Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Zwei-Photonen-Laserablationsansatz, der an Zebrafischlarven durchgeführt wurde und als Modell dient, um die Knochenregeneration und die Auswirkungen der Immunantwort auf die Ablation zu untersuchen.

Abstract

Zebrafische (Danio rerio) haben eine hervorragende Fähigkeit, verschiedene Organe und Gliedmaßen zu regenerieren. Die Knochenregeneration im Zebrafisch wurde mit verschiedenen Methoden wie Flossenamputation, Schuppenrupfen, Schädeltrepanation und mikroskopischen Ansätzen untersucht. Unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Aufbaus, der mit einem Zwei-Photonen-Laser ausgestattet ist, wurde eine Laserablationsmethode als Läsionsparadigma entwickelt, um knochenbildende Zellen (Osteoblasten) im sich entwickelnden Operkel von Zebrafischlarven abzutragen. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die präzise Ablation von Zellen, da Fläche, Form und Tiefe fein eingestellt werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Bildgebung des Bereichs vor und kurz nach der Ablation, so dass kurzfristige Auswirkungen der Verletzung analysiert werden können. In diesem Versuchsaufbau wurde die Immunantwort nach Ablation von Osteoblasten im verletzten Bereich untersucht. Nach der Ablation wurde eine Zunahme der Rekrutierung von Makrophagen beobachtet, was auf die Relevanz ihres Vorhandenseins während der Knochenregeneration hinweist.

Introduction

Zebrafische regenerieren verschiedene Organe wie Netzhaut, Gehirn, Herz und Bauchspeicheldrüse¹. Darüber hinaus regenerieren Zebrafische Skelettelemente, weshalb sie zur Untersuchung der Regeneration von Flossen, Schuppen und Schädelkappen verwendet wurden2^. Zur Untersuchung der Gewebe- und Knochenregeneration wurden verschiedene experimentelle Paradigmen verwendet, wie z. B. Flossenresektion (Amputation), Flossenfraktur, Schädeltrepanation ^3,4, Kryoverletzung ^5,6 oder genetische Ablation ^7,8,9. In jüngster Zeit wurden Laserablationsansätze bei Zebrafischen häufig eingesetzt, um die Heilungs- und Regenerationsreaktion nach Verletzungen zu untersuchen 10,11,12,13,14.

Die laservermittelte Ablation wurde in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung eingesetzt, z. B. in der Mechanobiologie, der Entwicklungsbiologie, der Regenerationsforschung und der Tumorchirurgie 10,11,12,15,16,17,18,19. Es gibt verschiedene Methoden der Laserablation, wie z. B. die Verwendung von YAG- (Yttrium-Aluminium-Granat), UV- (ultraviolett) oder 2p-Lasern (Zwei-Photonen)²⁰. Die Laserablation ermöglicht die sehr genaue Entfernung einzelner Zellen oder größerer Gewebeteile und ermöglicht die Untersuchung verschiedener Prozesse, wie z. B. die Reaktion des Immunsystems auf die Tumorablation²¹ oder während der Regeneration der Operkel des Zebrafisches. Im letzteren Beispiel wurde die Ablation durch das Verschwinden des nukleären und zytoplasmatischen Fluorophorsignals und die Nekrosefärbung bestätigt^10,22.

Es ist allgemein bekannt, dass die angeborene Immunantwort und ihre regulierte Kinetik für eine angemessene Geweberegeneration unerlässlich sind. Neutrophile und Makrophagen sind die ersten Zellen, die an die Verletzungsstelle rekrutiert werden, wo sie verschiedene Funktionen erfüllen, wie z. B. die Freisetzung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die Entfernung von Zelltrümmern und den Umbau der extrazellulären Matrix²³. Diese Rekrutierung und die anschließende Funktionalisierung der Makrophagen wurden auch bei amputierten Zebrafischflossen²⁴ und dem sich entwickelnden Operkel beobachtet, der einer Laser-"Nanodissektion" unterzogen wurde, die zur Osteoblastenablation^{führte 10}. In letzterem Experiment wurde nach UV-Laser und Zwei-Photonen-Laser-vermittelter Ablation eine Wiederherstellung der Osteoblastenzahl, eine normale Operkelentwicklung und die Rekrutierung von angeborenen Immunzellen (Neutrophile, Makrophagen und osteoklastenähnliche Zellen) in den verletzten Bereich beobachtet¹⁰. Experimente an Zebrafischen, bei denen das Immunsystem durch den Einsatz von Glukokortikoiden pharmakologisch unterdrückt wurde, zeigten eine Beeinträchtigung der Regeneration bei fehlregulierter Immunität, was die funktionelle Rolle des Immunsystems bei der Gewebereparatur unterstützt 3,10,25,26.

