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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

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DOI:

10.3791/67301

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18. April 2025

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1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 3Department of Psychology, California State University at Fullerton, 4Department of Neuroscience, University of California, Riverside, 5Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 6Integrative Center for Learning and Memory, Brain Research Institute, David Geffen School of Medicine at UCLA

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zebrafischlarven sind ein vielversprechendes Modellsystem für Wirbeltiere, um die neuronalen Mechanismen des Verhaltens zu untersuchen. Ihre Transluzenz und relativ einfachen neuronalen Schaltkreise erleichtern den Einsatz optogenetischer Techniken bei zellulären Verhaltensanalysen. Fluoreszierende Indikatoren für die neuronale Aktivität in vivo , wie z. B. GCaMP6s, wurden häufig verwendet, um die neuronale Aktivität zu untersuchen, die mit einfachen Verhaltensweisen bei Zebrafischlarven verbunden ist. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zum Nachweis sensorisch induzierter Aktivität in halb zurückgehaltenen Zebrafischlarven unter Verwendung der transgenen Linie Tg(elav3:GCaMP6s) vor. Insbesondere verwenden wir den chemischen Wirkstoff Allylisothiocyanat, um eine robuste, reproduzierbare Fluoreszenzreaktion in einer Gehirnregion an der Grenze zwischen Hinterhirn und Rückenmark zu induzieren. Wir diskutieren die potenziellen Anwendungen von GCaMP6s für die optische Überwachung der neuronalen Aktivität während einer Reihe von Verhaltensparadigmen und die Grenzen dieser Technik. Unser Protokoll skizziert einen zugänglichen Ansatz zur Überwachung dynamischer, verhaltensbezogener in vivo neuronaler Aktivität im Gehirn von Zebrafischlarven.

Einleitung

Der Zebrafisch stellt ein Wirbeltiermodell dar, das sich für detaillierte zellulär-molekulare neurobiologische Untersuchungen steuern lässt. Zebrafischlarven besitzen 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) ~100.000 Neuronen, deutlich weniger als Säugetiergehirne. Darüber hinaus sind Zebrafische relativ durchscheinend, eine Eigenschaft, die optische Untersuchungen der neuronalen Struktur und Funktion erleichtert 1,2,3,4,5. Mehrere optogenetische Werkzeuge wurden für den Einsatz im Zebrafisch entwickelt, darunter High-Fidelity-Kalziumindikatoren6, Spannungssensoren 7,8 und aktivitätsabhängige Marker der neuronalen Aktivität 9,10,11,12,13. Diese Werkzeuge ergänzen andere Vorteile dieses Modells, wie z. B. die Zugänglichkeit für genetische Veränderungen 14,15,16,17 und die Bereitschaft, mit der Zebrafischlarven in Badelösungen enthaltene Chemikalien aufnehmen 18,19,20,21.

Für die optische Physiologie des Zebrafisches sind eine Vielzahl von Methoden nützlich, insbesondere die Zwei-Photonen-, Lichtblatt- und konfokale Mikroskopie. Jede dieser Technologien muss zwei miteinander verbundene Auflösungsprobleme in Einklang bringen: den optischen Zugang, einschließlich der Lichtstreuung durch umgebendes Gewebe, und die Probenahmegeschwindigkeit, insbesondere für die Erfassung der Kinetik des Aktionspotenzials im Sub-Millisekunden-Bereich22. Es gab dramatische Verbesserungen bei der In-vivo-Kalziumbildgebung mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie, aber diese Methode ist oft auf ein Sichtfeld von <1 mm2 beschränkt, und typischerweise kann nur eine einzige Tiefenebene erfasst werden, wodurch die Erfassung der Aktivität in großen Regionen neuronaler Schaltkreise eingeschränktwird 22. Für die Lichtblattmikroskopie löst das Potenzial, die Aktivität fast aller Neuronen im Gehirn aufzuzeichnen, die Einschränkung des Sichtfelds der Zwei-Photonen-Mikroskopie, aber die derzeitigen Kamerageschwindigkeiten begrenzen die Erfassung physikalisch auf etwa drei Gehirnvolumina pro Sekunde bei 40 Ebenen pro Hirnvolumen bei der Zebrafischlarve 1,23. Die konfokale Mikroskopie ist der Zwei-Photonen- und Lichtblattmikroskopie sowohl in der Tiefenauflösung als auch in der Einfanggeschwindigkeit unterlegen. Die konfokale Mikroskopie hat die Vorteile eines breiten Zugangs zu Laboratorien weltweit und der Möglichkeit, Rekonstruktionen der neuronalen Aktivität im gesamten Gehirn mit Hilfe von Reportern der neuronalen Aktivität wie cFos und p-ERK9 zu erzielen. Darüber hinaus kann das konfokale Mikroskop, wenn kleine Hirnregionen angesprochen werden, eine angemessene zeitliche Auflösung der neuronalen Aktivität liefern.

