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Methodenartikel

Anreicherung subzellulärer Proteine in Leptospiren mit einem Triton X-114-basierten Fraktionierungsansatz

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DOI:

10.3791/67298

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8. August 2025

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1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Obwohl Prokaryoten kein organelläres System haben, gibt es subzelluläre Regionen mit lokalisierten Proteinen. Die quantitative und qualitative Analyse der Enzyme und Proteine in den subzellulären Regionen ist wichtig für die Entwicklung von Wirkstoff- und Impfstoffzielen. Hier veranschaulichen wir die subzelluläre Fraktionierung von Leptospiral-Proteinen mit Hilfe von Triton X-114 und deren Analyse.

Zusammenfassung

Prokaryoten haben keine präzisen subzellulären Organellen, sondern weisen unterschiedliche Regionen wie Zytoplasma, innere Membran, Periplasma und äußere Membran auf, in denen die meisten biochemischen und physiologischen Funktionen organisiert sind. Um die funktionellen Eigenschaften von Proteinen zu verstehen, muss daher ihre subzelluläre Lokalisation aufgeklärt werden. Die Extraktion subzellulärer Proteine aus gramnegativen Bakterien stellt jedoch aufgrund ihrer komplexen Phospholipid-Doppelschicht eine Herausforderung dar. Obwohl sich Triton X-114 bei der Extraktion von Außenmembranproteinen (OMP) als vielversprechend erwiesen hat, ist ein prägnantes Protokoll nach wie vor schwer fassbar. Dieses Protokoll zeigt einen Schritt-für-Schritt-Workflow zur Extraktion subzellulärer Proteine am Modell der Spirochäte Leptospira . Diese Technik, die sich durch subzelluläre Fraktionierung und Phasentrennung auszeichnet, liefert unterschiedliche Fraktionen für zytoplasmatische, äußere und innere Membranproteine. Das Detergensmittel Triton X-114 eignet sich aufgrund seiner optimalen Trübungspunkttemperatur (~22 °C) und der niedrigen kritischen Mizellenkonzentration (CMC) gut für die Phasentrennung und ermöglicht so eine effiziente Extraktion und Reinigung nativer Proteine mit minimaler Denaturierung. Insbesondere zeigt die Analyse die Effizienz bei der Unterscheidung von Proteinen aus der inneren und äußeren Membran, die sich vom Zytoplasma unterscheidet.

Einleitung

Subzelluläre Proteomanalysen (SCP) spielen eine zentrale Rolle bei der Aufklärung der bakteriellen Pathogenese, indem sie das Proteom in spezifischen subzellulären Kompartimenten von Bakterienzellen analysieren. Dieser subzelluläre Proteomik-Ansatz charakterisiert bakterielle Proteine innerhalb unterschiedlicher Kompartimente, reduziert die Komplexität, indem er Proteine mit hoher Häufigkeit ausschließt und Einblicke in ihre Organisation und proportionale Häufigkeit gibt 1,2. Zum Beispiel enthüllte eine Studie über Shewanella oneidensis unter Verwendung von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS-Techniken einen wesentlichen Teil seines Proteoms und lieferte entscheidende Details über die Kompartimentarchitektur der Zell- und Proteinhäufigkeit. Diese Studie dient als grundlegender Rahmen für nachfolgende Untersuchungen der subzellulären Organisation innerhalb gramnegativer Bakterien3. Im Bereich der bakteriellen Pathogenese ist die Abgrenzung des bakteriellen Proteoms während einer In-vivo-Infektion unerlässlich, um die Mechanismen zu verstehen, die die Pathogenität antreiben4. Die Untersuchung des Proteoms intrazellulärer Salmonellen in Epithelzellen über verschiedene Infektionsstadien hinweg hat maßgeblich dazu beigetragen, die Anpassungsstrategien aufzudecken, die von bakteriellen Krankheitserregern in ihrem intrazellulären Milieu eingesetzt werden 4,5. SCP-Strategien bieten umfassende Einblicke in die zelluläre Dynamik, indem sie die Proteinhäufigkeit und Translokation innerhalb verschiedener zellulärer Kompartimente bewerten. Diese Methode ermöglicht die umfassende Identifizierung von Proteinen aus verschiedenen bakteriellen Kompartimenten und verbessert die gründliche Analyse bakterieller Proteome 6,7.

