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Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien

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DOI:

10.3791/67274

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20. September 2024

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1School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Zn2+-begrenzten Medien, Wachstumsgefäßen und Samenkulturen zur Produktion von Zn2+-begrenzten Ribosomen in Mykobakterien. Spuren von Zn2+ führen zu Zn2+-limitierendem Wachstum und wir beschreiben morphogene Merkmale, die als Bioindikatoren verwendet werden, um die Zn2+-Begrenzung in vitro im Modellbakterium Mycobacterium smegmatis und dem humanpathogenen M. tuberculosis zu verifizieren.

Zusammenfassung

Viele Bakterien bauen alternative Ribosomen unter Zn2+-limitierenden Wachstumsbedingungen auf, indem sie Zn2+-bindende ribosomale Proteine durch Zn2+-unabhängige Paraloge ersetzen. Die Definition eines Systems zur Untersuchung dieser alternativen Ribosomen hat sich als schwierig erwiesen, da Zn2+-Kontaminationen im Labor üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, werden manchmal Chelatbildner zu Wachstumsmedien hinzugefügt, aber dieser Ansatz verwirrt die biologische Reaktion auf eine allmähliche Zn2+-Limitierung und ist mit dem Ribosomenschlaf verbunden. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Anleitung zur Vorbereitung von Medien und Aussaatkulturen für ein Zn2+-begrenztes Wachstum ohne Zugabe von Chelatoren. Nach dieser Methode durchläuft das Modellbakterium, Mycobacterium smegmatis, eine Morphogenese, die auf alternative Ribosomen angewiesen ist. Da die Morphogenese beherrschbar ist und nur unter Zn2+-limitierenden Bedingungen auftritt, kann M. smegmatis als Bioindikator zur Verifizierung biologisch relevanter Wachstumsbedingungen verwendet werden. Drei Bioindikator-Phänotypen (Zelldichte, Zelllänge und Coenzym F420-Fluoreszenz), die auf eine Zn2+-Limitierung im Wildtyp hinweisen, werden beschrieben, und Veränderungen in diesen Bioindikatoren für eine Deletionsmutante, die keine alternativen Ribosomen bilden kann, werden skizziert. Da die Spurenkontamination von Zn2+ für jede Mediencharge schwer zu kontrollieren ist und eine genaue Quantifizierung von Zn2+ in jeder Medienvorbereitung übermäßig aufwändig ist, ist die Verfolgung dieses Bioindikator-Phänotyps ein zugänglicher Weg, um die Aufbereitung von Zn2+-begrenzten Wachstumsmedien zu validieren. Um geeignete Bedingungen für das Zn2+-begrenzende Wachstum und die alternative Ribosomenproduktion zu identifizieren, wurden Veränderungen in den Bioindikator-Phänotypen auch für Zn2+-kontaminierte oder starkZn 2+-abgereicherte Zubereitungen von Zn2+-begrenzten Medien profiliert. Weitere Details zum Erreichen eines Zn2+-limitierenden Wachstums und einer alternativen Ribosomenproduktion in M. tuberculosis werden zusammen mit dem zugehörigen Bioindikator-Phänotyp vorgestellt. Insgesamt werden die hier beschriebenen detaillierten Anweisungen und Bioindikator-Phänotypen dazu beitragen, die Produktion von translational aktiven alternativen Ribosomen in Mykobakterien zu standardisieren.

Einleitung

Zink-Ionen (Zn2+) sind ein essentieller Mikronährstoff und ein Standardbestandteil von mikrobiologischen Medien. Viele Bakterien ertragen jedoch eine Zn2+-Limitierung in der Umwelt, da Zn2+-limitierende Bedingungen weit verbreitet sind. soil1, marine2, und Nischen innerhalb der host3 sind oft Zn2+-begrenzt. Daher haben die meisten Bakterien Mechanismen entwickelt, um die Zn2+-Beschränkung zu überwinden und die zelluläre Funktion zu erhalten4. Systeme, die an der Aufrechterhaltung der Zn2+-Homöostase beteiligt sind, stehen unter strenger transkriptioneller Kontrolle5 und sind an der Abscheidung von Zn2+ unter Verwendung hochaffiner Zn2+-Importsysteme, der Mobilisierung zellulärer Zn2+-Reserven und dem Ersatz bestimmter Zn2+-bindender Proteine durch alternative Zn2+-unabhängige Paraloge6 beteiligt. Ein Beispiel für Letzteres sind Zn2+-unabhängige ribosomale Protein (RPs) Paraloge, die ein gemeinsames Merkmal von Zn2+-responsiven Regulons in Bakterien sind4. Diese hochdivergenten Zn2+-unabhängigen RPs unterscheiden sich von ihren Zn2+-bindenden Paralogen durch die Unterbrechung des Zn2+-bindenden CXXC-Motivs7. Mehr als die Hälfte der sequenzierten prokaryotischen Genome enthält mindestens ein Paar duplizierter RPs, wobei in vielen von ihnen ein RP Zn2+ bindet, während sein Paralog nicht class="xref">8 bindet. Während die C+/C-Notation (die das Vorhandensein/Fehlen des Cystein-reichen Zn2+-Bindungsmotivs anzeigt) häufig in Bezug auf diese paralogen RP-Paare verwendet wird7, wurden Zn2+-unabhängige RPs auch als alternative (Alt) Versionen der primären (Prim), Zn2+-bindenden RP-Paraloge beschrieben, da AltRPs als alternative RPs für die Ribosomenbiogenese im Zn2+ dienen-Eingeschränkter Zustand bei einigen Bakterien und es ist ein Schlüsselwort mit besserer Auffindbarkeit9,10,11.

Da die AltRP-Expression stark durch Zn2+ reguliert wird, ist es logisch anzunehmen, dass die AltRP-Expression angesichts der Zn2+-Limitierung funktionelle Redundanz zu Zn2+-abhängigen ribosomalen Proteinen bietet. In der Tat wurde diese Eigenschaft von AltRPs für das Modell-Bodenbakterium Bacillus subtilis demonstriert, bei dem das Wachstum während der Zn2+-Begrenzung durch Befreiung der Oberfläche PrimRP L31 und Ersatz durch das AltRP L31 gerettet wird12,13. Einige AltRPs sind jedoch paralog zu Kern-PrimRPs, z. B. S14, was bedeutet, dass ihr Einbau während der Ribosomenbiogenese erforderlich ist12,13. Der Wiederaufbau des Ribosoms mit AltRPs ist ein engagiertes, energieintensives Programm. Während diese Kern-AltRPs dazu dienen könnten, Zn2+ aus dem Ribosom zu befreien, ist es auch möglich, dass einige AltRPs in der Zn2+-begrenzten Umgebung eine zusätzliche Funktion entwickelt haben. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass AltRPs von ihren paralogen PrimRPs abweichen; Die Sequenzhomologie von AltRP-Genen ist bei Homologen in verschiedenen Spezies oft höher als bei der Zn2+-bindenden PrimRP-Gensequenz innerhalb derselben Spezies7,10. Da Gene, die für stark divergierende AltRPs kodieren, unter Zn2+-abhängiger transkriptioneller Kontrolle stehen, werden sie aus dem Selektionsdruck entfernt, der auf die streng regulierten und hochkonservierten ribosomalen Superoperonen ausgeübt wird14. Der entkoppelte Selektionsdruck auf die genetische Information, die für die ribosomale Maschinerie und die AltRPs kodiert, setzt diese RPs anderen Evolutionsverläufen aus als die homologen PrimRPs und könnte eine linienspezifische Evolution desselben AltRP in verschiedenen Bakterien ermöglichen10,15. Die weit verbreitete Existenz von AltRPs in Bakterien und die entkoppelte genetische Regulation dieser einzigartigen RPs wirft die interessante Frage auf, ob der Einbau von AltRPs in bakterielle Ribosomen AltRP-haltigen Ribosomen (Alt-Ribosomen) eine besondere Eigenschaft verleiht.

Mykobakterien sind eine ideale Gruppe von Bakterien, um die mechanistischen Eigenschaften von Alt-Ribosomen zu untersuchen. Erstens besitzen Mykobakterien ein hochkonserviertes AltRP-Operon, das vier Gene enthält, die für AltRPs kodieren: S14-2, S18-2, L28-2 und L33-28,9. Mykobakterielle AltRPs unterscheiden sich signifikant von ihren PrimRP-Paralogen; In allen vier PrimRP/AltRP-Paaren ist ein gegebenes AltRP-Gen über alle Mykobakterienarten hinweg ähnlicher als das PrimRP-Gen in derselben Spezies10. Die linienspezifische Evolution von AltRPs ist auch innerhalb von Mykobakterien offensichtlich, wie die AltRPs S18-2 und L28-2 in Mycobacterium tuberculosis und M. bovis zeigen, die einzigartige Sequenzen am C-Terminus enthalten, die in anderen Mykobakterien nicht vorhanden sind10. Zweitens enthält diese Gruppe hochgradig verwandter Bakterien nicht-pathogene und pathogene Mitglieder, die in verschiedenen Umgebungen leben, vom Boden (z. B. M. smegmatis) bis hin zu unzähligen Wirten: Mensch (z. B. M. tuberculosis), Rind (z. B. M. bovis), aquatisch (z. B. M. marinum) und Vogel (z. B. M. avium), um nur einige zu nennen. Die hochkonservierte Natur des altRP-Operons in Mykobakterien, die linienspezifische Evolution spezifischer AltRP-Gene und die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen Mitglieder dieser Gruppe existieren, bieten eine einzigartige Gelegenheit, die konservierte und linienspezifische Evolution der AltRP-Funktion und der mechanistischen Eigenschaften von Alt-Ribosomen zu analysieren. Trotz der Häufigkeit von AltRPs in prokaryotischen Genomen wurde die Rolle von AltRPs und Alt-Ribosomen nur in wenigen Bakterien untersucht9,10,11,12,13,16,17,18,19. Die Etablierung eines standardisierten Systems mit spezifischen Metriken zur Validierung von Zn2+-limitierenden Wachstumsbedingungen in Mykobakterien würde die experimentellen Ergebnisse verbessern und das Verständnis von Alt-Ribosomen im Bereich der Ribosomenforschung voranbringen.

