Messung von vier uterinen NK-Zell-Subtypen mittels multiplexierter fluoreszierender immunhistochemischer Färbung bei Frauen mit wiederholtem Implantationsversagen

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine bahnbrechende Methode zur Quantifizierung von Untergruppen natürlicher Killerzellen der Gebärmutter während des Implantationsfensters unter Verwendung fortschrittlicher immunhistochemischer Multiplex-Fluoreszenz-Färbetechniken vor.

Zusammenfassung

Die Immunhistochemie (IHC) spielt eine entscheidende Rolle in der biologischen Forschung und klinischen Diagnose und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen. Traditionelle IHC-Färbemethoden haben jedoch Einschränkungen bei der Unterscheidung verschiedener Subtypen von Immunzellen. Diese Herausforderung hat Wissenschaftler dazu veranlasst, neue Technologien und Methoden zur präzisen Identifizierung und Differenzierung von Immunzell-Subtypen zu erforschen. In den letzten Jahren hat sich die Multiplex-IHC als Lösung herauskristallisiert, die den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene und deren Visualisierung innerhalb derselben Gewebeprobe ermöglicht. Natürliche Killerzellen der Gebärmutter (uNK) spielen eine zentrale Rolle bei frühen Schwangerschaftsprozessen, einschließlich der Dezidualisierung, des Umbaus der Spiralarterien der Gebärmutter und der Embryonenimplantation. Verschiedene Subtypen von uNK-Zellen weisen unterschiedliche Funktionen auf, die es ihnen ermöglichen, verschiedene biologische Ereignisse für eine erfolgreiche Embryonalentwicklung und Schwangerschaft zu koordinieren. Daher ist eine eingehende Erforschung der uNK-Zellsubtypen unerlässlich, um die Mechanismen der Immunregulation während der Schwangerschaft aufzuklären. Solche Studien liefern wertvolle Erkenntnisse und neuartige Ansätze für die Behandlung verwandter Erkrankungen wie Unfruchtbarkeit und wiederkehrender Fortpflanzungsstörungen. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Multiplex-IHC-Färbeprotokoll zur Untersuchung der Dichte von vier Subtypen von uNK-Zellen in Endometriumproben während des Implantationsfensters (WOI) vorgestellt. Das Protokoll umfasst die Probenvorbereitung, die Optimierung von Subtyp-Markern, mikroskopische Bildgebung und Datenanalysen. Dieses Multiplex-IHC-Färbeprotokoll bietet eine hohe Spezifität und Sensitivität und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis verschiedener uNK-Zell-Subtypen und bietet Forschern damit ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Feinheiten und Mechanismen der Immunregulation während der Schwangerschaft zu erforschen.

Einleitung

Die erste dokumentierte Lebendgeburt nach In-vitro-Fertilisation-Embryotransfer (IVF-ET) wurde 1978 berichtet. In den letzten 40 Jahren gab es bei unfruchtbaren Paaren eine hohe Nachfrage nach der Unterstützung durch IVF-ET¹. Im Jahr 2021 begannen 238.126 Patienten in den Vereinigten Staaten mit insgesamt 413.776 IVF-Zyklen. Dies bedeutet einen Anstieg der Zyklen um 25 % gegenüber 2 Jahren zuvor und einen Anstieg um 135 % gegenüber 2012². Dieser Anstieg ist hauptsächlich auf die steigende Prävalenz von Unfruchtbarkeit und die verzögerte Planung einer Schwangerschaft zurückzuführen. Fortschritte bei Embryokulturtechniken und Superovulationsprotokollen haben zu einer erhöhten Lebendgeburtenrate pro ET-Zyklus geführt, die bei Frauen unter 40 Jahren 30%-50% und bei Frauen über 40 Jahren weniger als 30% erreicht². Trotz dieser Fortschritte nistet sich jedoch immer noch mehr als die Hälfte der übertragenen Embryonen nicht ein. Wiederholtes Einnistungsversagen (RIF), typischerweise definiert als Versagen nach drei oder mehr aufeinanderfolgenden Versuchen, hochwertige Embryonen zu übertragen, betrifft 15% der Frauen, die sich einer IVF-ET³ unterziehen. Paare mit RIF sind extrem anfällig und anfälliger für teure und unnötige Eingriffe, die sie unangemessenen Risiken aussetzen können⁴. Daher ist es entscheidend, die Ursachen von RIF zu verstehen und die Einnistung des Embryos zu verbessern, um den Erfolg von IVF-ET zu verbessern, insbesondere für Frauen mit RIF. Die Vorbereitung des Endometriums ist entscheidend für eine erfolgreiche Einnistung des Embryos. Dieser Prozess ist gekennzeichnet durch eine signifikante Akkumulation von natürlichen Killerzellen der Gebärmutter (uNK), die von 30 % der gesamten Lymphozyten im Endometrium während der mittleren sekretorischen Phase auf 70 % bis 80 % in der Dezidua während der Frühschwangerschaft übergehen⁵. Bemerkenswert ist, dass sich uNK-Zellen von peripheren NK-Zellen unterscheiden, bei denen es sich um zytotoxische Lymphozyten handelt, die für das angeborene Immunsystem entscheidend sind und den Tod der infizierten Zellen durch Lyse oder Apoptose verursachen. Während die genauen Funktionen von uNK-Zellen noch nicht vollständig verstanden sind, deuten mehrere Hinweise darauf hin, dass sie am Remodeling der Angiogenese, der Trophoblasteninvasion und der Entwicklung des Fötus beteiligt sind⁶. Der Zusammenhang zwischen dem prozentualen Anteil von uNK-Zellen gegenüber Stromazellen und RIF hat in den letzten 20 Jahren große Anziehungskraft erlangt. Eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse, die 8 Studien mit 604 Frauen umfasste, zeigte, dass die Dichte von CD56+uNK-Zellen während der mittleren Lutealphase bei Frauen mit RIF im Vergleich zu fruchtbaren Kontrollen signifikant erhöht ist⁷. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass sich die Eigenschaften von uNK-Zellen während der mittleren Lutealphase signifikant von denen von dezidualen NK-Zellen (dNK) unterscheiden. Obwohl sich uNK-Zellen nach der Schwangerschaft weiter in verschiedene Untergruppen von dNK-Zellen differenzieren können, repräsentiert die Messung von uNK-Zellen allein dNK-Zellen nicht genau⁸. uNK-Zellen durchlaufen eine dynamische Differenzierung und spielen unterschiedliche Rollen im Menstruationszyklus und in den Dezidualisierungsprozessen, was sie komplexer macht, als sie allein durch CD56 identifiziert werden können. Mehrere Marker sind erforderlich, um ein umfassendes Verständnis des Verhaltens von uNK-Zellen während der Endometriumpräparation zu erlangen. In unserer jüngsten Studie wurde die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eingesetzt, um die Vielfalt von uNK-Zellen während des gesamten Menstruationszyklus zu identifizieren. Die Ergebnisse, die mit Hilfe der Durchflusszytometrie validiert wurden, zeigten das Vorhandensein von vier verschiedenen Subtypen von uNK-Zellen, die jeweils während des Menstruationszyklus dynamische Veränderungen zeigten⁹. Die Analyse der Genanreicherung und die funktionelle Anreicherung der Genontologie deuten darauf hin, dass diese uNK-Untergruppen in verschiedenen Stadien der Menstruation unterschiedliche Funktionen erfüllen. Dennoch ist die Durchflusszytometrie in klinischen Laboratorien nicht überall zugänglich, und die sofortige Verarbeitung von frischem Endometriumgewebe für den Enzymverdau macht es unmöglich, experimentelle Schritte bei Fehlern zu wiederholen.

