfügige Schwankungen als Aktivität erkannt werden.
4. Wählen Sie Bereich ausführen aus, um die Aktivität über den Zeitraum zu berechnen, der durch die Schieberegler Frame und Verzögerung angegeben wird.
5. Speichern Sie die numerischen Daten, indem Sie Datei > Speichern unter > Ergebnisse(.mat) auswählen, und verwenden Sie sie, um die mittlere protrusive oder retraktive Aktivität zu bestimmen.
6. Bestimmen Sie die 90 %-Konfidenzintervalle für jeden Zeitpunkt.
   HINWEIS: Dadurch wird ein Array mit mehreren verschiedenen Werten gespeichert. Die im Skript enthaltene Textdatei "How to use ProActive" enthält eine detaillierte Beschreibung, was die einzelnen Werte darstellen und wie sie bestimmt wurden²⁶.
7. Speichern Sie die visuelle Darstellung der Aktivität, indem Sie Datei > Speichern als > Bilder (.tif) auswählen.

9. Analyse der Schwerpunktverschiebung

1. Verwenden Sie für die Analyse der Schwerpunktverschiebung eine beliebige Software, die Schwerpunktkoordinaten bestimmen kann.
2. Öffnen Sie in der Analysesoftware den maskierten Bildstapel der interessierenden Zelle, wie in Protokollabschnitt 7 beschrieben.
3. Wählen Sie Messen > Integrierte Morphometrie-Analyse aus, klicken Sie dann auf Einstellungen > Schwerpunktmarkierung > -prüfung zeichnen und wählen Sie dann Messen.
   1. Erfassen Sie die Schwerpunktkoordinaten vor der Bewegung (A).
   2. Notieren Sie die Schwerpunktkoordinaten am Ende des Experiments (B).
   3. Notieren Sie die Koordinaten für den Mittelpunkt des Beleuchtungsmusters (C).
4. Nachdem nun die drei Punkte gesammelt wurden, bestimmt man den Winkel BAC⁸. θ₁ entspricht dem Winkel ABC und θ₂ entspricht dem Winkel CBA (Abbildung 4Cii). Verwenden Sie dazu die folgende Gleichung:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   HINWEIS: Ein Taschenrechner kann verwendet werden, um die Winkel und Entfernungen direkt von den Koordinaten zu bestimmen, um die Verwendung zu vereinfachen.
5. Bestimmen Sie die Schwerpunktverschiebung, indem Sie die Entfernung, die der Zellschwerpunkt in Pixeln zurückgelegt hat, mit dem Umrechnungsfaktor multiplizieren, wobei 1 Pixel 0,4 μm entspricht. Die spezifische Umrechnung von Pixeln in Entfernung hängt von der Vergrößerung und der Kameraeinstellung des Systems ab.
6. Nachdem der Schwerpunktverschiebungswinkel und der Abstand bestimmt wurden, öffnen Sie eine Grafiksoftware, die Bilder von Polarkoordinaten erstellen kann.
7. Geben Sie den Schwerpunktverschiebungswinkel als θ-Maß und die zurückgelegte Strecke als Radius ein. Nutzen Sie die ANOVA, um auf Konfidenzintervalle von 95 % zu testen.
8. Plotten Sie die Ergebnisse und speichern Sie das Bild.

Ergebnisse

Der LightR-Src wird nach der in Abbildung 1A,B beschriebenen Strategie entworfen und generiert. Die biochemische Analyse von LightR-Src greift auf die Phosphorylierung der bekannten endogenen Src-Substrate p130Cas (Y249)²² und Paxillin (Y118)²³ als Reaktion auf blaues Licht bei 60 min kontinuierlicher Beleuchtung zu (Abbildung 2B). Bemerkenswert ist, dass keine Hintergrundaktivierung der Src-Kinase beobachtet wird, wenn LightR-Src nur 16-18 Stunden nach der Transfektion in der Dunkelheit exprimiert wird. Darüber hinaus induziert die katalytisch inaktive Mutante von LightR-Src mit D388R-Mutation keine Phosphorylierung des Src-Substrats, was zeigt, dass die Phosphorylierung durch aktives LightR-Src durchgeführt wird und nicht durch einen unspezifischen Effekt der Blaulichtbeleuchtung verursacht wird (Abbildung 2B). Unter Berücksichtigung von Berichten über oszillatorische Aktivität der Src^27-Kinase in lebenden Zellen untersuchten wir, ob LightR-Src so abgestimmt werden kann, dass es eine zyklische Aktivierung zeigt. Das ursprüngliche LightR-Src zeigte eine langsame Deaktivierungskinetik (Abbildung 2C), was zur Generierung einer neuen Variante, Fast-LightR-Src, führte, die die I85V-Mutation in beiden VVDs beherbergte. Abbildung 2D zeigt, dass Fast-LightR-Src eine deutlich schnellere Deaktivierungskinetik zeigt und innerhalb von 10 Minuten nach dem Ausschalten des Lichts vollständig inaktiviert wird, verglichen mit über einer Stunde bei LightR-Src. Mit FastLightR-Src konnten wir auch wiederholte Zyklen der Aktivierung/Inaktivierung erreichen (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse zeigen zusammengenommen die Fähigkeit des LightR-Tools, eine spezifische und streng kontrollierte Regulation der Src-Aktivität in lebenden Zellen zu erreichen.

