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Methodenartikel

Planarien als Tiermodell für experimentelle akute Anfälle

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DOI:

10.3791/67307

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14. Februar 2025

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1Department of Biomedical and Translational Sciences, Macon and Joan Brock Virginia Health Sciences Eastern Virginia Medical School, Old Dominion University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Krampfanfälle wirken sich negativ auf verschiedene Funktionen und die Lebensqualität aus. Planaria-Würmer wurden unterschiedlichen Konzentrationen von Chemokonvulsiva ausgesetzt, um ihre Anfallsphänotypen und ihre störende Motilität zu bewerten. Diese Studie schlägt vor, Planarienwürmer als Modell für akute Anfälle beim Menschen zu verwenden und ist von Bedeutung für die Entwicklung von Medikamenten für Epilepsie.

Zusammenfassung

Epilepsie gehört zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen, die durch wiederkehrende spontane Anfälle gekennzeichnet sind. Krampfanfälle stellen eine klinische Manifestation einer unkontrollierten, übermäßig synchronisierten neuronalen Zellaktivität dar. Das Ausmaß der Hirnschädigung durch Anfälle hängt von deren Dauer und Intensität ab. Leider gibt es kein wirksames Mittel gegen Epilepsie. Ziel dieser Untersuchung ist es, zu beurteilen, ob der Planarienwurm Dugesia dorotocephala als Modell dienen könnte, um bei der Identifizierung und Entwicklung von Therapien für Epilepsie zu helfen, die auf akute Anfälle abzielen können. Derzeit werden verschiedene Modelle, wie z.B. marine Modelle, zur Bewertung von Antiepileptika (ASM) verwendet. Sie sind jedoch sehr teuer und es gibt ethische Bedenken. Alternativ bieten wirbellose Modelle eine kostengünstige Forschungsmöglichkeit im Wirkstoffforschungsprozess für ASM. Planarien gehören zur Familie der Plattwürmer und bewohnen marine Süßwasser- und Landumgebungen. Dugesia dorotocephala ist die dominierende Art der aquatischen Planarien in Nordamerika. D. dorotocephala stellt sich aufgrund seiner Kosteneffizienz, wirbeltierähnlichen Neuronen und quantifizierbaren Verhaltensweisen im Gegensatz zu anderen Wirbellosen oder größeren Tieren als brauchbares Wirbellosenmodell für Epilepsiestudien dar. Sie wurden in verschiedenen pharmakologischen und umwelttoxikologischen Studien in Bezug auf Alter, Gedächtnis und Regeneration eingesetzt. In dieser Studie wurden Planarien unterschiedlichen Konzentrationen von Pilocarpin, einem gängigen Chemokonvulsivum, ausgesetzt, um ihr Verhalten bei Exposition zu untersuchen. Im Anschluss an die Beobachtung wurden die Planarien euthanasiert und entweder in Formaldehyd oder Golgi-Lösung zur neurohistologischen Beurteilung konserviert. Bei Planarien wurden sechs verschiedene Verhaltensphänotypen beobachtet: dorsale Oszillationen, Kopfschwingungen, dorsale Expansion des Schwanzes, C-Form, Kopfschlag und Schwanzschnippen. Die dorsalen Oszillationsfrequenzen waren in den Versuchsgruppen im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht und zeigten eine Dosisabhängigkeit. Zusätzlich störte Pilocarpin die Beweglichkeit der Planarien. Pilocarpin-induzierte Anfälle bei Planarien können als Modell für die Bewertung akuter Anfälle und der Medikation gegen Krampfanfälle dienen, was für die Entwicklung therapeutischer Interventionen für menschliche Patienten, die an Epilepsie leiden, unerlässlich ist.