Zn2+ ist ein Mikronährstoff; daher tragen Spuren von Verunreinigungen von Zn2+ in Chemikalien und Wasser zur Bioverfügbarkeit von Zn2+ bei, auch wenn sie in der Medienvorbereitung weggelassen werden. Die Spurenmengen von Zn2+, die in Wasser oder Chemikalien vorhanden sind, können von Labor zu Labor drastisch variieren, wodurch das Ergebnis des Zn2+-begrenzenden Wachstums beeinflusst wird. Die empirische Quantifizierung des [Zn2+] in jeder unabhängigen Herstellung von Medien ist für die meisten Laboratorien, die routinemäßige Wachstumsassays durchführen, übermäßig aufwändig, aber ein Mechanismus zur Beseitigung der Möglichkeit einer Zn2+-Kontamination in Wachstumsmedien wäre an sich wertvoll. Zu diesem Zweck wird hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung eines chemisch definiertenZn2+-begrenzten Mediums (ZLM), von Wachstumsgefäßen und Samenkulturen für das Zn2+-limitierende Wachstum und die Alt-Ribosomenproduktion in M. smegmatis und M. tuberculosis vorgestellt. Wichtige morphogene Merkmale (Zelldichte, gemessen mit OD600, Zelllänge und Fluoreszenz des Coenzyms F420) nach dem Wachstum in ZLM werden verwendet, um zu überprüfen, ob die Zn2+-Limitierung erreicht wurde. Coenzym F420 ist ein Deazaflavin-Cofaktor, der eine wichtige Rolle beim Katabolismus und bei der Abwehr von oxidativem Stress bei Methanogenen und Mykobakterien spielt20,21. Wichtig ist, dass Mykobakterien autofluoreszierend sind, wenn sie bei 420 nm angeregt werden, da dieser Cofactor22 häufig vorhanden ist. Die molekulare Bindung zwischen [Zn2+] und der F420-Fluoreszenz ist noch nicht geklärt, aber die Verfolgung der F420-Fluoreszenz in Kulturen ist ein handhabler und zuverlässiger Bioindikator.

In M. smegmatis treten die Bioindikator-Phänotypen in den Wildtyp-Bakterien auf, aber eine Deletionsmutante, der das altRP-Operon fehlt, durchläuft nicht das gleiche morphogene Programm und kann als differentieller Bioindikator verwendet werden10. Obwohl M. tuberculosis während der Zn2+-Limitierung nicht dem gleichen morphogenen Programm wie M. smegmatis folgt, hat M. tuberculosis eine robuste und globale Reaktion auf Zn2+ Einschränkung und ein Schlüssel-Bioindikator-Phänotyp nach dieser Methode23. Das hier definierte System ermöglicht somit die Erzeugung von Prim- und Alt-Ribosomen unter den gleichen Wachstumsbedingungen (d.h. Zn2+-Limitierung), was die mechanistische Aufschlüsselung der Alt-Ribosomenfunktion und ihrer Rolle bei der Gestaltung der bakteriellen Physiologie erleichtert. Diese Wachstumsmethode wurde verwendet, um die Struktur aktiver Alt-Ribosomen aufzuklären und ihre translationale Aktivität in Wildtyp-M. smegmatis24 zu demonstrieren. Ein weiterer Beleg dafür, dass diese Wachstumsmethode und dieser Bioindikator-Phänotyp die biologische Funktionalität von AltRPs während der Zn2+-Limitierung unterstreicht, ist, dass die AltRP-Expression für dieZn 2+-abhängige Morphogenese erforderlich ist und einen tiefgreifenden Einfluss auf das Transkriptom und Proteom von Zn2+-limitiertem M. smegmatis10,25 hat. Die gleiche Methode, mit geringfügigen Änderungen in der Menge des Inokulums und der Inkubationszeit, wird verwendet, um Zn2+-begrenzte Kulturen von M. tuberculosis zu erzeugen9,23. Hier werden Protokolle und Bioindikator-Phänotypen für das Erreichen eines Zn2+-begrenzenden Wachstums sowohl bei M. smegmatis als auch bei M. tuberculosis detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf M. smegmatis liegt, da dieses Bakterium empfindlicher auf Zn2+-Kontamination in den Medien reagiert und breiter zugänglich ist als der langsam wachsende Erreger.

Protokoll

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind der Wildtyp M. smegmatis mc2 155 (Geschenk von Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) und der ΔaltRP-Deletionsstamm (stammt aus dem Prisic-Labor10). Sie können je nach lokalen Biosicherheitsvorschriften und verfügbaren Ressourcen in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 (BSL1) oder in einem BSL2-Labor kultiviert werden. Hier ist das Protokoll für ein BSL2-Labor beschrieben. Falls es in einem BSL1-Labor durchgeführt wird, kann eine aseptische Technik mit Bunsenbrenner einen Sicherheitswerkbank ersetzen. Außerdem müssen Forschende, die weitere Stämme oder Bedingungen einbeziehen möchten, das benötigte Mediumsvolumen entsprechend der Gesamtanzahl der analysierten Kulturen berechnen. Pathogenes M. tuberculosis H37Rv (Mtb-H37Rv; Geschenk von Dr. Robert Husson, Boston Children's Hospital) muss unter Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) unter Tragen eines Atemschutzgeräts (z. B. PAPR oder N95) manipuliert werden. Flaschen dürfen nicht wiederverwendet werden, wenn hochvirulente Mykobakterien wie Mtb-H37Rv kultiviert werden. Das auxotrophe M. tuberculosis mc26206 (Mtb-Aux) ist abgeschwächt und kann in einem BSL2-Labor bearbeitet werden (Geschenk von Dr. William R. Jacobs Jr., Albert Einstein College of Medicine).

1. Vorbereitung der Kolben

HINWEIS: Zn2+-limitierende Wachstumsbedingungen werden in wiederverwendbaren (autoklavierbaren) Polycarbonat-Erlenmeyerkolben mit 250 mL erreicht. Verwenden Sie keine Glasflaschen für Zn2+-limitierende Wachstumsbedingungen, oder untersuchen und vergleichen Sie strikte Säurereinigungsverfahren mit den in diesem Protokoll dargestellten Ergebnissen19. Neuwertige Flaschen sind ausreichend, um Zn2+-limitierende Wachstumsbedingungen zu erreichen, mischen Sie jedoch niemals neue und alte Flaschen innerhalb eines Experiments. Entsorgen Sie Flaschen, die Anzeichen von Schwäche aufweisen (üblicherweise an den Nähten) oder bereits mehr als etwa 20-mal verwendet wurden. Überprüfen Sie die Kapselfilter regelmäßig auf Beschädigungen und entsorgen Sie sie bei Beeinträchtigung. Falls vorhanden, entsorgen Sie die Kappeinsätze, die auf die Oberseite der Kappen geschraubt werden und die Filter abdecken. Diese Methode beschreibt die Vorsichtsmaßnahmen zur Reinigung der Flaschen und deren Vorbereitung für die Wiederverwendung.

  1. Kennzeichnen Sie die Kolben dauerhaft, sodass jeder Satz nur für Zn2+-limitierende Bedingungen verwendet wird. Kennzeichnen Sie einen weiteren Satz Kolben für Zn2+-reiche Kultivierung. Die Kennzeichnung mit unterschiedlichen Farben ist hilfreich, um eine Verwechslung der Kolben zu vermeiden.
  2. Verhindern Sie, dass Kultur-Rückstände in den Kolben austrocknen. Geben Sie unmittelbar nach dem Abgießen der Kultur Wasser in die Kolben (z. B. 100 mL). Falls die Kultur am Ende des Wachstums nicht geerntet wird, gießen Sie die gesamte Kultur nach der Aufzeichnung der Bioindikator-Phänotypen gemäß diesem Protokoll in einen Abfallbehälter für Flüssigkeiten mit einer Endkonzentration von 10 % Bleichmittel.
  3. Autoklavieren Sie die Kolben mit Wasser und verschlossenen Deckeln im Flüssigkeitszyklus (mindestens 121 °C bei 15 psi) für 20 Minuten.
  4. Nach dem Autoklavieren waschen Sie die Kolben mit einem nichtionischen, niedrig schäumenden Reinigungsmittel und bürsten Sie sie gründlich mit einer weichen Bürste aus. Verwenden Sie eine eigens dafür vorgesehene Bürste ausschließlich zum Reinigen der Kolben, die für das Zn2+-limitierte Wachstum verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Kolben sauber sind und keine Rückstände oder Verunreinigungen aufweisen. Bürsten oder seifen Sie die Verschlüsse nicht, sondern spülen Sie sie vorsichtig mit entsalztem Wasser aus.
  5. Spülen Sie die Kolben gründlich mit Leitungswasser, anschließend dreimal mit entsalztem Wasser (Typ II oder III) und mindestens einmal mit ultrareinem Wasser (Typ I) (18,2 MΩ-cm bei 25 °C und ≤ 5 ppb gesamter organischer Kohlenstoff).
  6. Stellen Sie die Kolben senkrecht mit der Öffnung nach unten auf, damit kein Wasser im Boden stehen bleibt. Verwenden Sie keine standardmäßigen, an der Wand befestigten Labor-Trockengestelle, da diese die Kolben schräg halten und so kleine Wasseransammlungen ermöglichen. Herkömmliche Geschirrregale sind ausreichend. Lassen Sie die Kolben und Deckel vollständig trocknen.
  7. Sobald die Kolben trocken sind, schrauben Sie die Verschlüsse fest auf und bedecken Sie diese mit Aluminiumfolie. Befestigen Sie ein Stück Autoklav-Kontrollband an der Folie, um den sterilen Zustand anzuzeigen und die Kapselfilter vor Staub zu schützen.
  8. Autoklavieren Sie die gereinigten Kolben (mindestens 121 °C bei 15 psi) für 20 Minuten, gefolgt von einem Vakuum nach dem Zyklus zum Trocknen der Ladung (sofern das Autoklavgerät über diese Funktion verfügt). Lagern Sie die Kolben trocken und vor Staub geschützt.