Die Anwendung von FastLightR-Src ermöglicht es auch, die Auswirkungen einer transienten Src-Aktivierung auf die Zellmorphodynamik zu bewerten. Die Aktivierung von FastLightR-Src in HeLa-Zellen induziert die Zellausbreitung, und dieser Prozess stoppt, sobald FastLightR-Src inaktiviert wird. Nach der Aktivierung beobachteten wir die Translokation von FastLightR-Src aus dem perinukleären Kompartiment zu den fokalen Adhäsionen und der Plasmamembran, ein Verhalten, das die Wildtyp-Src-Kinase^11,12 zeigte. Leuchtende Zellen, die die katalytisch inaktive Mutante D388RLightR-Src exprimieren, zeigen keine solchen Ausbreitungseffekte (Abbildung 3B,C). Dies bestätigt weiter, dass FastLightR-Src ähnlich wie sein Wildtyp-Gegenstück funktioniert. Die lokale Beleuchtung einer Zellregion führt zu einer lokalisierten Aktivierung von FastLightR-Src, was durch eine lokale Akkumulation von LightR Src in fokaler Adhäsion und begleitet von der Bildung lokaler Membranvorsprünge (Abbildung 4B (i), (ii)) und einer Zellschwerpunktverschiebung (Abbildung 4C (i), (ii)) angezeigt wird, was zu einer Zellbewegung in Richtung Licht führt. Nachdem wir die Anwendung des LightR-Tools für die Regulation der Src-Kinase etabliert haben, zeigen wir den weitreichenden Nutzen von LightR, der sich auf die Regulation der bRaf-Kinase und der DNA-Rekombinase Cre erstreckt. Die Analyse von LightR-bRaf zeigt eine lichtinduzierte Phosphorylierung des endogenen Substrats von bRaf, MEK1, und eine nachgeschaltete Phosphorylierung von ERK1/2-Kinasen^24,25 auf einem Niveau, das mit dem der konstitutiv aktiven bRaf-Mutante (V600E) vergleichbar ist (Abbildung 5A). Umgekehrt zeigt das katalytisch inaktive D575RLightR-bRaf keine MEK1- und ERK1/2-Phosphorylierung, vergleichbar mit unbeleuchteten LightR-bRaf-Proben, was die Spezifität der LightR-bRaf-Regulation bestätigt. Die Bildgebung von lebenden Zellen zeigte, dass wiederholte Zyklen der FastLightR-bRaf-Aktivierung/-Inaktivierung eine wiederholte Translokation von ERK2 in und aus dem Zellkern induzieren, was mit den bekannten Ergebnissen der bRaf-Aktivierung bestätigt²⁸ (Abbildung 5B). Die Aktivierung von LightR-Cre führt zur erfolgreichen Rekombination eines Reporter-mCherry-Gens, was die Anwendbarkeit von LightR auf verschiedene Enzymklassen demonstriert (Abbildung 5C).

