Methodenartikel

Ein toxikologischer und ökotoxikologischer Assay auf der Grundlage der Beweglichkeit der Hämozyten von Muscheln (Mytilus galloprovincialis)

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DOI:

10.3791/67285

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13. Dezember 2024

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1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dem Artikel wird eine neuartige In-vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten basiert. Die Methode soll zur Entwicklung ethischerer und empfindlicherer toxikologischer und ökotoxikologischer Expositionstests beitragen.

Zusammenfassung

Hämozyten sind die zirkulierenden immunkompetenten Zellen in Muscheln und spielen eine Schlüsselrolle bei mehreren wichtigen Funktionen der zellvermittelten angeborenen Immunität. In den frühen Stadien der Immunantwort wandern Hämozyten aktiv zum Infektionsherd. Diese inhärente Motilität ist ein grundlegendes Merkmal dieser Zellen. Es stellt eine zelluläre Schlüsselfunktion dar, die mehrere Prozesse integriert, wie z. B. Zelladhäsion, Zellsignalisierung, Zytoskelettdynamik und Veränderungen des Zellvolumens. Daher können Veränderungen der Zellmotilität nach Exposition gegenüber Arzneimitteln oder Schadstoffen als nützlicher toxikologischer Endpunkt dienen. Trotz der grundlegenden Rolle der Zellmotilität in der Zellphysiologie ist sie aus toxikologischer Sicht nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wird eine neuartige in vitro Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Bewertung der Hämozytenmotilität von Mytilus galloprovincialis basiert. Wir haben einen Zellmotilitätsassay an Hämozyten entwickelt, die an der Unterseite einer 96-Well-Polystyrol-Mikroplatte haften. Nach der Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen von Medikamenten wurden die Zellverläufe und -geschwindigkeiten durch Zellverfolgung unter Zeitraffermikroskopie quantifiziert, was es uns ermöglichte, die Auswirkungen auf die Hämozytenmotilität zu messen. Aufgrund der Leichtigkeit der Hämozytenentnahme aus den Tieren auf relativ nicht-invasive Weise bietet die vorgeschlagene Methode einen alternativen Test zum Screening der Wirkungen und Wirkmechanismen von Schadstoffen und Arzneimitteln. Es steht im Einklang mit den 3R-Kriterien (Replacement, Reduction, and Refinement), geht auf ethische Bedenken ein und trägt zur Reduzierung von In-vivo-Tierversuchen für Wirbeltiere bei.

Einleitung

Wirkungsbasierte Methoden, wie z. B. In-vitro- und In-vivo-Bioassays, stellen innovative Instrumente für den Nachweis der Auswirkungen chemischer Umweltschadstoffe auf lebende Organismen und für ihren Einsatz als Instrumente bei der Umweltüberwachung und Risikobewertungdar 1,2,3,4. Sie ergänzen den klassischen analytisch-chemischen Ansatz, indem sie einige seiner Grenzen überwinden. Mit wirkungsbasierten Methoden können beispielsweise die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen, ihre Auswirkungen auf die Gesundheit des Organismus und die kombinierten toxikologischen Wirkungen von Gemischen bewertet werden. Diese kombinierten Effekte sind möglicherweise nicht vorhersehbar, wenn sie ausschließlich auf der chemischen Analyseberuhen 5.

In den letzten Jahren stellte die Ökotoxikologie von neu besorgniserregenden Schadstoffen (neu auftretende Schadstoffe) ein Gebiet dar, in dem wirkungsbasierte Methoden nützliche Instrumente zur Feststellung der Exposition und zur Bewertung der Auswirkungen auf die Biota sein können 1,5,6,7. Bei mehreren wirkungsbasierten Methoden werden Muscheln als Prüforganismen für die Umweltüberwachung und -bewertung verwendet 8,9. Einige Merkmale machen diese Organismen für ökotoxikologische Studien geeignet, wie z. B. ihre weite Verbreitung, ihre filtrierende Natur, ihre sessile Lebensweise, die Fähigkeit zur Bioakkumulation eines breiten Spektrums von Umweltschadstoffen und zur Entwicklung nachweisbarer Reaktionen auf Schadstoffe, die Möglichkeit, mit verschiedenen Lebensstadien zu arbeiten und unter Laborbedingungenzu halten 7. Sie reagieren sehr empfindlich auf Schadstoffbelastung und zeigen je nach Spezies, Lebensstadium und Umweltbedingungen eine Vielzahl von Reaktionen auf toxische Schadstoffe 8,9,10. Daher verwenden mehrere Umweltrichtlinien Muschelarten als standardisierte Testarten10,11.

