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Methodenartikel

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

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DOI:

10.3791/67279

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6. September 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Zwei-Photonen-Laserablationsansatz, der an Zebrafischlarven durchgeführt wurde und als Modell dient, um die Knochenregeneration und die Auswirkungen der Immunantwort auf die Ablation zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) haben eine hervorragende Fähigkeit, verschiedene Organe und Gliedmaßen zu regenerieren. Die Knochenregeneration im Zebrafisch wurde mit verschiedenen Methoden wie Flossenamputation, Schuppenrupfen, Schädeltrepanation und mikroskopischen Ansätzen untersucht. Unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Aufbaus, der mit einem Zwei-Photonen-Laser ausgestattet ist, wurde eine Laserablationsmethode als Läsionsparadigma entwickelt, um knochenbildende Zellen (Osteoblasten) im sich entwickelnden Operkel von Zebrafischlarven abzutragen. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die präzise Ablation von Zellen, da Fläche, Form und Tiefe fein eingestellt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Bildgebung des Bereichs vor und kurz nach der Ablation, so dass kurzfristige Auswirkungen der Verletzung analysiert werden können. In diesem Versuchsaufbau wurde die Immunantwort nach Ablation von Osteoblasten im verletzten Bereich untersucht. Nach der Ablation wurde eine Zunahme der Rekrutierung von Makrophagen beobachtet, was auf die Relevanz ihres Vorhandenseins während der Knochenregeneration hinweist.

Einleitung

Zebrafische regenerieren verschiedene Organe wie Netzhaut, Gehirn, Herz und Bauchspeicheldrüse1. Darüber hinaus regenerieren Zebrafische Skelettelemente, weshalb sie zur Untersuchung der Regeneration von Flossen, Schuppen und Schädelkappen verwendet wurden2. Zur Untersuchung der Gewebe- und Knochenregeneration wurden verschiedene experimentelle Paradigmen verwendet, wie z. B. Flossenresektion (Amputation), Flossenfraktur, Schädeltrepanation 3,4, Kryoverletzung 5,6 oder genetische Ablation 7,8,9. In jüngster Zeit wurden Laserablationsansätze bei Zebrafischen häufig eingesetzt, um die Heilungs- und Regenerationsreaktion nach Verletzungen zu untersuchen 10,11,12,13,14.

Die laservermittelte Ablation wurde in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung eingesetzt, z. B. in der Mechanobiologie, der Entwicklungsbiologie, der Regenerationsforschung und der Tumorchirurgie 10,11,12,15,16,17,18,19. Es gibt verschiedene Methoden der Laserablation, wie z. B. die Verwendung von YAG- (Yttrium-Aluminium-Granat), UV- (ultraviolett) oder 2p-Lasern (Zwei-Photonen)20. Die Laserablation ermöglicht die sehr genaue Entfernung einzelner Zellen oder größerer Gewebeteile und ermöglicht die Untersuchung verschiedener Prozesse, wie z. B. die Reaktion des Immunsystems auf die Tumorablation21 oder während der Regeneration der Operkel des Zebrafisches. Im letzteren Beispiel wurde die Ablation durch das Verschwinden des nukleären und zytoplasmatischen Fluorophorsignals und die Nekrosefärbung bestätigt10,22.

Es ist allgemein bekannt, dass die angeborene Immunantwort und ihre regulierte Kinetik für eine angemessene Geweberegeneration unerlässlich sind. Neutrophile und Makrophagen sind die ersten Zellen, die an die Verletzungsstelle rekrutiert werden, wo sie verschiedene Funktionen erfüllen, wie z. B. die Freisetzung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die Entfernung von Zelltrümmern und den Umbau der extrazellulären Matrix23. Diese Rekrutierung und die anschließende Funktionalisierung der Makrophagen wurden auch bei amputierten Zebrafischflossen24 und dem sich entwickelnden Operkel beobachtet, der einer Laser-"Nanodissektion" unterzogen wurde, die zur Osteoblastenablationführte 10. In letzterem Experiment wurde nach UV-Laser und Zwei-Photonen-Laser-vermittelter Ablation eine Wiederherstellung der Osteoblastenzahl, eine normale Operkelentwicklung und die Rekrutierung von angeborenen Immunzellen (Neutrophile, Makrophagen und osteoklastenähnliche Zellen) in den verletzten Bereich beobachtet10. Experimente an Zebrafischen, bei denen das Immunsystem durch den Einsatz von Glukokortikoiden pharmakologisch unterdrückt wurde, zeigten eine Beeinträchtigung der Regeneration bei fehlregulierter Immunität, was die funktionelle Rolle des Immunsystems bei der Gewebereparatur unterstützt 3,10,25,26.

