Methodenartikel

Isolierung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen

DOI:

10.3791/67315

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27. September 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie primäre hippocampusale Mikroglia von adulten Mäusen isoliert und gereinigt werden können, gefolgt von Anweisungen zur Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an diesen akut isolierten Zellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia sind residente Immunzellen im Gehirn, die mit Neuronen interagieren, um die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aufrechtzuerhalten. Studien zeigen, dass die Mikrogliaoberfläche Kaliumkanäle exprimiert, die die Aktivierung der Mikroglia regulieren, während Anomalien in diesen Kaliumkanälen zu neuronalen Erkrankungen führen können. Derzeit werden Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Mikroglia hauptsächlich an kultivierten primären Mikroglia von fötalen oder neugeborenen Mäusen durchgeführt, da es schwierig ist, elektrophysiologische Bewertungen an akut isolierten Mikroglia durchzuführen. In dieser Studie wird ein leicht verständliches Protokoll für die Isolierung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen und die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an den isolierten Zellen eingeführt. Kurz gesagt, das Gehirn wurde einer Maus nach der Enthauptung entnommen, der Hippocampus wurde bilateral präpariert und Mikroglia wurden mit einem Dissoziationskit für das Gehirn von Erwachsenen isoliert. Die Mikroglia wurden dann mit einer magnetisch aktivierten Zellsortiermethode (MACS) aufgereinigt und auf Deckgläser ausgesät. Die erfolgreiche Isolierung von Mikroglia wurde durch Immunfluoreszenzfärbung mit anti-CD11- und anti-Iba1-Antikörpern bestätigt. Ein Deckglas wurde in eine Aufzeichnungskammer gelegt, und die Ganzzellkaliumströme der akut isolierten Mikroglia wurden unter Voltage-Clamp-Bedingungen aufgezeichnet.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, die von myeloischen Vorläuferzellen im primitiven Dottersack abstammen, sind im ZNS beheimatet und machen etwa 10 % bis 15 % der gesamten Nervenzellen aus 1,2. Funktionell können Mikroglia nicht nur die lokale Umgebung überwachen, Immunabwehrfunktionen ausführen undNeuronen ernähren und unterstützen 3,4, sondern auch direkt mit Neuronen in Kontakt treten, um neuronale Oberflächenrezeptoren und die entsprechende Ligandenbindung zu regulieren, und indirekt über die Sekretion von Zytokinen interagieren5. Studien in vitro und in vivo haben gezeigt, dass Mikroglia verschiedene Arten von Kaliumkanälen exprimieren, die zur Aufrechterhaltung des negativen Membranpotentialsbeitragen 6 und die Aktivierung der Mikroglia regulieren. Angesichts der Tatsache, dass abnormale mikrogliale Kaliumkanäle bei verschiedenen Gehirnerkrankungen beobachtet wurden7, ist es für Forscher von entscheidender Bedeutung, potenzielle Medikamente zu identifizieren, die auf diese Kaliumkanäle abzielen, und Strategien zur Regulierung der Mikrogliafunktion zu entwickeln.

Traditionelle Verdauungs- und Reinigungsmethoden für Mikroglia verwenden oft das gesamte Gehirn, wodurch die Heterogenität der Mikroglia über verschiedene Gehirnbereiche hinweg übersehenwird 8. In-vitro-Dissoziation und Langzeitkultur in serumhaltigen Medien versetzen Mikroglia in einen aktiven Zustand9, der ihre physiologischen Eigenschaften und ihren wahren Zustand möglicherweise nicht genau widerspiegelt.

Während nach außen gerichtete Gleichrichter-Kaliumströme in primär kultivierten Neugeborenen-Mikroglia und Zelllinien10 aufgezeichnet wurden, können sich die Daten aus Langzeitkulturen von fötalem oder neugeborenem Maus-Hirngewebe von denen reifer Mikroglia unterscheiden. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, Mikroglia akut zu isolieren und sofort Ganzzellaufzeichnungen von mikroglialen Kaliumströmen unter Verwendung von adultem Maushirngewebe durchzuführen.