Abbildung 1: Entwicklungsstrategie des LightR-Ansatzes. (A) Kristallstrukturen von zwei Vivid-Monomeren im dunklen Zustand (PDB: 2PD7) und des Dimers im beleuchteten Zustand (PDB: 3RH8). (B) Cartoon-Darstellung des LightR-Designs. Zwei tandemartig verbundene VVD-Photorezeptoren, die in die katalytische Domäne eingefügt sind, stören die katalytische Aktivität des Proteins im Dunkeln. Die Dimerisierung von VVD als Reaktion auf blaues Licht stellt die Proteinaktivität wieder her. (C) Kristallstrukturen von (i) Src (PDB 1Y57) und (ii) bRaf (PDB 4MNF) katalytischen Domänen. (ii) Struktur der Cre-Rekombinase (PDB 1MA7). Gelbe Pfeile zeigen die LightR-Insertionsstelle an und zeigen die substituierte Aminosäure an. (D) Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie für die Insertion der LightR-Domäne in eine Zielenzymsequenz¹⁹. In Schritt 1 werden speziell entwickelte Primer für die PCR-Synthese eines LightR-Fragments verwendet, das vor und nach der Insertionsstelle von Annealing-Stellen im Zielgen flankiert wird. In Schritt 2 wird gezeigt, dass das so erzeugte LightR-Fragment als "Megaprimer" für die Insertion von LightR in das Zielenzymgen durch Quick-change-ortsgerichtete Mutagenese verwendet wird. Die Tafeln A-C wurden mit Genehmigung von Shaaya et ^al.10 angepasst und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Biochemische Charakterisierung von manipulierten LightR-Proteinen. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls zur biochemischen Charakterisierung von LightR Src. (B) LinXE-Zellen, die transient das LightR Src-Konstrukt exprimieren und ein mCherry- und ein myc-Tag am C-Terminus tragen, wurden unter Verwendung eines 465-nm-LED-Aufbaus 60 Minuten lang kontinuierlich mit blauem Licht beleuchtet. Zelllysate wurden auf Phosphorylierung von Src-Substraten, Paxillin und p130Cas untersucht. Die Ergebnisse des Western Blots zeigen die Phosphorylierung von endogenem Paxillin und p130Cas als Reaktion auf die Aktivierung von LightR-Src in lebenden Zellen. (C,D) LinXE-Zellen, die die angezeigten LightR-Src-Konstrukte transient exprimierten und am C-Terminus einen Tandem-mCherry-myc-Tag trugen, wurden kontinuierlich für bestimmte Zeiten (0 min und 30 min) blauem Licht ausgesetzt und dann für angegebene Zeiträume im Dunkeln platziert. Zelllysate wurden auf Phosphorylierung von Src-Substraten untersucht, was den Vergleich der Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik zwischen (C) LightR-Src und (D) FastLightR-Src zeigt. (E) LinXE-Zellen, die die angezeigten LightR-Src-Konstrukte transient exprimierten und am C-Terminus den Tandem-mCherry-myc-Tag trugen, wurden kontinuierlich 20 Minuten lang blauem Licht ausgesetzt, gefolgt von wiederholter Inkubation im Dunkeln für 10 Minuten und im Licht für 20 Minuten. Zelllysate wurden gesammelt und auf Phosphorylierung von Src-Substraten untersucht, was die Effizienz des Src-Kinase-Zyklus zwischen Aktivierungs- und Inaktivierungszuständen zeigt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Die Zahlen, die neben den Western-Blot-Feldern B-E angezeigt werden, stellen die Molekulargewichte der Proteine dar, gemessen in Kilodalton (kDa). Die Tafeln B-E wurden mit Genehmigung von Shaaya et ^al.10 angepasst und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Globale und zeitliche Beleuchtungssteuerung und Einfluss auf die FastLightR-Src-Aktivität. (A) Karikaturdarstellung des experimentellen Schemas der globalen und zeitlichen zyklischen Beleuchtung und der anschließenden Datenanalysen. (B,C) Die Regulation der Zellmorphologie und der FastLightR-Src-Lokalisierung durch blaues Licht wird in repräsentativen Bildern von HeLa-Zellen dargestellt, die aus einer Zeitrafferserie mit Hilfe der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden. Diese Zellen exprimierten vorübergehend FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 Zellen) oder katalytisch inaktives D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 Zellen) zusammen mit Stargazin-iRFP670 (Plasmamembranmarker). Die Bildgebung von lebenden Zellen wurde im Minutentakt durchgeführt, während die Zellen global mit blauem Licht beleuchtet wurden (blaue Umrisse). (B) Gelbe Pfeile markieren die Lokalisierung von FastLightR-Src an Strukturen, die fokalen Adhäsionen ähneln. Die Bilder wurden aus einer Zeitrafferserie von HeLa-Zellen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie gewonnen. (C) Die Quantifizierung der Veränderungen in der Zellfläche, die durch die Aktivierung von FastLightR-Src vs. D388RLightR-Src induziert werden, ist auf jedem Panel dargestellt. Das Beleuchtungsfenster wird als blaue Rechtecke angezeigt. Die Diagramme stellen mittlere ± 90 %-Konfidenzintervalle dar. Die Panels B und C wurden mit Genehmigung von Shaaya et ^al.10 angepasst und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kontrolle der lokalen subzellulären Beleuchtung und Einfluss auf die FastLightR-Src-Aktivität. (A) Karikaturdarstellung des experimentellen Schemas der lokalen subzellulären Beleuchtungssteuerung. (B) (i) Zeitraffersequenz zur Darstellung einer HeLa-Zelle, die FastLightR-Src-mCherry exprimiert und lokal mit blauem Licht beleuchtet wird (dargestellt durch einen blauen Kreis). Die Bilder wurden jede Minute mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (60-fach-Objektiv) aufgenommen. Die Bilder werden als invertierte Kontrastbilder dargestellt, die in bestimmten Zeitintervallen aufgenommen wurden. (ii) Zellprojektionsbilder, die Vorsprünge zeigen, die in bestimmten Zeitintervallen gebildet wurden. Die Schwellenwertbestimmung und Maskierung der Zellmorphologie über den experimentellen Zeitrahmen stellt die Plattform zur Analyse der Zellausbreitung und der Zellranddynamik dar. Der angegebene beleuchtete Bereich der Zelle wird durch einen blauen Kreis umrandet. (C) (i) Polardiagramm für Zellen, die den Migrationsabstand (d) und den Abweichungswinkel (θ) des Schwerpunkts relativ zur lokalen Blaulichtbeleuchtung darstellen. Schwarze Punkte stellen einzelne HeLa-Zellen dar, die katalytisch inaktives D388RLightR-Src (N = 6 Zellen) oder FastLightR-Src (N = 10 Zellen) exprimieren. (ii) Schematische Darstellung der Schwerpunktverschiebungsstrecke (d), die der Schwerpunkt der Zelle von der Einleitung (1) bis zum Abschluss (2) der lokalen Blaulichtstimulation zurücklegt. Der Abweichungswinkel (θ) gibt das Ausmaß der Divergenz der Schwerpunktbewegung der Zelle von der Position des blauen Lichts an. Die hellgraue Schattierung zeigt die Region, die von der Zelle als Reaktion auf die lokale FastLightR-Src-Stimulation hervorgetreten ist. Der angegebene beleuchtete Bereich der Zelle wird durch einen durchgehenden blauen Kreis angezeigt. Die Panels B und C wurden von Shaaya et ^al.10 adaptiert und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Breite Anwendbarkeit des LightR-Ansatzes. (a) Regulierung von LightR-bRaf. LinXE-Zellen, die transient LightR-bRaf-Venus, katalytisch inaktive D575R LightR-bRaf Venus oder konstitutiv aktive bRaf (V600E)-Venus exprimieren, wurden für den angegebenen Zeitraum kontinuierlichem blauem Licht ausgesetzt. Zelllysate wurden auf die Phosphorylierung der angezeigten Proteine untersucht. (B) Repräsentative Bilder, die aus einer Zeitrafferreihe von Lebendzell-Bildgebung mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden, veranschaulichen die Regulation der globalen Blaulichtantwort in LinXE-Zellen, die transient FastLightR-bRaf-Venus und mCherry-ERK2 koexprimieren. Diese Zellen wurden global mit blauem Licht beleuchtet (50 ms Impulse pro Sekunde, 50 Impulse pro Minute) für eine bestimmte Zeit, die blau umrandet ist. Die Bildgebung von mCherry-ERK2 in lebenden Zellen wurde jede Minute durchgeführt. Gelbe Pfeile markieren die Stadien der nuklearen ERK2-Lokalisierung, die durch die Blaulichtaktivierung von technisch hergestelltem bRaf induziert werden. (C) LinXE-Zellen wurden transient mit einem Floxed-stop-mCherry-Reporter und LightR-Cre-iRFP670 co-transfiziert. Die Zellen wurden bis zu 8 Stunden lang entweder dunklen Bedingungen oder pulsierendem blauem Licht (2 s an, 10 s aus) ausgesetzt. Die Bilder für alle Zeitpunkte jedes Kanals wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (10-fach-Objektiv) bei identischen Einstellungen aufgenommen und auf konsistente Helligkeits- und Kontrastwerte angepasst, um den Vergleich der Proteinexpressionsniveaus zwischen den Proben zu erleichtern. Das Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt und führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die Abbildung wurde von Shaaya et ^al.10 übernommen und modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1: LightR-Sequenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Beschreibung der LightR-Insertionsstellen und Checkliste für das LightR-Protein-Design. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Primer für das Klonen von LightR. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Transfektionsbedingungen für die biochemische Analyse der LightR-Protein-Aktivität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 5: Transfektionsbedingungen für die bildgebende Analyse der LightR-Protein-Aktivität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Gepulste Beleuchtung mit integrierter Entwicklungsumgebung (IDE). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Einstellungen für die Mikroskopbeleuchtung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Unsere Studie stellt einen optogenetischen Ansatz zur Untersuchung verschiedener Signalwege vor und zeigt seine breite Anwendbarkeit bei der Beantwortung verschiedener biologischer Fragestellungen. Das LightR-Werkzeugsystem bietet mehrere wesentliche Vorteile: (1) Allosterische Regulation der Proteinaktivität, (2) Enge zeitliche Kontrolle der Aktivität, die abgestimmt werden kann, um unterschiedliche Kinetiken der Aktivierung und Inaktivierung zu erreichen, (3) Räumliche Auflösung der Aktivität auf subzellulärer Ebene, (4) Spezifität der Signalmodulation und der biologischen Aktivität und (5) Breites Spektrum der Anwendbarkeit auf verschiedene Zielproteine. Bemerkenswert ist, dass LightR all diese Vorteile auf einzigartige Weise in einem einzigen Tool integriert und damit einen bedeutenden Schritt nach vorne darstellt.