Das Ziel dieser Studie war es daher, die Messung dieser vier Subpopulationen von NK-Zellen mit Hilfe eines Multiplex-Färbeassays zu untersuchen, der einen praktischeren diagnostischen Ansatz bietet. Bei der Mehrfachfärbung werden unterschiedliche spezifische Antikörper gegen jedes Ziel mit unterschiedlichen Fluorophormarkierungen verknüpft, die unterschiedliche Wellenlängen des Lichts emittieren, wenn sie durch eine bestimmte Lichtwellenlänge angeregt werden. Im Vergleich zur traditionellen IHC-Färbemethode kann diese Methode die relative Häufigkeit und Verteilung mehrerer Targets in einer Probe quantitativ vergleichen und Informationen über die Interaktion und Co-Lokalisation verschiedener Targets liefern, was es uns ermöglicht, verschiedene Subtypen von uNK-Zellen zu identifizieren. Dieser Ansatz wird nicht nur unser Verständnis der Beziehung zwischen uNK-Zellen und RIF vertiefen, sondern auch Erkenntnisse für die Untersuchung anderer Immunzell-Subpopulationen bei endometriumbedingten Erkrankungen liefern.

Protokoll

Die Studie wurde von der Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee (CREC-Ref.-Nr.: 2022.581) genehmigt. Frauen mit RIF wurden vom Assisted Reproductive Technology Center des Prince of Wales Hospital der Chinese University of Hong Kong rekrutiert. RIF wurde definiert als das Scheitern einer klinischen Schwangerschaft nach dem Transfer von mindestens 4 Embryonen guter Qualität in mindestens 3 frischen oder gefrorenen Zyklen bei einer Frau unter 40 Jahren¹⁰. Die Einverständniserklärung der Teilnehmerinnen wurde eingeholt, bevor die Endometriumbiopsien entnommen wurden.