Unter den Muscheln ist der weit verbreitete Mytilus galloprovincialis eine der am häufigsten verwendeten Arten im ökotoxikologischen Bereich, da er in der Lage ist, frühzeitig nachweisbare Reaktionen auf die Exposition gegenüber chemischer Verschmutzung zu entwickeln, einschließlich Metallothionein-Induktion, Veränderung antioxidativer Enzyme, Destabilisierung der lysosomalen Membran, Lipidperoxidation, Lipofuszinakkumulation, erhöhte Mikrokernfrequenz, Carboanhydrase-Induktion 12,13,14, 15. Datenschutz Hämozyten, die immunkompetenten hämolymphhatischen Zellen, werden häufig verwendet, um die toxikologischen Auswirkungen von Umweltschadstoffen in Muscheln zu untersuchen 4,13,16,17. Diese Zellen sind entscheidend für die Immunantwort des Organismus und erfüllen mehrere wichtige Funktionen der zellvermittelten angeborenen Immunität. Dazu gehören die Eliminierung von Mikroben durch Phagozytose und verschiedene zytotoxische Reaktionen, wie die Freisetzung von lysosomalen Enzymen, antimikrobiellen Peptiden und die Produktion von Sauerstoffmetaboliten während des Atemausbruchs 18,19,20. Hämozyten sind intrinsisch bewegliche Zellen 21,22,23, die in der Lage sind, während des frühen Stadiums der Immunantwort des Organismus an den Ort der Infektion zu wandern. Im Allgemeinen ist die Motilität ein grundlegendes Merkmal, das alle Immunzellen charakterisiert, da sie die Immunüberwachung dieser Zellen zum Schutz des Körpers ermöglicht24. Untersuchungen an verschiedenen Weichtierarten zeigen, dass die Motilität der Hämozyten eine entscheidende Komponente ihrer Immunantwort, der Wundheilung und der Interaktion mit Krankheitserregern ist. Diese Motilität wird durch spezifische molekulare Signalwege reguliert, was die Komplexität und Spezialisierung der Hämozytenfunktionen in Mollusken unterstreicht 21,25,26,27.

Trotz der grundlegenden Bedeutung der Motilität für die Physiologie der Hämozyten haben nur sehr wenige Studien die Empfindlichkeit der Hämozytenmotilität gegenüber chemischen Umweltschadstoffen untersucht 23,28,29,30. Kürzlich charakterisierte unsere Gruppe die spontane Bewegung von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten in einer gewebekulturbehandelten Polystyrol-96-Well-Mikroplatte und untersuchte die Empfindlichkeit der Hämozytenmotilität gegenüber einer in vitro-Exposition gegenüber Paracetamol23. Die Hämozyten von M. galloprovincialis zeigten eine zufällige Zellbewegung, die auf Lamellipodien und schnellen Formveränderungen basierte, wie sie zuvor bei einer anderen Muschelart, Mytilus edulis 21,22,23,28, gefunden und bereits bei menschlichen Immunzellen beschrieben wurden31. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Motilität der Hämozyten empfindlich auf chemische Stressoren reagiert23,28. Basierend auf diesen vorangegangenen Erkenntnissen wird in dieser Arbeit eine neuartige in vitro Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Bewertung der Motilität von M. galloprovincialis-Hämozyten und ihrer Veränderungen durch velozimetrische Analyse der Zellmotilität (Quantifizierung der mittleren Geschwindigkeit, der migrierten Entfernung, des euklidischen Abstands und der Direktheit) basiert. Die Methode bietet die Möglichkeit, die Toxizität mehrerer Substanzen in vitro entweder in Kurzzeit-Assays (1-4 h) oder in Langzeit-Expositions-Assays mit einer Dauer von 24-48 h zu screenen.