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode, die konfokale Mikroskopie verwendet, um die neuronale Aktivität in transgenen Zebrafischen aufzuzeichnen, die GCaMP6s panneuronal exprimieren. Mehrere ähnliche Protokolle mit Zebrafischlarven wurden entwickelt, um die Funktion der Nervenbahnen 24,25,26,27,28,29 zu verstehen. Schlüsselmerkmale mehrerer dieser Protokolle, wie z. B. Zeitraffer-Bildgebung, fluoreszierende Indikatoren für die Kalziumdynamik und Live-Bildgebung, wurden kombiniert, um die neuronale Aktivität in einer kleinen Population von Neuronen im zentralen Nervensystem des Zebrafisches als Reaktion auf Allylisothiocyanat (AITC), einen aversiven chemischen Reizstoff, zu messen 11,26,27,29,30,31. AITC löst eine hirnweite Reaktion aus, die sich auf den Hinterhirnbereichkonzentriert 11. Eine Gruppe von Neuronen nur kaudal zum Hinterhirn spielt eine Rolle bei der Fortbewegung und einer verlängerten Reaktion auf AITC. Diese Reaktion überdauert die Entfernung des aversiven Reizes30. Durch die Einschränkung des Sichtfeldes ist es uns gelungen, die neuronale Aktivität in diesem neuronalen Cluster zu detektieren, die sich in der Fluoreszenzänderung von Neuronen widerspiegelt, die GCaMP6s exprimieren. Wir stellen Techniken, Richtlinien und Best Practices zur Verfügung, um mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie eine ausreichende raumzeitliche Auflösung zu erreichen. Darüber hinaus gehen wir auf die Grenzen unserer optischen Aufzeichnungsmethode ein. Trotz dieser Einschränkungen soll die Methode die Untersuchung einer Vielzahl von neurobiologischen Phänomenen ermöglichen, einschließlich des Gedächtnisses und der sensomotorischen Verarbeitung.

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Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care Use Committee an der California State University, Fullerton, genehmigt (Protokoll # 2023-1310).

1. Inszenierung von Zebrafischlarven in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt

  1. Zucht adulter transgener Tiere mit panneuronal exprimierendem Tg(elav3:GCaMP6s)6 mit zwei Männchen auf zwei Weibchen gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege. Die erwachsenen Tiere werden in spezielle Brutkammern gebracht, so dass die freigesetzten Eier in einer unteren Kammer mit doppeltem Boden aufgefangen werden, die für erwachsene Tiere nicht zugänglich ist. Beim ersten Licht oder wenn ein Trennteiler entfernt wird, geben die Weibchen Eier frei, und die Männchen befruchten die Eier, die sie im doppelten Boden gefangen haben.
  2. Entnehmen Sie adulte Eizellen und entnehmen Sie befruchtete Eizellen mit einem Eisieb und legen Sie sie in das Medium des Embryos (E3) (5 mM NaCl, 0,33 mM MgSO4, 0,33 mM CaCl2, 0,17 mM KCl, 1 mM HEPES, 0,00001 % Methylenblau, pH 7,0)30 mit 14 h hell/10 h dunkel bei 28,5 °C in einem Inkubator
    HINWEIS: Das verwendete E3-Rezept enthält eine niedrige Konzentration an Methylenblau, das die Fluoreszenz nicht beeinflusst oder zu einem signifikanten Autofluoreszenzsignal führt. Aufgrund der natürlichen Transluzenz, die die transgene Linie GCaMP6s bietet, ist die Verwendung von 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU) in den im Protokoll angegebenen Entwicklungsaltern nicht erforderlich.
  3. Tiere 2-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) mit 3 % Agarose bei niedrigem Schmelzpunkt, gelöst in E3-Medium, einbetten. Die Hitze agarose auf eine Temperatur, bei der der Zebrafisch manipuliert werden kann, ohne den Organismus zu schädigen. Bevor die Agarose bei niedrigem Schmelzpunkt abkühlt und erstarrt (<1 min), positionieren Sie die Larven mit der Rückenseite nach oben in einer Petrischale mit Glasboden, so dass die zu untersuchende Hirnregion so nah wie möglich am Objektiv ist, wie in Abbildung 1 gezeigt. Je nach Versuch sind in der Regel 8 bis 10 Zebrafische pro Versuchsgruppe ausreichend.
    HINWEIS: Die Tiere wurden in diesem Protokoll nicht betäubt.
  4. Nachdem die Agarose mit der Larve an Ort und Stelle ist (ca. 2 bis 3 Minuten), fügen Sie 5 ml E3-Lösung hinzu. Schneiden Sie dann die Agarose mit einem Skalpell ein, wie es das Versuchsprotokoll vorschreibt.
    HINWEIS: Verschiedene Teile des Agars sollten weggeschnitten werden, je nachdem, welche Teile des Zebrafisches von der Fessel befreit werden müssen und/oder eine andere Art von Reiz erhalten müssen.
  5. Stellen Sie die Petrischale mit dem Zebrafisch auf den konfokalen Mikroskoptisch und lassen Sie den Fisch 20 Minuten lang akklimatisieren.