1. Gewinnung und Verarbeitung von Endometriumproben

1. Zeitpunkt der Entnahme von Endometriumproben
   1. Entnehmen Sie Endometriumproben nach einem strengen Protokoll, um die Konsistenz unter den Studienteilnehmerinnen zu gewährleisten. Bei Patientinnen mit natürlichem Zyklus führen Sie ab dem 9^. Tag des Menstruationszyklus eine Urinanalyse durch und führen Sie am 7^. Tag nach dem LH-Anstieg (LH+7)¹¹ eine Endometriumbiopsie durch. Bei Patienten, die sich einer Hormonersatztherapie (HRT) unterziehen, verabreichen Sie täglich 6 mg Estradiolvalerat oral ab Tag 2 des Menstruationszyklus.
   2. Beurteilen Sie die Endometriumdicke durch Ultraschall am 13. Tag des Menstruationszyklus. Wenn die Endometriumdicke 8 mm erreicht oder überschreitet, verabreichen Sie Progesteron transvaginal und führen Sie 5 Tage nach der Progesteronverabreichung eine Endometriumbiopsie durch¹².
2. Entnahme und Fixierung von Endometriumproben: Führen Sie eine Pipette in die Gebärmutterhöhle ein und schieben Sie sie in die Fundusregion vor. Üben Sie einen Sog aus, indem Sie den inneren Kolben nach unten ziehen und gleichzeitig die Gebärmutterschleimhautoberfläche durch rotierende und vertikale Bewegungen in der Gebärmutterhöhle abkratzen. Spülen Sie die gesammelten Proben mit normaler Kochsalzlösung ab, um Gebärmutterhals- und Gebärmuttersekrete zu entfernen. Messen Sie Proben und beurteilen Sie die Größe. Proben von 3 mm x 15-25 mm werden sofort in 10 ml 10 % neutrales gepuffertes Formalin getaucht und 24-48 h bei Raumtemperatur fixiert.
3. Dehydratisierung: Nach Abschluss der Fixierung werden die Proben einer Dehydratisierungssequenz unterzogen, die darauf ausgelegt ist, Wasser durch Ethanol zu ersetzen. Tauchen Sie das Gewebe dazu in 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanolbäder, um eine vollständige Dehydrierung zu gewährleisten. Nach dem abschließenden Ethanolbad werden die Proben in Xylol eingelegt, um Alkoholreste zu entfernen und für die Paraffinfiltration vorzubereiten.
4. Einbetten: Nachdem Sie das Gewebe flach auf den Boden der Form gelegt haben, schmelzen Sie Paraffin und fügen Sie es vorsichtig den Proben hinzu, um sicherzustellen, dass das Endometriumgewebe vollständig in der Paraffinmatrix eingekapselt ist. Nachdem Sie die Formen mit Paraffinwachs gefüllt haben, kühlen Sie sie auf einem Gefriertisch ab, um die Verfestigung des Paraffinwachses zu fördern. Sobald die Paraffinblöcke ausgehärtet sind, lagern Sie sie bei Raumtemperatur, bis eine weitere Verarbeitung erforderlich ist.
   HINWEIS: Die verwendeten Formen wurden speziell so ausgewählt, dass sie der Größe der entnommenen Endometriumproben gerecht werden, damit das Endometriumgewebe flach auf dem Boden liegen kann, ohne sich zu falten, wodurch eine optimale Ausrichtung für die anschließende Schnittung gewährleistet wird und kein unnötiger Überschuss entsteht.
5. Teilung: Zur Vorbereitung der Teilung die Paraffinblöcke 2 h bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. Schneiden Sie die Proben mit einem Mikrotom in 4 μm große Abschnitte, glätten Sie die Scheiben auf der Oberfläche von destilliertem, auf 42 °C erwärmtem Wasser und montieren Sie sie auf selbstklebende Glasobjektträger. Legen Sie die Scheiben über Nacht auf einen Diatrockner und lagern Sie sie vor Gebrauch bei Raumtemperatur.

2. Optimierung der immunhistochemischen Bedingungen des Multiplex

1. IHC-Validierung: Für die Validierung von IHC-Färbeparametern ist ein systematischer Ansatz zu verfolgen, um die Bedingungen für die Antigengewinnung, die Antikörperkonzentration und die Inkubationszeiten fein abzustimmen.
   1. Innerhalb der vom Hersteller empfohlenen Verdünnungsbereiche sind 2-3 Konzentrationen für jeden Antikörper zu testen. Optimieren Sie die Antigengewinnung durch den Vergleich von Puffern bei pH 6 und pH 9 und bewerten Sie Inkubationsprotokolle sowohl bei Raumtemperatur für 1,5 h als auch über Nacht bei 4 °C.
   2. Beurteilen Sie jeden Zustand akribisch und konzentrieren Sie sich dabei auf die Intensität, Spezifität und das Hintergrundrauschen. Wählen Sie die optimale Kombination, um die klarste, spezifischste Färbung mit minimaler unspezifischer Bindung zu erzielen. Diese strenge Validierung gewährleistete die höchste Genauigkeit und Reproduzierbarkeit im IHC-Protokoll.
2. Tyramide Signal Amplification (TSA) Monoplex-Färbung: Optimieren Sie nach der Bestimmung der optimalen Färbeparameter für einzelne Antikörper die Paarung von Antikörpern mit verschiedenen TSA-Farbstoffen. Kombinieren Sie den Marker mit höherer Expression mit einem Farbstoff mit niedrigerer Fluoreszenzintensität oder umgekehrt. Während dieser Phase passen Sie die Antikörperkonzentration und die Inkubationszeit entsprechend der beobachteten Fluoreszenzsignalstärke an. Wenn ein signifikanter Hintergrund oder eine unspezifische Färbung beobachtet wird, wird der paarige Farbstoff¹³ gewechselt.
3. TSA-Multiplex-Färbung: Für das Multiplex-Immunhistochemie-Protokoll (m-IHC) wurde die sequenzielle Reihenfolge der Färbung sorgfältig nach etablierten Prinzipien definiert. Um sicherzustellen, dass der Multiplexing-Prozess die Sensitivität und Spezifität der Einzelmarkierungsfärbung widerspiegelt, priorisieren Sie Antikörper mit niedrigeren Expressionsniveaus zu Beginn der Färbesequenz. Platzieren Sie Antikörper, die eine Basenreparatur für die Antigengewinnung erfordern, am Ende der Färbesequenz, da die Basenreparatur im Vergleich zu säurebasierten Methoden, die in einigen Fällen unspezifische Färbeartefakte verstärken können, robust ist.
4. Entscheiden Sie anhand der Erkenntnisse aus den Schritten 2.1 und 2.2, welche Antikörper in welchem Stadium verwendet werden sollen, basierend auf ihren Anforderungen an die Antigengewinnung und der Expressionsdichte. So wurde beispielsweise der CXCR4-Antikörper, der eine Basenreparatur für die Antigengewinnung erfordert, in die Endphase der Färbung gebracht. Umgekehrt hat der CD49a-Antikörper, der sich durch eine geringere Expressionsdichte auszeichnet, die erste Position in der Färbesequenz erhalten. Maximieren Sie die Chancen auf eine erfolgreiche Erkennung und minimieren Sie Maskierungseffekte, die in den späteren Phasen des Multiplexing-Verfahrens auftreten können.
5. Testen Sie für die verbleibenden Antikörper während der Optimierungsphase verschiedene Kombinationen, um die effektivste Sequenz zu bestimmen, die sowohl Sensitivität als auch Spezifität in Einklang bringt. Die Ergebnisse dieser vergleichenden Analysen dienen als Grundlage für die endgültige Zusammensetzung des Multiplex-Panels, wie in Tabelle 1 beschrieben, und stellen sicher, dass das ausgewählte Panel eine optimale Leistung bietet und gleichzeitig den Hintergrund minimiert.

