Methodenartikel

Co-Kulturmodell mit zwei Arten von adhärenten Zelllinien

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DOI:

10.3791/67314

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8. November 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Maternal-Fetal Medicine Institute, Department of Obstetrics and Gynecology, Shenzhen Baoan Women's and Children's Hospital, Shenzhen University, 2The First Clinical Medicine College, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll zeigt ein neuartiges experimentelles In-vitro-Modell , das die Biologie von zwei Arten von adhärenten Zelllinien mit einem dreidimensionalen (3D)-gedruckten Gerüst rekapitulieren kann. Der Aufbau dieses Modells und die Arbeitsabläufe, von der Zellpräparation über die Zellkultur bis hin zur Analyse und Auswertung, werden beschrieben.

Zusammenfassung

Die Einnistung des Embryos wird durch die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen in der Mutter-Embryo-Schnittstelle beeinflusst. Die direkte und indirekte Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb der Dezidua ist entscheidend für die Regulierung der Empfänglichkeit des Endometriums; Die molekularen Mechanismen, die diese Wechselwirkung vermitteln, sind jedoch noch unklar. In diesem Zusammenhang wird ein Modell zur Untersuchung des Implantationsprozesses benötigt, um ein umfassendes In-vitro-Modell zu etablieren, das die Biologie der Interaktion zwischen Endometriumepithel und Stroma rekapitulieren kann. Dieses Modell besteht aus regulären Zellkulturplatten und einem passenden Gerüst, das durch dreidimensionalen (3D) Druck aus kostengünstigen Materialien erzeugt wird. Im Folgenden stellen wir eine Reihe von Protokollen für die Modellkonstruktion, die Zellvorbereitung, die Zellaussaat, die Zellkultur, die Beobachtung und die Bewertung vor. Darüber hinaus haben wir repräsentative Ergebnisse mit Zellen unter dem Mikroskop einbezogen, die gute Wachstumsbedingungen aufweisen. Ziel dieser Studie war es, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die die Interaktion zwischen endometrialen Stromazellen und Epithelzellen sowie zwischen Trophoblastzellen und Endometriumzellen nachahmen.

Einleitung

Trotz umfangreicher Forschung über die Schwangerschaft beim Menschen sind die molekularen Mechanismen an der Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus während der Implantation und der frühen Schwangerschaft nach wie vor wenig verstanden1. Das menschliche Endometrium besteht hauptsächlich aus zwei Zelltypen: Endometriumepithelzellen (EECs) und Endometriumstromazellen (ESCs). Die Einnistung verläuft in drei Phasen: Apposition, Anheftung und Invasion, die zur Entwicklung eines kompetenten Embryos und eines rezeptiven Endometriums führen2. In Anbetracht der ethischen Zwänge von In-vivo-Studien an menschlichen Probanden sowie der Schwierigkeiten bei der vollständigen Simulation des menschlichen Zustands bei Tieren ist die Konstruktion von In-vitro-Modellen für menschliche Endometriumkulturen zu einem wirksamen Mittel geworden, um die Einnistungs- und Frühschwangerschaftsprozesse zu replizieren3. Diese Modelle sind wertvoll für die Untersuchung sowohl normaler als auch pathologischer Schwangerschaften und bieten eine grundlegende Plattform für die vorläufige Erprobung und Validierung therapeutischer Interventionen in der translationalen Medizin.

Kommerzielle Kammern sind in der zellbiologischen Forschung weit verbreitet. Diese Kammern bieten wertvolle Einblicke in die Zellmigration und die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen. Kommerzielle Kammern sind jedoch in der Regel für den einmaligen Gebrauch bestimmt und können kostspielig sein4.

Eine große Anzahl von In-vitro-Humankulturmodellen, bestehend aus Endometrium und Blastozyste oder Blastozysten-Surrogaten, wurde entwickelt, um den detaillierten Prozess der Implantation besser zu verstehen. Diese Modelle befinden sich jedoch noch in der Anfangsphase ihrer Anwendung, da die 3D-Struktur ein hochkomplizierter Versuchsaufbau ist und bestimmte spezifische Differenzierungsmedien teuer sind 5,6,7.