Hier wird eine Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablationsmethode zur Untersuchung der Biologie der Knochenregeneration in sich entwickelnden Zebrafischknochen beschrieben. Insbesondere wird die Wirkung des Osteoblasten-Ablationsansatzes im Operkel in Bezug auf die Immunantwort gezeigt, die durch ein Monitoring der Rekrutierung von Makrophagen an die Ablationsstelle untersucht wird.

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Protokoll

Das Prüfprotokoll wurde von der Landesdirektion Sachsen genehmigt, Zulassungsnummern 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Die verwendeten Zebrafischstämme wurden gemäß den nationalen Rechtsvorschriften und unter standardisierten Bedingungen, wie bereits beschrieben, gehalten27,28. Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen

  1. Bewahren Sie die Embryonen in 1x E3-Medien auf. Bereiten Sie das 1x E3-Medium vor, indem Sie 170 mL eines 60x E3-Stoffes in 10 l entionisiertem Wasser verdünnen und 2 mL 0,1 % Methylenblau hinzufügen.
    1. Bereiten Sie das 60x E3-Medienmaterial vor, indem Sie 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl2,2 H2O, 4,90 g MgSO4,7 H2O in 1 l entionisiertem autoklaviertem Wasser mischen.
  2. Für die Einbettung der Larven Aliquots aus 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMA) im Voraus vorbereiten und bei Raumtemperatur aufbewahren.
    1. Zur Herstellung von Aliquoten lösen Sie LMA in 1x E3-Medien auf, z. B. 500 mg LMA in 50 mL 1x E3 in einem Erlenmeyerkolben, erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, und geben Sie sie in 1 mL Aliquots in 1,5 mL Röhrchen ab.

2. Zucht von Zebrafischen und Entnahme von Embryonen

HINWEIS: Doppelte transgene Zebrafischlarven, die das Vorhandensein von engagierten Osteoblasten [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 und Makrophagen [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] berichteten, wurden hier verwendet30 (Abbildung 1A).

  1. Setzen Sie Elternzebrafische mit den gewünschten Einzeltransgenen am Abend vor der Paarung in Standard-Paarungskäfige ein.
    HINWEIS: Standard-Paarungskäfige ermöglichen es, die Eier in ein unteres Fach zu gelangen, wo der Zebrafisch sie nicht erreichen kann.
    1. Halten Sie Männchen und Weibchen bis zur Paarung mit einer Trennwand im Paarungskäfig getrennt. Entfernen Sie die Trennwand am Morgen des nächsten Tages, um die Paarung einzuleiten.
  2. Spätestens mittags nehmen Sie die elterlichen Zebrafische aus den Aufzuchtbecken und sammeln die Embryonen, wobei Sie das Wasser aus dem Paarungskäfig durch ein Sieb abseihen.
    HINWEIS: Falls das genaue Alter der Larven entscheidend ist, entnehmen Sie die Embryonen in regelmäßigen Abständen von ca. 30 Minuten. Kupplungsverbindungen sollten in Experimenten mit verschiedenen Versuchsgruppen verwendet werden.
  3. Legen Sie die Embryonen in eine Schale mit einem Durchmesser von 100 mm, die 1x E3-Medium enthält, und bewahren Sie sie in einem Inkubator bei 28 °C31 auf.
  4. Entfernen Sie unbefruchtete Eizellen und tote Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops mit einer Plastikpipette aus der Schale und wechseln Sie täglich 1x das E3-Medium.
  5. Sortieren Sie vor dem Experiment Larven, die positiv für die Reportertransgene sind, mit einem Fluoreszenzstereomikroskop.