Die biochemischen Eigenschaften und Kaliumkanaleigenschaften wurden mit einer Methode untersucht, die für die Isolierung und Reinigung von Mikroglia aus kleinen Geweben geeignet ist 11,12,13,14,15. Daher bietet dieses Protokoll Forschern eine Anleitung, um die biochemischen und funktionellen Eigenschaften von Mikroglia unter physiologischen und Krankheitsbedingungen aufzuklären. Obwohl dieses Protokoll den Hippocampus und die Kaliumkanäle als Beispiele verwendet, kann es auch auf die Untersuchung anderer Gehirnbereiche und elektrophysiologischer Eigenschaften von Kanälen/Zellen angewendet werden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Versuche wurden vom Life Science Animal Care and Use Committee der South China Normal University genehmigt und es wurden angemessene Tierschutzstandards eingehalten (ethische Genehmigung: SCNU-SLS-2023-048). Für diese Studie wurden männliche oder weibliche 3-5 Monate alte C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Lösungen

  1. Bereiten Sie 50 ml intrazelluläre Lösung vor, die 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA und 2 mM MgCl2 enthält. Den pH-Wert mit 1 M KOH-Lösung auf 7,2 einstellen und den osmotischen Druck mit D-Saccharose13,16 auf 300 mOsm einstellen. Bei -20 °C lagern.
  2. Bereiten Sie 50 ml MACS-Puffer (magnetic-activated cell sorting) mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS vor.
  3. Poly-L-Lysin (PLL) in einer Verdünnung von 1:1000 in Wasser herstellen.
    HINWEIS: Deckgläser sollten am Tag vor dem Experiment mit PLL beschichtet werden. Inkubieren Sie die beschichteten Schlicker über Nacht bei 37 °C. Recyceln Sie PLL am zweiten Tag und trocknen Sie die beschichteten Slips bei 37 °C.

2. Herstellung einer einzelligen Suspension aus Hirngewebe

  1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Chloralhydrat (0,15 mL/10 g, i.p.) (nach institutionell anerkannten Protokollen). Das Verschwinden des Hornhautreflexes und des Schmerzreflexes durch Einklemmen der Zehen oder Einklemmen der Haut bei Mäusen bestätigt eine tiefe Anästhesie. Legen Sie die Tiere in Rückenlage auf einen Seziertisch und stecken Sie ihre Gliedmaßen fest.
    1. Die Brust wird freigelegt und das Herz17 wird mit eiskaltem, sterilem PBS durchblutet, um intravaskuläre zirkulierende Blutzellen zu entfernen. Halten Sie den Kopf fest und schneiden Sie die Haut entlang der Gehirnmittellinie mit einer Schere ein, um den Schädel freizulegen.
    2. Schneiden Sie den hinteren Teil des Schädels beidseitig und zwischen den Augenhöhlen mit einer kleinen Schere ein. Schneide den Schädel entlang der sagittalen Naht ab und entferne den Schädel mit einer Pinzette. Entnehmen Sie das Hirngewebe schnell mit einer Pinzette17.
  2. Legen Sie das Hirngewebe in 10 cm große Kulturschalen mit eiskaltem PBS. Präparieren Sie die Großhirnrinde beidseitig mit einer Pinzette, isolieren Sie das Hippocampusgewebe und schneiden Sie es in kleinere Stücke. Übertragen Sie die Stücke in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Die bilaterale Dissektion der Großhirnrinde zeigt die Sichel des Hippocampusgewebes in beiden Hemisphären des Gehirns.
  3. Suspendieren Sie die kleinen Stücke des Hippocampusgewebes in 2 ml eiskalter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 300 × g (bei Raumtemperatur), dann entsorgen Sie die HBSS.
  4. Geben Sie 1950 μl Enzymmischung 1 in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das die Hippocampus-Gewebestücke enthält. Schütteln Sie das Zentrifugenröhrchen kontinuierlich in einem 37 °C heißen Wasserbad für 5 min.
    HINWEIS: Enzymmischung 1 ist eine Kombination aus 50 μl Enzym P und 1900 μl Puffer Y, vorgewärmt auf 37 °C (als Teil des im Handel erhältlichen Kits enthalten, siehe Materialtabelle).
  5. Nehmen Sie das Zentrifugenröhrchen aus dem Wasserbad. 30 μl der frisch zubereiteten Enzymmischung 2 werden in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Pipettieren Sie die Gewebefragmente 20 Mal mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf und ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang in einem Wasserbad unter ständigem Schütteln bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Enzymmischung 2 ist eine Kombination aus 20 μl Puffer Y und 10 μl Enzym A. Die beiden oben genannten Verdauungsschritte wandeln das Hirngewebe in eine zelluläre Suspension um. Die Gesamtaufschlusszeit sollte 15 Minuten nicht überschreiten.
  6. Entfernen Sie das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie die Suspension mehrmals mit einer 1 mL-Pipette auf und ab, bis keine großen Gewebestücke mehr übrig sind.
  7. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 70 μm Zellsiebfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen 50 mL Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden große Stücke unverdauten Gewebes entfernt.
  8. Das Filtrat in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und 10 min lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Pipette.
  9. Waschen Sie die Zellsuspension, indem Sie 20 Mal mit 15 mL HBSS auf und ab pipettieren und 10 Minuten lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und
    resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml MACS-Puffer.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird die einzellige Suspension bereitgestellt, die in nachfolgenden Experimenten verwendet wird.