Einleitung

Epilepsie, die durch zwei oder mehr Anfälle innerhalb von 24 Stunden ohne erkennbare Ursache gekennzeichnet ist, betrifft weltweit ~50 Millionen Menschen1. Von ihnen sollen 10-15 Millionen Menschen an medikamentenresistenter Epilepsieleiden 2. Daher ist die Untersuchung von Epilepsiemedikamenten von entscheidender Bedeutung. Die Erkrankung beinhaltet kurze Episoden von entweder teilweisen oder generalisierten unwillkürlichen Bewegungen, die von leerem Starren bis hin zu Versteifung und Zittern des Körpers reichen, und ist mit einem Anstieg der elektrischen Aktivität im Gehirn verbunden3.

Historisch gesehen hat sich die Epilepsieforschung auf Nagetiere und andere Säugetiere gestützt, da diese evolutionär dem Menschen ähneln. Diese Methoden können jedoch zeitaufwändig und teuer sein, so dass ein alternativer Ansatz erforderlich ist 4,5. Nicht-Säugetiere wie Fruchtfliegen, Blutegel, Kaulquappen, Zebrafische und Spulwürmer wurden in Studien verwendet und haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Planarien ein vergleichendes genomisches Studienmodell zwischen dem Genom von Wirbellosen und dem menschlichen Genom liefern können, neben der Möglichkeit, prokonvulsiva, Anti-Krampfanfall-Medikamente (ASM) und Verhaltensmuster zu testen6. Planarien (Phylum Platyhelminthes), bekannt als Plattwürmer und Mitglieder der Turbellaria-Klasse, sind vor allem für ihre regenerativen Fähigkeiten bekannt; Diese Untersuchung konzentriert sich jedoch auf ihre Reaktion auf anfallsauslösende Substanzen.

Planarien teilen grundlegende neurologische Mechanismen mit dem Menschen, wie z. B. die Reaktionsfähigkeit auf Serotonin und Dopamin, zeigen eine 95%ige Ähnlichkeit mit den Genen des Nervensystems im Gehirn von Säugetieren und besitzen eine erkennbare Gehirnstruktur7. Darüber hinaus zeigen sie unter Laborbedingungen beobachtbare Bewegungen und sind im Vergleich zu Nagetieren oder anderen Säugetieren kostengünstig, zeiteffizient und ethisch vertretbar. Diese beobachtbaren Verhaltensweisen, wie schraubenartige, C-ähnliche und walnussförmige Bewegungen, sind seit Jahrzehnten ausführlich dokumentiert und werden mit Substanzen wie Kokain, Nikotin, Dopamin und Pilocarpin in Verbindung gebracht 7,8,9,10,11,12,13,14. Daher erweisen sich Planarien als brauchbares Modell für die Erforschung von Epilepsiemedikamenten am Menschen.

Ziel dieser Methode ist es, Neuronen von Planarien, die mit Hilfe einer Golgi-Färbung mit Pilocarpin exponiert wurden, zu charakterisieren. Die Golgi-Färbung wird verwendet, um Neuronen unter Lichtmikroskopie sichtbar zu machen, und wurde verwendet, um zu untersuchen, ob eine Veränderung der Morphologie mit Anfällen zusammenhängt 15,16,17. In der aktuellen Literatur gibt es keine Hinweise darauf, dass Golgi-Färbungen an Planariengehirnen durchgeführt wurden. Obwohl frühere Studien pharmakologische Wirkungen durch die Beobachtung von Verhaltensphänotypen dokumentiert haben, ist dieses Manuskript das erste, das die Neuronen von Planarien, die Pilocarpin ausgesetzt waren, mit Hilfe der Golgi-Färbung charakterisiert11,18. Diese Technik erweist sich als wertvoll für die Visualisierung und das Verständnis der morphologischen Veränderungen, die mit Anfällen verbunden sind. In dieser Studie wurde eine signifikante Zunahme der Häufigkeit des oszillierenden dorsalen Oszillationsverhaltens bei Planarienwürmern festgestellt, wenn die Konzentration von Pilocarpin erhöht wurde.

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Protokoll

HINWEIS: Der gesamte Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 beschrieben.