Die subzelluläre Verteilung von Proteinen bestimmt nicht nur ihre funktionelle Aktivität, sondern erhöht auch ihre funktionelle Vielfalt8. Zum Beispiel weisen Enzyme je nach ihrer subzellulären Lokalisation unterschiedliche Regulationsmechanismen und Aktivitätsniveaus auf. Transglutaminasen (TGasen) zum Beispiel weisen unterschiedliche Rollen oder Regulationsmechanismen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten in Pollenschläuchen auf: Zytoplasmatische TGasen bauen primäre Amine in zytosolische Proteine (z. B. Aktin und Tubulin) in einer Ca(2+)-abhängigen Weise ein und interagieren mit dem Zytoskelett; Membran-TGasen sind mit Golgi- und Plasmamembranen assoziiert, was auf eine Rolle bei der exozytotischen Verabreichung hindeutet; und Zellwand-assoziierte TGasen regulieren das apikale Wachstum durch Kolokalisierung mit Zellwandmarkern. Diese funktionalen Unterscheidungen werden durch kompartimentspezifische Rollen9 vermittelt. Darüber hinaus unterstreicht die Reparatur oxidierter Proteine in der Bakterienhülle die entscheidende Rolle von Enzymsystemen in spezifischen zellulären Kompartimenten, die reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind10. Betrachten wir die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), deren subzelluläre Lokalisation durch Lipidmodifikationen moduliert wird, die ihre Interaktion mit verschiedenen zellulären Membranen beeinflussen11. Die Kompartimentierung von Enzymen sorgt für unterschiedliche Umgebungen, die Wechselwirkungen zwischen Enzymen und Substraten begünstigen, und erleichtert so kompartimentspezifische Stoffwechselprozesse12.

Bakterien und andere Prokaryoten haben keine klaren subzellulären Organellen; Es gibt unterschiedliche Regionen, einschließlich Zytoplasma, innerer Membran, Periplasma und äußerer Membran. Die meisten biochemischen und physiologischen Funktionen im Organismus sind in verschiedenen subkelleren Kompartimenten organisiert13. Daher ist die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen wichtig, um ihre funktionellen Eigenschaften vorherzusagen. Die Extraktion subzellulärer Proteine aus gramnegativen Bakterien stellt jedoch aufgrund ihrer komplexen doppelmembranigen Phospholipid-Doppelschicht eine Herausforderung dar. Herkömmliche Extraktionsmethoden, bei denen Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) und Zusatzstoffe wie Harnstoff verwendet werden, beeinträchtigen häufig die Integrität des Membranproteins, was sich auf die nachgelagerten Analysen auswirkt14,15. Darüber hinaus spielt die Lipidzusammensetzung eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Konformationsänderungen von Membranproteinen. Der Erfolg der Solubilisierung hängt von Faktoren wie dem Detergens-Lipid-Protein-Verhältnis ab, da der Prozess das Einbringen des Detergens in die Lipiddoppelschicht und die anschließende Proteinsolubilisierung umfasst16. Die Wahl des Detergens ist entscheidend für die effektive Solubilisierung von Membranproteinen, wobei Faktoren wie Trübungspunkttemperatur und Inkubationszeitberücksichtigt werden 17. Das Lipidmilieu kann die Konformationsänderungen von Membranproteinen beeinflussen18,19.