Hier wird eine Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablationsmethode zur Untersuchung der Biologie der Knochenregeneration in sich entwickelnden Zebrafischknochen beschrieben. Insbesondere wird die Wirkung des Osteoblasten-Ablationsansatzes im Operkel in Bezug auf die Immunantwort gezeigt, die durch ein Monitoring der Rekrutierung von Makrophagen an die Ablationsstelle untersucht wird.

Protocol

Das Prüfprotokoll wurde von der Landesdirektion Sachsen genehmigt, Zulassungsnummern 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Die verwendeten Zebrafischstämme wurden gemäß den nationalen Rechtsvorschriften und unter standardisierten Bedingungen, wie bereits beschrieben, gehalten^27,28. Die Einzelheiten zu allen Reagenzien und der Ausrüstung, die in der Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen

1. Bewahren Sie die Embryonen in 1x E3-Medien auf. Bereiten Sie das 1x E3-Medium vor, indem Sie 170 mL eines 60x E3-Stoffes in 10 l entionisiertem Wasser verdünnen und 2 mL 0,1 % Methylenblau hinzufügen.
   1. Bereiten Sie das 60x E3-Medienmaterial vor, indem Sie 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl_2,2 H₂O, 4,90 g MgSO_4,7 H₂O in 1 l entionisiertem autoklaviertem Wasser mischen.
2. Für die Einbettung der Larven Aliquots aus 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMA) im Voraus vorbereiten und bei Raumtemperatur aufbewahren.
   1. Zur Herstellung von Aliquoten lösen Sie LMA in 1x E3-Medien auf, z. B. 500 mg LMA in 50 mL 1x E3 in einem Erlenmeyerkolben, erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat, und geben Sie sie in 1 mL Aliquots in 1,5 mL Röhrchen ab.

2. Zucht von Zebrafischen und Entnahme von Embryonen

HINWEIS: Doppelte transgene Zebrafischlarven, die das Vorhandensein von engagierten Osteoblasten [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)^zf132]²⁹ und Makrophagen [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)^gl23] berichteten, wurden hier verwendet³⁰ (Abbildung 1A).

1. Setzen Sie Elternzebrafische mit den gewünschten Einzeltransgenen am Abend vor der Paarung in Standard-Paarungskäfige ein.
   HINWEIS: Standard-Paarungskäfige ermöglichen es, die Eier in ein unteres Fach zu gelangen, wo der Zebrafisch sie nicht erreichen kann.
   1. Halten Sie Männchen und Weibchen bis zur Paarung mit einer Trennwand im Paarungskäfig getrennt. Entfernen Sie die Trennwand am Morgen des nächsten Tages, um die Paarung einzuleiten.
2. Spätestens mittags nehmen Sie die elterlichen Zebrafische aus den Aufzuchtbecken und sammeln die Embryonen, wobei Sie das Wasser aus dem Paarungskäfig durch ein Sieb abseihen.
   HINWEIS: Falls das genaue Alter der Larven entscheidend ist, entnehmen Sie die Embryonen in regelmäßigen Abständen von ca. 30 Minuten. Kupplungsverbindungen sollten in Experimenten mit verschiedenen Versuchsgruppen verwendet werden.
3. Legen Sie die Embryonen in eine Schale mit einem Durchmesser von 100 mm, die 1x E3-Medium enthält, und bewahren Sie sie in einem Inkubator bei 28 °C³¹ auf.
4. Entfernen Sie unbefruchtete Eizellen und tote Embryonen mit Hilfe eines Stereomikroskops mit einer Plastikpipette aus der Schale und wechseln Sie täglich 1x das E3-Medium.
5. Sortieren Sie vor dem Experiment Larven, die positiv für die Reportertransgene sind, mit einem Fluoreszenzstereomikroskop.