1. Verhaltens-Phänotyp-Assay

  1. Bereiten Sie Konzentrationen von 1 mM und 2 mM Pilocarpin vor, die in Quellwasser gelöst sind, und kontrollieren Sie es nur mit Quellwasser.
  2. Pipettieren Sie 3 ml jeder Lösung in eine 4 x 3-Well-Platte, wobei jede Reihe eine andere Konzentration von Pilocarpin darstellt.
  3. Legen Sie eine im Labor gezüchtete Dugesia dorotocephala , die etwa 2 Wochen alt ist, mit einer Transferpipette in jede der 12 Vertiefungen, wobei die Spitze abgeschnitten ist.
    HINWEIS: Schneiden Sie die Spitze so ab, dass das Ende groß genug ist, um die Planarien aufzunehmen, ohne sie zu beschädigen.
  4. Zeichnen Sie das Verhalten der Planarien 1 Stunde lang mit einer Kamera auf, die das Verhalten gut aufzeichnet und für das menschliche Auge beobachtbar ist, wenn sie bei normalen Lichtverhältnissen in Innenräumen über der 4 x 3-Well-Platte positioniert ist.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.4 mit Konzentrationen von 3 mM, 4 mM und 6 mM Pilocarpin, gelöst in Quellwasser.

2. Motilitätsanalyse

HINWEIS: Das Verhalten der Planarien wurde in Vertiefungen mit einem Durchmesser von 2,5 cm aufgezeichnet. Die 1 h langen Videoaufnahmen wurden in 30 min lange Teile aufgeteilt und mit kommerzieller Software beschnitten, um Planarien einzeln zu analysieren.