2. Aufbau und Bildgebung unter konfokaler Mikroskopie mit Stimulusapplikation

  1. Nach der Eingewöhnungsphase zentrieren Sie den Fisch unter dem 40x (NA 1.0) Wasserimmersionsobjektiv bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Hellfeldes mit einer Lichtquelle (~475 nm).
  2. Die Einstellungen für die Aufnahme des konfokalen Mikroskops hängen von den Qualitäten und dem Expressionsniveau des fluoreszierenden Moleküls, der Tiefe und den optischen Eigenschaften des Gewebes, der Größe des Sichtfelds und der Aufnahmegeschwindigkeit ab. Bestimmen Sie mit der Reichweitenanzeige die geeigneten Einstellungen, um eine optimale Erfassung des emittierten Lichts entsprechend den experimentellen Anforderungen zu gewährleisten.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung und die Master-Verstärkung richtig eingestellt werden, um Fluoreszenzlicht im optimalen Bereich einzufangen und so unnötige Verluste des GCaMP6s-abhängigen Fluoreszenzsignals zu vermeiden. Verwenden Sie die unten aufgeführte Liste der wichtigsten konfokalen Einstellungen und Faktoren, um die geeigneten Einstellungen zu bestimmen.
    1. Lochblendengröße: Bestimmen Sie diese durch das verwendete Objektiv und stellen Sie es so ein, dass es eine einzelne Fokusebene akzeptiert, während andere Fokusebenen eingeschränkt werden. Für dieses Protokoll wird eine Lochblende von 32 μm verwendet.
    2. Laserleistung und Wellenlänge: Passen Sie die Laserleistung basierend auf dem Expressionsniveau des fluoreszierenden Moleküls sowie der Tiefe und den optischen Eigenschaften des Gewebes an. Verwenden Sie die Entfernungsanzeige, um sicherzustellen, dass der Laser die Reichweite des Fotodetektors nicht überschreitet. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf die Wellenlänge des Lichts ein, das das fluoreszierende Molekül optimal anregt. Da die Fische für das GCaMP6s-Transgen heterozygot waren und die Expressionsniveaus niedrig waren, verwenden Sie für dieses Experiment eine Laserleistung von 5 % bei einer Wellenlänge von 488 nm und einer Master-Verstärkung von 650. Bei starker Transgenexpression liegt die Laserleistung zwischen 1,5 % und 3 %, was in der Regel ausreichend ist.
      HINWEIS: Wenn die Laserleistung zu niedrig eingestellt ist, gehen Informationen (von der Photomultiplier-Röhre erkanntes Licht) verloren. Wenn die Laserleistung zu hoch eingestellt ist, kann das emittierte Licht die Reichweite des Detektors überschreiten oder die Probe beschädigen (Photobleiche).
    3. Master-Gain: Der Master-Gain bestimmt die Empfindlichkeit des Fotodetektors. Verwenden Sie die Bereichsanzeige, um sicherzustellen, dass die Master-Verstärkung nicht zu hoch eingestellt ist und dadurch die Reichweite des Fotodetektors überschritten wird. Für dieses Experiment wird die Master-Verstärkung auf 650 eingestellt.
    4. Sichtfeld: Stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld groß genug ist, um das interessierende Gewebe zu erfassen. Dies ist im Allgemeinen eine große Einschränkung für konfokale Mikroskope, da die Größe des Sichtfelds die Aufnahmegeschwindigkeit einschränkt, wie in Abbildung 2 gezeigt. Für die Experimente mit AITC stellen Sie das Sichtfeld auf 79,86 μm2 ein.
    5. Erfassungsgeschwindigkeit: Wenn die Erfassungsgeschwindigkeit erhöht wird, wird die vom Fotodetektor erfasste Lichtmenge reduziert. Wenn weniger Licht eingefangen wird, verschlechtert sich die Bildqualität. Stellen Sie sicher, dass die Aufnahmegeschwindigkeit die Qualität des Bildes und die Geschwindigkeit, die für die Erfassung des interessierenden physiologischen Ereignisses erforderlich ist, in Einklang bringt. Hier ist die Aufnahmegeschwindigkeit auf 1,20 f/s eingestellt.
  4. Zentrieren Sie das Gesichtsfeld auf einem neuronalen Cluster kaudal zur Commissura infima Halleri im rostralen Teil des Rückenmarks30. Dieser Cluster ist mit ~2,5 dpf recht klein, wird aber später in der Entwicklung viel größer (7 dpf).
    HINWEIS: Wenn die Agarose-Montage in Schritt 1 suboptimal ist, d. h. wenn das Tier schräg oder zu tief in der Agarose positioniert ist, wird die Bildqualität beeinträchtigt. In Abbildung 3 sind ein Bild des Zebrafisch-Rückenmarks bei einem gut platzierten Tier und ein kontrastierendes Bild des Rückenmarks bei einem suboptimal platzierten Zebrafisch dargestellt.
  5. Führen Sie einen Zeitreihenscan mit einem Sichtfeld von 79,86 μm2 bei 1,20 Bildern pro s (fps) und einer räumlichen Auflösung von 0,119 μm2 pro Pixel durch. Passen Sie die Größe des Sichtfelds und die Geschwindigkeit der Bildaufnahme je nach gewünschter Anwendung an.
  6. 2 Minuten nach Beginn der Bildgebung geben Sie mit einer Pipette 41,67 μl einer Stammlösung von AITC (10 μM Endkonzentration) oder E3-Lösung in die Schale. Setzen Sie die Aufzeichnung für ~30 s fort, um Änderungen in der GCaMP6s-Aktivität im interessierenden Bereich mit Zeitrafferaufnahmen zu beobachten. Nachdem die Aufzeichnung abgeschlossen ist, befreien Sie das Tier von der Agarose und euthanasieren Sie es gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege.
    HINWEIS: Bei der Aufzeichnung der GCaMP6-Aktivität kann das konfokale Licht selbst ein Stimulus sein. Dies muss bei der Analyse der bildgebenden Ergebnisse berücksichtigt werden. Die Aufnahmezeit ist eine Funktion der Anzahl der Bilder und der Aufnahmerate jedes Bildes, die nach Bedarf für die gewünschte Zeit angepasst werden kann.