Detergenzien sind unerlässlich, um Membranproteine aus biologischen Membranen zu extrahieren und ihre Löslichkeit in wässrigen Lösungen zu gewährleisten, eine Voraussetzung für die anschließende Proteinreinigung. Die Reinigung von Membranproteinen ist jedoch oft eine Herausforderung, da sie aus ihrer nativen Lipidmembranumgebung entfernt und in einen Detergenzpuffer gelegt werden, der die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Membran nur teilweise repliziert20. Nach der Extraktion werden Membranproteine in der Regel in nachfolgenden Prozessen mittels Dialyse, Proteinfällung und einigen chromatographischen Methoden als lösliche Proteine aufgereinigt20,21. Die Phasentrennung bietet eine leistungsstarke Alternative oder Ergänzung zu chromatographiebasierten Aufreinigungsprotokollen und kann direkt auf lösliche Proteine angewendet werden. Grundsätzlich ermöglicht die Phasentrennung die Teilung integraler Membranproteine in eine mit Detergens angereicherte Phase und zytosolische Proteine in der detergenziösen wässrigen Phase20,22. In früheren Studien wurden mehrere Detergenzien beschrieben, die bei der Solubilisierung von Membranproteinen verwendet werden20. Dazu gehören die Triton-Familie (Triton X-100 & Triton X-114), die Tween-Familie (Tween-20 & -80), anionische Detergenzien, kationische Detergenzien, Polyoxyethylenglykolmonoether-Detergenzien usw., aber sie haben Vor- und Nachteile in Bezug auf Proteinstruktur und Funktion20. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Detergenzien haben einen großen Einfluss auf die Phasenteilung und Solubilisierung von Membranproteinen20. Detergenzien sind amphipathische Moleküle mit einer polaren Kopfgruppe und einer hydrophoben Kohlenwasserstoffkette. In geringen Konzentrationen liegen sie als Monomere im Wasser vor. Oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) bilden sie Mizellen, deren Größe vom Detergenstyp abhängt, wobei die Aggregationszahl die Anzahl der Moleküle pro Mizelle angibt (auch als Mizellenmolekulargewicht bezeichnet). Ein weiterer wichtiger Faktor ist der "Trübungspunkt", der durch Ändern der Temperatur einer wässrigen mizellaren Waschmittellösung erreicht werden kann, die trüb wird und schließlich zwei unterschiedliche Phasen bildet. Dieser Prozess wird als Phasentrennung oder Wolkenpunktextraktion bezeichnet. Ein hoher CMC kann mehr Membranproteine liefern, die hohen Konzentrationen von Detergenzien mit schwächerer Bindung entsprechen, die gegen einen Puffer mit einer definierten Detergenzienkonzentration dialysiert werden können20. Das Erreichen eines hohen CMC-Gehalts in den meisten Detergenzien erfordert jedoch eine hohe Trübungspunkttemperatur, die die Struktur und Funktion des extrahierten Proteins beeinträchtigen und nachgelagerte Prozesse beeinträchtigen kann. Selbst die hohe Konzentration des Detergens in dieser Phase kann schädlich für das Protein sein und aufgrund der hohen Viskosität zu Problemen beim Liquid Handling beim Pipettieren des präzisen Volumens führen. Zum Beispiel hat Triton X-100 eine hohe Ausbeute an Membranproteinen in der Detergensmizelle oberhalb der Trübungspunkttemperatur von 64-65 °C. Um die Arbeitstemperatur zu halten, werden 9%-23% (NH4)2ALSO4 oder 16%-25% NaCl-Zugabe kann auf Raumtemperatur (RT) reduziert werden, was zu einer hohen Konzentration an Detergenzien führt, was wahrscheinlich die Proteinstabilität beeinträchtigt. In ähnlicher Weise wird bei der Tween-basierten Extraktion eine hohe Trübungspunkttemperatur verwendet (76 °C für Tween 20 und 93 °C für Tween 80). Anionisches Detergens SDS wird häufig in Proteinanwendungen verwendet, denaturiert aber in der Regel Proteine20. Forscher, die darauf abzielen, Membranproteine effizient zu extrahieren, identifizierten Triton X-114 aufgrund seiner optimalen Trübungspunkttemperatur von etwa 22 °C als klassisches Detergensmittel, das sich ideal für Studien an Membranproteinen eignet. Triton X-114 wurde erstmals 1981 von Bordier eingeführt und wird seitdem in großem Umfang für die Extraktion und Reinigung von Membranproteinen in verschiedenen Quellen, einschließlich tierischer und pflanzlicher Gewebe sowie Mikroorganismen, eingesetzt20,22. Der niedrige CMC von Triton X-114 verhindert die Entfernung durch Dialyse; Seine milde Beschaffenheit minimiert jedoch die Denaturierung von Membranproteinen in der mit Detergenzien angereicherten Phase. Darüber hinaus bildet Triton X-114 im Vergleich zu Triton X-100 kleinere Mizellen (n = 7-8)20. Im Studienprotokoll von James G. Pryde wurde Triton X-114 für die Extraktion von Membranproteinen aus kultivierten Säugetierzellen verwendet. Bei einer Trübungspunkttemperatur von über 20 °C (Inkubation bei 30 °C für 3 min) wurden integrale Membranproteine in die mit Detergenzienz angereicherte Phase aufgeteilt, während periphere und zytosolische Proteine aus der detergenziösen wässrigen Phase zurückgewonnen wurden22. Darüber hinaus verwendeten David A. Haake et al. Triton X-114, um äußere Membranproteine (OMPs) aus Leptospira interrogans, mit und ohne CaCl2 als Zusatzstoff23,24. Spätere Studien bestätigten, dass Triton X-114 OMPs effektiv aus subzellulären Kompartimenten ohne Zusatzstoffe wie Glycerin oder CaCl extrahiert225,26. Die Aufnahme von Salzen kann jedoch die Detergenzkonzentration erhöhen, was sich auf groß angelegte Proteomstudien mit Hochdurchsatz-Massenspektrometrie auswirken kann20. In unserer Arbeit zur subzellulären Proteomanalyse setzten wir Triton X-114 in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie ein, wodurch eine signifikante Anreicherung über alle subzellulären Kompartimente hinweg erreicht wurde, einschließlich zytoplasmatischer Proteine, Proteine der inneren Membran und der äußeren Membran25,26. Das primäre Ziel des vorliegenden Protokolls ist es, subzelluläre Kompartimente einer typischen gramnegativen Bakterienzelle effizient anzureichern und gleichzeitig Probleme in nachgelagerten Prozessen zu minimieren. Darüber hinaus ist das Protokoll so konzipiert, dass es kostengünstig und zeiteffizient ist. Hier gehen wir auf das im Labor entwickelte, optimierte Protokoll für die Isolierung subzellulärer Proteine ein und diskutieren jeden Engpass, der während des Extraktionsprozesses auftritt.