Die Bauweise von LightR als allosterischer Schalter bietet mehrere Vorteile. Die Fähigkeit von LightR, die Proteinaktivität zu kontrollieren, wenn es in eine kleine flexible Schleife eingeführt wird, bietet eine beträchtliche Vielseitigkeit für die Anwendung auf verschiedenen Proteinen mit unterschiedlichen Strukturen und Funktionen. Da es sich um einen allosterischen Schalter handelt, reguliert LightR nur die Zieldomäne des interessierenden Proteins und beeinflusst die anderen Domänen des Proteins nicht. Daher ermöglicht diese Methode eine spezifische Regulation der Aktivität, ohne wesentliche Funktionen des Proteins zu beeinträchtigen, wie z.B. Wechselwirkungen mit seinen Bindungspartnern oder die native Lokalisierung in den Zellen. Zwei-Komponenten-Optogenetik-Systeme wurden erfolgreich zur Regulation der Proteinlokalisierung, von Wechselwirkungen oder anderen essentiellen Funktionen eingesetzt, indem sie lichtvermittelte Kontrolle der Homo- oder Heterodimerisierung nutzten 29,30,31,32,33,34,35. Diese Systeme erfordern jedoch oft eine optimierte äquimolare Expression von zwei Proteinen, was ihre Anwendung erschwert. Die allosterische Regulation mit dem LightR-System wird innerhalb eines einzigen Proteins erreicht und bietet somit einen viel vielseitigeren Ansatz für die Abfrage der Zellsignalisierung.