3. Einbettung von Larven in niedrigschmelzende Agarose

1. LMA-Aliquote werden in einem Thermoblock oder Wasserbad bei 65 °C geschmolzen. Sobald das LMA geschmolzen ist, halten Sie es bis zum Einbetten bei 42 °C (Abbildung 1B). Fügen Sie 50 μl 0,4 % MS-222 zu den geschmolzenen 1 ml LMA-Aliquot hinzu, um eine Konzentration von 0,02 % MS-222 für die Anästhesie zu erreichen.
2. Narkose 4 dpf (Tage nach der Befruchtung) Larven (oder ältere Larven) in 0,02% MS-222 E3 Medien.
3. Übertragen Sie die anästhesierten Larven mit einer 3-ml-Pasteur-Kunststoffpipette in eine Mikrotiterschale mit Glasboden und entfernen Sie das überschüssige E3-Medium mit derselben Pipette (Abbildung 1B). Vermeiden Sie das Austrocknen der Larven.
   HINWEIS: Es können mehr als eine Larve gleichzeitig in eine Schale eingebettet werden. Es wird empfohlen, 3 bis 5 Larven einzubetten, um genügend Zeit für die Platzierung zu haben.
4. Nehmen Sie die geschmolzene LMA-Agarose aus dem Wasserbad/Thermoblock und geben Sie einen (kühlenden) Tropfen LMA in die Schale, wobei Sie den Glasboden bedecken, auf dem die Larven positioniert waren. Achte darauf, dass der LMA nicht zu heiß, aber trotzdem flüssig ist.
5. Setzen Sie dann die Larven in die gewünschte Seitenlage, bevor sich die Agarose verfestigt. Achten Sie hier auf eine seitliche Position, in der sich der Operkel so nah wie möglich am Glasboden der Schale befindet, als Vorbereitung für den Aufbau des inversen Mikroskops (Abbildung 1B).
6. Lassen Sie die Agarose fest werden und geben Sie dann E3-Medien (mit maximal 0,02 % MS-222) in die Schale, um ein Austrocknen der Agarose zu vermeiden (Abbildung 1B).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Einbettungsverfahrens. (A) Doppeltransgenes Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)^29,30 wurden Zebrafischlarven mit grün markierten operkulären Osteoblasten und Makrophagen mit roter Markierung verwendet. (B) Der Arbeitsablauf des Einbettungsverfahrens, wie in Schritt 3 des Protokolls beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. In-vivo-Bildgebung der Larven und Laserablation

1. Zur Laserablatation von Osteoblasten im sich entwickelnden Operkel des transgenen Zebrafisches Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)^29,30, verwenden Sie ein inverses Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 25x/0,95 Wasserobjektiv oder einem gleichwertigen Aufbau.
2. Platzieren Sie die Schale mit den eingebetteten Larven auf dem mikroskopischen Tisch am inversen Mikroskop und positionieren Sie die gewünschte Region für die Ablation in der Mitte des Gesichtsfeldes. Der Operkel kann mit Hilfe des GFP-Fluoreszenzsignals leicht identifiziert werden.
3. Sobald der Operkel fokussiert und im Sichtfeld des Mikroskops zentriert ist, wählen Sie die Z-Stapel-Einstellungen (oft werden Z-Intervalle von 1-2 μm verwendet), um die gesamte Breite des Operkels abzubilden. Wählen Sie gleichzeitig den Bereich in einer bestimmten Z-Ebene, der abgetragen werden soll (normalerweise in der hinteren Zone des Operkels). Die Zwei-Photonen-Laserablation wird nur in dieser Ebene durchgeführt.
   HINWEIS: Eine höhere Auflösung in der z-Dimension führt zu längeren Bildgebungszeiten, ermöglicht aber später volumetrische Analysen der erfassten Daten.
4. Bilden Sie den interessierenden Bereich des Operkels vor der Ablation ab. Verwenden Sie für die GFP-Detektion einen Weißlichtlaser bei 488 nm und einen Hybriddetektor im Bereich von 495 nm bis 550 nm oder gleichwertig. Bilden Sie die Makrophagen mit einer 555-nm-Anregung (Weißlichtlaser) mit einem mCherry-Nachweisbereich von 595 bis 780 nm auf einem Hybriddetektor (oder einem gleichwertigen Detektor) ab.
   1. Verwenden Sie das Bildformat 512 x 512 für ein gutes Qualitäts-Zeit-Verhältnis (andere Formate können verwendet werden, wenn eine höhere Auflösung oder alternativ eine höhere Geschwindigkeit gewünscht wird).
      HINWEIS: Ein am Mikroskop installierter temperaturgesteuerter Inkubator kann verwendet und z. B. auf 28 °C eingestellt werden.
5. Zeichnen Sie einen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von 25 μm (andere Formen und Größen können je nach Experiment ausgewählt werden) in einer ausgewählten 2D-Ebene und fokussieren Sie das Operkel mit dem ROI-Werkzeug.
6. Um die Ablation durchzuführen, wenden Sie eine Ablationsleistung (ohne Objektiv gemessen) bei 450 mW an und belichten Sie den ausgewählten Bereich mit einer Scangeschwindigkeit von 400 Hz und einer Gesamtdauer von 10 s dem Zwei-Photonen-Laser. Während der Ablation kann der Bereich mit einem Hybriddetektor im Bereich von 401-443 nm oder gleichwertig sichtbar gemacht werden.
7. Bestätigen Sie nach der Ablation die Ablation strukturell, indem Sie denselben Z-Stapel mit den gleichen Einstellungen wie vor der Ablation erneut abbilden. Der abgetragene Bereich enthält keine fluoreszierenden Zellen mehr.