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Protokoll

HINWEIS: In diesem Protokoll werden Leptospira interrogans für das subzelluläre Proteinextraktionsexperiment verwendet. Während dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen gramnegativen Bakterien angepasst werden kann, kann je nach den spezifischen Forschungszielen eine Optimierung erforderlich sein. Die Materialtabelle und die Tabelle 1 enthalten die Liste der Chemikalien und Geräte sowie die Zusammensetzung der Puffer bzw. Reagenzlösungen, während Tabelle 2 die Laboreinrichtungen umreißt.

1. Leptospira-Stamm und Kulturbedingungen

  1. Beziehen Sie die L . interrogans Serogruppe Icterohaemorrhagiae Serovar Copenhageni Stamm Fiocruz L1-130.
    HINWEIS: Dieser Stamm wurde vom Indian Council of Medical Research - Regional Medical Research Centre in Port Blair, Indien, bezogen, einem WHO-Kooperationszentrum, das sich auf die Diagnose, Referenz, Forschung und Schulung von Leptospirose spezialisiert hat.
  2. Züchten Sie Leptospira (Inokulum mit ~1 × 106 Zellen/ml) in 50 ml Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) Medium, ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (BSA).
  3. Inkubieren Sie bei 30 °C, bis die Kultur die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht (3,5 × 108 Zellen/ml). Testen Sie die Aliquots des Kulturmediums auf Nähragarplatten, um sicherzustellen, dass das Medium nicht kontaminiert ist.
    HINWEIS: Verwenden Sie Dunkelfeldmikroskopie und eine Petroff-Hausser-Zählkammer, um die Zellen zu zählen. Weitere Informationen finden Sie in einem bereits veröffentlichten Artikel27.

