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Methodenartikel

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

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DOI:

10.3791/67264

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27. September 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Zusammenfassung

Die intestinale Ischämie-Reperfusions-Schädigung (I/R) ist eine akute Erkrankung, die durch eine Gewebeschädigung gekennzeichnet ist, die aus einer eingeschränkten Durchblutung der Mesenterialgefäße resultiert und sowohl zu lokalen als auch zu systemischen Pathologien mit schlechter Prognose führt. Sowohl Ischämie als auch Reperfusion lösen eine Reihe von zellulären und molekularen Reaktionen aus, wobei Entzündungszellen als Schlüsselregulatoren der Pathologie dienen. Diese Wechselwirkungen mit dem ischämischen Endothel werden durch mehrere Adhäsionsrezeptoren vermittelt. Es wurden mehrere Tiermodelle etabliert, um diese Pathologie nachzuahmen und die beteiligten molekularen Signalwege zu untersuchen. In dieser Studie wird ein mikrochirurgisches Modell der I/R-Verletzung mit intravitaler Mikroskopie kombiniert, um das Rollen von Leukozyten, die Adhäsion und die Bildung von extrazellulären Fallen (NET) für Neutrophile sichtbar zu machen. Dieses Modell wird auf transgene Mäuse mit einem Mangel an endothelialem PAR1 (F2r) angewendet, um den Einfluss von PAR1 auf das Leukozytenrollen und die NET-Bildung 1 h nach der Ischämie und unmittelbar nach der Reperfusion zu bewerten. In vivo wurde die Acridinorange-Leukozytenfärbung eingesetzt, und die NETs wurden mit Hilfe einer Nukleinsäurefärbung visualisiert. Interessanterweise wurde eine verminderte Leukozytenadhäsion und NET-Bildung bei Mäusen beobachtet, denen der endotheliale PAR1-Rezeptor fehlte. Dieses Modell ermöglicht die in vivo Analyse von Schlüsselregulatoren, die an I/R-Verletzungen beteiligt sind.

Einleitung

Die akute mesenteriale Ischämie (AMI) ist eine seltene Pathologie1 mit hohem Mortalitätsrisiko2, die durch einen verminderten Blutfluss im Mesenterium aufgrund von Thromben in der Zöliakie-Achse oder der Arteria mesenterica superior oder inferior gekennzeichnet ist. In 60%-70% der Fälle sind akute Verschlüsse der Arteria mesenterica superior durch Thrombose oder Embolisation für eine akute Darmischämie verantwortlich3. Im Gegensatz dazu ist die mesenteriale Venenthrombose in 5-15% der Fälle für eine mesenteriale Ischämie verantwortlich, an der die Vena mesenterica superior und seltener die Vena mesenterica inferior beteiligtist 4. Die Hypoxie und Mangelernährung, die aus der Ischämie resultieren, führen zu Störungen des Energiestoffwechsels auf zellulärer Ebene5. Zum Beispiel aktiviert eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion mehrere Signalwege und setzt zelluläre Todesmechanismen in Gang6. Obwohl eine schnelle Reperfusion die Wiederherstellung des aeroben Stoffwechsels ermöglicht, führt die Wiederherstellung des Blutflusses in eine ischämische Region häufig zu ausgedehnten Gewebeverletzungen aufgrund der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)7, einer Kalziumüberladung8, einer endothelialen Dysfunktion9 und Entzündungsreaktionen10.