3. m-IHC-Verfahren

1. Entparaffinierung, Hydratation und Fixierung: Die Gewebeschnitte 2 h lang bei 60 °C backen, anschließend sequentiell in Xylol I (10 min), Xylol II (10 min), 100 % Ethanol (5 min), 95 % Ethanol (5 min), 80 % Ethanol (5 min), 75 % Ethanol (5 min), ddH₂O (2 min für 3x), 10 % neutral gepuffertes Formalin (mindestens 20 min), und ddH₂O (2 min für 3x).
2. Antigen-Retrieval: Geben Sie 200 mL des jeweiligen AR6- oder AR9-Puffers, wie in Tabelle 1 für jeden Antikörper aufgeführt, in eine hitzebeständige Antigen-Retrieval-Kassette. Legen Sie die Schnitte in den entsprechenden Antigen-Retrieval-Puffer und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle bei hoher Leistung ca. 2 min bis zum Siede. Decken Sie anschließend die Kassette locker ab, erhitzen Sie sie 15 Minuten lang bei schwacher Leistung und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab. Spülen Sie die Partien mit ddH₂O und PBST ab.
3. Hydrophobe Barriere zeichnen: Nachdem Sie die überschüssige Lösung mit saugfähigem Papier entfernt haben, zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen vollständigen Kreis um das Gewebe.
4. Inaktivierung der endogenen Enzymaktivität: Schnitte mit 3 % Wasserstoffperoxid behandeln und 8 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBST 3x für je 2 min waschen.
5. Blockieren von unspezifischen Stellen: Nach dem Trocknen mit saugfähigem Papier eine Blockierungslösung (1x Antikörperverdünnungsmittel/Block) auftragen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Inkubation mit Primärantikörper: Nach Entfernung der Blockierungslösung 150 μl des ersten Primärantikörpers, CD49a, in einer Verdünnung von 1:1000 in 1x Antikörperverdünnungsmittel auf jeden Objektträger auftragen. Inkubieren Sie wie zuvor in Abschnitt 2 optimiert. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation 3x für jeweils 2 min mit PBST. Für die übrigen Antikörper siehe Tabelle 1 für spezifische Verdünnungsverhältnisse.
7. Inkubation mit Sekundärantikörper: Verwenden Sie vor dem Auftragen des Sekundärantikörpers saugfähiges Papier, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen und eine Verdünnung des Reagenzes zu verhindern. Geben Sie 4-5 Tropfen (ca. 150 μl) des 1x Anti-Ms + Rb HRP-Sekundärantikörpers auf jeden Objektträger, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Führen Sie nach der Inkubation drei Wäschen mit PBST für jeweils 2 Minuten durch.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass der 1x Anti-Ms + Rb HRP-Sekundärantikörper spezifisch für Kaninchen- und Maus-Primärantikörper ist.
8. Signalverstärkung mit TSA-Farbstoff: Nach dem Abtupfen von überschüssiger Feuchtigkeit den TSA-Farbstoff 1:100 im Amplifikationsverdünnungsmittel verdünnen. Geben Sie 150 μl dieser verdünnten TSA-Farbstofflösung zu jedem Objektträger. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBST 3x für je 2 min waschen.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.5-3.8 für das TSA-Verfahren mit dem entsprechenden Antikörper und Farbstoff.
10. Färben von Zellkernen: Nach dem Färben des letzten Antikörpers werden ungebundene Fluorophore durch Mikrowellenschnitte in 200 ml AR6-Puffer in einer hitzebeständigen Kassette eliminiert, 2 Minuten lang sieden und dann 15 Minuten lang mit geringer Leistung erhitzt. Die Proben auf Raumtemperatur abkühlen und mit ddH₂O und PBST spülen. 150 μl DAPI-Arbeitslösung, verdünnt in PBST (1:10), tropfenweise zugeben, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und 2x mit ddH₂O spülen.
11. Einbettung: Nachdem die Schnitte ca. 30 Minuten lang vollständig an der Luft an einem dunklen Ort getrocknet wurden, tragen Sie einen einzigen Tropfen (ca. 30 μl) des fluoreszierenden Eindeckmittels auf und platzieren Sie Deckgläser.
    HINWEIS: Schützen Sie alle Vorgänge nach dem ersten Auftragen des TSA-Farbstoffs vor Licht. Eine sofortige Beobachtung und Bilderfassung waren nach Abschluss der Färbung unerlässlich, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern.