Die Verwendung von erschwinglicher 3D-Druck-Hardware und eine relativ kurze Fertigungszeit ermöglichen es, Strukturen für verschiedene experimentelle Zwecke anzupassen. 3D-Drucktechniken helfen, Zeitkosten zu reduzieren und ermöglichen die Erstellung komplexer, kundenspezifischer Strukturen. Diese Technologie beschleunigt das Design und die Iteration von Prototypen erheblich und ist damit ein wertvolles Werkzeug für Forscher in verschiedenen Bereichen, das es ihnen ermöglicht, ihre Arbeit effizienter zu erledigen 8,9,10.

In dieser Arbeit stellen wir ein praktikables und wirtschaftliches Versuchsprotokoll für die Konstruktion der 3D-Struktur und ihre Verwendung als Zellkultursystem vor, das die Interaktion zwischen endometrialen Stroma- und Epithelzellen simulieren kann, um die Empfänglichkeit des Endometriums während der Embryoimplantation zu untersuchen. Dies bietet eine anpassbare und kostengünstige Alternative für kommerzielles Einwegmaterial.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Medien vor der Verwendung auf 37 °C voräquilibriert.

1. 3D Druck des Gerüsts und Modellbau

HINWEIS: Die Schritte hier wurden gemäß dem Handbuch der kommerziellen 3D-Metalldruckmaschine durchgeführt. Die Schritte werden im Folgenden kurz beschrieben (Ergänzungsdatei 1).

  1. Druckbett Nivellierung
    1. Tippen Sie auf das Menüsymbol im Dashboard und navigieren Sie zu Dienstprogramme. Wählen Sie Bed Level aus, um die Nivellierungsroutine zu starten.
    2. Entfernen Sie das Druckblatt aus dem Druckbett und wählen Sie Fertig. Das Druckbett steigt zur Vorbereitung der Nivellierung auf seine maximale Höhe an. Sobald der Fortschrittsbalken 100 % erreicht, drücken Sie Start.
    3. Wenn der Metal X-Drucker noch nicht nivelliert wurde, wählen Sie Zurücksetzen. Wenn dies der Fall ist, wählen Sie Überspringen und fahren Sie direkt mit Schritt 1.1.5 (dem 16-Punkt-Scan) fort.
    4. Drehen Sie mit einem 2,5-mm-Inbusschlüssel alle Nivellierschrauben mit drei Betten im Uhrzeigersinn, bis sie fest angezogen sind. Lockern Sie sie dann, indem Sie sie zwei volle Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn drehen, um sie auf eine mittlere Höhe zu bringen. Drücken Sie Fertig , um fortzufahren.
    5. Der Drucker scannt das Bett an 16 festgelegten Punkten. Berühren Sie während dieses Vorgangs nicht das Bett oder den Rahmen. Sobald der Fortschritt 100 % erreicht hat, drücken Sie auf Weiter.
  2. Bogen drucken
    1. Entfernen Sie alle Metallreste oder Stützreste. Schalten Sie den Schieberegler Vakuum auf Ein.
    2. Lassen Sie das Bett absenken und aufheizen, und drücken Sie dann auf Weiter. Legen Sie das Druckblatt über das Vakuumgitter und drücken Sie Weiter.
    3. Positionieren Sie die Bogenpresse über dem Druckbogen und richten Sie sie an den Z-Schienen an der Rückseite der Kammer aus.
    4. Warten Sie, bis das Vakuum einrastet und eine stabile Abdichtung entsteht. Sobald das Vakuum eingeschaltet ist, drücken Sie Fertig.
  3. Laden von Metallfilamenten
    1. Positionieren Sie den Druckkopf manuell in der Mitte des Druckbereichs. Entferne die Druckkopfabdeckung, indem du sie nach oben und von den Befestigungsschrauben schiebst.
    2. Tippen Sie auf das Menüsymbol auf der Optionstafel. Wählen Sie Materialien aus den Optionen aus.
    3. Wählen Sie Load Metal , um die Laderoutine zu starten. Wählen Sie Quick Load aus.
    4. Wählen Sie die spezifische Art des zu ladenden Metallmaterials aus (z. B. Aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
    5. Legen Sie die Spule auf die Halterung und drücken Sie Weiter. Schließen Sie die Klappe, lassen Sie die Spulen aufwärmen, und drücken Sie dann auf Weiter.
    6. Führen Sie das Material in den vorderen Einlass des Druckkopfs (mit M gekennzeichnet) ein, bis der Extruder beginnt, es durchzuziehen.
  4. Druck von Metallteilen
    1. Klicken Sie im Bedienfeld "Druckeinstellungen" auf "Gebäude d exportieren". Speichern Sie die Datei auf einem USB-Laufwerk, das mit FAT32 formatiert ist, und stecken Sie sie in den Drucker.
    2. Wählen Sie das Menüsymbol auf dem Board aus. Navigieren Sie zu Speicher und wählen Sie Aus Speicher drucken aus. Wählen Sie die Teiledatei aus, um den Druck zu starten.
  5. Entfernen von Metallteilen
    1. Schiebe den Druckbogen und die gedruckten Teile vorsichtig vom Druckbett. Lösen Sie die Teile vorsichtig vom Druckbogen. Das flexible Blatt sollte sich leicht ablösen lassen.