3. Einbettung von Larven in niedrigschmelzende Agarose

  1. LMA-Aliquote werden in einem Thermoblock oder Wasserbad bei 65 °C geschmolzen. Sobald das LMA geschmolzen ist, halten Sie es bis zum Einbetten bei 42 °C (Abbildung 1B). Fügen Sie 50 μl 0,4 % MS-222 zu den geschmolzenen 1 ml LMA-Aliquot hinzu, um eine Konzentration von 0,02 % MS-222 für die Anästhesie zu erreichen.
  2. Narkose 4 dpf (Tage nach der Befruchtung) Larven (oder ältere Larven) in 0,02% MS-222 E3 Medien.
  3. Übertragen Sie die anästhesierten Larven mit einer 3-ml-Pasteur-Kunststoffpipette in eine Mikrotiterschale mit Glasboden und entfernen Sie das überschüssige E3-Medium mit derselben Pipette (Abbildung 1B). Vermeiden Sie das Austrocknen der Larven.
    HINWEIS: Es können mehr als eine Larve gleichzeitig in eine Schale eingebettet werden. Es wird empfohlen, 3 bis 5 Larven einzubetten, um genügend Zeit für die Platzierung zu haben.
  4. Nehmen Sie die geschmolzene LMA-Agarose aus dem Wasserbad/Thermoblock und geben Sie einen (kühlenden) Tropfen LMA in die Schale, wobei Sie den Glasboden bedecken, auf dem die Larven positioniert waren. Achte darauf, dass der LMA nicht zu heiß, aber trotzdem flüssig ist.
  5. Setzen Sie dann die Larven in die gewünschte Seitenlage, bevor sich die Agarose verfestigt. Achten Sie hier auf eine seitliche Position, in der sich der Operkel so nah wie möglich am Glasboden der Schale befindet, als Vorbereitung für den Aufbau des inversen Mikroskops (Abbildung 1B).
  6. Lassen Sie die Agarose fest werden und geben Sie dann E3-Medien (mit maximal 0,02 % MS-222) in die Schale, um ein Austrocknen der Agarose zu vermeiden (Abbildung 1B).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einbettungsverfahrens. (A) Doppeltransgenes Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 wurden Zebrafischlarven mit grün markierten operkulären Osteoblasten und Makrophagen mit roter Markierung verwendet. (B) Der Arbeitsablauf des Einbettungsverfahrens, wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. In-vivo-Bildgebung der Larven und Laserablation