4. Bilderfassung und -analyse

1. Belichtungszeit: Nehmen Sie Bilder mit einem Imager auf, der die Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluorophore übernimmt. Überprüfen Sie beim Festlegen der Belichtungszeiten die Folien mit einer Vielzahl von Markierungsausdrücken, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Fokussieren Sie für jede Marker-/Filterkombination manuell auf verschiedene Bereiche der Folie. Verwenden Sie die Funktion Automatische Belichtung, um die Belichtungszeit einzustellen.
2. Wählen Sie Filter entsprechend den TSA-Farbstoffen aus und untersuchen Sie mehrere Objektträger, um die optimalen Belichtungszeiten pro Kanal zu bestimmen. Wenden Sie diese Einstellungen konsistent auf alle nachfolgenden Aufnahmen an, um die Vergleichbarkeit während der gesamten Bildgebung zu gewährleisten.
3. Auswahl der Erfassungsbereiche: Um eine unverzerrte Probenahme über alle Gewebeschnitte und eine konsistente Einbeziehung des luminalen Epithels in jedes analysierte Feld zu gewährleisten, wählen Sie den anfänglichen Bereich für die Bildaufnahme nach dem Zufallsprinzip aus, wobei das kritische Kriterium das Vorhandensein der luminalen Epithelgrenze ist.
4. Nach der Erfassung dieses Anfangsbildes wählen Sie systematisch nachfolgende Bereiche aus, indem Sie ein Halbbild nach links oder rechts vom Startpunkt verschieben (wobei ein Feld zwischen jedem aufgenommenen Bild weggelassen wird), während der luminale Epithelrand innerhalb des Rahmens beibehalten wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um mindestens fünf verschiedene Bereiche zu erfassen, von denen jeder mindestens einen Teil des Luminalepithels enthält, um eine gleichbleibende Analysetiefe über¹⁴ hinweg aufrechtzuerhalten. Dieser Ansatz zielte darauf ab, mindestens etwa 10.000 Stromazellen über alle erfassten Felder hinweg einzubeziehen, um eine umfassende und repräsentative Datenerfassung zu gewährleisten.
5. Bildanalyse
   1. Bildvorbereitung: Um multispektrale Bilder zu importieren und zu analysieren, navigieren Sie zunächst in der Softwareoberfläche zu Datei > Bild öffnen, um die Dateien und die Autofluoreszenz (AF)-Folie zu laden. Nachdem Sie die Bilder hochgeladen haben, fahren Sie mit dem Entmischen der Fluorophore fort, indem Sie auf die Schaltfläche Select Fluors klicken und die entsprechende Spektralbibliothek auswählen. Sobald alle Fluorophore ausgewählt sind, klicken Sie auf OK, um die Auswahl zu bestätigen. Um das AF-Spektrum zu isolieren, verwenden Sie die AF-Pipette, um einen repräsentativen Bereich des Gewebes aus dem AF-Bild abzutasten, und achten Sie darauf, dass keine Pixel, die kein Gewebe sind, ausgeschlossen werden. Klicken Sie nach dem Sampling in der unteren linken Ecke der Benutzeroberfläche¹⁵ auf Image vorbereiten oder Alle vorbereiten.
   2. Gewebesegmentierung: Starten Sie den Segmentierungsprozess, indem Sie manuell eine Basislinie von 3-5 Regionen pro Gewebetyp innerhalb des Bildes abgrenzen, einschließlich Epithelbereichen mit Epithelzellen, stromafarbenen Bereichen mit Stromazellen und leeren Bereichen ohne zellulären Inhalt. Wenn die anfänglichen Segmentierungsergebnisse nicht zufriedenstellend sind, kommentieren Sie manuell zusätzliche Regionen, um das Trainingsdataset zu verbessern und so die Genauigkeit und Zuverlässigkeit nachfolgender Analysen zu erhöhen. Diese dynamische Anpassung von Regionen und Parametern stellt sicher, dass die Software ähnliche Strukturen im aktuellen und anderen importierten Bildern automatisch und mit erhöhter Genauigkeit identifizieren kann.
      HINWEIS: Die anfängliche Annotation dient als Trainingsdatensatz für die Software, um die Eigenschaften der einzelnen Gewebekomponenten zu erlernen. Die Segmentierungsfunktionen der Software werden dann iterativ auf der Grundlage der Komplexität und Variabilität des Gewebes verfeinert.
   3. Zellensegmentierung: Klicken Sie auf Zellen segmentieren , um die Zellensegmentierung zu starten. Wählen Sie in der Einstellung für die Zellsegmentierung die Option Kerne und Membran aus. Wählen Sie DAPI aus, um Zellkerne zu identifizieren, und passen Sie die Intensitätseinstellung an, um alle Zellkerne ohne Hintergrundrauschen zu erkennen. Wählen Sie die Signale CD16, CD49a und CD56 aus, um die Membran zu finden und dieses Signal zur Unterstützung der Kernspaltung zu verwenden. Verwenden Sie die Funktion zur Spaltung von Kernkomponenten , um nahe beieinander liegende Kerne zu unterscheiden.
      HINWEIS: DAPI hebt das Innere von Zellen hervor. Die Funktion zur Spaltung von Kernkomponenten hilft bei der Unterscheidung von Zellkernen, wenn sie nahe beieinander liegen oder verschmolzen aussehen. Dieser Schritt ist wichtig, um zuverlässige Zellzählungen zu erhalten und die Integrität der Analyse zu wahren.
   4. Zellphänotypisierung: Verwenden Sie vier verschiedene Zelloberflächenmarker, darunter CD56, CD49a, CXCR4 und CD16, um verschiedene Subtypen von NK-Zellen zu unterscheiden. Bezeichnen Sie im Phänotypisierungsschema diese vier Marker als die Phänotypen, mit denen fortgefahren werden soll. Weisen Sie im Abschnitt "Associate View" jedem der Phänotypen zur Identifizierung bestimmte Farben zu. Kategorisieren Sie mit der Schaltfläche Hinzufügen Zellen, die die Markierungen entweder positiv oder negativ ausdrücken. Im CD56-Phänotyp können Zellen beispielsweise als CD56+ oder CD56- gekennzeichnet werden. Markieren Sie während des Trainingsprozesses mindestens fünf Zellen für jeden Phänotyp manuell. Führen Sie eine zusätzliche manuelle Beschriftung durch, wenn das anfängliche Training keine effektiven Ergebnisse liefert.
   5. Nachdem die Konfiguration der Zellphänotypisierung festgelegt wurde, zeigt jede Zelle im Bild an, ob die vier Oberflächenmarker positiv oder negativ exprimiert sind. Exportieren Sie die resultierenden Daten zur weiteren Analyse in eine Tabelle.
   6. Datenverarbeitung: Importieren Sie die aus allen Bildern erhaltenen Daten zur Verarbeitung in eine Tabelle. Berechnen Sie den Prozentsatz aller uNK-Zellen-Subtypes im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellen im Bild. Die endgültige Zellzahl stellt die durchschnittliche Anzahl über mehrere Bilder dar und bietet einen umfassenden Überblick über die Population verschiedener uNK-Zellsubtypen innerhalb der Stichprobe.