2. Vorbereitung für die Zell-Co-Kultur im 3D-Modell

HINWEIS: Es wird empfohlen, hochtemperaturbeständige Materialien als Verbrauchsmaterialien für den 3D-Druck von Gerüststützen für Zelldeckgläser zu verwenden, um die Sterilisation im Autoklaven vor jedem Einsatz in Zellkulturexperimenten zu erleichtern. In dieser Studie wurden immortalisierte humane endometriale Stromazellen (HESC) und humane endometriale Epithelzellen (Ishikawa) verwendet. Über die Charakterisierung dieser Zelllinien wurde bereits berichtet 5,6.

  1. Zellkultur und Passage
    1. Bereiten Sie 50 ml komplementäres Medium für hESC vor, indem Sie DMEM/F12-Medium + 2 mM L-Glutamin + 10 % kohlegestreiftes fötales Rinderserum (FBS) + 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung hinzufügen.
    2. Bereiten Sie 50 ml komplementäres Medium für Ishikawa vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin Lösung hinzufügen.
    3. Auftauen der Zellen
      HINWEIS: Die gekaufte Zelllinie wurde auf Trockeneis in gefrorenem Zustand versendet. Es sollte in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff oder unter -130 °C gelagert werden.
      1. Bereiten Sie alle erforderlichen sterilisierten Geräte und Dissoziationsenzyme vor und erwärmen Sie das komplementäre Medium auf 37 °C.
      2. Tauen Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad mit gelegentlichem leichtem Wiegen zügig auf. Die Zellsuspension wird in ein Röhrchen mit 5 mL Basalkulturmedium überführt und 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert.
      3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Das Zellpellet wird in 5 mL des vorbereiteten vollständigen Kulturmediums resuspendiert und in zwei T25-Kulturflaschen abgefüllt. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
  2. Vorbereitung der Zellen mit einem Deckglas
    1. Verwenden Sie ein quadratisches Deckglas von 18 mm als Oberfläche der Zellkultur. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas sauber und steril ist.
    2. Beschichten Sie das Deckglas am Boden einer 12-Well-Platte mit 200 μl extrazellulärer Matrix (ECM) in einer Konzentration von 200-300 μg/ml. Halten Sie die Platte 1 h lang bei 37 °C.
    3. Entfernen Sie das ECM von der Platte. Untersuchen Sie die Zellen auf angemessene Konfluenz und stellen Sie sicher, dass die Dichte beider Zelllinien etwa 70 % bis 80 % beträgt.
    4. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen 2x mit 3 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    5. Fügen Sie 2 ml Dissoziationsenzym hinzu und kultivieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 37 °C, um sie abzulösen.
    6. Neutralisieren Sie mit vollständigem Kulturmedium und erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension durch Auf- und Abpipettieren.
    7. Nehmen Sie 100 μl der Zellsuspension und mischen Sie sie mit Trypanblau (Verdünnungsfaktor = 2).
    8. Schieben Sie das Deckglas über die Kammer des Hämozytometers. Füllen Sie beide Seitenkammern mit der Zellsuspension, die Trypanblau enthält.
    9. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in Quadraten auf beiden Seiten unter einem 20-fach-Mikroskop und berechnen Sie die Dichte der Zellen.
    10. Die Zellen werden auf die vorbereitete Platte mit frischem Medium umgefüllt und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Seed-hESC in der Vertiefung mit 1 x 105 Zellen/ml für 24 h.
    11. Für die Ishikawa-Zelllinie säen Sie die Zelle am nächsten Tag ohne Deckglas in die Vertiefung.