2. Zellernte

  1. Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen werden drei biologische Repliken der L . interrogans-Kultur in gleichen Volumina (jeweils 25 ml) in Zentrifugenröhrchen überführt.
    HINWEIS: Die Leptospira-Kultur wurde während des Transfers in einer laminaren Luftstromhaube in einer BSL-2-Laboreinrichtung gehandhabt.
  2. Alle Röhrchen bei 2500 × g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig in ein Becherglas mit Desinfektionsmittel umfüllen und entsorgen. Verwenden Sie das Zellpellet für den nächsten Schritt.
  3. Waschen Sie die Zellpellets dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (jeweils 1 ml), ergänzt mit 5 mM MgCl2, und zentrifugieren Sie sie nach jedem Waschen 10 Minuten lang bei 10.000 × g .
    HINWEIS: Dieser Schritt entfernt das unerwünschte BSA, das im EMJH-Medium vorhanden ist, von der Oberfläche des Zellpellets.

3. Extraktion subzellulärer Proteine

  1. Triton X-114 Extraktion
    1. Behandeln Sie das nach der Entnahme erhaltene Leptospira-Zellpellet mit einem Extraktionspuffer, der 10 mM Tris-Cl (pH 8), 1 % Triton X-114 und 150 mM NaCl in einer Menge von 1 ml pro geerntetem Pellet enthält (Tabelle 1) (optional – je nach experimentellem Zweck kann ein Proteaseinhibitor-Cocktail hinzugefügt werden).
      HINWEIS: Bei diesem Verfahren werden Bakterien einfach einer Detergenzienlösung ausgesetzt, indem der Extraktionspuffer zur Extraktion von Membranproteinen hinzugefügt wird.
    2. Mischen Sie den Extraktionspuffer vorsichtig mit dem Pellet mit einer Mikropipette unter 25 °C, bis die Lösung optisch trüb wird.
    3. Die Mischung über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    4. Mischen Sie den resultierenden Extrakt erneut mit einer Mikropipette und zentrifugieren Sie ihn bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C.
    5. Dekantieren Sie den Überstand in ein anderes Fläschchen und bewahren Sie das Zellpellet für nachfolgende Extraktionsprozesse auf.
      HINWEIS: Dieser Überstand enthält eine Mischung aus hydrophilen und hydrophoben Proteinen, die reichlich aus dem Zytoplasma und der äußeren Membran stammen, und wird für die Phasentrennung verwendet.
    6. Geben Sie 50 μl Puffer mit 10 mM Tris-Cl (pH 8), 8 M Harnstoff, einem Proteasehemmer-Cocktail und 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) zum Zellpellet.
    7. Die Mischung nach Zugabe des Extraktionspuffers 5 Minuten lang kontinuierlich vortexen, dann weitere 5 Minuten bei 4 °C inkubieren.
    8. Das Gemisch wird erneut bei 15.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert und der resultierende Überstand als Pelletfraktion (P) bezeichnet.
      HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass die Pelletfraktion eine hohe Häufigkeit von inneren Membranproteinen in Leptospiraenthält 25,26.
  2. Phasen-Partition
    1. Die Triton X-114-Konzentration des aus der Extraktion erhaltenen Überstands wird auf 2 % eingestellt. Wenn das Überstandsvolumen beispielsweise 900 μl beträgt, fügen Sie 9 μl Triton X-114 Reinigungsmittel hinzu, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
    2. Die Mischung wird 1 h lang bei 37 °C inkubiert, dann 5 Minuten lang bei 30 °C bei 2000 × g zentrifugiert. Diese Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit kann die Trennung von Phasen beschleunigen.
    3. Lassen Sie die Mischung in zwei verschiedene Phasen aufteilen: wässrig und waschmittelhaltig. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit korrekt ist, um eine sichtbare Trennung zu erreichen. Lassen Sie es bei Bedarf 1 Minute ruhen, bevor Sie es isolieren. Tritt keine Trennung ein, wiederholen Sie bei Bedarf Schritt 3.2.2.
      HINWEIS: Die Phasentrennung kann visuell, durch Trübungsmessungen mit einem Spektralphotometer oder durch statische Lichtstreuung beobachtet werden. Um die Genauigkeit des Trübungspunkt-Assays zu erhöhen, fügen Sie der Lösung einen hydrophoben Farbstoff (5-Hexadecanoyl-aminoeosin) mit einer Konzentration von 500 nM hinzu und analysieren Sie ihn mit ultraviolett-sichtbarer Spektroskopie (UV-VIS).
    4. Isolieren Sie die obere wässrige Phase, indem Sie die Grenzfläche mit einer sterilen Spritze durchstechen und in eine separate Durchstechflasche überführen. Isolieren Sie die untere Detergenzphase mit einer Mikropipette und bewahren Sie sie in einer separaten Durchstechflasche auf.
      HINWEIS: Behandeln Sie die Durchstechflasche mit beiden Phasen während des Trennvorgangs vorsichtig. Bevor Sie die Durchstechflasche mit einer Spritze durchstechen, öffnen Sie den Deckel, um einen Nadelbruch oder Schwierigkeiten beim Herausziehen der oberen wässrigen Phase zu vermeiden. Die Verwendung einer Spritze gewährleistet eine genauere Volumenmessung jeder Phase nach der Trennung und minimiert die Kreuzkontamination von Proteinen zwischen den Phasen.
    5. Kennzeichnen Sie die Phasen als wässrig (A) und Detergens (D) und lagern Sie sie für die zukünftige Verwendung bei -20 °C.