Die breite Anwendbarkeit des LightR-Schalters auf verschiedene Proteinklassen wird zum Teil durch die Optimierung verschiedener Module innerhalb der LightR-Domäne erreicht. Die Linker, die LightR mit dem interessierenden Protein verbinden, und der Linker, der zwei VVD-Domänen innerhalb von LightR verbindet (Inter-VVD-Linker), können die Effizienz der Regulation beeinflussen. Die Wahl des inter-VVD flexible linker (GGS)4G(GGS)3 bietet ausreichend Flexibilität und Länge, um die Assoziation und Dissoziation der VVD-Monomere innerhalb der LightR-Domäne zu gewährleisten. Dieser Linker hat bisher die erfolgreiche Regulation aller Zielproteine sichergestellt. In Fällen, in denen die LightR-Domäne das Protein im Dunkeln nicht ausreichend inaktiviert, kann jedoch ein starrerer Linker eingeführt werden, der die VVD-Domänen weiter auseinander hält, um die Öffnung der LightR-Klemme zu verbessern und das Enzym inaktiv zu halten. Der Linker sollte immer noch ausreichend flexibel sein, um eine Dimerisierung der VVDs und eine Aktivierung des Zielproteins zu ermöglichen. Um LightR mit dem interessierenden Protein zu verbinden, verwenden wir kurze flexible Linker, GPGGSGG und GSGGPG, die an die N- und C-Termini der LightR-Domäne angehängt werden. Sie bieten eine ausreichende Flexibilität in der Verbindung und verhindern so eine irreversible Störung des Zielproteins. Dennoch sind sie kurz genug, um eine Verzerrung des Zielproteins im Dunkeln zu ermöglichen und gleichzeitig die Wiederherstellung der Proteinfunktion bei Licht zu erleichtern. Diese Linker unterstützen die Regulation durch LightR für viele Proteinanwendungen. In bestimmten Fällen, in denen diese Linker möglicherweise keine ausreichende Inaktivierung des Proteins im Dunkeln bieten, könnte eine Verkürzung der Linker jedoch von Vorteil sein. Eine solche Linker-Verkürzung könnte die Flexibilität verringern und die Verzerrung verstärken, die durch die offene LightR-Klemme im Dunkeln verursacht wird, wodurch Undichtigkeiten minimiert werden. Dennoch könnte diese Anpassung die maximale Aktivität des Enzyms aufgrund möglicher struktureller Verzerrungen im beleuchteten Zustand beeinträchtigen. Alternativ könnte der Ersatz mehrerer Aminosäuren in der Insertionsschleife ähnliche Vorteile einer ausgewogenen Flexibilität in Fällen bieten, in denen die Konformationsinstabilität kein wesentliches Problem darstellt.