3. Aufbau des Co-Kultur-Modells

  1. Weichen Sie die Gerüste 2 Tage lang gründlich mit Ethylalkohol und doppelt destilliertem Wasser (ddw) ein. Gerüste mit einem Autoklaven bei 121 °C sterilisieren und trocknen.
  2. Geben Sie etwa 2 ml komplementäres Medium für die Ishikawa-Zelllinie in das gut kultivierende Ishikawa und stellen Sie sicher, dass der Flüssigkeitsstand das Deckglas bedeckt.
  3. Übertragen Sie die Deckglasabdeckung mit hESC auf das Gerüst und halten Sie die Seite mit der Zelle nach unten. Stecken Sie das Gerüst in den gut kultivierenden Ishikawa. Für den zweiten Satz kehren Sie diese Anordnung um, indem Sie den Deckglasbezug mit Ishikawa auf das Gerüst übertragen und das Gerüst in den gut kultivierenden hESC stecken. Verwenden Sie die Zellen ohne Gerüstaufbau für die Analyse des unabhängig wachsenden Zellwachstums.
  4. Inkubieren Sie das Co-Kultursystem bei 37 °C, 5 % CO2. Die Co-Kultur-Periode kann je nach Versuchsdesign variieren, liegt aber typischerweise zwischen 24 und 72 Stunden.

4. Bilderfassung

  1. Entfernen Sie vorsichtig das Nährmedium und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
  2. Deckgläser mit anhaftenden Zellen mit einer feinen Pinzette oder Pinzette aus Kulturschalen entfernen. Legen Sie optional Deckgläser in eine neue Schale mit PBS, um ein Austrocknen während des Transfers zu verhindern.
  3. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger und geben Sie einen Tropfen PBS. Übertragen Sie das Deckglas mit den Zellen vorsichtig auf den Tropfen Eindeckmedium und stellen Sie sicher, dass die Zellen mit der Vorderseite nach unten auf den Objektträger zeigen.
  4. Legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Tisch des inversen Mikroskops. Wählen Sie das passende Objektiv (z. B. 10x, 20x) und stellen Sie den Fokus mit den Grob- und Feinfokusknöpfen ein.
  5. Stellen Sie Mikroskopparameter wie Beleuchtungsintensität und Kameraeinstellungen ein. Nehmen Sie mit der Mikroskopsoftware Bilder der Zellen in den gewünschten Vergrößerungen und Sichtfeldern auf. Passen Sie die Belichtungszeit und andere Bildeinstellungen an, um die Bildqualität zu optimieren.

5. Bildverarbeitung

  1. Klicken Sie auf Öffnen , um das Bild zu öffnen, klicken Sie auf Prozess > Filter > Verbesserung, um > Lokale Entzerrung auszuwählen, und klicken Sie auf Übernehmen.
  2. Klicken Sie auf Bearbeiten > In > Graustufen 8 konvertieren. Klicken Sie auf "Verbessern" und wählen Sie "Kontrast anwenden" aus.
  3. Klicken Sie auf Fächer zählen und messen. Klicken Sie auf Manuell, wählen Sie einen Bereich aus und passen Sie das Histogramm an, um sicherzustellen, dass alle Zellen abgedeckt sind.
  4. Klicken Sie auf Maske anwenden, schließen Sie das aktuelle Fenster, klicken Sie auf Automatische helle Objekte > Messen, wählen Sie Messung aus und wählen Sie Aera, Dendric, Density und Size.
  5. Klicken Sie auf "Automatisch helle Objekte" und dann auf "Anzahl". Klicken Sie auf Daten exportieren , um die Messdaten in eine Tabelle zu exportieren.