Protokoll

Alle Versuche wurden im Rahmen der italienischen Tierschutzgesetzgebung (D.L.26/2014) durchgeführt, mit der die Richtlinie des Europäischen Ausschusses (2010/63 EWG) umgesetzt wurde. Mytilus galloprovincialis ist eine filtrierende Muschel, die allgemein als Mittelmeermuschel bekannt ist. Er ist im Mittelmeer und an der Atlantikküste Südeuropas beheimatet. Es wurde eingeführt und ist im westlichen Nordamerika, Asien und Südafrika weit verbreitet. Er ist eine wichtige kommerzielle Fischereiart in mehreren Teilen der Welt. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von künstlichem Meerwasser (ASTM) oder gefiltertem natürlichem Meerwasser

  1. Für die Aufbereitung von künstlichem Meerwasser ASW nach ASTM D1141-98 (2021)32 lösen Sie folgende Salze in destilliertem Wasser (g für 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2,6H 2O, 0,0019 NaF. Die ASW-Lösung hat einen pH-Wert von 7,80.
  2. Für die Aufbereitung von gefiltertem natürlichem Meerwasser (FSW) wird natürliches Meerwasser 37 PSU, das an einem Ort gesammelt wird, der nicht von anthropogenen Aktivitäten betroffen ist, mit 0,2-μm-Filtern gefiltert.

2. Eingewöhnung der Tiere

  1. Adulte Muschelexemplare (Mytilus galloprovincialis Lam.) werden vor der experimentellen Verwendung 24 h lang in statischen Tanks (in Hungerphasen) mit belüftetem ASW oder FSW (1 l/Tier) bei 15 °C in einem thermostatischen Raum akklimatisiert.

3. Reagenzienpräparat zur Beurteilung der Hämozytenmotilität

  1. Bereiten Sie gefiltertes Meerwasser (FSW) wie oben oder physiologische Standardkochsalzlösung (SPS) vor. HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g in ca. 800 ml destilliertem Wasser auflösen und dann durch Zugabe von mehr destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 7,36 ein.
  2. Bereiten Sie eine neutralrote Stammlösung von 20 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor.
  3. Neutralrot-Färbelösung vorbereiten: Fügen Sie 5 μl einer neutralroten Stammlösung zu 995 μl FSW oder SPS hinzu.
  4. Bereiten Sie FSW oder SPS zu, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 40 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin, wie folgt vor: Fügen Sie 100 μl 2 mM L-Glutamin und 100 μl Penicillin/Streptomycin-Mischung zu 10 mL FSW/SPS hinzu.
  5. Bereiten Sie 0,4% Trypanblau in FSW oder SPS vor.
    HINWEIS: Die neutrale rote Stammlösung wurde nach Martínez-Gómez et al.33 hergestellt. Die Neutral Red Stammlösung hält sich bei 4 °C Lagerung ca. 2-3 Wochen. Neutral Red Färbelösung und 0,4 % Trypanblau sollten kurz vor dem Assay hergestellt werden.

4. Hämolymph-Probenahme

  1. Füllen Sie eine Spritze mit 0,5 mL gefiltertem Meerwasser FSW oder physiologischer Standardkochsalzlösung SPS (bei 15 °C) vor.
  2. Hebeln Sie die Klappen entlang der Bauchfläche mit einem Skalpell leicht und vorsichtig auseinander. Halten Sie das Skalpell in Position oder verwenden Sie eine Pipettenspitze. Lassen Sie die Nadel einer Injektionsspritze in den Raum zwischen den Ventilen eindringen.
  3. Entnehmen Sie vorsichtig 0,5 ml Hämolymphe aus dem hinteren Adduktorenmuskel mit der Fertigspritze gemäß UNEP/RAMOGE34.
  4. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und geben Sie den Inhalt der Spritze in ein Mikroröhrchen.
  5. Sammeln Sie die Hämolymphe von 3-4 Muscheln und sammeln Sie die Hämolymphproben in einem Röhrchen bei 15 °C im gleichen Verhältnis zwischen den Individuen.
    HINWEIS: Die Vorfüllung der Spritze wird verwendet, um die Hämolymphe während der Probenahme sofort 1:1 zu verdünnen. Die Verdünnung der Hämolymphe mit FSW oder SPS im Verhältnis 50:50 wird häufig verwendet, um die Aggregation von Hämozyten zu verhindern, so Martínez-Gómez et al.33.