5. Bergung von Larven und Bildgebung zur Überwachung der Rekrutierung von Immunzellen

1. Wenn die Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen mit Verzögerung durchgeführt werden muss, erholen Sie die Larven aus der Bildgebung und der Anästhesie. Entnehmen Sie die Larven vorsichtig mit einer Pinzette oder einer Seziernadel aus dem LMA.
   1. Entfernen Sie zunächst eine Schicht Agarose, die die Larven bedeckt. Zweitens entfernen Sie die Agarose, die in direktem Kontakt mit den Larven steht. Lassen Sie diesen Schritt aus, wenn eine unmittelbare Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen stattfindet.
2. Legen Sie die Larven zurück in eine Schale mit reinem E3-Medium und überprüfen Sie ihre Erholung. Die Genesung zeigt sich durch das Schwimmen der Larven.
3. Bei 4 oder 6 hpl (Stunden nach der Läsion) wird der Operkelbereich erneut mit den gleichen Einstellungen am selben Mikroskop abgebildet, um die Auswirkungen der Ablation auf die Makrophagenrekrutierung zu überprüfen. Wiederholen Sie dazu das Einbetten (Schritt 3) und das Imaging wie zuvor (Schritt 4).
4. Entfernen Sie nach der Bildgebung die Larven aus dem LMA. Die Opferung der Larven kann je nach gesetzlichen Vorgaben entweder durch Inkubation in Eiswasser oder mit einer Überdosierung von MS-222 in E3 erfolgen. Die Proben können dann für Folgestudien verwendet oder entsorgt werden.

6. Bildanalyse und statistische Analyse

1. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware wie z.B. Fiji³². Abhängig von der Z-Auflösung der erfassten Daten können Analysen in 2D oder 3D durchgeführt werden.
2. Quantifizieren Sie die Makrophagen manuell, indem Sie entweder Zellen einbeziehen, die klar voneinander getrennt sind, z. B. durch Unterscheidung der Hauptzellkörper, oder alternativ durch Quantifizierung von Zellen mit einer Kernmarkierung oder durch Messung der Fläche, falls sich Zellen überlappen (nächster Schritt).
3. Zur Quantifizierung der Fläche erstellen Sie eine Maske, die die Makrophagen umfasst. Verwenden Sie dazu das Tool Image > Adjust > Threshold und erstellen Sie einen ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) in Fidschi. Schließen Sie kleine Partikel im Hintergrund zur Quantifizierung aus.
   1. Messen Sie dann die Fläche (Analysieren > Messen). Überlegen Sie, ob Bereiche mit überlappender zellulärer Fluoreszenz in die Messung einbezogen werden müssen.
      HINWEIS: Hier wurde die zirkuläre Ablationsfläche bei den Flächenmessungen weggelassen, da rekrutierte Makrophagen in diesem Bereich nicht unterschieden werden können.
4. Erstellen Sie Diagramme, die die Messergebnisse mit geeigneter Software darstellen. Um die Daten vor und nach der Ablation zu vergleichen, führen Sie einen entsprechenden statistischen Test durch (hier wurde ein gepaarter einseitiger t-Test durchgeführt).
   HINWEIS: Die Figuren können mit Hilfe von Fotobearbeitungs- und Grafikdesign-Software vorbereitet werden.