6. Zellernte

  1. Entfernen Sie die Deckgläser vom Objektträger und geben Sie sie in eine saubere und trockene Vertiefung.
  2. Ernten Sie die Ishikawa-Zelle mit einem RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomik oder einem Ripa-Lysereagenz für die Proteomforschung.
    HINWEIS: Bei hESC war die Deckglas-Kulturmethode für die Bildaufnahme nach Immunfärbung effektiver. Alternativ kann das hES-Protein mit einem RNA-Isolationsreagenz oder einem Ripa-Lysereagenz geerntet werden. Zelllinien, die auf dem Deckglas oder der Oberfläche der Platte kultiviert wurden, könnten ausgetauscht werden; Wir empfehlen jedoch, die für die bildgebende Analyse vorbereiteten Zellen auf das Deckglas zu säen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das hausgemachte Gerüst für Zellobjektträger, das in diesem Prozess verwendet wird, das aus einem oberen Stützring besteht, der auf die Befestigung an Standard-12-Well-Zellkulturplatten zugeschnitten ist, ergänzt durch einen basalen Zellträgerhalter mit vier L-förmigen stabförmigen Strukturen.

Laut Abbildung 2 blieb die Dichte beider Zelltypen in der Kokulturbedingung (Abbildung 2A,B) nach 72 Stunden Co-Kultur niedrig; Die Dichte beider Zelltypen, die unabhängig voneinander kultiviert wurden, nahm jedoch signifikant zu (Abbildung 2C,D). Darüber hinaus war die Länge der co-kultivierten hES-Zellen im Vergleich zu unabhängig kultivierten hES-Zellen kürzer (Abbildung 2E-G).

Das Profil von Ishikawa-Zellen und hES-Zellen deutet auf Wechselwirkungen zwischen den beiden Zelltypen hin. Gleichzeitig ermöglicht uns das System, weiterhin Folgeexperimente an den einzelnen Zelllinien durchzuführen, einschließlich der immunchemischen Färbung und des Western Blots.

figure-results-1
Abbildung 1: 3D-gedrucktes Deckglasgerüst, das im Versuchsprotokoll verwendet wurde. (A) Gerüst in Monoform. (B) Gerüst in binärer Form. (C) Abbildung, die die Platzierung des Deckglases auf dem Gerüst zeigt. (D) Abbildung, die die Platzierung des Gerüsts in einer Standard-12-Well-Platte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Profil von hESC- und Ishikawa-Zelllinien, die 3 Tage lang unter unterschiedlichen Bedingungen behandelt wurden. (A) Der Ishikawa-Samen auf dem Deckglas, der mit hESC durch ein Gerüst co-kultiviert wurde (Balken = 200 μm). (B) Der hES-Samen auf dem Deckglas wurde mit Ishikawa unter Verwendung eines Gerüsts co-kultiviert. (C) Die Ishikawa-Zellen wurden in einem komplementären Medium mit 10 % FBS kultiviert. (D) Die hES-Zellen wurden in einem komplementären Medium mit 10 % FBS kultiviert. (E) Die Zelldichte von hES-Zellen ist unter Co-Kulturbedingungen signifikant niedriger als unter unabhängigen Kulturbedingungen. (F) Die Zelldichte von ISHIKAWA-Zellen unter Co-Kulturbedingungen ist signifikant geringer als unter unabhängigen Kulturbedingungen. (G) Die Länge des hESC unter Co-Kulturbedingungen ist deutlich kürzer. N=3; , S<0.05, zeigt der Fehlerbalken den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Codierungsdatei für den 3D-Druck. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Für die indirekte Co-Kultur von endometrialen Stroma- und Epithelzellen wird ein vereinfachtes und kostengünstiges Protokoll beschrieben. Bei dieser Methode wird ein hausgemachtes Gerüst für Zellobjektträger verwendet, das aus einem oberen Stützring besteht, der auf die Befestigung an Standard-12-Well-Zellkulturplatten zugeschnitten ist, ergänzt durch einen Basalzellträgerhalter mit vier L-förmigen stabförmigen Strukturen. Dieser Aufbau erleichtert die Trennung von endometrialen Stroma- und Epithelzellen und ermöglicht gleichzeitig deren Interaktion durch den Austausch von Signalmolekülen im Kulturmedium. Einer der Hauptvorteile dieses Ansatzes ist die erhebliche Reduzierung von Zeit und Aufwand im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Co-Kultursystemen11. Das selbstgebaute Gerüst ist aus leicht erhältlichen Materialien gebaut, was die Kosten für den Aufbau erheblich senkt. Darüber hinaus ist das Design einfach, so dass die Forscher das Gerüst einfach auf- und abbauen können, was Zeit und Mühe im Labor spart. Darüber hinaus kann das selbstgebaute Gerüst für mehrere Zwecke gereinigt und sterilisiert werden, was es zu einer nachhaltigen und wirtschaftlichen Option für die laufende Forschung macht. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft für Langzeitstudien, bei denen konsistente und zuverlässige Ergebnisse entscheidend sind.