5. Hämozytenplattierung und -kultur

  1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  2. Verdünnen Sie die Hämolymphe in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml mit FSW oder SPS.
  3. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit von Hämozyten in Suspension durch Trypanblau-Färbung: Geben Sie 100 μl 0,4 % Trypanblau, gelöst in FSW oder SPS, zu 100 μl Hämozytensuspension. 5 min bei 15 °C inkubieren.
  4. Geben Sie anschließend einen Tropfen Suspension in ein Hämozytometer und zählen Sie die ungefärbten (lebensfähigen) und gefärbten (nicht lebensfähigen) Zellen unter mikroskopischer Beobachtung.
  5. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Hämozyten als Prozentsatz lebensfähiger Zellen, berechnet auf die Gesamtzahl der gezählten Zellen35.
  6. Verwenden Sie die folgende Formel für die Bewertung der Zellviabilität35:
    Lebensfähige Zellen (%) = [Anzahl lebensfähiger Zellen/Gesamtzahl der Zellen (lebensfähig + nicht lebensfähig)] x 100
  7. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Hämozyten höher als 95 % sein sollte, um im weiteren Verlauf des Protokolls fortzufahren.
  8. Geben Sie 50 μl verdünnte Hämolymphe in jede Vertiefung einer mit TC behandelten Zellkultur-Mikroplatte mit 96 Well aus Polystyrol mit flachem Boden. Decken Sie den Teller mit dem Deckel ab.
  9. Lassen Sie die Hämozyten 30 Minuten lang bei 15 °C am Boden der Vertiefungen haften, um eine Monoschicht zu bilden.
  10. Entfernen Sie die überschüssige Hämolymphe, indem Sie vorsichtig mit einer Mikropipette aspirieren.

6. Kurzzeit-Assay

  1. Für Kurzzeit-Assays (innerhalb von 1-4 h) inkubieren Sie die am Boden der Vertiefungen haftenden Zellen sofort mit 100 μl der in FSW oder SPS gelösten Substanz von Interesse in unterschiedlichen Konzentrationen bei 15 °C. Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen für drei Wiederholungsbestimmungen jeder Versuchsbedingung.
  2. Beurteilen Sie nach der Inkubation die Zellmotilität gemäß Schritt 8.

7. Assay bei längerer Exposition

  1. Bei längerer Exposition, d. h. 24-48 h Expositionsassays, inkubieren Sie die kultivierten adhärenten Zellen mit steigenden Konzentrationen der im Kulturmedium gelösten Prüfsubstanz (FSW oder ASW), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 40 IE/ml, Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) bei 15 °C. Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen für drei Wiederholungsbestimmungen jeder Versuchsbedingung.
  2. Beurteilen Sie nach der Inkubation die Zellmotilität gemäß Schritt 8.

8. Beurteilung der Zellmotilität durch Zeitraffermikroskopie

  1. Setzen Sie die Multiwell-Platte mit den adhärenten lebenden Hämozyten in einen Multimode-Reader ein.
  2. Beurteilen Sie die Beweglichkeit der adhärenten lebenden Zellen durch Echtzeit-Bildgebung auf der Platte durch Zeitraffermikroskopie: Nehmen Sie Bilder derselben Region of Interest (ROI) (Dimension des verwendeten ROI: 720 μm x 720 μm) in jeder Vertiefung mit einer Rate von 1 Bild alle 1 Minute für 10 Minuten mit dem Multimode-Reader unter 20-facher Vergrößerung und Farbhellfeldvisualisierung auf.
  3. Zur besseren Visualisierung der Blutröhren färben Sie die Zellen kurz vor dem Zeitraffermikroskop wie folgt mit dem Vitalfarbstoff Neutralrot:
    1. Entfernen Sie das Inkubationsmedium aus jeder Vertiefung.
    2. 100 μl Färbelösung von Neutralrot, gelöst in physiologischer Standardkochsalzlösung, die die interessierende Substanz enthält, in die Vertiefungen der Platte mit den adhärenten Zellen geben.
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 15 °C für 15 min. Wasche den überschüssigen Farbstoff aus.
    4. Es werden 100 μl der in FSW oder SPS gelösten Substanz von Interesse zugegeben. Visualisieren Sie die Zellen für die Beurteilung der Beweglichkeit.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Multimode-Readers ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Bildern aus einer großen Anzahl von Wells, wodurch die gleichzeitige Motilitätsdetektion aller experimentellen Bedingungen und Replikate, die in der Vertiefung enthalten sind, ermöglicht wird. Der neutralrote Farbstoff bleibt in den Lysosomen erhalten, die als kleine orangefarbene Flecken im Zytoplasma erscheinen, während der Zellkern als durchscheinendes Loch erscheint, da er nicht durch den Acidophilus-Vitalfarbstoff verfärbt wird. Die Bildaufnahme erfolgte für 10 min bei einer Raumtemperatur von 20 °C.