Ergebnisse

Um den Zeitpunkt der Entnahme von Endometriumproben bei Frauen, die sich dem natürlichen Zyklus unterziehen, konsistent zu halten, wurde ein Urintest durchgeführt, um ihren Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) genau nachzuweisen, wobei 7 Tage nach dem LH-Anstieg Endometriumbiopsien durchgeführt wurden. Bei Frauen, die sich einem HRT-Zyklus unterzogen, wurden die Proben genau 5 Tage nach Beginn der Progesteron-Supplementierung geplant. Um verschiedene Subtypen von NK-Zellen im Endometrium zu quantifizieren, wurde die m-IHC-Färbung eingesetzt. Eine schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs ist in Abbildung 1 dargestellt.

Die Optimierung des experimentellen Verfahrens ist entscheidend, um qualitativ hochwertige m-IHC-Färbeergebnisse zu erzielen und die Genauigkeit und Konsistenz der Versuchsergebnisse zu gewährleisten. Zunächst wurde die IHC eingesetzt, um die geeignete Antikörperkonzentration zu bestimmen, wobei die Antigen-Retrieval-Lösungen AR6 oder AR9 ausgewählt wurden. Für Antikörper wie CD56, CD16 und CD49 wird eine Antigen-Retrievallösung mit pH 6 empfohlen, während für den CXCR4-Antikörper mit einer Antigenreparaturlösung mit einem pH-Wert von 9 im Vergleich zu einem pH-6-Puffer bessere Färbeergebnisse erzielt wurden. Sobald die Parameter, einschließlich des Antikörperverdünnungsverhältnisses, der Inkubationszeit und der Antigen-Entnahmebedingungen, bestimmt wurden, kann der am besten geeignete TSA-Farbstoff basierend auf der Affinität des Antikörpers ausgewählt werden. Es sollte ein Farbstoff mit schwacher Fluoreszenzhelligkeit gewählt werden, um die hohe Affinität des Antikörpers zu ergänzen. Referenzdaten zur Signalstärke von TSA-Farbstoffen finden Sie in Tabelle 2. Nach Abschluss des TSA-Monoplex-Assays kann die Reihenfolge des TSA-Multiplex bestimmt werden. Da die vier Antikörper darauf ausgelegt sind, verschiedene Subtypen von uNK-Zellen zu identifizieren, ist eine Co-Lokalisierung zwischen den Antikörpern unvermeidlich. Um die spektrale Überlappung zu minimieren und Interferenzen zwischen Fluoreszenzeinheiten zu vermeiden, wurde die folgende Strategie angewendet: Auswahl von Fluoreszenzeinheiten mit möglichst weit voneinander entfernten Wellenlängen, Vergleich der Position und Anzahl der positiven Signale des TSA-Multiplexes mit denen des TSA-Monoplex, um ihre Identität sicherzustellen (Abbildung 2), und Sicherstellung eines klaren Hintergrunds (Abbildung 3)¹⁶.

Nach der Optimierung und Fertigstellung der m-IHC-Färbeverfahren wurde der Bildgebungsarbeitsplatz für die Bildaufnahme und die Bildanalysesoftware für die eingehende Analyse der Bilder eingesetzt (Abbildung 4). Für die Klassifizierung von uNK-Zellen wurden sowohl traditionelle als auch innovative Methoden verwendet. Die traditionelle Klassifikation unterteilt NK-Zellen in zwei Kategorien, CD56+CD16- und CD56+CD16+¹⁷, basierend auf dem Expressionsniveau von CD16. Aufbauend auf dieser Grundlage versuchten wir, die Heterogenität der NK-Zellen mit Hilfe einer neuartigen Klassifikationsstrategie weiter abzugrenzen. Mit Hilfe der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) aus unserer früheren Forschung isolierten wir einzelne NK-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und führten eine RNA-Sequenzierung durch, um die transkriptomischen Profile jeder Zelle zu erfassen. Unsere Analyse ergab vier verschiedene NK-Zell-Subtypen: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) und NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Diese Subtypen zeichneten sich durch eine differentielle Expression von CD49a und CXCR4 aus, wobei CD56 als universeller Marker für alle NK-Zellen diente. CD49a wurde spezifisch in den Subtypen NK1 und NK2 nachgewiesen, während CXCR4 in den Subtypen NK2 und NK4 vorhanden war. Um diese Klassifizierung zu validieren, führten wir eine Durchflusszytometrie-Analyse durch, um die Genauigkeit unserer Subtypisierungsmethode sicherzustellen (Abbildung 5)⁹. Der Anteil jedes uNK-Zellsubtyps wird als Prozentsatz relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen dargestellt.