3. Analyse des GCaMP-Signals mit FIJI

  1. Wenn die Ausgabe nach der Aufzeichnung nicht im .tif Dateiformat für die nachgelagerte FIJI-Analyse vorliegt, exportieren Sie die Bilddateien als .tif Dateien aus der Mikroskop-Software-Suite.
  2. Laden Sie FIJI für die Analyse von neuronalen Spuren herunter. Öffnen Sie FIJI, importieren Sie die .czi-Dateien in das Programm und verwenden Sie bei Aufforderung die Standardeinstellungen im BioFormats-Plugin.
  3. Markieren Sie einen interessanten Bereich/ein Neuron mit den Kreis- oder Freihandwerkzeugen, indem Sie auf die entsprechenden Symbole klicken. (Wenn Sie mit der Maus über die Symbole fahren, blinkt der Name des Werkzeugs im Programm auf.)
    HINWEIS: Da der Interessenbereich unterschiedlich groß ist, sind feste Bereiche/Kreise nicht möglich. Software, die die Registrierung von Fluoreszenzänderungen über die Zeit als Voxel ermöglicht, wie das Thunder-Paket32, könnte die Detektion einzelner Neuronen ermöglichen; Für die ~20 Neuronen im aktuellen Experiment wäre die Detektion der Membrangrenzen durch einen blinden Beobachter jedoch wahrscheinlich einem automatisierten Detektionssystem überlegen.
  4. Nachdem Sie einen ROI ausgewählt haben, klicken Sie in der Symbolleiste "FIJI " auf "Analyze > Tools > ROI Manager". Klicken Sie danach auf Hinzufügen [t], und der ausgewählte ROI wird dem ROI-Manager-Fenster hinzugefügt.
  5. Klicken Sie im ROI-Manager auf Mehr > Multi-Measure. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei, und klicken Sie auf OK. Fidschi wird Rohdaten produzieren, die als CSV-Datei mit Python oder als Rohdaten in einer Tabellenkalkulation bearbeitet werden können.
  6. Um die Rohdaten zu normalisieren und als neuronale Spur für einen bestimmten interessierenden Bereich darzustellen, mitteln Sie die letzten ~30 s-Werte des 2-Minuten-Fensters vor dem Stimulus und normalisieren Sie alle Post-Stimulus-Werte auf diesen durchschnittlichen Ausgangswert:
    Normalisierte Fluoreszenzintensität = (momentane Fluoreszenz einer gegebenen Region von Interesse nach dem Stimulus)/(durchschnittliche Fluoreszenz von ~30 s eines 2-minütigen Intervalls vor dem Stimulus)
  7. Stellen Sie die Daten als neuronale Kurven dar, wie in Abbildung 4 dargestellt.
    HINWEIS: Bei einigen Arten von Mikroskopie, wie z. B. der Lichtblattmikroskopie, bei denen ein Volumen des Gehirns aufgezeichnet wird, werden Bewegungsartefakte durch Nachbearbeitung der räumlichen Registrierung auf ein Referenzvolumendes Gehirns 1,11 adressiert. Da wir jedoch nur von einer einzigen Ebene aus aufnehmen, können keine Anpassungen für Bewegungsartefakte vorgenommen werden. Daher wurden für die hier gezeigten Ergebnisse keine Frames entfernt. Sollten jedoch Bewegungsartefakte die Ergebnisse signifikant verändern, könnten automatisierte Systeme Frames mit den Bewegungsartefakten1, 11 identifizieren und korrigieren oder ein verblindeter Beobachter könnte solche Frames entfernen.