4. Protein-Schätzung

  1. Die Proteinkonzentrationen jeder Triton X-114-Fraktion (wässrig, detergendes und pelletiert) sind mit dem Bicinchoninic Assay28 oder anderen geeigneten Methoden zu bestimmen.

5. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gelelektrophorese

HINWEIS: Proteine aus jeder Fraktion (wässrig, detergens, pellets) müssen mit Beta-Mercaptoethanol behandelt werden, um sie zu reduzieren, und dann mit 10 % SDS-PAGE (drei biologische Replikate) getrennt werden. Das Rezept für die 10% SDS-PAGE finden Sie in Tabelle 1. Für das Targeting von Proteinproben müssen alle Enzymaktivitätsanalysen in einer nativen Form durchgeführt werden, die in nativer PAGE aufgelöst werden kann.

  1. Resuspendieren Sie die Proteinprobe in eiskaltem Aceton mit dem vierfachen Volumen der Probe. Die Mischung mindestens 2 Stunden lang bei -20 °C inkubieren und dann 10 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugieren. Zusätzlich die Pelletfraktion in 80 % eiskaltem Aceton resuspendieren und dann 5 min bei 4 °C inkubieren. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 × g , um überschüssige Harnstoffsalzkristalle zu entfernen.
  2. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und legen Sie das Proteinpellet in ein trockenes Bad, bis das gesamte restliche Aceton aus den Fläschchen verdampft ist.
  3. Inkubieren Sie die Proteinproben in 20 μl Probenpuffer, der Beta-Mercaptoethanol enthält, und erhitzen Sie sie dann 10 Minuten lang bei 95 °C in einem Wasserbad oder Trockenbad.
    HINWEIS: Hier stellen die Proteinproben die wässrige (A)-Fraktion dar, die zytoplasmatische Proteine enthält, die Detergenzfraktion (D), die äußere Membranproteine enthält, und die Pelletfraktion (P), die innere Membranproteine enthält.
  4. Laden Sie die Proben, die A, D und P enthalten, zusammen mit einem vorgefärbten Proteinmarker (M) und einem Gesamtprotein (T) in jede Vertiefung des 10%igen SDS-PAGE-Gels.
    HINWEIS: Das Gesamtprotein kann hergestellt werden, indem alle drei Fraktionen unter Verwendung von 20 μl Probenpuffer in ein einziges Fläschchen gezogen werden.
  5. Verwenden Sie 1x Elektrodenpuffer in der Elektrophoreseapparatur (Tabelle 1). Stellen Sie die Laufparameter des Gels auf 6 mA für das Stapelgel und 12 mA für das auflösende Gel ein. Führen Sie die Elektrophorese bei RT durch.
  6. Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue G oder anderen im Labor erhältlichen Proteinflecken.