  1. Zur Laserablatation von Osteoblasten im sich entwickelnden Operkel des transgenen Zebrafisches Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, verwenden Sie ein inverses Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 25x/0,95 Wasserobjektiv oder einem gleichwertigen Aufbau.
  2. Platzieren Sie die Schale mit den eingebetteten Larven auf dem mikroskopischen Tisch am inversen Mikroskop und positionieren Sie die gewünschte Region für die Ablation in der Mitte des Gesichtsfeldes. Der Operkel kann mit Hilfe des GFP-Fluoreszenzsignals leicht identifiziert werden.
  3. Sobald der Operkel fokussiert und im Sichtfeld des Mikroskops zentriert ist, wählen Sie die Z-Stapel-Einstellungen (oft werden Z-Intervalle von 1-2 μm verwendet), um die gesamte Breite des Operkels abzubilden. Wählen Sie gleichzeitig den Bereich in einer bestimmten Z-Ebene, der abgetragen werden soll (normalerweise in der hinteren Zone des Operkels). Die Zwei-Photonen-Laserablation wird nur in dieser Ebene durchgeführt.
    HINWEIS: Eine höhere Auflösung in der z-Dimension führt zu längeren Bildgebungszeiten, ermöglicht aber später volumetrische Analysen der erfassten Daten.
  4. Bilden Sie den interessierenden Bereich des Operkels vor der Ablation ab. Verwenden Sie für die GFP-Detektion einen Weißlichtlaser bei 488 nm und einen Hybriddetektor im Bereich von 495 nm bis 550 nm oder gleichwertig. Bilden Sie die Makrophagen mit einer 555-nm-Anregung (Weißlichtlaser) mit einem mCherry-Nachweisbereich von 595 bis 780 nm auf einem Hybriddetektor (oder einem gleichwertigen Detektor) ab.
    1. Verwenden Sie das Bildformat 512 x 512 für ein gutes Qualitäts-Zeit-Verhältnis (andere Formate können verwendet werden, wenn eine höhere Auflösung oder alternativ eine höhere Geschwindigkeit gewünscht wird).
      HINWEIS: Ein am Mikroskop installierter temperaturgesteuerter Inkubator kann verwendet und z. B. auf 28 °C eingestellt werden.
  5. Zeichnen Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 25 μm (andere Formen und Größen können je nach Experiment ausgewählt werden) in einer ausgewählten 2D-Ebene und fokussieren Sie das Operkel mit dem ROI-Werkzeug.
  6. Um die Ablation durchzuführen, wenden Sie eine Ablationsleistung (ohne Objektiv gemessen) bei 450 mW an und belichten Sie den ausgewählten Bereich mit einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz und einer Gesamtdauer von 10 s dem Zwei-Photonen-Laser. Während der Ablation kann der Bereich mit einem Hybriddetektor im Bereich von 401-443 nm oder gleichwertig sichtbar gemacht werden.
  7. Bestätigen Sie nach der Ablation die Ablation strukturell, indem Sie denselben Z-Stapel mit den gleichen Einstellungen wie vor der Ablation erneut abbilden. Der abgetragene Bereich enthält keine fluoreszierenden Zellen mehr.

5. Bergung von Larven und Bildgebung zur Überwachung der Rekrutierung von Immunzellen

  1. Wenn die Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen mit Verzögerung durchgeführt werden muss, erholen Sie die Larven aus der Bildgebung und der Anästhesie. Entnehmen Sie die Larven vorsichtig mit einer Pinzette oder einer Seziernadel aus dem LMA.
    1. Entfernen Sie zunächst eine Schicht Agarose, die die Larven bedeckt. Zweitens entfernen Sie die Agarose, die in direktem Kontakt mit den Larven steht. Lassen Sie diesen Schritt aus, wenn eine unmittelbare Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen stattfindet.
  2. Legen Sie die Larven zurück in eine Schale mit reinem E3-Medium und überprüfen Sie ihre Erholung. Die Genesung zeigt sich durch das Schwimmen der Larven.
  3. Bei 4 oder 6 hpl (Stunden nach der Läsion) wird der Operkelbereich erneut mit den gleichen Einstellungen am selben Mikroskop abgebildet, um die Auswirkungen der Ablation auf die Makrophagenrekrutierung zu überprüfen. Wiederholen Sie dazu das Einbetten (Schritt 3) und das Imaging wie zuvor (Schritt 4).
  4. Entfernen Sie nach der Bildgebung die Larven aus dem LMA. Die Opferung der Larven kann je nach gesetzlichen Vorgaben entweder durch Inkubation in Eiswasser oder mit einer Überdosierung von MS-222 in E3 erfolgen. Die Proben können dann für Folgestudien verwendet oder entsorgt werden.