3. Akute Trennung von Mikroglia

  1. 1 ml der einzelligen Suspension in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 3 Minuten lang bei 4 °C 300 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  2. Resuspendieren Sie das einzellige Pellet in 90 μl MACS-Puffer. 10 μl CD11b/c-Mikrokügelchen zugeben und die Suspension 15 Minuten lang bei 4 °C auf einem horizontalen Schüttler inkubieren.
  3. Stellen Sie die Sortiersäule in das Magnetfeld eines geeigneten MACS-Separators und befeuchten Sie die Säule zweimal mit 500 μL MACS-Puffer.
  4. Waschen Sie die einzellige Suspension, indem Sie 1 mL MACS-Puffer direkt in das Röhrchen geben und bei 4 °C 300 × g für 3 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand vollständig an.
  5. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl MACS-Puffer.
  6. Übertragen Sie die resuspendierte Zellsuspension mit einer 1-mL-Pipette in die Sortiersäule im Magnetfeld. Verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule dreimal mit 500 μl MACS-Puffer, während sie im Magnetfeld verbleibt.
    HINWEIS: Der Durchfluss enthält unbeschriftete Zellen. Die Säule sollte gewaschen werden, ohne sie aus dem Magnetfeld zu nehmen.
  7. Entfernen Sie die Sortiersäule aus dem Magnetfeld. Geben Sie 1 mL MACS-Puffer in die Säule und drücken Sie ihn langsam mit dem Kolben durch. Sammeln Sie den Durchfluss.
    HINWEIS: Der Durchfluss enthält die markierten Zellen (d. h. die Mikroglia). Um die Reinheit der Mikroglia zu verbessern, kann der Vorgang mit einer neuen Sortiersäule (optional) wiederholt werden.
  8. Säen Sie die ausgewählten Zellen in eine 24-Well-Platte, die ein Deckglas enthält, das mit PLL beschichtet ist. Fügen Sie 200 μl Nährmedium hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang in einem 37 °C heißen Inkubator mit 95 % O2, 5 % CO2 und 60 % bis 80 % Luftfeuchtigkeit. Dieser Schritt ermöglicht es den Mikroglia, sich an das Deckglas zu heften, um nachfolgende Ganzzell-Patch-Clamp- und Immunfluoreszenz-Experimente durchzuführen.