Viele experimentelle Tiermodelle, die einen vorübergehenden Gefäßverschluss der Arteria mesenterica superior verwenden, wurden etabliert, um die molekularen Mechanismen während der Ischämie-Reperfusion (I/R)-Verletzung aufzuklären11. Die Verwendung solcher Modelle in Kombination mit der Intravitalmikroskopie (IVM) ist grundlegend, um Einblicke in die zugrundeliegenden zellulären Wechselwirkungen und den Krankheitsverlauf zu gewinnen11. Kurz nach der Ischämie wird eine Dysfunktion der Darmbarriere beobachtet12, wobei das Epithel seine Integritätverliert 13, was zu einer bakteriellen Translokation an extraintestinale Stellen wie die mesenterialen Lymphknoten, die Milz, die Leber und die Niereführt 12,14. Die Reperfusion verschlimmert die Schleimhautschädigung weiter15. Eine Entzündungsreaktion in den Arteriolen äußert sich durch die rollende und feste Adhäsion von Leukozyten an der Endothelzellschicht, die von Molekülen wie L-Selektin16, P-Selektin (CD62P)17, Blutplättchen GPIIb/IIIa und Fibrinogen18 abhängig ist. Interessanterweise wird die Adhäsion von Leukozyten an mesenterialen Venolen durch das Vorhandensein der Darmmikrobiota19 und des Toll-like-Rezeptors 4-Signalwegs10 beeinflusst. I/R-Schädigung löst auch die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NET) aus10. Die therapeutische Ausrichtung auf die extrazelluläre DNA, die von aktivierten Leukozyten wie Neutrophilen stammt, verbessert das Ergebnis der intestinalen I/R-Schädigung20. In der Leber wird die I/R-Schädigung durch residente Mikrophagengezündet 21, und die microRNA-Hemmung schwächt die Apoptosedeutlich ab 22. Bemerkenswert ist, dass eine I/R-Schädigung im Mesenterium zu einer Darmdysbiose führt, die reversibel ist und nach Revaskularisation verschwindet23.

Das Endothel wird auch durch die schädigenden Auswirkungen von I/R-Verletzungen beeinflusst, wobei ROS eine entscheidende Rolle in diesem Prozess spielt24. Es werden Leukozytenadhäsion an der Endothelzellschicht, Endothelschäden und Veränderungen des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels beobachtet9. Die beteiligten molekularen Signalwege sind jedoch noch nicht vollständig erforscht.

Der Protease-aktivierte Rezeptor 1 (PAR1, F2r) ist ein Membranrezeptor, der von einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Endothelzellen, exprimiert wird und bei entzündlichen Zuständen aktiviert wird25. Seine Aktivierung erfolgt, wenn Serinproteasen den Rezeptor am N-Terminus spalten und den angebundenen Liganden freilegen, der wiederum den Rezeptor aktiviert, indem er an die zweite extrazelluläre Schleife des Molekülsbindet 26. Der endotheliale Protein-C-Rezeptor (EPCR)-PAR1-Signalweg beeinflusst die endotheliale NO-Homöostase und erleichtert die Wiederherstellung des Blutflusses bei peripherer Ischämie27.

In dieser Studie wurde die I/R-Schädigung auf ein genetisches Mausmodell angewendet, das durch einen endothelzellspezifischen PAR1-Mangel gekennzeichnet ist, um das Rollen, die Adhäsion und die NET-Bildung von Leukozyten sichtbar zu machen. Die Kombination aus einem genetischen Mausmodell und intravitaler Mikroskopie nach I/R-Mikrochirurgie liefert wertvolle Erkenntnisse, indem sie die spezifischen Zelltypen aufzeigt, die am Krankheitsverlauf beteiligt sind. Die Anwendung der I/R-Schädigung auf genetische Mausmodelle ist entscheidend für die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele, die zur Verbesserung des Krankheitsverlaufs eingesetzt werden können. Darüber hinaus wurde die Bedeutung des endothelialen PAR1 für die NETose gezeigt.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Mäusen wurden vom örtlichen Ausschuss für das Tierrecht (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Deutschland; G21-1-041). 6-8 Wochen altes Rüde und Hündchen B6. Für die Studie wurden FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc-Mäuse verwendet. Die endothelzellspezifische Regulation von F2r (PAR1) erfolgt über den VE-Cadherin Cre-Promotor28. In dieser Studie zeigten flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) eine reduzierte F2r (PAR1)-Expression auf Endothelzellen, und flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) exprimieren normale endotheliale F2r (PAR1) -Spiegel. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung auf die Operation

  1. Sterilisieren Sie die notwendigen chirurgischen Instrumente (extra schmale Schere gerade, Pinzette, Gefäßklemme usw.).
  2. Bereiten Sie das Anästhesiesystem auf Sauerstoff- und Isofluranbasis mit einem Nasenkonus und einer Heizplatte vor.