  1. Beginnen Sie ein neues Experiment mit automatisierter Verhaltensanalysesoftware. Öffnen Sie das erweiterte automatisierte Verhaltensverfolgungssystem. Klicken Sie unter Neues Experiment auf Neu . Benennen Sie das Experiment.
  2. Richten Sie die experimentellen Einstellungen wie unten beschrieben ein.
    1. Klicken Sie in der Eingabeaufforderung auf Experimenteinstellungen . Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen die Standardeinstellungen sind: Videoquelle (aus Videodatei), Anzahl der Arenen (1), Verfolgte Merkmale (Mittelpunkterkennung), Körperpunkt-Erkennungstechnik (konturbasiert), Analyseoptionen (keine), Einheiten (cm, s, deg).
  3. Richten Sie die Arena-Einstellungen wie unten beschrieben ein.
    1. Klicken Sie auf Arena-Einstellungen auf der Registerkarte Arena-Einstellungen oben links im Setup-Fenster. Wenn Sie aufgefordert werden, ein Video hochzuladen, wählen Sie aufgezeichnetes Filmmaterial von Planarien aus dem gespeicherten Dateispeicherort aus. Sobald das Video ausgewählt ist, klicken Sie auf Greifen.
    2. Befolgen Sie die Anweisungen oben rechts auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf 1. Zeichnen Sie den Maßstab zum Kalibrieren. Ziehen Sie auf dem Videobild der Vertiefung eine Maßstabslinie von Kante zu Kante der Probenvertiefung. Geben Sie die reale Entfernung des Vertiefungs (2,5 cm) ein.
    3. Klicken Sie auf 2. Wählen Sie "Arena formen und zeichnen" aus. Stellen Sie sicher, dass Arena 1 im rechten Bereich ausgewählt ist. Bewegen Sie den Mauszeiger in die obere Mitte des Bildschirms und klicken Sie auf das Kreissymbol.
    4. Erstellen Sie einen Kreis im hochgeladenen Videobild, indem Sie ihn von einem Rand der Arena zum anderen ziehen. Stellen Sie sicher, dass sich die Arena in der orangefarbenen Zone befindet. Passe die Form so an, dass sie zur Arena passt. Stellen Sie sicher, dass sich die Beschriftung "Arena 1" innerhalb der Grenzen der Arena befindet.
    5. Ändern Sie unten im rechten Bereich Form, Größe und Position (Breite:2,75, Höhe:2,75, X:0, Y:0) auf die gewünschten Maße.
    6. Klicken Sie auf 3. Wählen Sie Form- und Zeichnungszonen (optional) aus. Die Zonengruppe 1 im rechten Bereich wird nun ausgewählt. Bewegen Sie den Mauszeiger in die obere Mitte des Bildschirms und wählen Sie das Kreissymbol aus. Erstellen Sie einen kleineren Kreis im Arena-Bild, indem Sie ihn nach innen ziehen.
    7. Ändern Sie im unteren rechten Bereich Form, Größe und Position in die gewünschten Maße (Breite:1,75, Höhe:1,75, X:0, Y:0).
    8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zonenbeschriftung hinzufügen in derselben Menüleiste wie der Kreis. Klicken Sie in die Mitte des kleineren Kreises. Klicken Sie im rechten Bereich mit der rechten Maustaste auf das Tag Zone 1 , um die Zonenmitte umzubenennen.
    9. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Zonenbeschriftung hinzufügen . Klicke auf den Rand der Arena, außerhalb der mittleren Zone. Klicken Sie im rechten Bereich mit der rechten Maustaste auf Zone 2 , um die Zone in Perimeter umzubenennen.
    10. Klicken Sie auf 4. Validieren Sie die Einrichtung , um sicherzustellen, dass die Arenaeinstellungen gültig sind.
  4. Richten Sie die Einstellungen für die Teststeuerung wie unten beschrieben ein.
    1. Klicken Sie auf Einstellungen für die Teststeuerung auf der Registerkarte Einstellungen für die Teststeuerung oben links im Setup-Bereich. Sechs Komponentenfelder werden angezeigt. Klicken Sie im vierten Feld mit der Bezeichnung "Bedingung" auf "Einstellungen ", das Zeit (1) und "Unendliche Zeit" (Bedingung nie erfüllt) enthält.
    2. Klicken Sie auf die Blase neben "Nach" und geben Sie die Dauer (30 Minuten) in das rechte Textfeld ein. Es gibt auch ein Dropdown-Menü rechts neben dem Textfeld Zeit, in dem Sie zwischen h, min und s auswählen können.