2. Herstellung des Zn2+-limitierten Mediums (ZLM)

HINWEIS: Verwenden Sie zur Zubereitung der Medien ausschließlich Plastikbecher, Messzylinder und sonstiges Material aus Kunststoff. Legen Sie ein Satz Laborgeräte fest, der ausschließlich für die Herstellung von Zn2+-limitierten Medien verwendet wird. Spülen Sie alle Geräte vor und nach Gebrauch gründlich mit ultrareinem (Typ I) Wasser aus. Verwenden Sie Chemikalien hoher Reinheit und beziehen Sie sie, wenn möglich, stets vom selben Lieferanten.

  1. Zubereiten eines Zn2+-limitierten Sauton-Mediums ohne Zusatz von Zn2+-Salzen26, indem die folgenden Chemikalien in einem 1-Liter-Kunststoffbecher mit einem Magnetrührstab und etwa 950 mL ultrareinem Wasser gemischt werden:
    0,5 g KH2PO4 (0,05 %; MW: 136,09)
    0,5 g MgSO4 × 7H2O (0,05 %; MW: 246,48)
    2 g Zitronensäure, wasserfrei (0,2 %; MW: 192,12)
    4 g L-Asparagin, 99 % (0,4 %; MW: 132,12)
    60 mL Glycerin (6 %)
    189 µL 1 M Eisenammoniumcitrat (0,005 %; MW: 265)
    1. Glycerin mit einer Einweg-Plastikpipette mit 50 mL hinzufügen. Die Pipette gründlich ausspülen, indem man etwa 10-mal auf- und abpipettiert, bis kein Glycerinrest mehr in der Pipette verbleibt.
      HINWEIS: Glycerin ist hochviskos und schwer zu dosieren. Alternativ kann das Glycerin auch in einen Messzylinder gegossen und mehrfach mit etwa 30 mL ultrareinem Wasser ausgespült werden, wobei das Spülwasser anschließend dem Medium zugesetzt wird. Bei dieser Vorgehensweise mit einem geringeren Anfangsvolumen beginnen (~600 mL), damit das Endvolumen nach Zugabe von Glycerin und den Spülflüssigkeiten aus dem Messzylinder nicht größer als ~950 mL wird.
  2. Das Volumen des Mediums auf etwa 950 mL auffüllen und gut mischen. Das L-Asparagin löst sich erst nach einigen Minuten; warten, bis keine weißen Flocken mehr sichtbar sind, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird.
    HINWEIS: Die Eisenammoniumcitrat-Lösung verleiht dem Medium eine hellgelbe Farbe.
  3. 15 mL frische NaOH-Lösung (~10 %, w/v) mit ultrareinem Wasser in einem Kunststoffbehälter (z. B. 15 mL konische Zentrifugenröhrchen) herstellen.
  4. Den pH-Meter vor Gebrauch gründlich mit ultrareinem Wasser spülen und nur die Sondenspitze in das Medium eintauchen. Den pH-Meter während der pH-Einstellung unter leichtem Rühren im Medium belassen. Mit einer Einweg-Plastikpipette die frisch hergestellte NaOH-Lösung so zugeben, dass ein End-pH-Wert von 7,4 erreicht wird.
    HINWEIS: Der Ausgangs-pH-Wert des Mediums ist stark sauer. Es ist eine große Menge an NaOH-Lösung erforderlich, um den pH-Wert in den neutralen Bereich zu bringen. Zunächst 4–6 mL der NaOH-Lösung zugeben; wenn der pH-Wert etwa 6,5 erreicht hat, die NaOH-Lösung tropfenweise zugeben. Den Ziel-pH-Wert von 7,4 nicht überschreiten. Falls dies geschieht, nicht versuchen, mit HCl oder anderen Säuren nachzuregulieren – das Medium entsorgen. Es ist empfehlenswert, einen eigenen pH-Meter ausschließlich für die Herstellung von ZLM zu verwenden, um Kontaminationen durch andere Medien oder Puffer zu vermeiden.
  5. Das Medium in einen Messzylinder überführen und mit ultrareinem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L auffüllen. Das Medium durch eine Einweg-Filterflasche mit 0,2 µm Porengröße sterilfiltrieren.
  6. Steril 2,5 mL der filtersterilisierten 20 %igen Tween-80-Lösung (endgültige Konzentration 0,05 %) hinzufügen. Bei 4 °C lichtgeschützt bis zu 6 Monate lagern.

3. Wachstum unter Zn2+-limitierenden Bedingungen in M. smegmatis

HINWEIS: Aufgrund von Chargenunterschieden in der Menge an Zn2+, die im ZLM enthalten ist, ist es unbedingt erforderlich, für alle Kulturen in einem Experiment dieselbe Mediumcharge oder mehrere gut miteinander vermischt Chargen zu verwenden. Zusätzlich zu dem Medium, das zum Ansetzen der Kulturen benötigt wird, werden etwa 100 mL zusätzliches Medium zum Waschen und Normalisieren der Anzuchtkulturen benötigt.