2. Vorbereitung der Tiere

  1. Wiegen Sie das Tier.
  2. Führen Sie eine Anästhesie durch: Anästhesie von Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Lösung, die Midazolam (5 mg/kg), Medetomidin (0,5 mg/ml) und Fentanyl (0,5 mg/kg) enthält (gemäß institutionell zugelassenen Protokollen).
  3. Entfernen Sie Haare im Operationsbereich von Hals und Bauch mit einem Elektrorasierer für Kleintiere.
  4. Positionieren Sie die Maus in dorsaler Liege auf dem Heizkissen und verbinden Sie sie über einen Nasenkonus mit dem Sauerstoffsystem. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus mit chirurgischem Klebeband auf einem beheizten Pad. Stellen Sie sicher, dass die Latex-Nasenmembran fest über dem Kopf der Maus sitzt. Überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres rektal mit einem nagetierspezifischen Thermometer.
  5. Tragen Sie Haarentfernungscreme auf, um alle verbleibenden Haare aus dem chirurgischen Bereich des Halses zu entfernen, und wischen Sie die Haut des Operationsbereichs mit 70% Ethanol ab.
  6. Führen Sie einen Zehenquetschtest (Pedalreflex) durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist.

3. Chirurgischer Eingriff

  1. Katheterimplantation in die Halsvene
    1. Machen Sie einen Querschnitt (~0,5 cm) über der Luftröhre, entfernen Sie die Haut, die den Hals bedeckt, und isolieren Sie die rechte Halsvene.
    2. Verwenden Sie einen etwa 5 cm langen Seidenfaden, schließen Sie das distale Ende der Vene und fixieren Sie ihn mit einer chirurgischen Zange. Legen Sie drei Seidenfäden etwa 2 cm unterhalb der Vene: einen nahe dem distalen Ende und zwei nahe dem proximalen Ende der Halsvene. Binden Sie einen chirurgischen Knoten, aber schließen Sie das Gefäß nicht.
    3. Bereiten Sie einen Polyethylen-Katheter (0,28 mm ID, 0,61 mm OD) vor, der mit 0,9 % NaCl gefüllt und mit einer 1-ml-Spritze verschlossen wird. Schneiden Sie mit einer Schere ein Loch zwischen dem zweiten und dritten Knoten und implantieren Sie den Katheter in die Halsvene. Aspirieren Sie die Spritze, um sicherzustellen, dass Blut im Katheter vorhanden ist.
    4. Fixieren Sie den Katheter in der Vene, indem Sie den Seidenfaden binden und sicherstellen, dass er sicher befestigt ist. Verwenden Sie medizinisches Klebeband, um die Spritze zu sichern.
    5. Bereiten Sie Acridin-Orange vor: Verdünnen Sie 1:4 eine 2 mg/ml-Stammlösung mit steriler Kochsalzlösung (0,5 mg/ml-Endkonzentration) in einer 1-ml-Spritze. Halten Sie die Spritze im Dunkeln und injizieren Sie 50 μl in die Maus.
    6. Nukleinsäurefarbstoff herstellen: Eine 5 mM Stammlösung 1:1000 mit steriler Kochsalzlösung (5 μM Endkonzentration) in einer 1 mL Spritze verdünnen. Halten Sie die Spritze im Dunkeln und injizieren Sie 50 μl in die Maus.
    7. Injizieren Sie in vivo Acridinorange (50 μg/μl, 50 μl pro Maus) über den Venenkatheter jugularis, um gefärbte Leukozyten und einen extrazellulären DNA-Fluoreszenzfarbstoff sichtbar zu machen, ähnlich wie bei der Färbung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) (5 μM, 50 μl pro Maus). NETs und Leukozyten werden gleichzeitig abgebildet.
  2. Modell der mesenterialen I/R-Verletzung
    1. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit 70% Ethanol.
    2. Führen Sie eine 3-5 cm lange Laparotomie entlang der Linea alba mit einer chirurgischen Schere durch.
    3. Entfernen Sie mit zwei mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig den Darm und identifizieren Sie eine Stelle mit minimaler Fettbedeckung. Dünndarmäste auf einen schwarzen Teig legen, um das Hintergrundsignal zu reduzieren.
    4. Erfassen Sie die Videos vor I/R (vor Ischämie).
    5. Machen Sie eine Feuchtigkeitskompresse mit NaCl und legen Sie den Darm hinein. Stellen Sie sicher, dass der Darm während Schritt 5.6 von der Kompresse umgeben ist und die Feuchtigkeit erhalten bleibt.
    6. Die Arteria mesenterica superior mit einer kleinen Gefäßklemme verschließen.
    7. Schieben Sie den Darm mit mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig in die Bauchhöhle zurück und verwenden Sie eine 7-0-Naht, um die Bauchdecke zu schließen, um Feuchtigkeits- und Temperaturverlust zu vermeiden. Halten Sie die Ischämie 60 Minuten lang aufrecht und überprüfen Sie die Anästhesie mindestens alle 20 Minuten.
    8. Nach 1 h die Reperfusion einleiten, indem Sie die Klemme entfernen.
      HINWEIS: Die korrekte Durchführung des Ischämie-Eingriffs führt zu einer sichtbaren Veränderung. Anfangs erscheint die betroffene Stelle aufgrund der mangelnden Durchblutung blass oder weiß. Nach dem Entfernen der Klemme kehrt der Blutfluss allmählich in den ischämischen Bereich zurück, der seine normale Farbe wieder annimmt, was einen erfolgreichen Verschluss bedeutet. Es ist zwingend erforderlich, die Maus während des gesamten Ischämiestadiums kontinuierlich genau zu beobachten.
    9. Tragen Sie nach der ischämischen Phase einige Tropfen Kochsalzlösung auf den abgeschnittenen Bereich auf und entfernen Sie dann vorsichtig die mikrovaskulären Clips mit einem Clip-Applier.
    10. Entfernen Sie mit kochsalzbefeuchteten Wattestäbchen vorsichtig wieder den Darm, positionieren Sie die kleinen Äste der Vene auf einem schwarzen Teig, injizieren Sie erneut 50 μl Acridin-Orange und nehmen Sie die Videos derselben Vene an der gleichen Stelle auf (Post-Ischämie).