      HINWEIS: Die Erkennungseinstellungen für aufgenommenes Filmmaterial hängen von der Qualität des Filmmaterials ab. Die folgenden Methoden können manipuliert werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen, die spezifisch für einzelnes Filmmaterial sind.
  5. Richten Sie die Erkennungseinstellungen wie unten beschrieben ein.
    1. Klicken Sie auf Erkennungseinstellungen auf der Registerkarte Erkennungseinstellungen oben links im Setup-Bereich. Klicken Sie auf die Schaltfläche Video auswählen im oberen rechten Bereich. Laden Sie das gewünschte Video hoch, um die Erkennungseinstellungen zu senken.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Erweitert im selben rechten Bereich. Stellen Sie nun auf der Registerkarte Methode sicher, dass sie auf Grauskalierung eingestellt ist. Ändern Sie den Bereich (0 - 100).
    3. Vergewissern Sie sich, dass auf der Registerkarte "Glättung" des rechten Bedienfelds die Option "Keine", die Korrektur ausgelassener Frames deaktiviert und die Reduzierung des Rauschens "Spur" deaktiviert ist.
    4. Passen Sie auf der Registerkarte Motivkontur des rechten Fensterfelds die Sequenzeinstellung an und ändern Sie Erosion, Dilatation und Erosion auf 1, 1 bzw. 0.
    5. Ändern Sie auf der Registerkarte Betreffgröße die Optionen Minimum (0) und Maximum (125000). Klicken Sie unten rechts auf Speichern .
  6. Richten Sie eine Sequenz von Videoversuchen für die Beobachtung ein, wie unten beschrieben.
    1. Klicken Sie oben links im Setup-Bereich auf Testliste . Laden Sie Videomaterial von Proben in der gewünschten Reihenfolge hoch, indem Sie auf die Ellipsen in der Spalte Systemvideodatei klicken. Um weitere Testversionen hinzuzufügen, klicken Sie oben links im Bereich "Testliste" auf "Testversionen hinzufügen ".
  7. Richten Sie die Akquise-Einstellungen ein.
    1. Klicken Sie oben links auf der Registerkarte Akquisition auf Akquisition . Klicken Sie im rechten Bereich unter Akquiseeinstellungen auf Alle geplanten Testversionen verfolgen.
    2. Um mit der Erfassung zu beginnen, klicken Sie auf die rote Schaltfläche in der unteren Mitte des Bildschirms neben Bereit zum Start. Die Videoerfassung beginnt nun und dauert eine gewisse Zeit, abhängig von der Menge und Länge der hochgeladenen Videotests.
  8. Richten Sie die Analyseeinstellungen wie unten beschrieben ein.
    1. Klicken Sie auf Analyseprofil im linken Bereich der Registerkarte Analyse. Klicken Sie auf die standardmäßig ausgewählten abhängigen Variablen "Geschwindigkeit " und " Bewegte Entfernung" und löschen Sie sie.
    2. Klicken Sie im Bereich "Abhängige Variablen" auf der Registerkarte "Standort" auf "In Zone". Klicken Sie auf die Kontrollkästchen Mittel- und Umfangszone , sodass sie markiert sind.
    3. Klicken Sie auf die Registerkarte Teststatistik im Feld In Zone. Deaktivieren Sie die Option Latenz auf den ersten Platz. Klicken Sie auf Hinzufügen.
    4. Klicken Sie auf der Registerkarte Körper auf die Schaltfläche Drehung. Klicken Sie auf Im Uhrzeigersinn und belassen Sie den Schwellenwert (50,00 Grad) und den verschobenen Mindestabstand (2,00 cm) auf der Standardeinstellung. Klicken Sie auf Hinzufügen.
    5. Klicken Sie erneut auf die Schaltfläche Drehen und dann auf Gegen den Uhrzeigersinn. Klicken Sie auf Hinzufügen.
  9. Analysieren Sie Tracks wie unten beschrieben.
    1. Klicken Sie auf der Registerkarte Ergebnisse auf Visualisierung nachverfolgen. Deaktivieren Sie im rechten Bereich unter Filter die Option Letzte. Die Wiedergabesteuerungsleiste im unteren mittleren Bereich des Bildschirms zeigt die Visualisierung der Spur von Proben zu bestimmten Beobachtungszeiten an.
  10. Analysieren und exportieren Sie die Ergebnisse. Die Ergebnisse finden Sie in den restlichen Registerkarten unten links. Um Daten zu exportieren, klicken Sie im linken Bereich unter Exportieren auf Rohdaten oder Statistiken .