  1. Führen Sie alle Schritte in einem Sicherheitswerkbank durch. Bereiten Sie die Animpfkulturen 18 h vor dem Beginn des Wachstumsexperiments vor. Verwenden Sie keine überwucherten oder verklumpten Animpfkulturen. Eine Animpfkultur pro Stamm ist ausreichend.
    1. Fügen Sie aseptisch 5 mL Medium 7H9-ADC (Middlebrook 7H9-Brühe mit 0,05 % Tween 80 und 10 % ADC-Anreicherung [Endkonzentration: 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Dextrose, 0,085 % NaCl und optional 0,0003 % Katalase]) einem 50 mL Bioreaktor-Röhrchen hinzu.
    2. Fügen Sie aseptisch 10 µL aufgetauter glycerinhaltiger Zellbestand (hergestellt gemäß26) direkt zum Medium hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen mit dem Deckel.
    3. Stellen Sie die Röhrchen fest in einem Schüttelinkubator in einem Winkel von etwa 45°, sodass die Flüssigkeit beim Schütteln etwa bis zur Hälfte des Röhrchens ansteigt.
    4. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 °C unter Schütteln bei 120 U/min für etwa 18 h.
  2. Überprüfen Sie die Übernachtkulturen, um sicherzustellen, dass die Kultur gleichmäßig trüb ist und keine signifikanten Klumpen aufweist. Die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Übernachtkultur sollte idealerweise bei 0,5–0,8 liegen.
  3. Sedimentieren Sie die Übernachtkulturen in den Bioreaktor-Röhrchen, die für das Übernachtwachstum verwendet wurden, durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie das Überstandsvolumen durch Abgießen oder Absaugen und resuspendieren Sie in 5 mL ZLM. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Resuspension zweimal, insgesamt drei Waschschritte.
    1. Während der Zentrifugationsschritte füllen Sie eine Küvette bis zum Überlaufen mit 70 % Ethanol zur Sterilisation. Lassen Sie die gefüllte Küvette 10 min im Sicherheitswerkbank stehen und spülen Sie sie anschließend dreimal gründlich mit ZLM mittels Pipette ab.
      HINWEIS: Der Normalisierungsprozess der Zellen erfordert Zeit und Übung, um effizient durchgeführt zu werden. Durch die direkte Normalisierung der Zellen in der mit Ethanol sterilisierten Küvette wird der Prozess erheblich beschleunigt.
    2. Bereiten Sie ausreichend viele Küvetten für die Anzahl der in der Studie enthaltenen Stämme vor, z. B. erfordert dieses Protokoll zwei sterilisierte Küvetten, eine für den Wildtyp und eine für den ΔaltRP-Mutanten.
  5. Nach drei Waschungen mit ZLM resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 2 mL ZLM.
  6. Kalibrieren Sie ein Spektrophotometer mit 600 µL ZLM in einer Küvette. Die Küvette muss nicht sterilisiert sein. Stellen Sie die Küvette beiseite und verwenden Sie sie zur Kalibrierung des Spektrophotometers vor der Normalisierung jeder Kultur (d. h. jedes Stammes).
  7. Arbeiten Sie nacheinander mit jeweils einem Stamm, überführen Sie 600 µL gewaschener Zellen aus Schritt 3,5 in eine sterilisierte Küvette, die in Schritt 3,4,1 vorbereitet wurde, und messen Sie die Start-OD600. Wenn die OD600 über 1 liegt, fahren Sie mit Schritt 3,8 fort. Wenn die OD600 unter 1 liegt, führen Sie die Unterpunkte 3,7,1 und 3,7,2 durch.
    1. Wenn die Start-OD600 aus Schritt 3,7 unter 1 liegt, sammeln Sie die gesamte Kultur aus der Küvette, geben Sie sie zurück zu den restlichen gewaschenen Animpfzellen im Zentrifugenröhrchen, und zentrifugieren Sie die Kultur erneut wie in Schritt 3,3 beschrieben. Resuspendieren Sie die Kultur in einem geringeren Volumen als in Schritt 3,5 verwendet (z. B. 1 mL), um eine höhere Zelldichte zu erreichen, und wiederholen Sie Schritt 3,7.
    2. Wenn die OD600 nach Schritt 3,7,1 weiterhin unter 1 liegt, ist die Kultur nicht dicht genug; beginnen Sie das Verfahren erneut ab Schritt 3,1. Inkubieren Sie die Kulturen länger oder erhöhen Sie die Inokulummenge für die Übernachtkultur, sodass die endgültige Dichte der Übernachtkultur etwa OD600 = 0,5–0,8 beträgt, wie in Schritt 3,2 beschrieben.
  8. Berechnen Sie das Volumen an ZLM, das zu den 600 µL gewaschener Zellen in der Küvette hinzugefügt werden muss, um eine OD600 von 1 zu erreichen, mithilfe der folgenden Gleichung und der in Schritt 3,7 gemessenen OD600:
    Volumen ZLM (µL) = (Start-OD600 – 1) × 600 µL
  9. Fügen Sie das in Schritt 3,8 berechnete Volumen ZLM der in Schritt 3,7 vorbereiteten Küvette hinzu, mischen Sie gut durch 5–10-maliges Pipettieren und messen Sie die OD600 erneut.
  10. Passt die OD600 innerhalb von 5 % an OD600 = 1 an, gemäß den folgenden Unterpunkten. Verwenden Sie zwei Pipetten, wobei eine (P1000-Größe) ausschließlich zum Mischen der Kultur verwendet wird, um die Anzahl der verwendeten Spitzen bei jeder Anpassung zu reduzieren.
    1. Wenn die OD600 über 1 liegt, geben Sie ZLM tropfenweise (~50 µL pro Portion) hinzu, mischen Sie gut durch 5–10-maliges Auf- und Abpipettieren und messen Sie die OD600. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf, bis die Kultur innerhalb von 5 % von OD600 = 1 liegt.
    2. Wenn die OD600 während der Normalisierung unter 1 fällt, geben Sie weitere gewaschene Zellen (~20 µL zu Beginn) aus Schritt 3,5 hinzu, mischen Sie gut durch 5–10-maliges Auf- und Abpipettieren und messen Sie die OD600. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf (oder geben Sie mehr ZLM wie in Schritt 3,10,1 beschrieben hinzu, falls die OD600 über 1 steigt), bis die Kultur innerhalb von 5 % von OD600 = 1 liegt.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Volumen in der Küvette während der Zellnormalisierung ~1,5 mL nicht überschreitet, um ein Verschütten in das Spektrophotometer zu vermeiden. Entfernen Sie gegebenenfalls Kultur aus der Küvette beim Verdünnen. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Kulturvolumen in der Küvette über dem Mindestvolumen liegt, das für eine genaue Messung der OD600 am Spektrophotometer erforderlich ist. Die meisten Spektrophotometer benötigen mindestens 600 µL.
  11. Wiederholen Sie die Schritte zur Zellnormalisierung (3,6–3,10) für alle in der Studie enthaltenen Stämme und Bedingungen.
  12. Bereiten Sie die für ein Experiment benötigte Gesamtanzahl an Kolben vor, indem Sie aseptisch 50 mL ZLM in 250 mL Kunststoff-Erlenmeyerkolben geben, die wie in Schritt 1 beschrieben vorbereitet wurden.
  13. Inokulieren Sie die Kolben, indem Sie aseptisch 50 µL der auf OD600 = 1 normalisierten Kultur direkt aus der Küvette hinzufügen, um eine End-OD600 von 0,001 zu erreichen (1:1000-Verdünnung des normalisierten Inokulums).
  14. Fügen Sie für Kulturen, die ohne Zn2+-Limitierung gezüchtet werden (d. h. Zn2+-reiche Medien, ZRM), 30 µL sterile 10 mM ZnSO4-Lösung (frisch aus 1 M steriler Stammlösung hergestellt) direkt zu den Kulturkolben hinzu, um eine Endkonzentration von 6 µM ZnSO4 zu erreichen.
  15. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 °C unter Schütteln bei 100 U/min für 3 Tage bis zur stationären Phase (Tag 0 ist der Tag der Inokulation).
  16. Messen Sie jeden Tag des Wachstums mithilfe eines Monochromators oder eines Filter-basierten Mikroplattenlesegeräts die folgenden Wachstumsparameter unter Verwendung von 200 µL Kultur in einer 96-Loch-Flachboden-Mikroplatte. Nehmen Sie die Plattenmessungen unmittelbar nach dem Aliquotieren der Zellen vor, damit diese sich nicht absetzen.
    HINWEIS: Eine Vorwärmung des Plattenlesegeräts ist nicht erforderlich, da die absoluten Fluoreszenzwerte weniger aussagekräftig sind als das Verhältnis und die Fluoreszenzscans, und das kleine Volumen erreicht während des Platten-Setups rasch Raumtemperatur. Die Fluoreszenz kann von oben oder unten der Platte gemessen werden, falls Kondensation am Deckel Probleme verursacht, obwohl die Fluoreszenzintensitätswerte insgesamt geringer sind, wenn von unten gelesen wird.
    1. Zelldichte (d. h. OD600): Um die aus einem Mikroplattenlesegerät erhaltene OD600 zu berichten, erstellen Sie eine Kalibrierkurve, um die Messung mit der Pfadlänge der Mikroplatte bei einem festgelegten Volumen (z. B. 200 µL) auf die Standard-Pfadlänge von 1 cm umzurechnen.
    2. Fluoreszenz des Cofaktors F420 (Ex 420 nm/Em 475 nm): Verwenden Sie bei Filter-basierten Mikroplattenlesegeräten den nächstgelegenen Filter-Satz (z. B. Ex 430 nm/Em 488 nm) und schwarze 96-Loch-Mikroplatten.
    3. Messen Sie die Hintergrundfluoreszenz bei 375 nm (Ex 375 nm/Em 475 nm).
    4. Wenn ein Monochromator verwendet wird, erstellen Sie einen Fluoreszenzintensitäts-Scan von Ex 230–440 nm in 5 nm-Schritten mit fester Emission bei 475 nm.
    5. Wenn ein Monochromator verwendet wird, berechnen Sie den Prozentsatz der Fluoreszenzintensität bei 375 nm im Vergleich zu 420 nm mithilfe der Gleichung:
      F375/420 (%) = (F375/F420) × 100

4. Aufzeichnung und Messung der Zelllänge

  1. Am Tag 3 die Zelllänge visualisieren und dokumentieren. Ein Objekt- und ein Deckglas mit einem fusselfreien Tuch reinigen. Mit einer Pipette einen Tropfen Kultur von 10 µL auf das Objektglas geben und das Deckglas direkt auf die Kultur legen. Das Deckglas vorsichtig andrücken, sodass sich die Kultur ausbreitet und nahezu den gesamten Bereich unter dem Deckglas ausfüllt. Die Präparate sofort anfertigen und untersuchen, um Austrocknung zu vermeiden.
    ANMERKUNG: Wenn sich die Kultur nicht leicht ausbreitet, verhindert Schmutz einen guten Kontakt, und Wasserbewegungen erschweren es, Zellen scharf abzubilden. Ein neues Präparat anfertigen.
  2. Mit einem auflichtmikroskopischen Aufbau (oder DIC, siehe unten) mit 100x Öl-Immersion und 10x Okularobjektiven (insgesamt 1000fache Vergrößerung) sowie einer Kameraanbindung das präparierte Objektglas untersuchen.
    ANMERKUNG: Die Zellen sind mit der Kontrastierung durch differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC) deutlich besser sichtbar10. Wenn möglich, diesen Mikroskoptyp für hochwertige Aufnahmen verwenden. Für die routinemäßige Analyse und Überprüfung des Zn2+-limitierten Wachstumszustands genügt ein Standard-Auflichtmikroskop.
  3. Aufnahmen von Bereichen des Objektglases machen, in denen sich mehrere scharf eingestellte, in einer Ebene liegende (d. h. die gesamte Länge der Zelle sichtbar ist) und nicht bewegte Zellen befinden. Es genügend Aufnahmen aus verschiedenen Bereichen des Objektglases (oder mehrerer Objektgläser derselben Kultur) machen, sodass insgesamt mindestens 100 Zellen vermessen werden können.
  4. Mit demselben Mikroskop und Objektiv ein Kalibrierungspräparat aufnehmen.
  5. In Fiji27 das Lineal-Werkzeug verwenden, um eine Linie über die Länge des Kalibrierungspräparats zu ziehen. Analyze > Set scale auswählen und die bekannte Distanz sowie die Einheit der Maßstabsleiste eintragen. Global auswählen, um die Skalierung auf alle zukünftigen Bilder und Messungen anzuwenden.
  6. Ein Mikroskopaufnahme öffnen. Mit dem Lineal-Werkzeug eine Linie über die Länge einer Zelle ziehen und die Taste M auf der Tastatur drücken, um die Zelle zu vermessen. Mindestens 100 Zellen jeder Kultur vermessen.
  7. Die in Fiji im Popup-Fenster generierten Längendaten in eine Tabellenkalkulation übertragen oder als durch Komma getrennte Werte (.csv) speichern, um sie statistisch auszuwerten.