4. Intravitale Hochgeschwindigkeits-Video-Epifluoreszenzmikroskopie

  1. Visualisieren Sie Leukozyten und NETs mit einem Hochgeschwindigkeits-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Langstreckenkondensor, einem Monochromator, einem 10-fach-Wasserimmersionsobjektiv und einer ladungsgekoppelten Gerätekamera ausgestattet ist. Die Bildaufnahme wurde mit einer Belichtungszeit von 30 ms und Alexa Fluor 488 (495/519) und Rhodaminrot (570/590) Filtern durchgeführt.
  2. Verwenden Sie Bildgebungssoftware für die Bilderfassung und -analyse.
  3. Quantifizieren Sie die Zellrekrutierung innerhalb einer interessierenden Region von 0,06 mm².
  4. Quantifizieren Sie adhärente Leukozyten als Zellen, die für einen Beobachtungszeitraum von 20 s stationär oder an die Endothelschleimhaut gebunden bleiben.
  5. Identifizieren Sie NETs als extrazelluläre Strukturen, die sowohl mit Leukozyten- als auch mit extrazellulären Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
  6. Einschläferung der Tiere durch Gebärmutterhalsluxation am Ende des Versuchs (nach institutionell anerkannten Protokollen).

5. Isolierung von Leber-Endothelzellen (LEC) und quantitative RT-PCR

  1. Isolierung von LECs durch magnetische Zellsortierung (MACS)29.
  2. Isolieren Sie die Gesamt-RNA.
  3. Durchführung der komplementären DNA-Synthese (cDNA)27 durch Mischen von 2 μg Gesamt-RNA mit 2 μl RT-Puffer, 0,8 μl dNTP-Mix, 2 μl RT-Zufallsprimern, 1 μl Reverser Transkriptase und 4,2 μl steril destilliertem H2O.
  4. Die cDNA-Transkription wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 25 °C für 10 Minuten, 37 °C für 120 Minuten, 85 °C für 5 Minuten.
  5. Verwenden Sie 20 ng cDNA für die qPCR.
  6. Verwenden Sie die folgenden Grundierungen: F2r (vorwärts): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (Rückwärts): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (vorne): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (Rückwärts): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. Es sind folgende Bedingungen zu verwenden: 95 °C 30 s, 45 Zyklen von (95 °C für 10 s, 60 °C für 25 s), 60 °C bis 95 °C für 6 s mit ΔΤ 1 °C.