Viele kritische Signalprozesse werden transient aktiviert oder oszillatorisch geregelt 36,37,38,39,40,41,42,43. Die Abstimmbarkeit des LightR-Tools ermöglicht es uns, komplexe Signalmuster nachzuahmen und bietet somit einen leistungsfähigen Ansatz für die Abfrage zeitlich gesteuerter biologischer Prozesse. Wir erreichen dies, indem wir die Off-Kinetik von LightR durch die Einführung der I85V-Mutation in beide VVD-Domänen modulieren. Diese Mutation reduziert die Halbwertszeit von VVD-Dimer im dunklen Zustand von 18.000 s auf 780 s¹⁹ und ermöglicht so eine schnellere Inaktivierung im FastLightR-Enzym.

Die schnelle Inaktivierungskinetik ermöglicht auch die Regulierung der Proteinaktivität mit subzellulärer Auflösung. Die LightR-Enzyme mit langsamer Kinetik könnten es schwierig machen, die Auswirkungen der subzellulären Aktivierung aufgrund der intrazellulären Diffusion des aktivierten Konstrukts zu beobachten. Mit der Fast-off-Kinetik wird jedes FastLightR-Enzym, das über den Bereich der lokalen Beleuchtung hinaus diffundiert, schnell inaktiviert. Durch die gezielte Aktivierung bestimmter subzellulärer Regionen können Forschende Einblicke in die lokalen Funktionen der Proteine gewinnen, um ihren Beitrag zu den komplexen zellulären Signalwegen und Signalnetzwerken besser zu verstehen.

Während FastLightRs von unschätzbarem Wert für die räumlich und zeitlich begrenzte optische Kontrolle von Proteinaktivitäten innerhalb von Zellen sind, gibt es immer noch Anwendungen, bei denen eine langsame Kinetik wünschenswert sein könnte. LightR mit Slow-off-Kinetik könnte in Studien eingesetzt werden, in denen eine anhaltende und verstärkte Aktivität durch blaues Licht erforderlich ist. Diese Anwendungen erfordern nur seltene Beleuchtungsimpulse, um eine kontinuierliche optogenetische Aktivität aufrechtzuerhalten und so auch Probleme wie Phototoxizität zu minimieren. Für verschiedene Szenarien könnte eine breite Palette von kinetischen Modifikationen^{10, 18}allein oder im Tandem miteinander implementiert werden, um eine vielversprechende Lösung für die Abstimmung der LightR-Leistung zu bieten, um seine Anwendung für ein spezifisches Experiment zu optimieren.