5. Modifikationen zum Kultivieren von Zn2+-limitierten M. tuberculosis (Mtb)

HINWEIS: Im Gegensatz zu Mtb-H37Rv kann Mtb-Aux keine L-Leucin und D-Pantothenat synthetisieren, weshalb diese Zusätze dem Medium zugesetzt werden28. Die Zusatzstoffe für Mtb-Aux beeinflussen die Zn2+-Limitierung nicht, und beide Stämme zeigen ähnliche Phänotypen in ZLM23. Dieses Protokoll wurde von einem zuvor veröffentlichten Protokoll abgeleitet23, wobei der Hauptunterschied darin besteht, dass die Kulturen acht Tage lang statt zehn Tage gezüchtet werden, um Klumpenbildung zu verringern und eine Anreicherung einzelner Zellen zu ermöglichen, was für nachfolgende Anwendungen wie Makrophagen-Infektionen erforderlich ist. Für andere geringfügige Unterschiede verweisen wir auf die Originalpublikation23. Die Inokulationsmethode unterscheidet sich von der von M. smegmatis, da ein wesentlich höherer Inokulum benötigt wird, um das Wachstum von M. tuberculosis einzuleiten.

  1. Für Mtb-Aux zusätzliche Supplementierung mit 50 µg/mL L-Leucin und 48 µg/mL D-Pantothensäure in allen Medien vornehmen. Sterilfiltern Sie 1000x-Stammlösungen von 50 mg/mL L-Leucin und 48 mg/mL Calcium-D-Pantothensäure mit einem 0,2-µm-Filter und geben Sie diese zu sterilisierten Medien hinzu.
  2. Geben Sie 1 mL aufgetauten Glycerin-Stammbakterien asseptisch in 4 mL 7H9-ADC in einem 14-mL-Rundbodenglas mit Schraubkappe (für Mtb-Aux) oder in einem 50-mL-Bioreaktor-Glas (für Mtb-H37Rv).
  3. Brüten Sie bei 37 °C ohne Schütteln, bis die Kultur einen OD600 von etwa 1 erreicht. Dies dauert ungefähr eine Woche. Belüften Sie die Kultur einmal täglich, indem Sie das Gefäß im Sicherheitswerkbank öffnen und mehrmals pipettieren, um die Kultur zu mischen.
  4. Inokulieren Sie 1 mL der stehenden Kultur in 50 mL 7H9-ADC in einem 250-mL-ventilierten Kunststoffkolben. Eine 50-mL-Kultur in 7H9-ADC reicht aus für biologische Triplicate pro Stamm und Bedingung (d. h. Wildtyp in ZLM und ZRM). Achten Sie darauf, große Klumpen (d. h. große Zellaggregate) zu vermeiden, indem Sie die Kultur vor der Inokulation 5–10 Minuten stehen lassen, damit sich die Klumpen am Boden des Gefäßes absetzen können, und anschließend die Kultur von oben entnehmen.
    ANMERKUNG: Die Inokulation mit großen Klumpen führt zu klumpigen Kulturen, was die Normalisierung und Reproduzierbarkeit beeinträchtigt.
  5. Brüten Sie bei 37 °C unter Schütteln bei 100 U/min, bis die Kultur einen OD600 von 0,5–0,8 (mittlere logarithmische Phase) erreicht. Dies dauert 3–5 Tage.
  6. Überführen Sie die Kultur in ein 50-mL-Konusrohr und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Überstandsvolumen, indem Sie 40 mL mit einer serologischen Pipette absaugen und den restlichen Überstand mit einer P1000-Mikropipette abpipettieren.
    ANMERKUNG: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Übertragung von Zn2+ aus dem 7H9-ADC-Medium zu minimieren.
  7. Lösen Sie das Pellet in 5 mL ZLM auf und stellen Sie das Gesamtvolumen der Kultur im Konusrohr auf 50 mL mit ZLM ein.
  8. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen erneut zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet auf ein Endvolumen von 50 mL, wie in Schritt 5.7 beschrieben.
  9. Messen Sie den OD600 der gewaschenen Inokulumkulturen und berechnen Sie das erforderliche Volumen, um einen Start-OD600 von 0,05 (Mtb-H37Rv) oder 0,08 (Mtb-Aux) in 50 mL zu erreichen, mithilfe der folgenden Gleichung:
    Gleichung für das Inokulumvolumen; optische Dichtegleichung für mikrobiologische Experimente.
    ANMERKUNG: Das Wachstum von Mtb-Aux mit einem Start-OD600 von 0,05 ist inkonsistent; daher wird ein höherer OD600 von 0,08 für ein konsistentes Wachstum verwendet.
  10. Portionieren Sie das in Schritt 5.9 berechnete Volumen der Inokulumkultur in ein neues 50-mL-Konusrohr und stellen Sie das Volumen auf 50 mL mit ZLM ein. Gießen Sie die gewaschene und normalisierte Kultur aus dem Konusrohr in vorbereitete Kunststoff-Erlenmeyerkolben, wie in Schritt 1 beschrieben. Wiederholen Sie dies unter Verwendung desselben Konusrohrs für alle biologischen Wiederholungen jedes Stammes und jeder Bedingung.
  11. Für Kulturen, die ohne Zn2+-Limitierung gezüchtet werden (d. h. Zn2+-reiche Medien, ZRM), geben Sie 30 µL sterile 10 mM ZnSO4 direkt in die Kulturkolben, um eine Endkonzentration von 6 µM ZnSO4 zu erreichen.
  12. Brüten Sie die Kulturkolben bei 37 °C unter Schütteln bei 100 U/min für 8 Tage. Messen Sie den OD600 und die F420-Fluoreszenz während des gesamten Wachstums, wie in Schritt 3 beschrieben. Verwerfen Sie Kulturen, wenn sie innerhalb der ersten Tage klumpig werden (d. h. die Kultur erscheint nicht trüb, und es sind Klumpen in der gesamten Kultur sichtbar).
    ANMERKUNG: Idealweise sind die Kulturen während der ersten Tage des Wachstums weitgehend planktonisch (d. h. frei von großen, mit bloßem Auge sichtbaren Klumpen). Mtb-Kulturen, insbesondere ZLM-Kulturen, werden im Verlauf des Wachstums zunehmend klumpiger, und es ist im späten logarithmischen Wachstum üblich, dass Klumpen als Flocken an der Oberfläche des Mediums schwimmen23.

Ergebnisse

Bioindikator-Phänotypen von M. smegmatis
Wildtyp M. smegmatis Kulturen, die in ZLM gezüchtet werden und Zn erreichen2+wachstumseinschränkend haben drei Haupt-Bioindikator-Phänotypen im Vergleich zu Zellen, die unter Zn wachsen2+– reiche Bedingungen: [1] verminderte OD600, [2] längliche Zellen und [3] verminderte Fluoreszenzspitze bei 420 nm. Der Mutant, der AltRPs fehlt (ΔaltRP) hat nicht das gleiche Zn2+abhängige Morphogenese, wie beim Wildtyp10, und sein einzigartiges Phänotyp in Zn2+-begrenzte Medien können als differentieller Bioindikator verwendet werden. Daher sollten alle drei Bioindikator-Parameter zunächst an Wildtypen, die in ZRM und ZLM gezüchtet wurden, evaluiert werden. Wenn der erwartete Zn2+– ein eingeschränkter Wildtyp-Phänotyp wird beobachtet, der ΔaltRP Der Deletionsstamm sollte anschließend evaluiert werden. Ein Wachstum in ZLM erreicht nicht immer Zn2+-begrenzte Bedingungen, was genau der Grund ist, warum Bioindikatoren benötigt werden. Einzigartige Wildtyp- und ΔaltRP Bioindikator-Phänotypen verifizieren, dass biologisch relevante Zn2+begrenzende Bedingungen wurden erreicht. Wenn Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, kein Zn erreichen2+wachstumsbegrenzend aufgrund von Zn2+ Kontamination in dem Medium oder den Kulturgefäßen (ZLM-C) werden diese Bioindikator-Phänotypen weniger ausgeprägt sein, wie gezeigt in Abbildung 1 und Abbildung 2. Umgekehrt, wenn die Konzentration von Zn2+ in ZLM ist zu niedrig, wird das Wachstum durch Zn beeinträchtigt2+ Ausschöpfung (ZLM-D), die sich in einer geringen Kulturtrübung und veränderten Bioindikator-Phänotypen zeigt, ebenfalls beschrieben in Abbildung 1 und Abbildung 2.

Die Zelldichte ist ein aussagekräftiges Maß für die Zn2+-Limitierung. Kulturen, die in ZRM gezüchtet werden, erreichen nach 72 h stets eine hohe Trübung (über einem OD600 von 5), möglicherweise mit Zellklumpenbildung, und erscheinen sichtbar gelber (Daten nicht gezeigt) als Kulturen in ZLM (Abbildung 1A). Die Zn2+-Limitierung hemmt das Wachstum (gekennzeichnet durch verminderten OD600) aller Stämme im Vergleich zur Zn2+-reichen Bedingung, wobei der ΔaltRP-Stamm eine geringere Zelldichte als der Wildtyp aufweist (Abbildung 1A). Zn2+-limitierendes Wachstum in ZLM führt beim Wildtyp stets zu einem OD600 von über 3,5 und unter 5, beim ΔaltRP-Stamm hingegen zu einem Wert unter 3 (Abbildung 1A). Kulturen in ZLM mit Zn2+-Kontamination (ZLM-C) erreichen eine ähnliche Zelldichte (OD600 über 5) wie Zn2+-reiche Kulturen in ZRM (Abbildung 1A). Falls die [Zn2+] in ZLM zu niedrig ist, werden die Kulturen stark an Zn2+ verarmt (ZLM-D), und das Wachstum ist beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Zelldichte der Wildtyp-Kulturen zeigt (OD600 unter 3; Abbildung 1A). Die Zelldichte des Wildtyps (3,5 < OD600 < 5) sollte als erster bioindikativer Phänotyp-Prüfpunkt dienen, um Zn2+-limitierende Bedingungen zu bestätigen. Nur Wildtyp-Kulturen, die die erwartete Zelldichte erreichen, sollten berücksichtigt werden; die Analyse des ΔaltRP-Stamms sollte erst nach der Bestätigung des Zn2+-limitierten bioindikativen Phänotyps im Wildtyp erfolgen.