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Ergebnisse

Um die endothelzellabhängigen Effekte auf das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten sowie auf die NET-Bildung zu untersuchen, wurde zunächst die Wirksamkeit des VE-Cadherin Cre induzierbaren F2r-Mangels in Endothelzellen untersucht. Die magnetische Zellsortierung wurde eingesetzt, um hepatische Endothelzellen zu isolieren. Anschließend wurde RNA isoliert, gefolgt von einer quantitativen real-time PCR (qRT-PCR). Die F2rΔEC-Mäuse , in denen die Cre-Rekombinase, die unter der Kontrolle des VE-C...

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Diskussion

Die mesenteriale I/R-Schädigung in Kombination mit intravitaler Mikroskopie wurde auf ein genetisches Mausmodell des F2r (PAR1)-Mangels in Endothelzellen für die in vivo Analyse von Leukozyten und NETs nach 1 h Ischämie angewendet. Das mesenteriale I/R-Verletzungsmodell wird häufig bei Nagetieren verwendet, bei denen sowohl die Ischämie- als auch die Reperfusionszeiten von Minuten bis zu mehreren Stunden variieren23,31

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Offenlegungen

Die Autoren legen keinen Interessenkonflikt offen.

Danksagungen

C.R. bedankt sich für die Förderung durch die Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz und ReALity (Projekt MORE), den BMBF-Cluster4Future CurATime (Projekt MicrobAIome; 03ZU1202CA), die Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) und den Innovationsfonds "Mikrobiom" der Deutschen Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) (81X2210129). C.R. ist Wissenschaftler am Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK). C.R. ist Mitglied des Centrums für Translationale Vaskuläre Biologie (CTVB), des Forschungszentrums für Immuntherapie (FZI) und des Potentialbereichs EXPOHEALTH an der Johannes Gutenberg-Universität Mainz. C.R. ist Mitglied der DFG-Forschergruppe 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. wurde mit einem Fellowship des Gutenberg Research College an der Johannes Gutenberg-Universität Mainz ausgezeichnet. K.K. wird durch das Exzellenzprogramm "Förderung von Wissenschaftlerinnen" des DZHK gefördert und ist Mitglied des Jungen DZHK. Z.G und O.D. sind Doktoranden an der Mainz Research School of Translational Biomedicine (TransMed).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acridin-OrangeSigma-Aldrich   A-6014
96-Well-Platte Multiplikation PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Anästhesiesysteme für NagetiereGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
schwarzer TeigStaedtlerModelliermasse
CD146 Mikrokügelchen, MausMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3Software
Kamera für ladungsgekoppelte GeräteHamamatsu PhotonicsORCA-R2Kamera
WattestäbchenBö ttger09-119-9100
Gebogener Hämostat 125mm/5"Indigo Instruments 22466
EnthaarungscremeBaleanicht anwendbar
Dorbene Vetzoetis
Dumont PinzetteFine Science Tools11251-35
Ethanol p.a. 99,5 %Roth5504.20
Extra schmale Schere – Straight/Sharp-Sharp/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Pinzette "Dumont #5" (Inox, Spitze 0.1mm, Länge 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpad Prism 10Software
Isofluran Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Leukofix Medical TapeBSNMedical0213600
Leberdissoziationskit, MausMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Trennsäulen MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 &Mikro; mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
NadelhalterFST12001-13
Nicht resorbierbares geflochtenes Seidennaht, Größe: 7/0, 91 Meter Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI FluoreszenzmikroskopOlympus
Mikroskop PCR für RöhrchenstreifenSarstedt72985002.00
PCR RöhrchendeckelSarstedt65989002.00
Plyethylen KatheterSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polypropylen 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Reverse Tanscription Kit (cDNA mit hoher Kapazität)Applied Biosystems4368813.00
Schulwaage KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
Federschere - seitlich abgewinkeltFST15006-09
StereomikroskopLeicaM50
Gerade Hämostaten 135mm/5.5"Indigo Instruments 22468
Spritze 1 mLBraun9166017V
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Temperaturregler TC-1000FMI F&oml; hr Medical Instruments GmbHnicht zutreffend
Gewebezange - 1x2 ZähneFST18057-14
GefäßklemmeFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480

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