9. Berechnung der Zellverfolgung und der velozimetrischen Parameter

  1. Analysieren Sie die Frames desselben interessierenden Bereichs, die unter Zeitraffermikroskopie von Bild J für jedes Well aufgenommen wurden.
  2. Speichern Sie die Bilder in einem Ordner ohne Leerzeichen im Namen. Die Bilder können entweder im JPEG- oder PNG-Format vorliegen.
  3. Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf Datei > Importieren > Bildsequenz.
  4. Führen Sie die Zellverfolgung für einzelne Zellen mit dem Plug-In "Manuelle Verfolgung" von ImageJ durch. Die Positionen der einzelnen Zellen werden in aufeinanderfolgenden Bildern markiert, so dass Positionsänderungen im Laufe der Zeit verfolgt werden können.
  5. Analysieren Sie mindestens 40 Zellen pro Well, wobei Zellen, die aus dem aufgezeichneten Feld ausweichen, aus der Analyse ausgeschlossen werden.
  6. Importieren Sie Datensätze aus dem ImageJ-Plug-in "Manual Tracking" in die frei verfügbare Software Chemotaxis und Migration Tool.
  7. Quantifizieren Sie velozimetrische Parameter, wie z. B. mittlere Geschwindigkeit, euklidische Entfernung, migrierte Entfernung und Direktheit unter Verwendung der Software Chemotaxis and Migration Tool gemäß den detaillierten Anweisungen in der frei verfügbaren Bedienungsanleitungder Software 36oder den unten angegebenen Schritten:
    1. Importieren Sie Datensätze aus dem ImageJ-Plug-in "Manuelles Tracking" in die Software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Slices aus (z. B. die Anzahl der Bilder, die für das Tracking verwendet werden).
    3. Kalibrieren Sie die Software, indem Sie die x/y-Pixelgröße und das Zeitintervall einstellen. Die x/y-Kalibrierung gibt die Kantenlänge eines Pixels in μm an, während das Zeitintervall die Dauer zwischen den einzelnen Schichten darstellt.
    4. Nachdem Sie die Werte und Parameter angepasst haben, klicken Sie auf Einstellungen übernehmen.
    5. Plotten Sie Trajektorien und exportieren Sie sie als Bild. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messwerte , um die Messwerte anzuzeigen. Speichern Sie es.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und speichern Sie die Geschwindigkeit und Direktheit der Spurserie.
  8. Die für Kontrollzellen berechneten velozimetrischen Parameter sind mit denen von Hämozyten zu vergleichen, die der Prüfsubstanz in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt waren.
    HINWEIS: Die migrierte Entfernung (gemessen in μm) bezieht sich auf die Länge des Migrationspfads während des Beobachtungszeitraums (10 min). Der euklidische Abstand (auch in μm gemessen) stellt den geradlinigen Abstand zwischen dem Startpunkt und dem Endpunkt der Zelle dar. Die mittlere Geschwindigkeit (ausgedrückt in μm min-1) wird als Verhältnis der migrierten Entfernung zur Dauer der Zellverfolgung für jede Zelle berechnet. Die Direktheit ist definiert als das Verhältnis der euklidischen Entfernung zur akkumulierten Entfernung für jede Trajektorie.

Ergebnisse

Die Studie stellt eine neuartige in vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vor, wobei die Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten genutzt wird. Abbildung 1A-C zeigt eine repräsentative Zeitraffer-Bildgebung von Hämozyten nach 30-minütiger Anheftung an den Boden der Vertiefung. Die Zellen in der Abbildung wurden kurz vor der Motilitätsbeurteilung mit Neutralrot gefärbt. Die Zellbewegungen wurden mit Hilfe der optischen Mikroskopie mit einer Rate von einem Bild pro Minute für 10 Minuten bei 20-facher Vergrößerung mit einem Multimode-Lesegerät überwacht. Abbildung 1A-C zeigt drei der 11 Frames, die aus demselben Region of Interest (ROI) bei 0 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten aufgenommen wurden. In allen drei Figuren sind dieselben Zellen nummeriert, um ihre Bewegung hervorzuheben, und die Nummerierung bleibt in allen Figuren konsistent, um ihre Flugbahnen deutlich zu veranschaulichen.

Die Zellen zeigen einzellige Bewegungen, die auf der Aktivität der Lamellipodien und schnellen Formveränderungen basieren. Die Zellen wurden mit dem lebenswichtigen Farbstoff Neutralrot markiert, um ihre Sichtbarkeit während des Trackings zu verbessern. Neutralrot ist ein amphiphiler und schwach kationischer Farbstoff, der die Zellmembran leicht durchdringen kann. Sobald sich der Farbstoff in den Zellen befindet, wird er durch die Protonierung in den Lysosomen eingeschlossen. Muschelhämozyten, insbesondere Granulozyten, weisen ein gut entwickeltes lysosomales System auf; Daher sind sie durch Neutralrot-Färbung gut sichtbar, wobei das Zytoplasma reich an mehreren rot markierten Lysosomen ist und der Zellkern (nicht durch den Farbstoff markiert) als durchscheinendes Loch erscheint.