4. Immunfluoreszenz

  1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Plattenvertiefungen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 0,1 M PBS auf dem Shaker.
  2. Entsorgen Sie das PBS und fixieren Sie die Mikroglia mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur (RT) auf dem Deckglas.
  3. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie den Deckglas dreimal mit 0,1 M PBS aus.
  4. Verwerfen Sie das PBS und permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 μl Blockierungspuffer mit 0,2 % Triton X-100 und 5 % BSA in PBS für 1 h bei RT auf dem Schüttler.
  5. Inkubieren Sie die Mikroglia mit Blockierungspuffer plus Anti-Iba1- und Anti-CD11b-Primärantikörpern18 über Nacht bei 4 °C.
  6. Am nächsten Tag entfernen Sie die primären Antikörper und spülen Sie den Deckglas dreimal mit PBS at RT auf dem Schüttler aus.
  7. Inkubieren Sie die Mikroglia mit dem Blockierungspuffer mit Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörpern für 2 h bei RT. Fügen Sie für die letzten 15 Minuten der Inkubation DAPI-Farbstoff hinzu.
  8. Entfernen Sie die Sekundärantikörper und spülen Sie den Deckglas dreimal mit PBS aus. Montieren Sie die Deckgläser für die Bildgebung auf Objektträger.

5. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von Kaliumströmen in Mikroglia

  1. Tauen Sie die intrazelluläre Lösung auf und bewahren Sie sie auf Eis auf.
  2. Pflasterpipetten (Elektroden) aus dünnwandigen Borosilikatglaskapillaren mit Hilfe eines vertikalen Abziehers17 ziehen.
    HINWEIS: Der Elektrodenwiderstand sollte weniger als 10 MΩ betragen.
  3. Übertragen Sie ein Deckglas in die Aufnahmekammer und fügen Sie die extrazelluläre Lösung hinzu, die 160 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 und 10 mM HEPES enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH-Lösung vor der Verwendung auf 7,2 einstellen13,16 und den osmotischen Druck mit D-Saccharose auf 300 mOsm einstellen.
  4. Lokalisieren Sie die kugelförmigen Mikroglia unter einem Wassermikroskop mit dem 40x-Objektiv.
  5. Füllen Sie die Elektrode mit intrazellulärer Lösung, befestigen Sie sie an der Verstärkerkopfstufe des Elektrophysiologie-Aufbaus und üben Sie positiven Druck aus. Wechseln Sie zum 4x Objektiv und lokalisieren Sie die Elektrode.
    1. Senken Sie die Elektrode in die Badlösung ab und stellen Sie den Verstärker in den Voltage-Clamp-Modus, um den Membrantest im Badmodus durchzuführen. Wechseln Sie zurück zum 40x Objektiv und bewegen Sie die Elektrodenspitze näher an die Mikroglia.
      HINWEIS: Wenn sich die Elektrodenspitze sehr nahe an einer Mikrogliazelle befindet, sollte der Widerstand leicht ansteigen.
    2. Üben Sie einen winzigen Unterdruck aus, um die Zelle zu halten. Wenn der Widerstand 100 MΩ erreicht, wechseln Sie im Membrantest vom Bad - in den Patch-Modus . Wenn der Widerstand 300 MΩ erreicht, lassen Sie den Unterdruck ab.
    3. Wenn der Widerstand die Bildung einer Gigaohm-Dichtung (d. h. >1 GΩ) zwischen der Elektrode und der Mikrogliamembran anzeigt, wechseln Sie im Membrantest vom Patch - in den Zellmodus .
  6. Üben Sie eine kleine Saugmenge aus und lösen Sie einen elektrischen Schlag aus, um die Membran zu zerreißen. Das Auftreten großer kapazitiver Transienten deutet auf einen erfolgreichen Membranbruch hin.
  7. Wechseln Sie in den Voltage-Clamp-Modus und öffnen Sie das Aufnahmeprogramm. Kaliumströme für 200 ms aufzeichnen. Um Potentiale zu testen, wenden Sie Spannungsschritte in 20-mV-Schritten von -120 mV bis +40 mV bei 1 Hz an.
  8. Analysieren Sie die erhaltenen Daten offline mit geeigneter Software.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurz gesagt, der Prozess beinhaltet die Isolierung von hippokampalen Mikroglia aus dem erwachsenen Mausgehirn, gefolgt von der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung dieser Zellen (Abbildung 1). Das Verfahren beginnt mit der Präparierung des Hippocampus von 3 bis 5 Monate alten erwachsenen C57BL/6J-Mäusen. Konkret wird das gesamte Gehirn nach der Perfusion entnommen und in eine Kulturschale mit eiskaltem PBS gegeben (Abbildung 2A). Um eine akute Isolierung der Zellen aus dem Hippocampus zu gewährleisten, wird die Großhirnrinde entfernt und das sichelförmige Hippocampusgewebe intakt isoliert (Abbildung 2B).