Abbildung 1: Diagramm des Ablaufs der Analyse von endometrialen NK-Zellen. Zu den Hauptschritten gehören die Erfassung und Entnahme des Endometriums, die Optimierung des m-IHC-Panels, die m-IHC-Färbung des Endometriums sowie die Aufnahme und Analyse des Bildes. Erstellt mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder zur Quantifizierung von Biomarkern mittels DAB-, TSA-Monoplex- und TSA-Multiplex-Färbung. Repräsentative Bilder für jeden der Antikörper, die mit DAB (linke Felder), TSA-Monoplex-IHC (mittlere Felder) und TSA-Multiplex-IHC (rechte Felder) gefärbt wurden, zeigten eine minimale Abweichung durch die Entwicklung von m-IHC. Die TSA-simulierten IHC-Bilder darunter imitieren die entsprechenden Hellfeldbilder in hohem Maße. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Experimentelle Ergebnisse nach m-IHC-Färbung des Endometriums. (A) Ein ungemischtes Bild wurde mit dem Imager bei 200-facher Vergrößerung aufgenommen. (B) Weitere Vergrößerung dieses unvermischten Bildes. (C-F) Die Bilder wurden in den Kanälen TSA-Farbstoff 570 (CD16), TSA-Farbstoff 650 (CD56), TSA-Farbstoff 620 (CXCR4) und TSA-Farbstoff 520 (CD49a) nach dem Entmischen mit der Bildgebungssoftware beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Analysieren Sie m-IHC-gefärbte Bilder. Die Bilder wurden mit Hilfe der Funktionen (A) Gewebesegmentierung, (B) Zellsegmentierung und (C) Zellphänotyp der Bildgebungssoftware analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Subtyp-Analyse von endometrialen NK-Zellen. (A) Konventionelle endometriale NK-Zellen können auf der Grundlage der CD16-Expression in CD56+CD16-NK-Zellen und CD56+CD16+NK-Zellen eingeteilt werden. (B) Die innovative Subtyp-Analysemethode klassifizierte endometriale NK-Zellen in vier Kategorien: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-) und NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Färbezyklus	Markierung	Klonen	Firma	Produkt	Antikörper-Verdünnung	AR-Puffer	Fluorophor
1	CD49a	Nr. CL7207	Novus Biologicals	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	Nr. CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	ABCAM	Artikel-Nr.: ab183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	Forschung und Entwicklung	MAB172	1:100	AR9	TSA 620

Tabelle 1: Liste der Konzentrationen der Antikörper und des TSA-Farbstoffs, die im m-IHC verwendet werden.

Fluorophor	Mantra
TSA-Farbstoff 520	Hoch
TSA-Farbstoff 540	Mittel
TSA-Farbstoff 570	Mittel
TSA-Farbstoff 620	Mittel
TSA-Farbstoff 650	Hoch
TSA-Farbstoff 690	Niedrig

Tabelle 2: TSA-Farbstoffe und entsprechende Fluoreszenzintensität.

Diskussion

Bei der Einnistung des Embryos handelt es sich um eine komplexe Wechselwirkung zwischen dem Embryo und der Gebärmutterschleimhaut. Der immunologische Status der Endometriumhomöostase spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Empfänglichkeit des Endometriums. Während der WOI sind NK-Zellen die vorherrschende Leukozytenpopulation im Endometrium. Etwa 90% der uNK-Zellen weisen eine hohe CD56-Expression auf, es fehlt jedoch an CD16. Eine untergeordnete Untergruppe von uNK-Zellen ähnelt jedoch den NK-Zellen des peripheren Blutes und weist eine geringe CD56-Expression, aber eine positive CD16-Expression^{auf 18}. Diese beiden uNK-Zellsubtypen weisen unterschiedliche Funktionen auf. Der CD56+CD16-Subtyp trägt in erster Linie zur Zytokinproduktion, zum Gefäßumbau und zur Interaktion mit Trophoblastzellen bei, die für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer Schwangerschaft entscheidend sind. Im Gegensatz dazu weist der CD56+CD16+-Subtyp eine höhere Zytotoxizität auf. Unter Verwendung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung kategorisierte unsere aktuelle Studie uNK-Zellen weiter in vier Untergruppen und unterteilte CD56+CD16-regulatorische NK-Zellen in drei Subpopulationen, basierend auf ihren spezifischen Phänotypen und Funktionen⁹. Die NK1-Untergruppe, charakterisiert durch CD56+CD49a+CXCR4-, ist am Gewebeumbau beteiligt. Die NK2-Untergruppe, die durch CD56+CD49a+CXCR4+ identifiziert wird, reguliert die Immunantwort. Die NK3-Untergruppe, die durch CD56+CD49a-CXCR4- gekennzeichnet ist, interagiert mit Trophoblasten. Die NK4-Untergruppe, die CD56+CD49a-CXCR4+ aufweist, weist Ähnlichkeiten mit CD56+CD16+ NK-Zellen auf und weist zytotoxische Funktionen^{auf 9}. In der vorliegenden Studie ist es uns zum ersten Mal gelungen, ein Protokoll zur Identifizierung dieser vier unterschiedlichen NK-Zelluntergruppen mittels m-IHC-Färbung zu etablieren.