Durch die Anwendung des Protokolls können nach Udayan et al.23 zwei Haupt-Hämozyten-Morphotypen beobachtet werden: (1) Spreizzellen mit einer bipolaren Bohnenform und manchmal einem amöboiden Umriss und kleinere runde sternförmige Zellen (Zellen n = 3 und 10). In beiden Zelltypen war die Bewegung durch kontinuierliche Formveränderungen gekennzeichnet, mit kontinuierlicher Ausdehnung und Zurückziehung von Pseudopodien und Filopodien.

Die Protokollanwendung ermöglicht die erfolgreiche Beurteilung der Hämozytenmotilität durch die Erstellung von Trajektoriendiagrammen, wie in Abbildung 2 dargestellt, und die Berechnung der wichtigsten velocimetrischen Parameter wie mittlere Geschwindigkeit und Direktheit. Diese entsprachen jeweils 6,46 ± 0,2 μm/min und 0,56 ± 0,02 (mittlere ± SEM) für Spreizzellen und 5,18 ± 0,34 μm/min bzw. 0,37 ± 0,03 für kleine Zellen unter basalen physiologischen Bedingungen nach 30 min Anheftung an den Boden der Vertiefung. Daher ermöglicht das Protokoll die Klassifizierung verschiedener Hämozytenpopulationen auf der Grundlage velozimetrischer Parameter.

Durch die Anwendung des Protokolls können Veränderungen des velozimetrischen Parameters der Hämozytenmotilität nach Exposition gegenüber Arzneimitteln oder Schadstoffen festgestellt werden. Abbildung 3A-D zeigt repräsentative Ergebnisse der In-vitro-Exposition von Muschel-Hämozyten gegenüber Paracetamol, einem der Arzneimittel, das in die Umwelt (PiE) mit der höchsten Konzentration und den höchsten Nachweishäufigkeiten in Flüssen auf der ganzen Welt freigesetzt wird31.

Laut Udayan et al.23 wurde in Kontrollzellen in beiden Zellmorphotypen ein signifikanter Anstieg der Geschwindigkeit mit der Zeit beobachtet, was auf eine Aktivierung der Hämozyten während der 24-Stunden-Kultur hindeutet, was vermutlich an die Entzündungsreaktion erinnert, die experimentell durch Entzug und Plattierung in der Kulturumgebung induziert wurde. Wenn die Zellen dem Arzneimittel ausgesetzt wurden, war die Motilitätsaktivierung der Hämozyten in Spreizzellen (Abbildung 3A) nach 24 h signifikant reduziert, nicht jedoch in kleinen runden Zellen (Abbildung 3C), die durch eine niedrigere mittlere Basalgeschwindigkeit gekennzeichnet waren (wie zum Zeitpunkt 0 bewertet). Darüber hinaus ermöglichte das Protokoll den Nachweis von Veränderungen der Zelltrajektorie nach Arzneimittelexposition, wie die signifikante Zunahme der Direktheit kleiner Zellen nach 24 Stunden und die Abnahme der Direktheit nach 1 Stunde Exposition in gespreizten Zellen zeigt (Abbildung 3C, D).