Stationäre Wildtyp-Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, das an Zn2+ arm ist, weisen eine Verlängerung auf und haben eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 9 µm, während Zn2+-reiche Kulturen, die in ZRM gezüchtet wurden, kurz sind und eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 3 µm aufweisen (Abbildung 1B). Wildtyp-Kulturen, die in ZLM mit Zn2+-Verunreinigung (ZLM-C) gezüchtet wurden, verlängern sich nicht vollständig, sind aber etwas länger als Zn2+-reiche Zellen, mit einer durchschnittlichen Zelllänge von 5 µm. Die Bioindikation von Zn2+-Verunreinigungen in kompletten ZLM-Partien deutet auf eine mögliche Kontamination während der Herstellung hin, während bei Einzelkulturen (d. h. Kolben) eine Kontamination auf unsachgemäßes Spülen der Kolben oder Fehler bei der Kulturpräparation zurückzuführen ist. Wildtyp-Kulturen, die in stark Zn2+-verarmtem ZLM (ZLM-D) gezüchtet wurden, zeigen eine weniger ausgeprägte Verlängerung mit einer durchschnittlichen Zelllänge von etwa 7 µm (Abbildung 1B). Das verlängerte Wildtyp-Phänotyp wird bei dem ΔaltRP-Stamm nicht beobachtet, und ΔaltRP-Zellen, die an Zn2+ limitiert sind, weisen eine durchschnittliche Zelllänge von etwa 5 µm auf (Abbildung 1B). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder von Zellen, die in verschiedenen Zubereitungen von ZLM oder ZRM gezüchtet wurden (gemäß Schritt 2) und mit einem zusammengesetzten Lichtmikroskop sichtbar gemacht wurden. Im Anschluss an Schritt 4 werden Zellen aus mehreren Bildausschnitten wie in Abbildung 2 dargestellt, um die durchschnittliche Zelllänge der in Abbildung 1B gezeigten Kulturen zu berechnen. Das verlängerte Wildtyp-Phänotyp ist spezifisch für Zn2+-limitierende Bedingungen; eine zelluläre Verlängerung wird nicht beobachtet, wenn die Kulturen Zn2+-reich oder stark Zn2+-verarmt sind (Abbildung 1B und Abbildung 2).

Das Phänotyp-Merkmal der verringerten F420-Fluoreszenz als Bioindikator ist am besten in Fluoreszenzscans zu beobachten (Abbildung 1C). Die verringerte Fluoreszenz des Cofaktors F420 wird quantifiziert, indem der Prozentsatz der Fluoreszenzintensität bei 375 nm (Hintergrund) im Verhältnis zu 420 nm (Autofluoreszenz des Cofaktors F420) berechnet wird, wie in Schritt 3.16.5 beschrieben, angegeben als F375/420. Für monochromatische Plattenlesegeräte ohne Scanning-Fähigkeit eignen sich Einzelmessungen bei 375 nm und 420 nm (jeweils mit Emission bei 475 nm), um F375/420 zu berechnen. Wildtyp-Kulturen, die unter Zn2+-reichen Bedingungen (d. h. in ZRM) gezüchtet wurden, weisen einen hochgradig reproduzierbaren F375/420-Wert von etwa 17 % auf (Abbildung 1D). Eine Verringerung der F420-Fluoreszenz in Zn2+-limitierten Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, zeigt sich durch einen Anstieg des F375/420-Werts auf etwa 27 % (Abbildung 1D). Die F420-Fluoreszenz des Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamms ist unter denselben Bedingungen bemerkenswert geringer als beim Wildtyp, was in den Fluoreszenzscans visuell deutlich wird (Abbildung 1C). Der F375/420-Wert ist im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm stärker variabel, mit einem Bereich von etwa 50–80 % (Abbildung 1D). Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, jedoch Anzeichen einer Zn2+-Kontamination aufweisen (ZLM-C), zeigen einen reduzierten F375/420-Wert von etwa 21 %, während Kulturen, die Zn2+-erschöpft sind (ZLM-D), einen F375/420-Wert von etwa 35 % aufweisen (Abbildung 1D).

Zusammenfassend sollten drei Bioindikator-Phänotypen im Wildtyp und im ΔaltRP-Stamm untersucht werden, um den Zn2+-limitierten Status von Kulturen, die in ZLM gezüchtet wurden, zu bestätigen. Die Bioindikatoren sollten bei biologisch relevanter Zn2+-limitierter Wachstumsbedingung wie folgt lauten: [1] Die OD600 des Wildtyps liegt zwischen 3,5 und 5, während die des ΔaltRP-Stamms unter 3 liegt, [2] Wildtyp-Zellen sind etwa 10 µm lang, während die Zellen des ΔaltRP-Stamms die halbe Länge aufweisen, und [3] das F375/420 des ΔaltRP-Stamms ist hoch, d.h. über 50 %.

Bioindikator-Phänotypen von M. tuberculosis
Zn2+-begrenzt M. tuberculosis zeigt nicht dasselbe morphogenetische Programm wie M. smegmatis. Genauer gesagt besteht kein Unterschied in der OD600 zwischen Zn2+-reich und Zn2+-begrenzte Kulturen und Zn2+-begrenzte Kulturen zeigen kein offensichtliches morphologisches Phänotyp aus, d. h., sie verlängern sich nicht23. Ebenso gibt es kein Zn2+-verarmtes Bioindikator-Phänotyp (d. h. verminderte Zelldichte) in M. tuberculosis wie beobachtet wird bei M. smegmatis. Zn2+-begrenzte Kulturen weisen im Vergleich zu Zn stärkeres Klumpen auf2+-replete Kulturen, obwohl beide Bedingungen am Tag 10 erheblich verklumpt sind (beobachtet sowohl bei Mtb-H37Rv als auch bei Mtb-Aux). Das entscheidende bioindikatorische Phänotyp für Zn2+ Einschränkung in M. tuberculosis verringerte Peak-F420 Fluoreszenz, wie zuvor beschrieben23. Die Ergebnisse für Kulturen, die 8 Tage lang gezüchtet wurden, werden hier anstelle von 10 Tagen dargestellt, um Klumpenbildung zu minimieren. Verminderte F420 Fluoreszenz ist in Zn sichtbar2+-begrenzte Kulturen mit monochromatischem (Abbildung 3) und Filterplattenlesegeräte. Bei Filterplattenlesegeräten unter Verwendung von Mtb-H37Rv, Zn2+Kulturen unter begrenzenden Bedingungen (d. h. in ZLM gezüchtet) weisen etwa 50 % der Rohfluoreszenzwerte im Vergleich zu Zn auf2+-replete Kulturen (d. h. in ZRM gezüchtet; Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung eines monochromatischen Plattenreaders im Bottom-Reading-Modus und Mtb-Aux, Zn2+-reiche Kulturen weisen F auf375/420 rund 75 % und Zn2+-verunreinigte ZLM-Kulturen weisen ähnliche Werte auf. Vermindertes F420 Fluoreszenz in Zn2+-begrenzte Kulturen, die in ZLM gezüchtet werden, spiegeln sich in F wider375/420 von über 100 %. Das Zn2+-begrenzt ΔaltRP Stamm weist ein ähnliches Wachstum und F auf420 Fluoreszenz, wie sie im Zn zu sehen ist2+-begrenzter Wildtyp (Abbildung 3) und eignet sich nicht als Bioindikator in M. tuberculosis da es in M. smegmatis (Abbildung 1). Daher empfiehlt es sich, Medien zu testen, die zur Kultivierung verwendet werden sollen M. tuberculosis mit dem schnell wachsenden M. smegmatis