Endometriumstromazellen und Epithelzellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Erleichterung einer erfolgreichen Embryoimplantation. Unter physiologischen Bedingungen haben Endometriumepithelzellen und Stromazellen im Endometrium typischerweise keinen direkten Kontakt. Forschungen zur Dezidualisierung von endometrialen Stromazellen beim Menschen haben gezeigt, dass Epithelzellen den Dezidualprozess parakrin beeinflussen. Die unmittelbare Nähe von Epithel- und Stromazellen ermöglicht eine effektive Kommunikation durch parakrine Signalübertragung12. Diese Interaktion ist entscheidend für die Koordination der zyklischen Veränderungen im Endometrium, einschließlich der Vorbereitung auf die Implantation und der anschließenden Gewebeablösung, wenn die Implantation nicht erfolgt11. Sowohl Epithel- als auch Stromazellen exprimieren Rezeptoren für Östrogen und Progesteron, die ihre Proliferation, Differenzierung und sekretorischen Aktivitäten regulieren. Das epithelial-stromale Übersprechen stellt sicher, dass diese Reaktionen gut koordiniert sind13. Daher bleibt die komplexe Wechselwirkung zwischen diesen Zellen ein kritisches Forschungsgebiet, da es wichtig ist, die komplizierten Prozesse zu verstehen, die der Empfänglichkeit des Endometriums und der Implantation des Embryos zugrunde liegen14. Trotz bedeutender Fortschritte in der Reproduktionsbiologie sind die detaillierten Mechanismen der Kommunikation zwischen diesen Zelltypen während der Implantation immer noch nicht vollständig geklärt15.

Das Gerüst bietet eine bequeme Möglichkeit, die Co-Kultur von zwei Arten von adhärenten Zellen zu erreichen. Im Prozess der langfristigen Co-Kultur wachsen und erneuern sich die Deckglaszellen jedoch im Laufe der Zeit weiter, und die abgestorbenen Zellen fallen ab und kommen mit den Zellen der unteren Schicht in Kontakt, was sich auf die Zellen der unteren Schicht auswirken kann. Zusätzlich werden die Zellsamen, die auf dem Deckglas gesät sind, mit der Vorderseite nach unten auf das Gerüst gelegt. Ob die Schwerkraft einen Einfluss auf den Zustand der Zellen hat, ist nicht bekannt. In dieser Forschung wurden zwei Zelllinien, hESC und Ishikawa, zur Demonstration verwendet. Das Gerüst kann in der Co-Kultur von zwei verschiedenen Arten von adhärenten Zelllinien weit verbreitet sein. Darüber hinaus kann das Gerüst auch als Plattform für andere Verbindungen oder Arzneimittelfreisetzungsmedien und als Montageplattform für verschiedene Geräte wie Lumineszenz-, Heizungs- und Elektrodengeräte verwendet werden.