6. Immunoblottierung

  1. Nach der Geltrennung inkubieren Sie das ungefärbte Gel 5 Minuten lang in Transferpuffer (25 mM Trisbase, 190 mM Glycin, 20 % Methanol).
  2. Inkubieren Sie Löschpapiere in geeigneter Größe 5 Minuten lang in Immunoblot-Transferpuffer und fügen Sie sie dann als untere Schicht des Sandwiches zusammen.
  3. Verwenden Sie Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen oder Nitrozellulosemembranen, um Proteine aus den ungefärbten Gelen zu übertragen. Beginnen Sie mit dem Eintauchen der PVDF-Membran in absolutes Methanol für 30 s, gefolgt von einem 5-minütigen Einweichen in den Immunoblot-Transferpuffer. Integrieren Sie es anschließend in das Blotting-Sandwich.
  4. Legen Sie nun das ungefärbte Gel, das aus dem Transferpuffer entfernt wurde, und verwenden Sie es im Transfer-Blotting-Sandwich.
  5. Zum Schluss bedecken Sie das Sandwich, indem Sie es auf ein anderes Löschpapier legen, lösen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen mit einem Tupfwalze und führen Sie die Übertragung mit einer halbtrockenen Transfermethode durch.
    HINWEIS: Je nach Laborausstattung können auch andere Ansätze, einschließlich Trocken- und Nasstransfer, verwendet werden.
  6. Tauchen Sie die Membran 2 h lang in einen Blockierungspuffer (8 % fettfreie Milch in TBS-0,1 % Tween 20 [TBS-T]), gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C mit monospezifischen Antiseren*, die auf das Leptospira-Lipoprotein LipL41 (1:5000) oder das 35-kDa-Kernprotein (FlaB) (1:4000) des Flagellenfilaments abzielen (*benutzerdefinierter Antikörper). Spülen Sie die Membran dreimal mit TBS-T, wobei Sie jede Spülung 5 Minuten lang einwirken lassen.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen beliebigen Antikörper. Der Verdünnungsfaktor von Antikörpern kann variieren.
  7. Inkubieren Sie die Membran mit einem Maus-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der mit Meerrettichperoxidase (HRP) IgG (1:20000 Verdünnung) konjugiert ist, für 2 Stunden bei RT.
  8. Setzen Sie die Membran dem Elektrochemilumineszenz-Reagenz (ECL) aus, um Proteinbanden sichtbar zu machen.
  9. Legen Sie die Membran unter einen blauempfindlichen Röntgenfilm in einem dunklen Raum.
    HINWEIS: Alle anderen Entwicklungsmethoden können ebenfalls verwendet werden.

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Ergebnisse

In diesem Experiment haben wir die Spirochäte Leptospira als Modellorganismus verwendet, um subzelluläre Kompartimente zu extrahieren. Wir verwendeten eine strategische Methodik, die auf dem Trübungspunkt und der kritischen Myzelkonzentration (CMC) basiert, und nutzten die Wirksamkeit von Triton X-114, einem nichtionischen Detergens (Abbildung 1). Bevor fortgefahren wurde, wurde eine Proteinschätzung durchgeführt, um die Konzentration in jeder Fraktion für ein einzelnes biologisches...