3. Euthanasie

  1. Bereiten Sie eine 22 mM Lösung von Eugenol in Quellwasser vor. Planarien mit der geschnittenen Transferpipette mit 9 ml 22 mM Eugenollösung in Petrischalen geben, wobei jede Konzentration getrennt gehalten wird. 3 Minuten lang einschläfern oder bis alle Bewegungen aufgehört haben.
  2. Legen Sie die Planarien in eine frische Petrischale, die mit 9 ml Quellwasser gefüllt ist, um sie 1x-2x zu spülen, und geben Sie sie entweder in die unten beschriebene Golgi-Lösung (Golgi-Färbung) oder 4%iges Paraformaldehyd (Immunfluoreszenz-Färbung).

4. Histologische Analyse

  1. Golgi-Färbung
    1. Nachdem die Planarien eingeschläfert wurden, geben Sie sie in ein Becherglas oder eine Petrischale, die mit einer 1:1-Mischung aus Lösungen A und B aus dem Golgi Stain Kit gefüllt ist. Ersetzen Sie die Lösungen A und B am nächsten Tag, indem Sie die Planarien in ein neues Becherglas geben, das mit einer Mischung aus Lösungen A und B gefüllt ist.
    2. Lassen Sie die Planarien 1 Woche in den Lösungen A und B ruhen.
    3. Entfernen Sie die Planarien aus den Lösungen A und B und geben Sie sie in Lösung C in ein anderes Becherglas. Ersetzen Sie Lösung C am nächsten Tag. Lassen Sie die Planarien mindestens 72 Stunden und bis zu 1 Woche in Lösung C ruhen.
    4. Entfernen Sie die Planarien aus Lösung C mit einer Transferpipette und betten Sie sie ein, indem Sie eine kleine Menge der OCT-Verbindung auf ein Futter geben, die Planarien hinzufügen und dann die Planarien mit der OCT-Verbindung umgeben. Planarien mit der Kryostatmaschine bei -24° C quer in 5 μM Schnitte schneiden.
    5. Planarien mit einer Transferpipette und Lösung C auf gelatinebeschichtete Objektträger aufsetzen und bis zu 3 Tage im Dunkeln bei RT trocknen lassen.
    6. Färben Sie Objektträger mit der Färbelösung (1 Teil Lösung D, 1 Teil Lösung E, 2 Teile Quellwasser), indem Sie die Objektträger in Bechergläser mit den Lösungen wie folgt tauchen: Färbelösung für 10 min, dann 2x für je 4 min in Quellwasser, dann 50% Ethanol für 4 min, dann 75% Ethanol für 4 min, dann 95% Ethanol für 4 min, dann in 100% Ethanol 4x für 4 min, und schließlich in Xylol 3x für 4 min.
    7. Deckglas mit histologischem Eindeckmedium und Gewebe unter Hellfeldmikroskopie betrachten.
  2. Immunfluoreszenz-Färbung
    1. Nachdem die Planarien eingeschläfert wurden, mindestens 24 h lang in 4%iges Paraformaldehyd legen. Nach diesem Schritt kann es auch im Kühlschrank aufbewahrt werden.
    2. Übertragen Sie Planarien auf 20 % Saccharose aus 4 % PFA und lassen Sie sie 1 Tag lang darin ruhen. Entfernen Sie die Planarien von der Saccharose und geben Sie sie für 5 Minuten in PBS-Puffer.
    3. Mit 3-4 Wäschen PBS-Puffer spülen und zur Lagerung auf 20 % Saccharose umfüllen, bis sie zum Färben bereit ist.
    4. In Lösungen mit 70 %, 95 % und 100 % Alkohol für jeweils 1 Minute geben. 1 Min. in Xylol legen.
    5. 95% und 70% Alkohol für jeweils 1 Minute zugeben. 3x für je 5 min in den PBS-Puffer geben. In eine 60:40 Methanol- und Wasserstoffperoxidlösung für 10-15 min geben.
    6. 3x für jeweils 5 min in PBS spülen. Das Volumen von 4 % Paraformaldehyd, das zuvor in 4.2.1 verwendet wurde, wird in diesen PBS-Puffer gegeben.
    7. 3x für jeweils 5 min in PBS spülen. 1 h mit Milchpulver blockieren, indem Sie die Planarien damit bedecken.
    8. Primärantikörper (1H6) auf 5 μg/ml mit PBS verdünnen und die Objektträger über Nacht bei 4 °C in der Antikörperlösung inkubieren. Am nächsten Tag die Planarien 10 Minuten lang in PBS spülen.
    9. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-IgG) auf 1 μg/ml in PBS und inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei RT in der Antikörperlösung. Am nächsten Tag die Planarien 15 Minuten lang in PBS spülen.
      HINWEIS: Unterschiedliche Antikörper haben unterschiedliche optimale Konzentrationen; Bestimmen Sie dies, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
    10. Ganze Planarien auf den Objektträger aufkleben, mit einem Deckglas abdecken, mit wässrigem Eindeckmedium versiegeln und das Gewebe unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachten.