Die Anwendbarkeit von LightR-Enzymen wird durch ihre Fähigkeit bestimmt, die biologische Funktion ihrer endogenen Gegenstücke nachzuahmen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, ihre Substratspezifität, ihre nachgeschaltete Signalübertragung und ihre subzelluläre Lokalisation zu bewerten. Die Spezifität der LightR-Src-Aktivität wird durch die Phosphorylierung von Src-Substraten, einschließlich Paxillin und p130Cas^22,23, bestätigt. FastLightR-Src pendelt unter zyklischer Beleuchtung zwischen der perinukleären Region und den fokalen Adhäsionen, was zu einer Zellausbreitung führt. Ein solches Phänomen ähnelt erfolgreich früheren Beobachtungen, die mit nativer Src-Kinase gemacht wurden, und bestätigt die Wirksamkeit des vorliegenden Werkzeugs bei der Erforschung der Src-Biologie 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf zeigt auch Spezifität beim Targeting von Signalkomplexen wie MEK- und ERK-Kinasen^24,25. Darüber hinaus zeigt FastLightR-bRaf zyklische Oszillationen des ERK-Kernshuttles als Reaktion auf blaues Licht, was eine bekannte Folge der bRaf-Aktivierung ist²⁸. Die Fähigkeit von LightR-Enzymen, die Funktionen endogener Proteine genau nachzuahmen, stellt ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung ihrer Funktion dar.

Die obige Diskussion zeigt die Fähigkeit von LightR-Kinasen, präzise zelluläre Signalwege innerhalb definierter zellulärer Kompartimente zu replizieren. In Übereinstimmung mit diesem Erfolg bei Kinasen dient LightR-Cre als illustratives Modell, das die Funktionalität der ursprünglichen Cre-Rekombinase demonstriert, die aus dem P1-Bakteriophagen gewonnen wurde. Die Cre-Rekombinase gehört zur Familie der ortsspezifischen Rekombinasen und erleichtert die Rekombination zwischen zwei Erkennungsstellen, die als loxP bezeichnet werden, auf der Ziel-DNA. Eine solche Rekombination führt zu einer DNA-Umlagerung durch ein Crossover-Ereignis. Basierend auf der Richtungsorientierung der loxP-Stelle auf der Ziel-DNA kann das Crossover-Ereignis entweder zur Deletion, Duplikation oder Translokation von chromosomalen Elementen führen⁴⁸. Cre-Rekombinase wurde häufig für die Generierung von In-vivo-Modellen der induzierbaren Genregulation verwendet^49,50. Andere spontane, chemisch induzierbare oder optogenetisch induzierbare Cre-Rekombinase-Systeme bieten jedoch eine begrenzte Kontrolle darüber, wann und wo die DNA-Rekombination im Tiermodell induziert wird. LightR-Cre überwindet diese Einschränkungen, indem es eine enge zeitliche und räumliche Kontrolle der DNA-Rekombination ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht uns die Abstimmbarkeit von LightR, unerwünschte undichte Aktivitäten zu eliminieren und die Regulierung von Cre mit hoher Präzision zu gewährleisten. Diese Fähigkeiten eröffnen neue Möglichkeiten für die Modellierung der Krankheitspathologie und die Entwicklung neuer Therapeutika.

Die präzise Regulation von LightR in Kinasen und DNA-Rekombinase liefert einen weiteren Beweis dafür, dass dieses Werkzeug mit der gleichen Strategie auf mehrere Proteine angewendet werden kann. Neben der Aktivierung verschiedener Enzymklassen kann LightR möglicherweise an andere Proteintypen gebunden werden, wobei die allosterische Modulation genutzt werden könnte, um Proteine in bestimmten subzellulären Regionen zu lokalisieren, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu induzieren, induzierbare Biosensoren mit blauem Licht zu entwickeln und vieles mehr. Aufgrund der allosterischen Vorteile des spezifischen Domain-Targetings können LightRs auch mit anderen chemogenetischen und optogenetischen Ansätzen im selben Protein kombiniert werden, um ein höheres Maß an Abstimmbarkeit für die Untersuchung biologischer Prozesse zu erreichen.