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Abbildung 1: Repräsentative Zeitrafferbildgebung von neutralrot gefärbten Hämozyten nach 30 min Anheftung an den Boden der Vertiefung. Die Zellen wurden kurz vor der Motilitätsbeurteilung mit dem Vitalfarbstoff Neutral Red gefärbt. Die Zellbewegungen wurden mit Hilfe der optischen Mikroskopie mit einer Rate von einem Bild pro Minute für 10 Minuten bei 20-facher Vergrößerung überwacht. Der Kürze halber werden in den Bereichen A, B und C drei der 11 Frames angezeigt, die aus demselben Interessenbereich (ROI) bei 0 Minuten, 5 Minuten und 10 Minuten erfasst wurden. In allen drei Ziffern sind dieselben Zellen nummeriert, um ihre Bewegung zu veranschaulichen, und Pfeile zeigen die Zeitintervalle an. Maßstabsleisten stellen 100 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentatives Trajektoriendiagramm von M. galloprovincialis-Hämozyten . Die gezeigten Trajektorien stammen aus einem einzigen Bohrloch. Die Trajektorien von 25 Zellen sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Einfluss der Paracetamol-Exposition (24 h) auf die Geschwindigkeit und Direktheit von Spreizzellen (A,B) und kleinen runden sternförmigen Zellen (C,D). Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz der Daten wurde durch eine unidirektionale ANOVA und den Tukey-Post-Test bewertet. *p < 0,05 vs. Kontrolle (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll stellt eine neuartige In-vitro-Methode dar, die für die schnelle und empfindliche Bewertung der Toxizität von Arzneimitteln und Schadstoffen auf der Grundlage der Bewertung der Motilität von M. galloprovincialis-Hämozyten und ihrer Veränderungen geeignet ist. Motilität ist ein besonderer Aspekt der Immunfunktion dieser Zellen 21,22,23,37,38, daher kann jede Veränderung der Zellmotilität auf Veränderungen in der Immunfunktion dieser Zellen hindeuten. Motilität ist eine essentielle zelluläre Funktion, die mehrere zelluläre Prozesse integriert, wie z. B. Zelladhäsion, Zellsignalisierung, Zytoskelettaktivität, intrazelluläre Signalübertragung und Zellvolumenregulation, und die Integration und Koordination komplexer biochemischer und biomechanischer Signale erfordert 39,40,41. Jeder dieser Prozesse oder die Komponenten jedes Prozesses können potenzielle Ziele der toxischen Wirkung von Arzneimitteln und Schadstoffen sein. Daher stellen Veränderungen der Motilität entweder in der Zellgeschwindigkeit und/oder in der Trajektorie empfindliche Endpunkte dar, die die Auswirkungen auf mehrere zelluläre Ziele integrieren.

Das Protokoll eignet sich für die In-vitro-Bewertung der Wirkungen von Prüfsubstanzen entweder in Kurzzeit-Assays (1-4 Stunden Dauer) oder Langzeit-Expositions-Assays mit einer Dauer von 24-48 Stunden, um ein schnelles Screening von Schadstoffen und Arzneimitteln auf potenzielle toxische Wirkungen zu ermöglichen. Durch die Verwendung einer 96-Well-Platte ermöglicht die Methode die gleichzeitige Prüfung mehrerer Substanzen oder unterschiedlicher Konzentrationen einer einzelnen Substanz, wodurch Zeit und Reagenzien gespart werden. Darüber hinaus kann das Protokoll auch für die Verwendung mit anderen Geräten, wie z. B. einem Phasenkontrastmikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop, angepasst werden. In diesem Fall könnten Zellen ohne Färbung oder mit fluoreszierenden Vitalfarbstoffen abgebildet werden.

Obwohl die Methode neuartige und empfindliche Alternativen für das toxikologische Screening bietet, müssen für breitere Anwendungen einige Einschränkungen der Methode berücksichtigt werden. Erstens ist ein kritischer Aspekt der Protokollanwendung die Temperatur. Es ist bekannt, dass Muschel-Hämozyten empfindlich auf Temperaturänderungen reagieren. Die Auswirkungen der Temperatur auf die Hämozyten sind komplex, wobei sich hohe und niedrige Temperaturen negativ auf ihre Immunfunktionen auswirken 42,43,44. Wie beim Aufbau der Methode beobachtet, ist die kritische Phase bezüglich des Einflusses der Temperatur auf die Zellmotilität die Vorphase der Zellernte, Adhäsion und Kultivierung auf dem Substrat, die der Akklimatisierungstemperatur der Organismen folgen muss. Ein Temperaturanstieg von einigen Grad über der Akklimatisierungstemperatur kann entscheidend sein, um die Form und Beweglichkeit der ausgebreiteten Zellen zu erlangen. Daher wird für die Hämozytenkultivierung eine Temperatur von 15 °C empfohlen. Die Zeitrafferaufnahme zur Beurteilung der Motilität wurde für 10 min bei einer Raumtemperatur von 20 °C durchgeführt. Basierend auf vorläufigen Beobachtungen während des Methodenaufbaus verändert die Exposition kultivierter Zellen für dieses Zeitintervall bei 20 °C die Hämozytenmotilität nicht signifikant. Eine weitere Einschränkung der Methode betrifft die manuelle Verfolgung von Hämozyten, die zu einer benutzerabhängigen Variabilität führen kann und viel Zeit und Liebe zum Detail erfordert. Die Verwendung des Vitalfarbstoffs Neutralrot verbessert jedoch die Visualisierung der Zellen und damit auch die Zellverfolgung durch die Visualisierung des gut entwickelten lysosomalen Systems. Der Zellkern wird durch den Farbstoff nicht gefärbt und erscheint als leeres Loch, das bei der manuellen Zellverfolgung leicht erkennbar und leicht zuspitzbar ist. Eine weitere Einschränkung der Methode hängt mit ihrem In-vitro-Charakter zusammen. Während die In-vitro-Bedingung eine kontrollierte Umgebung für die Beurteilung der Motilität bietet, repliziert sie möglicherweise nicht vollständig die komplexen Wechselwirkungen und Reaktionen, die in vivo auftreten, insbesondere innerhalb der Immunantworten des gesamten Organismus.