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Ergebnisse

Die Verabreichung von Allylisothiocyanat verursacht ein Kalzium-assoziiertes neuronales Signal in Zebrafischlarven
Die Verabreichung von AITC (Schritt 2.6) führt zu einem weit verbreiteten Anstieg der GCaMP6s-assoziierten neuronalen Aktivität im Gehirn der Zebrafischlarven11,30. Wir beobachteten ein erhöhtes Fluoreszenzsignal in einer kleinen Region des Gehirns nach der Anwendung von AITC, wie in Abbildung 4 gezei...

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Diskussion

Wir haben gezeigt, dass die neuronale Aktivität im Gehirn von Zebrafischlarven mit Hilfe von GCaMP6s zusammen mit konfokaler Mikroskopie aufgezeichnet werden kann; Die geringeren Aufnahmegeschwindigkeiten, die aufgrund der langsameren Kinetik von GCaMPs erforderlich sind, können durch eine Reduzierung des beobachteten Gehirnbereichs kompensiert werden6. Reporter mit schnellerer zeitlicher Dynamik (z. B. GCaMP6f) sind verfügbar, aber die überlegene zeitliche Auflös...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (SC2GM1304854) an die ACR und einen Zuschuss der National Science Foundation (2050850) an die DLG unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Niedriger Schmelzpunkt AgaroseInvitrogen16520-100Verdünnt auf 3%
Allylisothiocyanat (AITC)Sigma Aldrich377430Chemisches Stimulans
E3N/AN/AWasser-Medium für Zebrafischlarven
GlasbodenschalenThermo Fisher Scientific12-567-400Wird verwendet, um Zebrafische während bildgebender Experimente
zu haltenMikropipette (10-100 μl)Cole-Parmer21600-14Apparatur zur Erstellung von AITC-Verdünnungen
ObjektträgerFisherbrand12-550-A3Zur Untersuchung des Phänotyps
HochglanzpinzetteDUMONT11251-23Zur Orientierung von Zebrafischen in Agarose
myTEMP Mini Digital IncubatorsBenchmarkH2200-HCHaltebereich für Zebrafische; eingestellt auf 28,5°; C
NitrilhandschuheMedPRIDEMPR-50504Basic PSA
PetrischalenVWR89107-632Behälter für Zebrafische
Posi-Click-RöhrchenDENVILLEC-2171Verwendet für die AITC-Verdünnung
Samco Polyurethan-TransferpipettenThermo Fisher Scientific225Gerät zur Auswahl von Tieren/Verabreichen von verdünntem Bolus von AITC
Stemi SV11 Apo MikroskopZeiss1.25496E+11Zur Inszenierung von Zebrafischen
Transgene Larven Zebrafische (2 bis 7 DPF)N/AN/ATierexperimentiere; Tg(elav3:GCaMP6s) Stamm
Zeiss Konfokalmikroskop (Modell LSM9)Zeiss3523004097Bildgebung von Fischen

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