Results

Die Laserablation wurde wie im obigen Protokoll angegeben durchgeführt. Das GFP-Signal der Osteoblasten im ablierten Bereich verschwand sofort nach der Ablation. Um die Reaktion der Osteoblastenablation in Bezug auf die Immunantwort zu untersuchen, wurde das Vorhandensein von Makrophagen in 6 dpf Larven vor und bei 6 hpl abgebildet. Vor der Ablation wurden nur sehr wenige Makrophagen im Operkelbereich¹⁰ beobachtet (Abbildung 2). Bei 6 hpl wurde eine starke Akkumulation von Makrophagen in der ablierten Operkelregion und eine erhöhte Anzahl von Makrophagen im Gesichtsfeld, einschließlich des Operkels und des Bereichs um den Operkel, nachgewiesen¹⁰ (Abbildung 2).

Abbildung 2: Makrophagenrekrutierung bei 6 hpl in 6 dpf Zebrafischlarven. Operkelbereich ohne Ablation und bei 6 hpl. Operkuläre Osteoblasten sind grün markiert, Makrophagen magenta, und der gestrichelte Kreis zeigt den laserablierten Bereich. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Rekrutierung von Makrophagen wurde auch bei 4 dpf Larven mit viel kleineren Operkeln bei 4 hpl analysiert, wobei ähnliche Ergebnisse beobachtet wurden (Abbildung 3). Die Quantifizierung der Makrophagenzahl (außerhalb der unmittelbaren Laserablationsstelle) zeigte einen Anstieg innerhalb des untersuchten Zeitrahmens (4,00 ± 2,37 Makrophagen vor der Ablation versus 7,00 ± 2,76 Makrophagen bei 4 hpl) (Abbildung 3B). Ebenso nahm die Makrophagenfläche (gemessen in^{μm 2}, 785,8 μm² ± 723,1^{μm 2} vor der Ablation gegenüber 1553^{μm 2} ± 869,9^{μm 2} bei 4 hpl) zu (Abbildung 3C). Da Makrophagen manchmal schwer zu unterscheiden sind, empfiehlt es sich, die Makrophagenfläche anstelle der Makrophagenzahl zu messen, wie es hier geschehen ist.

Abbildung 3: Makrophagenrekrutierung bei 4 hpl in 4 dpf Zebrafischlarven. (A) Operkelbereich ohne Ablation und bei 4 hpl. Operkuläre Osteoblasten sind grün markiert, Makrophagen magenta, und der gestrichelte Kreis zeigt den laserablierten Bereich. Maßstabsbalken: 50 μm. (B) Quantifizierung der Anzahl der Makrophagen im Operkelbereich direkt vor (0 hpl) und nach der Ablation (4 hpl). (C) Quantifizierung der Makrophagenfläche (ohne Laserablationsstelle). Gepaarte einseitige t-Tests. Jeder Punkt stellt die Daten einer Larve dar, und es wird der mittlere ± SD angezeigt, n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Laserablation wird in verschiedenen Disziplinen der biologischen Forschung eingesetzt. Insbesondere war es nützlich als Methode zur Untersuchung der Geweberegeneration 10,11,12. Zum Beispiel wurden kürzlich die Rekrutierungs- und Phänotypveränderungen von angeborenen Immunzellen im Laufe der Zeit mit UV-Laser- oder Zwei-Photonen-Laserablationsassays analysiert, zusammen mit der Gewinnung von Osteoblasten an der Laserablationsstelle¹⁰. Die Live-Bildgebung der Rekrutierung von Immunzellen wurde bis zu 12 Stunden nach der Läsion (hpl) durchgeführt; Längere Bildgebungszeiten sind jedoch mit entsprechenden Anpassungen in der Anästhesie und der Genehmigung durch die jeweiligen Behörden vorstellbar. In Geurtzen et al. wurden Analysen bis zu mehreren Tagen nach der Laserablation durchgeführt und halfen, das entzündliche Milieu an der Ablationsstelle zu definieren und die unterstützende Rolle von Makrophagen bei der Knochenregeneration zu etablieren¹⁰. Viele weitere Anwendungen, wie z.B. die Untersuchung der Rolle der Freisetzung von³³ bei reaktiven Sauerstoffspezies beim Zelltod im Knochengewebe, sind denkbar.