Wachstumskurven, Längenverteilung und Fluoreszenzanalyse in bakteriellen Studien; Diagramme und Boxplots.
Abbildung 1: Bioindikator-Phänotypen von M. smegmatis unter Zn2+-Limitierung sowie die Wirkung von Zn2+-Kontamination und Zn2+-Ausschöpfung auf die Phänotypen. Vertretende Beispiele der in jeder Abbildung dargestellten Bioindikator-Phänotypen stammen aus denselben Kulturen nach 72 h. Beispiele für Wachstumsergebnisse unter Zn2+-Kontamination (ZLM-C), Zn2+-Limitierung (ZLM-L) und Zn2+-Ausschöpfung (ZLM-D) stammen aus unabhängigen Mediumzubereitungen, die alle dem hier beschriebenen Zubereitungsverfahren folgten (Schritt 2). Die repräsentativen Phänotypen für den Zn2+-limitierten Wildtyp und den ΔaltRP-Stamm stammen aus derselben Charge von ZLM. Alle Stämme und Bedingungen umfassen drei biologische Wiederholungen (n=3). (A) Wachstumskurven, die die optische Dichte bei 600 nm (OD600) zeigen, sowie die abnehmende Zelldichte bei Zn2+-Limitierung und -Ausschöpfung. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung zwischen den Wiederholungen. (B) Zelllängen der Wildtyp- und ΔaltRP-Stämme, die den verlängerten Phänotyp des Zn2+-limitierten Wildtyps veranschaulichen. Der Box-und-Whisker-Plot zeigt den Interquartilsabstand, Minimum, Maximum und Median der Zelllängen in µm. (C) Repräsentative Fluoreszenzscans von Kulturen, die eine verringerte F420-Fluoreszenzspitze bei Zn2+-Limitierung und eine weiter reduzierte F420-Fluoreszenz im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm zeigen. Es ist jeweils nur eine repräsentative Kultur aus den biologischen Triplikaten jeder unterschiedlichen Mediumzubereitung dargestellt. Die Fluoreszenzscans verwenden einen Anregungsbereich von 230 nm bis 440 nm mit 5-nm-Schrittweite und eine Emissionswellenlänge von 475 nm. Der eingeblendete Ausschnitt oben links zeigt eine vergrößerte Ansicht der Zn2+-limitierten Wildtyp- und ΔaltRP-Stämme, um die verringerte Fluoreszenzspitze bei 420 nm im Zn2+-limitierten ΔaltRP-Stamm hervorzuheben. Die Achseneinheiten entsprechen denen des Hauptdiagramms. Alle Legenden sind identisch zu (A). (D) Quantifizierung der verringerten Fluoreszenz des Cofaktors F420, berechnet als Prozentsatz von F375/420. Die Prozentsätze wurden aus den Werten der Fluoreszenzscans in (C) ermittelt. Der Box-und-Whisker-Plot zeigt den Interquartilsabstand, Minimum, Maximum und Median der Prozentsätze. Abkürzungen für den Zn2+-bezogenen Status des Mediums, die in Klammern nach dem Medientyp angegeben sind: R = Zn2+-reicher, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert, D = Zn2+-ausgeschöpft; weitere Abkürzungen: WT = Wildtyp-Stamm, a.u. = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse der Zn²⁺-Status-Elektrophorese, WT im Vergleich zu ΔaltRP, Proteinseparationsanalyse.
Abbildung 2: Repräsentative Mikroskopiebilder von M. smegmatis nach 72 h. Die Aufnahmen stammen von Kulturen, die in Abbildung 1 gezeigt werden. Die Zellen wurden mit einem Lichtmikroskop bei 1000facher Gesamtmagnifizierung unter Verwendung eines 100fachen Öl-Immersion-Objektivs abgebildet. Maßstabsbalken entsprechen 10 µm. Abkürzungen, die den Zn2+-relevante Status des Mediums in Klammern nach dem Medientyp angeben, sind: R = Zn2+-reich, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert und D = Zn2+-erschöpft; weitere Abkürzungen: WT = Wildtyp-Stamm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramm des Fluoreszenzanregungsspektrums; Wellenlänge vs. Fluoreszenz; Analyse von Proteinstudien.
Abbildung 3: Verlust des F420-Bioindikator-Phänotyps in Zn2+-limitiertem M. tuberculosis, dargestellt durch repräsentative Fluoreszenzmessungen des auxotrophen Mtb mc26206 (Mtb-Aux). Beispiele für Zn2+-kontaminierte und Zn2+-limitierte Wachstumsergebnisse stammen aus unabhängigen Medienzubereitungen. Die Zn2+-limitierten Stämme vom Wildtyp und ΔaltRP stammen aus derselben Charge von ZLM. Alle Stämme und Bedingungen umfassen drei biologische Wiederholungen (n=3). Im Diagramm ist jeweils nur eine repräsentative Kultur aus den biologischen Triplikaten jeder unterschiedlichen Medienzubereitung und jedes Stammes dargestellt. Die Fluoreszenzmessungen wurden im Bottom-Reading-Modus nach 8 Tagen Wachstum mit einem Anregungs-Wellenlängenbereich von 230 nm bis 440 nm und einer Schrittgröße von 5 nm sowie einer Emissionswellenlänge von 475 nm durchgeführt. Die Abkürzungen, die den Zn2+-bezogenen Status des Mediums in Klammern nach dem Medientyp angeben, bedeuten: R = Zn2+-reich, C = Zn2+-kontaminiert, L = Zn2+-limitiert und D = Zn2+-erschöpft; weitere Abkürzungen sind: WT = Wildtyp-Stamm, a.u. = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Ein wesentlicher Beitrag zur Wissenslücke über die mechanistische Untermauerung von Alt-Ribosomen ist die Schwierigkeit, Zn2+-limitierende Bedingungen in vitro zu erreichen. Spuren von Zn2+ -Kontaminationen im Labor sind häufig; Daher ist es eine Herausforderung, reproduzierbare Zn2+-begrenzte Wachstumsbedingungen zu erreichen. Zn2+ -Kontaminationen können aus verschiedenen Quellen stammen, obwohl die bedeutendste und häufigste Quelle für Kontamination und Variabilität das Reinstwasser ist, das zum Spülen von Laborgeräten und zur Herstellung von Medien verwendet wird. Reinstwassersysteme sollten ordnungsgemäß gewartet und 1 Minute lang gespült werden, bevor Laborgeräte gespült oder Wasser für Medien verwendet werden. Kolben, die nicht gut gewaschen oder mit Reinstwasser gespült werden, können eine Zn2+- Kontamination verursachen, was sich in der erhöhten Zelldichte in bestimmten Kolben zeigt, in anderen jedoch nicht in anderen aus derselben ZLM-Charge. Mit fabrikneuen Kolben kann beurteilt werden, ob die Quelle der Zn2+- Kontamination aus wiederverwendeten Kolben oder Medien stammt. Die Kontamination von Zn2+ in ZLM sollte durch verstärktes Spülen von Gegenständen, die zur Herstellung von Medien verwendet werden, und einer bestimmten Reihe von Materialien für die ZLM-Zubereitung behoben werden. Wenn keine dieser Maßnahmen die erwarteten Bioindikator-Phänotypen erreicht, sollte der [Zn2+] in Reinstwasser und ZLM quantifiziert werden, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Wasserquelle mit Zn2+ kontaminiert ist. Wie bereits berichtet, beträgt der [Zn2+] von ZLM 115 ± 37 nM23, und Konzentrationen unter 70 nM und über 150 nM führten in der Regel zu Zn2+-abgereicherten bzw.Zn 2+-kontaminierten Phänotypen. Eine gute Medienvorbereitung ist jedoch nur ein Faktor, der das Ergebnis beeinflusst, und unzureichendes oder übermäßiges Zn2+ kann aufgrund der unsachgemäßen Vorbereitung des Inokulums und/oder der Kultivierung, d. h. eines schlechten Umfüllens von Zn2+-reichen Medien während der Waschschritte, auftreten. Alle hier enthaltenen M. smegmatis-Kulturen wurden auf die gleiche Weise hergestellt - die Wachstumsergebnisse von Zn2+-kontaminierten (ZLM-C) und Zn2+-abgereicherten (ZLM-D) sind enthalten, um die Variabilität hervorzuheben, die zwischen verschiedenen Medienchargen mit demselben Reinstwassersystem auftreten kann, selbst wenn die Experimente korrekt durchgeführt werden.

Um sicherzustellen, dass die Kultivierung von Zellen in ZLM reproduzierbare Zn2+-limitierende Bioindikator-Phänotypen ergibt, ist es wichtig, die Kolben eindeutig zu kennzeichnen, sie immer für die gleiche Bedingung zu verwenden (d. h. mit ZLM oder ZRM), Kolben über mehrere Verwendungszwecke zu verfolgen und Kolben zu entsorgen, die sich am Ende ihres Lebenszyklus befinden oder weiterhin Zn2+-kontaminierte Bioindikator-Phänotypen mit ZLM ergeben. Die richtige Inokulumvorbereitung ist sehr wichtig, um ein Zn2+-limitierendes Wachstum zu erreichen, da Zn2+ -Verschleppung aus unzureichend gewaschenen Samenzellen eine häufige Quelle für Zn2+-Kontamination ist, die von Zn2+-kontaminiertem ZLM schwer zu analysieren sein kann. M. smegmatis-Kulturen sollten nach 72 Stunden Wachstum in ZLM (und parallel angebautem ZRM) untersucht und geerntet werden. Die Phänotypen der Morphogenese und der Bioindikatoren sind zwischen 48 und 72 h ausgeprägt; Daher kann die Bewertung oder Ernte von Kulturen auf Zn2+ -Limitierung zu früh (oder zu spät) nicht den vollständigen Bioindikator-Phänotyp liefern. Kulturen, die an Zn2+ abgereichert sind, weisen Zelllängen auf, die denen ähneln, die mit Zn2+ kontaminiert sind. daher sollten F420 Fluoreszenz und OD600 verwendet werden, um die beiden zu unterscheiden. Ebenso wachsen Zn2+-kontaminierte Kulturen möglicherweise nicht immer besser alsZn 2+-begrenzte Bakterien, aber die F420-Fluoreszenz und die Zelllänge des Wildtyps und der ΔaltRP-Mutante sollten zeigen, ob dieZn 2+-begrenzte Bedingung erreicht ist.