Wir haben LightR erfolgreich auf mehrere andere Proteine angewendet (Manuskripte in Vorbereitung). Trotz dieses Erfolgs kann die Entwicklung eines funktionsfähigen LightR-Proteins vor potenziellen Herausforderungen stehen, insbesondere bei der Auswahl einer geeigneten Insertionsstelle und der genauen Nachahmung der biologischen Funktion des Zielproteins. Wenn die Kristallstruktur nicht verfügbar ist, müssen sich die Forscher auf vorhergesagte Strukturen oder Aminosäuresequenzinformationen verlassen, was mehr Fehlerbehebung erfordert, um Proteine mit mehreren Insertionsstellen oder Aminosäuresubstitutionen zu entwickeln. Darüber hinaus muss die Aktivität des manipulierten Proteins fein abgestimmt werden, um die biologische Funktion innerhalb der Zelle genau zu replizieren. Der Erfolg dieser Experimente hängt von der präzisen funktionellen Mimikry des manipulierten Proteins mit seinem endogenen Homolog ab, das oft eine strenge Fehlersuche erfordert und je nach Zelltyp, Zielproteinklasse und -typ sowie der Stärke und Dauer der Aktivierung von blauem Licht variieren kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das LightR-System ein leistungsfähiges Werkzeug darstellt, um eine präzise raumzeitliche Kontrolle über die Proteinfunktion zu erreichen. Seine Robustheit, Abstimmbarkeit und Vielseitigkeit machen es von unschätzbarem Wert für die Untersuchung komplexer zellulärer Prozesse, die Entschlüsselung von Signalwegen und die Aufklärung genregulatorischer Mechanismen. Durch die beispiellose Kontrolle der Forscher über die Proteinaktivität verspricht das LightR-System, unser Verständnis grundlegender biologischer Prozesse zu verbessern und den Weg für innovative therapeutische Interventionen zu ebnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#1.5 Glas-Deckgläser 25 mm Rund	Warner Instruments	64-0715
1,5 mL Röhrchen	USA Wissenschaftlich	cc7682-3394
2x Laemmli Puffer			für 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml Glycerin, 52,5 ml 20 % SDS, 0,5 g Bromphenolblau, endgültiger pH-Wert 6,8
4-20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Puffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Mikroskop Ringlicht	Boli Optik	ML46241324	Blaue LED, 60 mm Durchmesser, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antikörper	Zellsignalisierung	9102
Anti-GAPDH Antikörper	Invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antikörper	Invitrogen	M11217
Anti-MEK	Zellsignalisierung	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-Paxillin-Zell-Signalweg		2542
Anti-Phospho-Erk 1/2 T202/Y204		9101
Anti-Phospho-pY249 p130Cas-Zell-Signalweg		4014
Anti-Phospho-Y118 Paxillin-Zell-Signalweg		2541
Anto-Phospho-S217/221 MEK-Zelle	Signalisierung	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A7816
Benchmark Fötales Kälberserum (FBS)	Gemini Bio-Produkte	100-106	Hitzeinaktiviert Triple 0,1 & Mikro; m sterilfiltriert
bRaf-V600E-Venus			Geschenk von Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Dinatrium)	Gold Biotechnologie	C-103-25
CellMask Deep Red Plasmamembranfarbstoff	Invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a-kompetente Zellen	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA-Leiter	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzym	NEB	R01765
DVB-T	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Clelands Reagenzien
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgen	#162155
Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfektionsreagenz	Promega	E2692	Transfektionsreagenz
Gel Grüne Nukleinsäure-Färbung	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Farbstoff Lila 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel-Extraktionskit	Thermo Scientific	K0692	Gel-Extraktions-Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Zellen	ATCC	CRL-11268
HeLa-Zellen	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relais	Digital Logger	DLI 705020645490	AC/DC Steuerrelais für Beleuchtung
Kanamycin Monosulfat	Gold Biotechnologie	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	LED-Panel-Lampensystem
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software zum Ausführen von CellGEO-Skripten
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis
Software MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineralöl	Sigma	M5310
MiniPrep Bausatz	Wahl der Gene	96-308
Mini-PROTEAN TGX Fertiggele 12 Well	Bio-Rad	4561085
Molekularbiologie Qualität Wasser	Corning	46-000-CV
Polychroitischer Multiband-Spiegel	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS ohne Ca und Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgen	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Geschenk aus dem Labor von Dr. Channing Der, UNC
PCR Röhrchen	labForce	1149Z65	0,2 mL 8-Streifen-Röhrchen und -Kappen, starre Streifen, einzeln angebrachte Domkappen
Phusion Plus DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primer	IDT
PVDF Membranen	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filterpapier Sandwiches
T0,25% Trypsin, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] Natrium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetat-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	Für die Elektrophorese
UPlanSApo 40x Mikroskop Objektiv	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	Für TTL-Schnittstelle
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100