5. Bildanalyse

  1. Öffnen Sie die Open-Source-Bildanalyse-Softwareanwendung. Installieren Sie das colour_deconvolution2.jar-Plugin in der Open-Source-Bildanalyse-Softwareanwendung, indem Sie das Plugin in die Anwendung ziehen.
  2. Wählen Sie das zu analysierende Bild aus und ziehen Sie es in die Open-Source-Bildanalyse-Softwareanwendung. Gehen Sie zur Registerkarte Bild und klicken Sie auf Farbe. Klicken Sie auf Colour Deconvolution2 v2.1.
  3. Klicken Sie in der Option Vektoren auf H DAB. Klicken Sie in der Ausgabeoption auf 8bit_Transmittance. Stellen Sie sicher, dass die Optionen "Simulierte LUTs", "Kreuzprodukt für Farbe 3", "Matrizen anzeigen" und "Legende ausblenden" ausgewählt sind. Klicken Sie auf OK.
  4. Wählen Sie das Bild in Schwarzweiß aus, um sicherzustellen, dass die Open-Source-Bildanalysesoftware das Bild effektiv analysieren kann.
  5. Gehen Sie zur Registerkarte Bild. Klicken Sie auf Anpassen. Klicken Sie auf Schwellenwert. Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die DAB-Färbung oder der Vordergrund rot und weißer Hintergrund ist. Stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert für jedes Bild gleich ist, wenn mehrere Bilder quantifiziert werden.
  6. Klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie auf Messungen festlegen. Wählen Sie Bereich, minimalen und maximalen Grauwert, Grenzwert bis Schwellenwert, Anzeigebeschriftung, Median und mittleren Grauwert aus. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie auf Messen. Erhalten Sie das Ergebnis.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1. U6n, bis alle Bilder quantifiziert sind. Klicken Sie auf das Ergebnisbild. Klicken Sie auf Datei. Klicken Sie auf Speichern unter. Speichern Sie die Datei als Tabellenkalkulation und zeigen Sie die Daten in der Tabellenkalkulationssoftware an.

6. Statistische Analyse

  1. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardfehler des Mittelwerts (SEM) für das Verhalten der Planarien mit Hilfe der Varianzanalyse (ANOVA) und des Student-t-Tests für statistische Signifikanz (p < 0,05).

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Ergebnisse

Das folgende Verhalten wurde von den Planarien beobachtet, die unterschiedlichen Konzentrationen von Pilocarpin ausgesetzt waren:
Dorsale Oszillationen: eine blasenartige Formation, die sich vom kranialen Ende des Körpers der Planarie bis zum kaudalen Ende erstreckt.
Kopfschwingungen: blasenartige Formation am Kopf der Planarie, die ein kaulquappenartiges Aussehen bildet.
C-Form: Kopf bewegt sich im Uhrzeigersinn und Schwanz bewegt sich gegen den Uhrzeigersinn, um ein C zu bilde...

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Diskussion

Diese Studie zeigte das Pilocarpin-induzierte Verhalten bei Planarien in verschiedenen Konzentrationen. Das relevanteste Verhalten war die oszillierende dorsale Expansion, da dieses Verhalten in anderen Studien zum anfallsähnlichen Verhalten bei Planarien 9,10,11,12 nicht dokumentiert wurde. Der Mechanismus, durch den Pilocarpin anfallsähnliche Verhaltensweisen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Wir danken dem EVMS Research Incentive Fund (PI: A.E. Musto) und Dr. Jorge Jacot für seine hilfreichen Vorschläge zur Optimierung des Immunfluoreszenzprotokolls.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Zentrifugenröhrchen
4% Paraformaldehyd-LösungHimediaTCL119
Wässrige EindeckmedienClini SciencesNB-47-02240-30ML
Becher (eines für jede getestete Konzentration)
Carolina SpringwaterCarolina Carolina132450
Kryostat
Verdünnte Primär- und Sekundärantikörper
Ethanol (100%)sigma Aldrich
EthosVision XT 16noldus
Fidschi Version 2.9.0
Gelatinebeschichtete Objektträgersigma Aldrich643203
Golgi Antikörper 1H6DSHBAB_2619608
Golgi-Färbung kit_Neuroscience AssociatePK 401/401A
Wasserstoffperoxid
Methanol
EindeckmittelThermo Fischer Scientific
OCT Compound
Sigma AldrichP4417
Milchpulver
Alufolie
Transferpipetten
Xylol
PBS Puffer

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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