Das Gleiche gilt für M. tuberculosis, da der Verlust des Phänotyps des F420-Bioindikators in Zn2+-begrenzten Kulturen zwischen 8 und 10 Tagen des Wachstums in ZLM ausgeprägt ist. Obwohl M. tuberculosis keinen starken Zn2+-begrenzten Bioindikator-Phänotyp wie M. smegmatis aufweist, wurde die hier vorgestellte Wachstumsmethode verwendet, um den Verlust des F 420-Bioindikator-Phänotyps mit Zn2+-begrenztem Wachstum zu assoziieren, wobei funktionelle Assays und Transkriptomik sowohl bei den virulenten als auch bei den abgeschwächten Stämmen von M. tuberculosis verwendet wurden (ref23und unveröffentlichte Daten). Daher ist die anschließende F420-Fluoreszenz ein zugänglicher Weg, um biologischeZn 2+-limitierende Bedingungen bei M. tuberculosis zu überwachen und zu verifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass der Mechanismus, der zu einer verminderten F420-Fluoreszenz unter Zn2+-limitierenden Bedingungen führt, ungeklärt bleibt, ebenso wie die Unterscheidung, ob die verminderte Fluoreszenz auf eine verminderte Abundanz des Coenzympools als Ganzes oder auf eine Verschiebung seines Redoxzustands zurückzuführen ist, da nur die oxidierte Form Fluoreszenz29 emittiert.

Wie hier gezeigt, ist die Herstellung vonZn 2+-begrenzenden Medien nuanciert, und es gibt zahlreiche Faktoren, die die effektive Konzentration von Zn2+- Ionen in den Medien beeinflussen können, selbst wenn das gleiche Protokoll und die gleichen Reagenzien verwendet werden. Spuren von Zn2+ in ZLM ermöglichen ein ausreichendes Wachstum und eine ausreichende Expression des Zn2+-limitierenden Phänotyps. Diese allmähliche Abnahme von Zn2+ zur Erreichung einer Begrenzung ähnelt dem Wayne-Modell der Hypoxie, bei dem Sauerstoff allmählich von Bakterien verbraucht wird, die in einem geschlossenen Kolben gezüchtet werden30. Da sowohl Hypoxie als auch Zn2+-begrenzte Phänotypen vom Bakterienwachstum abhängen, hören die Bakterien auf, zu wachsen, bevor sie in der Lage sind, das entsprechende morphogene Programm zu durchlaufen, wenn nicht genügend Sauerstoff oder in diesem Modell Zn2+ im Inokulum oder Medium vorhanden ist. Während die Zn2+ -Kontamination ein offensichtlicheres Problem darstellt, wenn man eine Zn2+ -Begrenzung erreichen möchte, könnte der Zn2+ -Abbau aufgrund der Wachstumsbeeinträchtigung und des übersehenen Zn2+-abhängigen Auslösers während des aktiven Wachstums auch ein Problem darstellen. Darüber hinaus wirkt sich die Verwendung von Monochromator- oder Filter-basierten Plattenlesegeräten mit Top- oder Bottom-Reading-Modus für die Fluoreszenzintensität leicht auf den berechneten F375/420-Prozentsatz aus. Daher sind die Werte der einzelnen Labore möglicherweise nicht direkt mit den hier vorgestellten vergleichbar, aber sie sollten ähnlich sein und den gleichen Trends folgen. Daher sollten Methoden und Verfahren zur Herstellung von ZLM, das ein Zn2+-begrenzendes Wachstum liefert, für jedes Labor- und Reinstwassersystem optimiert werden, und die hier vorgestellten Bioindikator-Phänotypen sollten als Standard zur Definition von Zn2+-begrenzenden Bedingungen verwendet werden.

Aufgrund der Schwierigkeit bei der Standardisierung und Reproduktion von Zn2+-begrenzten Wachstumsbedingungen besteht ein zugänglicher Ansatz zur Umgehung einer Zn2+-Kontamination darin, Medien, die ohne Zusatz von Zn2+ hergestellt wurden, einen Chelatbildner zuzusetzen. Dieser Ansatz verwirrt jedoch die wahre biologische Reaktion auf die Zn2+-Begrenzung und schafft oft eine Umgebung, die nach Zn2+ und anderen Mikronährstoffen hungert. Es wurde gezeigt, dass sogarZn 2+-spezifische Chelatbildner die Reaktion auf Eisenmangel hochregulieren, zusätzlich zu der Zn2+-abhängigen transkriptionellen Reaktion in M. tuberculosis23. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von Chelatbildnern eine sorgfältige Titration und Timierung, um eine stark Zn2+-arme Umgebung zu vermeiden, die die biologische Reaktion während des Wechsels von Zn2+-reichen zu Zn2+-begrenzten Bedingungen oder das anhaltende Wachstum in Umgebungen mit begrenzter Verfügbarkeit von freiem Zn2+ nicht widerspiegelt. Schließlich ist die Zugabe von Chelatbildnern möglicherweise nicht mit nachgelagerten Anwendungen (z. B. Makrophagen oder Tierinfektionen) kompatibel. Grundsätzlich unterschiedliche Schlussfolgerungen wurden über die Form und Funktion von Alt-Ribosomen gezogen, die mit Chelatbildnern gewonnen wurden, im Vergleich zu einer allmählichen Zn2+-Depletion in aktiv wachsenden Kulturen17,24. Hier werden verschiedene Phänotypen hervorgehoben, die sich aus relativ geringen Unterschieden in der Wasserreinheit in verschiedenen Chargen von Medien ergeben, selbst wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird. Das hier vorgestellte quantifizierbare, reproduzierbare und biologisch relevante System zur Erzeugung von Alt-Ribosomen, d.h. in Zn2+-begrenzten Wildtyp-Kulturen ohne Zugabe von Chelatoren, bietet eine standardisierte Methode, die für die Vereinheitlichung der Beiträge auf dem gesamten Feld zu einem besseren Verständnis der alternativen Ribosomenbiologie von größter Bedeutung sein wird.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Studie wurde finanziert durch den National Science Foundation (NSF) CAREER Award 1844854, den American Lung Association Innovation Award IA -937538 und das National Institute of Health (NIH) NIAID R21 AI109293 to S.P. Aktuelle Adresse für Allexa D. Burger ist das Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, USA.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1000 mL Vakuumfiltrationssysteme, Standard LineVWR10040-440
125 mL ErlenmeyerkolbenGreiner Bio-One679501
14 mL Kulturröhrchen, Kunststoff, mit Dual-Position-VerschlüssenVWR60818-725
250 mL ErlenmeyerkolbenGreiner Bio-One679502
40X-1000X Labor Binokular Biologische Verbindung MikroskopOmaxM82EZ
50 mL Bioreaktionsröhrchen, sterilVWR76211-286
50 mL Hochleistungszentrifugenröhrchen mit FahnenkappenVWR89039-656
Alcojet Schaumarmes WaschpulverAlconox1404
Ammoniumeisen (III)-citrat, braunThermo ScientificAAA1119930 MW: 265 g/mol, für 1 M Lösung 1,325 g in 5 mL Reinstwasser geben; lichtgeschützt bei 4 °C lagern
RinderserumalbuminThermo ScientificJ10857-A1
Calcium-D-PantothenatThermo ScientificAC243300050
KatalaseSigma-AldrichC1345-10G
Zitronensäure wasserfrei, kristallinFisher ScientificBP339-500
Dextrose wasserfreiFisher ScientificD14-500
Difco Middlebrook 7H9 BouillonBD Diagnostics271310
DiluPhotometer OD600 zur Bestimmung der Zelldichte und Bradford-AssaysImplenOD600-10
GENios FL Mikroplatten-ReaderTecanAbgekündigtes
Glycerin FisherScientificG33-4
Infinite M200 PRO Multimode Microplate ReaderTecanLGE140213-20BL
L-AsparaginThermo ScientificAAB2147336 
L-LeucinThermo ScientificA1231122
Macrofire SP CCD-KameraOptronikZur Verwendung mit dem Olympus-Mikroskop
Magnesiumsulfat-HeptahydratVWR97062-134
Milli-Q Direct 8 WasseraufbereitungssystemMilliporeC85358
Moticam X3MoticEingestellt, ersetzt durch Moticam X5 Plus; zur Verwendung mit Verbundmikroskop
ÖlsäureThermo Scientific031997-14
Olympus BX51 aufrechtes MikroskopOlympusAbgekündigt, ersetzt durch BX53M
Kaliumphosphat, monobasischFisher ScientificBP362-500
Semi-Mikro Zweiseitige Einweg-KunststoffküvettenVWR97000-590
Natriumchlorid, KristallVWRVW1494-01
NatriumhydroxidFisher ScientificS318-500 
Tween 80MP Biomedicals103170
Zinksulfid-Heptahydrat, kristallin/ACSMP Biomedicals219145290

Referenzen

  1. Alloway, B. Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans. Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).
  2. Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean. Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).
  3. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  4. Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).
  5. Outten, C. E., O’Halloran, T. V. Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis. Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).
  6. Merchant, S. S., Helmann, J. D. Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation. Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).
  7. Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).
  8. Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins. PLoS One. 7 (5), e36972(2012).
  9. Prisic, S., et al. Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).
  10. Dow, A., Prisic, S. Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions. PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).
  11. Chen, Y. X., et al. Selective translation by alternative bacterial ribosomes. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).
  12. Natori, Y., et al. A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).
  13. Gabriel, S. E., Helmann, J. D. Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions. J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).
  14. Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context. Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).
  15. Akanuma, G., et al. Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).
  16. Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR. J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).
  17. Li, Y., et al. Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).
  18. Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).
  19. Graham, A. I., et al. Severe zinc depletion of Escherichia coli. J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).
  20. Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).
  21. Gurumurthy, M., et al. A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).
  22. Patino, S., et al. Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).
  23. Dow, A., et al. Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).
  24. Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).
  25. Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis. Front Microbiol. 13, 811774(2022).
  26. Singh, A. K., Reyrat, J. Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs. Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  29. Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H. J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).
  30. Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).

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Zinklimitierungalternative RibosomenBioindikator Ph notypribosomale ProteineZellmorphogeneseCoenzym F420 FluoreszenzMessung der Zelll ngezinklimitierte MedienMycobacterium tuberculosis
Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien
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