6. Bildanalyse und statistische Analyse

  1. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware wie z.B. Fiji32. Abhängig von der Z-Auflösung der erfassten Daten können Analysen in 2D oder 3D durchgeführt werden.
  2. Quantifizieren Sie die Makrophagen manuell, indem Sie entweder Zellen einbeziehen, die klar voneinander getrennt sind, z. B. durch Unterscheidung der Hauptzellkörper, oder alternativ durch Quantifizierung von Zellen mit einer Kernmarkierung oder durch Messung der Fläche, falls sich Zellen überlappen (nächster Schritt).
  3. Zur Quantifizierung der Fläche erstellen Sie eine Maske, die die Makrophagen umfasst. Verwenden Sie dazu das Tool Image > Adjust > Threshold und erstellen Sie einen ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) in Fidschi. Schließen Sie kleine Partikel im Hintergrund zur Quantifizierung aus.
    1. Messen Sie dann die Fläche (Analysieren > Messen). Überlegen Sie, ob Bereiche mit überlappender zellulärer Fluoreszenz in die Messung einbezogen werden müssen.
      HINWEIS: Hier wurde die zirkuläre Ablationsfläche bei den Flächenmessungen weggelassen, da rekrutierte Makrophagen in diesem Bereich nicht unterschieden werden können.
  4. Erstellen Sie Diagramme, die die Messergebnisse mit geeigneter Software darstellen. Um die Daten vor und nach der Ablation zu vergleichen, führen Sie einen entsprechenden statistischen Test durch (hier wurde ein gepaarter einseitiger t-Test durchgeführt).
    HINWEIS: Die Figuren können mit Hilfe von Fotobearbeitungs- und Grafikdesign-Software vorbereitet werden.

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Ergebnisse

Die Laserablation wurde wie im obigen Protokoll angegeben durchgeführt. Das GFP-Signal der Osteoblasten im ablierten Bereich verschwand sofort nach der Ablation. Um die Reaktion der Osteoblastenablation in Bezug auf die Immunantwort zu untersuchen, wurde das Vorhandensein von Makrophagen in 6 dpf Larven vor und bei 6 hpl abgebildet. Vor der Ablation wurden nur sehr wenige Makrophagen im Operkelbereich10 beobachtet (Abbildung 2). Bei 6 hpl wurde eine starke Akkumulatio...

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Diskussion

Die Laserablation wird in verschiedenen Disziplinen der biologischen Forschung eingesetzt. Insbesondere war es nützlich als Methode zur Untersuchung der Geweberegeneration 10,11,12. Zum Beispiel wurden kürzlich die Rekrutierungs- und Phänotypveränderungen von angeborenen Immunzellen im Laufe der Zeit mit UV-Laser- oder Zwei-Photonen-Laserablationsassays analysiert, zusammen mit der Gewinnung von...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Transregio 67 (Projekt 387653785), das DFG SPP 2084 μBone (Projekt KN 1102/2-1) bis FK. Diese Arbeit wurde von der Light Microscopy Facility (DFG-Projekt 413875620), einer Core Facility der CMCB Technology Platform der TU Dresden, unterstützt. Die Arbeit an der TU Dresden wurde aus steuerlichen Mitteln auf der Grundlage des vom Sächsischen Landtag beschlossenen Haushaltsplans mitfinanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Calciumchlorid-Dihydrat, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Zellkulturschale, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Spitzenform gerade, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon 6-Well-PlatteCorning353502
Mikrotiterschale mit GlasbodenMatTekP35G-1,5-14-C35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 14 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet
Insight X3 MultiphotonenlaserSpectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X, Leica Microsystems
Niedrigschmelzende Agarose Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
Magnesiumsulfat Heptahydrat, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Gegenkäfigeviele Varianten, z.B. Tecniplast
MethylenblauCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Kaliumchlorid, KClPanReac AppliChem131494
Natriumchlorid, NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALKELeica MicrosystemsAusgestattet mit einem Insight X3 Multiphotonenlaser und Leica Application Suite Software
Edelstahl-PräpariernadelBochem12010140 mm
Stereomikroskop System SZX16OlympusAusgestattet mit einem LED-Beleuchtungssockel SZX2-ILLTQ
Thermostatschränke TS - WTWxylemTS 608/2-iFür die Inkubation (Embryo)
Transfer Pipette, 3,5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 Version 4.7.1.0.Zeissausgestattet mit Axiocam MRm Kamera und AxioVision Software

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