Einer der Vorteile der Verwendung der Zwei-Photonen-Laser-vermittelten Zellablation ist die Möglichkeit, sie mit der konfokalen Bildgebung zu kombinieren. Die hier verwendete Software (siehe Materialtabelle) kann auf einen Modus (Live-Daten-Modus) eingestellt werden, in dem Bildgebung und Abtrag nacheinander erfolgen, was den Prozess beschleunigt. Ein weiterer Vorteil der Technologie ist die Genauigkeit der Ablation. Die Größe und Form des Abtrags kann in der Software sehr genau eingestellt werden. In der hier vorgestellten Versuchsanordnung wurde eine kreisförmige Fläche mit einem Durchmesser von 25 μm für die Ablation ausgewählt. Bei anderen Ablationsexperimenten in Drosophila wurden jedoch lineare 25-μm-Ablationen verwendet, um die Gewebespannung im embryonalen Epithel zu reduzieren, indem benachbarte-Nachbar-Zellübergänge durchtrennt^{wurden 34}. Diese Genauigkeit ermöglicht die Ablation einer bestimmten und kontrollierten Anzahl von Zellen, Einzelzellen oder sogar Zellmembranen.

Bemerkenswert ist, dass die Art der Läsion, die mit einem Zwei-Photonen-Laser durchgeführt wird, nicht den natürlich auftretenden Verletzungen und dem Zelltod ähnelt, was in der Regenerationsforschung, aber auch in anderen Disziplinen berücksichtigt werden muss. Insbesondere erzeugen Laserablationen sehr fokussierte Läsionen, indem sie die Zellen in der interessierenden Region²⁰ vollständig zerstören (verbrennen) und dabei das umgebende Gewebe nur minimal schädigen, während mechanische oder andere Arten von Verletzungen dazu neigen, mehrere Gewebetypen und -schichten in einem breiteren Maßstab zu betreffen. Dies kann zu vielfältigen Folgen führen, die verschiedene Arten des Zelltods (z. B. Nekrose, Apoptose, Autophagie)³⁵ und unterschiedliche regenerative Ergebnisse mit sich bringen. Darüber hinaus können sich die Reaktionen auf die Laserablation in zellulärer und molekularer Hinsicht unterscheiden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Zellen, die die Laserläsionsstelle umgeben, zwar die Integrität der Plasmamembran verlieren können, aber den Schaden überleben und die Integrität wiederherstellen können³⁶. Die Laserablation führt auch zu Bereichen der geschädigten extrazellulären Matrix, die durch "thermische Explosionen" im Zentrum des angelegten Laserstrahls und auch durch starke Wärmeeinwirkung in den unmittelbar benachbarten Zellen entstehen können^10,37. Nichtsdestotrotz zeigen Zellen, die Laserablationsstellen umgeben, eine erhöhte Anzahl apoptotischer Körper, wie für laserabliertes Herzgewebe³⁸ gezeigt, und eine Immunantwort wird ausgelöst, wie hier gezeigt. Zusätzlich zu den beschriebenen Unterschieden könnte eine weitere Einschränkung von lasergestützten Ablationsassays die Tiefe sein, in der die Verletzung durchgeführt werden kann, und die begrenzte Größe der Proben. Strukturen, die in dicken Proben verborgen sind, werden möglicherweise nicht angemessen abgetragen, und die Bildgebung ist schwierig. Dies hängt jedoch sehr stark vom verwendeten Mikroskop und Laser sowie vom Objektiv und der Einbettung ab.

Die Einbettung der Larven in eine Weise, dass der Operkel in unmittelbarer Nähe des Glasbodens der Schale platziert wird, ist unerlässlich, falls ein umgekehrter Aufbau verwendet wird, wie in dem vorgestellten Protokoll. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, die Temperatur der LMA zu testen, bevor sie auf die Larven aufgetragen wird (Schritt 3.4), da heiße Agarose die Larven schädigt. Um dies zu vermeiden, nehmen Sie das LMA-Aliquot frühzeitig aus dem Thermoblock, z. B. indem Sie das übrig gebliebene E3-Medium aus der Glasbodenschale entfernen, und testen Sie die Temperatur, z. B. auf der Haut des Handgelenks. Der LMA soll warm, aber nicht heiß sein.