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Diskussion

Subzelluläre Fraktionierungstechniken spielen eine zentrale Rolle bei der Isolierung diskreter zellulärer Bestandteile für die anschließende Analyse. Triton X-114, ein nichtionisches Detergensmittel, wird häufig in diesen Techniken verwendet, da es in der Lage ist, Proben in verschiedene Phasen zu unterteilen, was die Trennung verschiedener zellulärer Komponenten ermöglicht32. Triton X-114 war besonders nützlich bei der Extraktion von Membranproteinen (in nativer ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben erklärt, dass sie keine widersprüchlichen finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Indian Council of Medical Research, Neu-Delhi, Indien, aufrichtig für die finanzielle Unterstützung durch das Grant No. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 und dem Department of Science and Technology, Science and Engineering Research Board, New Delhi, Indien, für ihre finanzielle Unterstützung über den Zuschuss Nr. SR/SO/HS/0108/2012 an M.G.M. Darüber hinaus danken die Autoren dem Indian Council of Medical Research, Neu-Delhi, Indien, für die Vergabe eines Senior Research Fellowship durch Grant No. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 an H.P bzw. AS und Department of Science and Technology, Science and Engineering Research Board, New Delhi, Indien, Grant No. PDF/2017/000343 zu S.A.D.C.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Essigsäure  Sigma  695092
Aceton    Sigma  32201
Acrylamid    Sigma  Nr. A-3553
Ammoniumpersulfat    Sigma  Nr. A-3678
Gleichgewicht  SHIMADUZ  Z741079
Bis Acrylamid    Sigma  Nr. M7279
Rinderserumalbumin Fraktion V (BSA)  Sigma  Nr. A-8022
Bromphenol Blau    Sigma  Nr. B-8026
Zentrifugenröhrchen (50 mL)Tarsons500020
Konischer Kolben mit Kappe (150 mL)Tarsons431030
Zentrifuge zum Kühlen  Eppendorf  5355316200
Coomassie brillantblau    Sigma1.12553
Dunkelfeld-Mikroskop  ZEISS  GmbH37081
Zarte Tücher für die ArbeitKimtech Wissenschaft34155
Trockenes Bad  Eppendorf  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) medium, Difco  Difco  279410
Gel-Trays: Gel-Trays müssen mindestens 2 cm breiter sein und eine glatte und ebene Oberfläche mit Deckel haben.  Hoefer  Nicht zutreffend
Glasschnabel (150 mL)Tarsons421030
Glycin G8790    Sigma  Nr. G-8898
Immobilon Blotting FilterpapierMilliporeIBFP0813C
Immunoblot halbtrockener Aufbau  ATTA  AE-6675
Inkubator - Zum Inkubieren der Gelschalen für 18 Stunden bei 37 °C.  EYELA  SLI-700
Laminare Luftströmung  Nicht zutreffend  Nicht zutreffend
Luminol  Sigma  09253
Magnesiumchlorid M8266  Sigma  M8266
Magnetrührer  TARSONS  6040
Methanol    Sigma  17995-7
Mikropipettenspitzen (10 & Mikro; L– 10 ml)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Mikropipetten  Eppendorf  EP2231300010
Mikroröhrchen (1,5 mL Safe-Lock)EppendorfEP022363212
Mini-Drehung  Genaxy (Englisch)  GEN-MINI-6K
Multimode-LesegerätBMG LABTECH  F/N 413-3877
Fettfreie Trockenmilch, RindSigma-AldrichNr. M7409
P-Cumarsäure    Sigma  Nr. C9008
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung    SigmaP4417 
Kühlschrank  LG  GC-B217BLJ2
Rocker - Schaukel- oder Rotationsschüttler mit niedriger Drehzahl zum Färben des Gels.  TARSONS  4080
SDS-PAGE SETUP - Elektrophorese-Gerät  Hoefer, Inc.  SE300-10A-1.0  Hoefer Modell ' miniVE" die 10 cm x 8 cm großes Gel mit einer Dicke von 1 mm gießen kann.
Natriumchlorid      Sigma  5886
Natriumdodecylsulfat (SDS)    Sigma  Nr. L-4396
TEMED    Sigma  T-9281
Triton X-114    Sigma648468
Trizma Basis (TRIS) T6066    Sigma  Nr. T6066
Wirbel  TARSONS  3020

Referenzen

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
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Subzellul re FraktionierungTriton X 114 ExtraktionLeptospira ProteineAu enmembranproteineInnenmembranproteinePhasentrennungProteinlokalisierungSDS PAGEImmunoblottingMassenspektrometrie
Anreicherung subzellulärer Proteine in Leptospiren mit einem Triton X-114-basierten Fraktionierungsansatz
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