Hier stellen wir ein zuverlässiges und robustes In-vitro-Zellkultursystem vor, das das spezifische Gerüst verwendet, das ein nützliches und praktisches Werkzeug ist, um den molekularen Mechanismus der Interaktionen zwischen embryonalen und mütterlichen Gebärmutterzellen weiter zu untersuchen. Darüber hinaus haben wir die Machbarkeit des etablierten Gerüsts als Modell für Blastozysten-/Trophoblastenstudien charakterisiert. Dieses Protokoll ermöglicht den Bau geeigneter Gerüste durch 3D-Druck und deren Funktion als 3D-Struktur für die Migrations- oder Invasionsplattformen in kleinen Volumina (12-Well-Platten), bei denen verschiedene Faktoren mit Hilfe von bildgebenden Quantifizierungssystemen bewertet werden können.

Die Verwendung von Zelllinien ermöglicht die Standardisierung des Modells, um verschiedene Bedingungen vergleichen zu können, was bei frischen primären Zottengeweben nicht anwendbar ist. Jede der Zelllinienkomponenten kann jedoch zur Validierung durch eine Primärkultur ersetzt werden. Durch die Einbeziehung von Zellen und Geweben, die von Patienten von Interesse stammen, kann das vorgeschlagene Modell die Demonstration und Modellierung verschiedener Krankheiten erleichtern, von denen bekannt ist, dass sie zu Unfruchtbarkeit und Schwangerschaftsversagen beitragen.

Kritische Schritte
Erstens sollte die Dichte der Ishikawa-Zellen für die Co-Kultur begrenzt sein, etwa 60%-70% Konfluenz. Zweitens sollte der Deckglasbezug mit den Zellen unten gehalten werden. Drittens sollte die Konzentration von ECM weniger als 3 mg/ml betragen, um die Bildung eines Gels zu vermeiden. Viertens sollte der Flüssigkeitsstand des Mediums im Co-Kultursystem das Deckglas bedecken.

Begrenzungen
Das oben erwähnte Modell besteht aus den endometrialen Epithelzellen und den Stromazellen; Eine Einschränkung der Studie bestand darin, dass Adenokarzinom-Ishikawa-Zellen als Epithelzell-Surrogate anstelle von Primärzellen verwendet wurden. Die Integration von primären Epithel- und Stromazellen desselben Patienten würde die physiologischen Bedingungen des menschlichen Endometriums replizieren. Für einige experimentelle Anwendungen betrifft eine mögliche Einschränkung das Fehlen anderer Zelltypen, wie z.B. Endothelzellen und Immunzellen, und es gibt keine Charakterisierung der Drüsenstruktur in diesem Modell, um den interaktiven Einfluss der Endometriumdrüsen auf andere endometriale Zelltypen zu bewerten. Unter physiologischen Bedingungen weisen die Epithelzellen jedoch eine Polarität auf, und dieser Charakter simuliert in vitro kaum Bedingungen ohne eine luminale Umgebung der Gebärmutter. Die endometrialen Stromazellen stehen im Menstruationszyklus unter dem Dezidualprozess16,17. Der molekulare Mechanismus der Dezidualisierung ist jedoch noch unklar. Mehrere Faktoren, darunter Immunzyten und Endothelzellen, könnten eine Rolle bei der Dezidualisierung spielen. Dieses Modell bietet eine begrenzte Möglichkeit, die indirekte Wechselwirkung zwischen Stroma- und Epithelzellen während des Dezidualprozesses zu untersuchen. Darüber hinaus sind die Niveaus und Rollen der biologischen Marker während der Dezidualisierung noch unklar, was weitere Untersuchungen rechtfertigt