In den letzten Jahren sind in den Biowissenschaften neue Ansätze und Methoden zum Einsatz gekommen, die darauf abzielen, die Ergebnisse zu verbessern und die Abhängigkeit von Tierversuchen zu verringern45. Das Protokoll bietet einen alternativen sensitiven Test für das In-vitro-Screening der Wirkungen und Wirkmechanismen von Schadstoffen und Arzneimitteln, um die toxikologischen Wirkungen chemischer Kontaminanten, die entweder einzeln oder in Gemischen in Umweltmatrizes vorhanden sind, schnell zu screenen. Es konzentriert sich auf einen neuen Endpunkt, die Motilität von Zellen des Immunsystems, die eine integrierte Antwort auf die toxikologischen Wirkungen von Medikamenten und Schadstoffen auf verschiedene zelluläre Ziele bieten kann. In diesem Sinne erweitert es das Spektrum der in der Literatur verfügbaren in vitro Tests, auch aus der Perspektive eines integrierten Multi-Assay-Ansatzes für die Anwendung im Umwelt-Biomonitoring. Einige Merkmale des Protokolls stimmen es mit den 3R-Kriterien (Replacement, Reduction, and Refinement) ab und tragen zur Reduzierung von In-vivo-Tierversuchen für Wirbeltiere und zur Entwicklung eines ethischeren und effizienteren toxikologischen und ökotoxikologischen Expositionstoxizitätstests bei. Zu diesen Merkmalen gehören die einfache Hämolymphgewinnung aus Muscheln auf schonend invasive Weise, die geringe Menge an Hämolymphe, die für den Test erforderlich ist, und die Verwendung einer Multiwell-Platte, die die gleichzeitige Exposition mehrerer Giftstoffkonzentrationen und Replikationen ermöglicht, was eine erhebliche Zeit- und Reagenzienersparnis ermöglicht.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Projekt "Dipartimento di Eccellenza" finanziert, das DiSTeBA vom italienischen Ministerium für Universität und Forschung, CUP: F85D18000130001, und vom NBFC (National Biodiversity Future Center) gefördert wurde, das von der Europäischen Union NextGenerationEU, PNRR, Projekt n. CN00000033, finanziert wurde. Wir danken auch der BIOforIU-Infrastruktur an der Fakultät für Bio- und Umweltwissenschaften und -technologien der Universität Salento.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; m Filter (Durchmesser 25 mm)ABLUO Laborbedarf
2,5 ml Injektionsspritze 22GStrahlen2522CM32Laborbedarf
96-Well-Polystyrol mit flachem Boden TC-behandelte MikroplatteCorning3916Laborbedarf
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KG
Software für chemische Chemotaxis und Migrationswerkzeuge (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Geräte: Multimode-Reader für die Zellbildgebung
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Röhrchen mit konischem BodenCorning352196Laborbedarf
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemisches
Hämozytometer Schnell ablesbar 102BiosigmaBVS100Laborbedarf
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500G
Chemical ImageJ SoftwareNIHSoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemisches
L-GlutaminMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essentielle Aminosäure für Zellkulturmedium
MgCl2· 6H2O Merk(Sigma - Aldrich) M2670
Chemisches MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemisches
Mikroskop Nikon Eclipse E600NikonAusrüstung: Zellbildgebung 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemikalie
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemie
NaFFluka71519 500gChemie
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KG
Chemisch Neutral RotMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVitalzellfarbstoff
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotika für Zellkulturen
SrCl2· 6H2O Merk(Sigma - Aldrich) 255521Chemisches
Trypan blau Merk (Sigma - Aldrich) T8154Zell-Farbstoff

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