Sobald die Larven mit LMA bedeckt sind, ist es wichtig, sie schnell in die richtige Position zu bringen, bevor sich das LMA zu verfestigen beginnt. Die seitliche Position ist am einfachsten zu erreichen; In der vorliegenden Studie war die gewünschte Position lateral mit einer leichten Neigung zur ventralen Seite. Falls sich das LMA verfestigt, bevor die Larven richtig positioniert sind, ist es möglich, das LMA zu entfernen (wie in Schritt 5.1) und das Einbetten zu wiederholen. Ebenso ist es wichtig, dass der Bereich, der abgebildet (und laserabliert) werden soll, so nah wie möglich am Glasboden der Schüssel liegt, um eine maximale Bildqualität und Zellablation zu erzielen, obwohl dies auch vom Arbeitsabstand des Objektivs abhängt.

Es ist möglich, mehr als eine Larve für die Bildgebung in dieselbe Schale einzubetten. Dies spart Zeit und nutzt das LMA besser aus. Die Anzahl der Larven, die eingelagert werden können, hängt von der Erfahrung des Experimentators ab, aber es werden 3-5 Larven empfohlen.

Die Laserablation kann auch mit aufrechten mikroskopischen Aufbauten unter Verwendung von Tauchlinsen durchgeführt werden. In diesem Fall ist es wichtig, die Larven mit einer leicht ventralen Ansicht (von oben) einzubetten, um eine gute Abbildungsqualität und einen Laserablationserfolg des Operkels zu ermöglichen. Außerdem sollte nur eine dünne Schicht LMA die Larven bedecken, um eine gute Anregung und Detektion von Fluoreszenzsignalen zu ermöglichen.

In diesem Protokoll wird ein Zwei-Photonen-Laser-vermittelter Ablationsaufbau für Osteoblasten als eine Methode zur Durchführung von Läsionen in sich entwickelnden Knochen, insbesondere im Operkel, beschrieben. Diese Methode kann angepasst werden, um Zellen in anderen Knochen von sich entwickelnden Zebrafischen abzutragen. Darüber hinaus ist es im Allgemeinen ein nützlicher Ansatz, um die Regeneration von verletztem Gewebe zu untersuchen^11,12. Die Leichtigkeit, mit der Ablationen und Gewebeschnitte unterschiedlicher Größe und Form durchgeführt werden können, ermöglicht den Einsatz in verschiedenen Versuchsaufbauten und Forschungsbereichen 15,17,18,19,21,34. Insgesamt ist die Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation eine sehr anpassungsfähige Methode - für verschiedene Gewebe, Organismen und sogar in vitro - und sie stellt ein wichtiges Werkzeug in der biologischen Forschung dar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calciumchlorid-Dihydrat, CaCl2· H2O	Carl Roth	5239.1
Zellkulturschale, PS, 100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	Spitzenform gerade, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon 6-Well-Platte	Corning	353502
Mikrotiterschale mit Glasboden	MatTek	P35G-1,5-14-C	35 mm Schale, Nr. 1,5 Deckglas, 14 mm Glasdurchmesser, unbeschichtet
Insight X3 Multiphotonenlaser	Spectra-Physics
Leica Application Suite	LAS X, Leica Microsystems
Niedrigschmelzende Agarose	Biozyme	840101	Biozym Plaque Agarose
Magnesiumsulfat Heptahydrat, MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
Gegenkäfige			viele Varianten, z.B. Tecniplast
Methylenblau	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
Kaliumchlorid, KCl	PanReac AppliChem	131494
Natriumchlorid, NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 FALKE	Leica Microsystems		Ausgestattet mit einem Insight X3 Multiphotonenlaser und Leica Application Suite Software
Edelstahl-Präpariernadel	Bochem	12010	140 mm
Stereomikroskop System SZX16	Olympus		Ausgestattet mit einem LED-Beleuchtungssockel SZX2-ILLTQ
Thermostatschränke TS - WTW	xylem	TS 608/2-i	Für die Inkubation (Embryo)
Transfer Pipette, 3,5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm, LD-PE, transparent
Zeiss SteREO Discovery.V12 Version 4.7.1.0.	Zeiss		ausgestattet mit Axiocam MRm Kamera und AxioVision Software