Die konventionelle IHC-Färbung und die Durchflusszytometrie sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Identifizierung von Immunzellen, jede mit ihren eigenen Stärken und Grenzen¹⁹. Während die konventionelle IHC aufgrund ihrer einfachen Zugänglichkeit im klinischen Umfeld weit verbreitet ist, steht sie vor Herausforderungen beim gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene und der Quantifizierung positiver Signale. Dies stellt eine erhebliche Hürde bei der genauen Charakterisierung von Immunzellphänotypen dar, die oft die Verwendung mehrerer Marker für eine präzise Messung erforderlich machen. Auf der anderen Seite ist die Durchflusszytometrie in der Lage, mehrere Zellmarker gleichzeitig zu detektieren, erfordert jedoch eine große Menge frischer Proben und liefert keine räumlichen Informationen über die Zellposition im Gewebe. Bemerkenswert ist, dass endometriale Immunzellen nicht gleichmäßig im gesamten Endometriumgewebe verteilt sind. Zum Beispiel sind uNK-Zellen in der Nähe der Basalschicht des Endometriums dichter aggregiert als in Bereichen in der Nähe der Leuchthöhle²⁰. Diese Einschränkungen der herkömmlichen IHC und Durchflusszytometrie können durch m-IHC und die Bildanalyseplattform behoben werden, die mit Algorithmen des maschinellen Lernens konjugiert sind, um eine Gewebesegmentierung, Zellsegmentierung und die Identifizierung positiver Zellen zu erreichen. Dieser Ansatz steigert die Effizienz, indem er Zehntausende von Zellen innerhalb von Minuten analysiert, minimiert die Verzerrung des Beobachters durch die automatische Identifizierung positiver Zellen und ermöglicht eine genauere Analyse anhand mehrerer Marker. Darüber hinaus werden keine frischen Proben mehr benötigt und bei Bedarf können Chargenexperimente oder wiederholte Analysen durchgeführt werden.

Die Durchführung einer umfassenden Bewertung der phänotypischen uNK-Zellen mit der m-IHC-Technik kann ein tieferes Verständnis der Korrelation zwischen uNK-Zellen und Embryoimplantation sowie deren Veränderungen bei Frauen mit RIF ermöglichen. Neben uNK-Zellen tragen auch andere endometriale Immunzellen zur lokalen Immunhomöostase bei. Zum Beispiel halten regulatorische T-Lymphozyten (Treg-Zellen) die Immuntoleranz aufrecht, indem sie hemmende Faktoren wie IL-10 und TGF-β freisetzen, die die Aktivität von Th1- und Th2-Zellen unterdrücken²¹. Die Differenzierung von M2-Makrophagen, die durch Steroide und Th2-Zytokine reguliert wird, trägt zum immuntoleranten Status bei, indem sie die Arginaseaktivität hochreguliert und die Stickoxidproduktion hemmt²². Darüber hinaus differenzieren sich dendritische Zellen (DCs) in der Gebärmutter zu reifen tolerogenen Zellen und setzen Faktoren wie sFLT1 und TGF-β1 frei, die die vaskuläre Neogenese regulieren und die Funktion von CD8+ T-Zellen hemmen, wodurch die Immunhomöostase aufrechterhalten und die Embryonalentwicklung unterstützt^{wird 18}. Ähnlich wie uNK-Zellen sind auch diese Immunzellen heterogen, und ein einzelner Marker kann ihre Phänotypen nicht genau identifizieren. Die Anwendung von m-IHC zur Beurteilung von uNK-Zelluntergruppen verdeutlicht das Potenzial für die Identifizierung von Untergruppen dieser endometrialen Immunzellen.

Neben dem Endometrium kann diese Methode auf verschiedene Gewebe angewendet werden, um Immunzellphänotypen zu identifizieren. Bei der Anwendung auf andere Gewebe sind nur geringfügige Anpassungen notwendig, um eine optimale Färbung zu gewährleisten. Wenn Forscher beabsichtigen, bestimmte Marker zu ersetzen, kann das ursprüngliche Panel modifiziert werden, um die spezifischen experimentellen Anforderungen zu erfüllen. Die Vielseitigkeit und Flexibilität dieses Panels machen es zu einem anpassungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung verschiedener Gewebe oder verschiedener Zelluntergruppen.

Diese Technologie erleichtert nicht nur das Verständnis der detaillierten Veränderungen in endometrialen Immunzellen, um den zugrunde liegenden Mechanismus der endometrialen Nichtempfänglichkeit zu entschlüsseln, sondern bietet auch Potenzial für die Entwicklung diagnostischer Tests. Die relativ einfache Gewinnung und Konservierung von Paraffinblöcken und -profilen hat den Weg für die breite Anwendung dieser Technik geebnet. Mit standardisierten Färbepanels können Krankenhäuser die automatisierte Färbetechnologie in Verbindung mit ausgefeilten Softwarealgorithmen nutzen, um die Effizienz ihrer Analyseverfahren erheblich zu steigern. Die Vorteile der m-IHC-Technologie machen sie zu einer praktikablen Option für klinische Praxen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	Primäre Antikörper
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	Primäre Antikörper
CD16	abcam	ab183354	Primäre Antikörper
CXCR4	R& D	MAB172	Primärantikörper
Amplifikationsverdünnungsmittel	Akoya Biosciences	FP1498 Serie	Fluorophor-Verdünnungspuffer
Antikörperverdünnungsmittel	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Verdünnen Sie den Antikörper
Citrat gepufferte Lösung, pH 6,0 /9,0(10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	Antigen-Rückgewinnungslösung
inForm fortschrittliche Bildanalysesoftware	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder Software 2.2.6	Datenanalyse-Software
Mantra Workstations	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral Imaging
Mikrowelle	Akoya Biosciences	Wechselrichter	Mikrowellen-Stripping
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	Geeignete Fluoreszenzreagenzien auf Tyramidbasis
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	Geeignete tyramidbasierte Fluoreszenzreagenzien
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	Geeignete tyramidbasierte Fluoreszenzreagenzien
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	Geeignete tyramidbasierte Fluoreszenzreagenzien
Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger	Fisher Technologies	120-550-15	Objektträger für den routinemäßigen histologischen Gebrauch
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Sekundärantikörper
Invitrogen & Handel   Fluoromount-G&Handel; Eindeckmedium	ThemoFisher Science	495802	Installation
Spectral DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	Nukleinsäurefärbung