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken allen Probanden, die an dieser Studie beteiligt waren. Wir schätzen auch die bildgebende Unterstützung durch Light Innovation Technology Ltd, Shenzhen. Diese Studie wurde unterstützt durch die Natural Science Funding of China (Grant No. 82201851), Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. JCYJ20210324141403009, RCYX20210609104608036), Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (Zuschuss-Nr. SZXK028) und Shenzhen Baoan Women's and Children's Hospital (Grant No. BAFY 2023003).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x Hanks″ Ausgewogene SalzlösungSolarbioH10461/10
12-Well, klare, TC-behandelte PlattenCorning3513-25
cm² ZellkulturflascheCorning430639-Aluminium
MarkForged6061-T6-DMEM
/F12Sigma-aldrichD2906-Dulbecco
' s modifizierter Eagle Medium GibcoC11995500BT
FBSGibco10099141C1/10
Fötales RinderserumGibco10099141C
ITS PremixBiocoat3543501/100
Matrigel MatrixCorning354248ECM
Metal XMarkforgedM F-PR-5000-Penicillin-Streptomycin
Gibco151401221/100
Rundes DeckglasBiosharpBS-18-RC-TrypLE
Select (10X)GibcoA1217701Dissoziationsenzym

Referenzen

  1. Iske, J., Elkhal, A., Tullius, S. G. The fetal-maternal immune interface in uterus transplantation. Trend Immunol. 41 (3), 213-224 (2020).
  2. Dey, S. K., et al. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev. 25 (3), 341-373 (2004).
  3. Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120(2022).
  4. Goss, S., et al. Mod3d: A low-cost, flexible modular system of live-cell microscopy chambers and holders. PLoS One. 17 (6), e0269345(2021).
  5. Zheng, J., Liu, L., Wang, S., Huang, X. Sumo-1 promotes Ishikawa cell proliferation and apoptosis in endometrial cancer by increasing sumoylation of histone h4. Int J Gynecol Cancer. 25 (8), 1364-1368 (2015).
  6. Damdimopoulou, P., et al. Human embryonic stem cells. Best Pract Res Clin Obst Gynaecol. 31, 2-12 (2016).
  7. Gargett, C. E., Schwab, K. E., Deane, J. A. Endometrial stem/progenitor cells: The first 10 years. Hum Reprod Update. 22 (2), 137-163 (2015).
  8. Lerman, M. J., Lembong, J., Gillen, G., Fisher, J. P. 3d printing in cell culture systems and medical applications. Appl Phys Rev. 5 (4), 041109(2018).
  9. Palmara, G., Frascella, F., Roppolo, I., Chiappone, A., Chiadò, A. Functional 3d printing: Approaches and bioapplications. Biosens Bioelectron. 175, 112849(2021).
  10. Li, S., et al. Multiscale architecture design of 3d printed biodegradable zn-based porous scaffolds for immunomodulatory osteogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3131(2024).
  11. Arnold, J. T., Lessey, B. A., Seppälä, M., Kaufman, D. G. Effect of normal endometrial stroma on growth and differentiation in Ishikawa endometrial adenocarcinoma cells1. Cancer Res. 62 (1), 79-88 (2002).
  12. Casper, R. F., Yanushpolsky, E. H. Optimal endometrial preparation for frozen embryo transfer cycles: Window of implantation and progesterone support. Fertil Steril. 105 (4), 867-872 (2016).
  13. Cooke, P. S., et al. Stromal estrogen receptors mediate mitogenic effects of estradiol on uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci U S Am. 94 (12), 6535-6540 (1997).
  14. Owusu-Akyaw, A., Krishnamoorthy, K., Goldsmith, L. T., Morelli, S. S. The role of mesenchymal-epithelial transition in endometrial function. Hum Reprod Update. 25 (1), 114-133 (2019).
  15. Evans, J., Hutchison, J., Salamonsen, L. A., Azlan, A. Endometrial inflammasome activation accompanies menstruation and may have implications for systemic inflammatory events of the menstrual cycle. Hum Reprod. 35 (6), 1363-1376 (2020).
  16. Gołąbek-Grenda, A., Olejnik, A. In vitro modeling of endometriosis and endometriotic microenvironment - challenges and recent advances. Cellular Signal. 97, 110375(2022).
  17. Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G. L., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

EmbryoimplantationEndometriumrezeptivit t3D gedrucktes Ger sthumane embryonale StammzellenIshikawa ZellenZellaussaatIn vitro ModellZellinteraktion
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