Für eine optimale Zellqualität und anschließende qualitativ hochwertige Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ist es entscheidend, die Verdauungszeit während der Herstellung der Einzelzellsuspension zu kontrollieren. In der Studie wurde das Hippocampusgewebe im Enzymgemisch konsequent manuell gerührt und die Verdauungszeit streng auf nicht mehr als 15 min begrenzt (Abbildung 3). Die Zellen wurden dann mit der MACS-Methode isoliert, wobei eine Reinheit von 86,20 % ± 0,68 % erreicht wurde19,20. Um zu bestätigen, dass es sich bei diesen sortierten Zellen um Mikroglia handelte, wurden Mikroglia-Oberflächenmarker durch Immunfluoreszenz mit anti-Iba1- und anti-CD11b-Antikörpern getestet, die häufig zum Nachweis von Mikroglia18 verwendet werden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die isolierten Zellen CD11b- und Iba1-positiv waren, was die erfolgreiche Isolierung von Mikroglia bestätigte (Abbildung 4).

Um zu beurteilen, ob die akut isolierten Mikroglia für Folgeexperimente von hoher Qualität sind, beschreiben wir, wie Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchgeführt werden, um die Kaliumströme der Mikroglia zu bewerten. Die aufgezeichneten Mikroglia hatten eine durchschnittliche Membrankapazität von 10,42 ± 2,05 (Abbildung 5). Die Ergebnisse zeigten, dass mikrogliale Kaliumströme aufgezeichnet werden konnten, was darauf hindeutet, dass die akut isolierten Mikroglia für neurobiologische Untersuchungen geeignet sind.

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Abbildung 1: Überblick über den experimentellen Ablauf. Es gibt vier Hauptschritte: Das Hirngewebe wird sorgfältig entnommen und der Hippocampus wird bilateral präpariert; Hippocampusgewebe wird verdaut, um eine Einzelzellsuspension unter Verwendung einer Enzymmischung herzustellen, wie im Protokollabschnitt beschrieben; Die Zielzellen werden durch ein magnetisch aktiviertes Zellsortierverfahren isoliert; und Kaliumströme in akut isolierten Zellen werden durch Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Dissektion des Hippocampus. (A) Das gesamte Gehirn einer 3 bis 5 Monate alten Maus. (B) Isolierter bilateraler Hippocampus. Maßstab: 0,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung der Verdauung des Hippocampusgewebes. Illustration kritischer experimenteller Schritte, die sicherstellen, dass das Hippocampusgewebe durch Zugabe von Enzymmischungen bei 37 °C und kontinuierlichem Schütteln für bis zu 15 Minuten zu einer einzelligen Suspension verdaut wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Identifizierung akut isolierter hippokampaler Mikroglia. Repräsentative konfokale Bilder, die CD11b- (grün) und Iba1-positive Zellen (rot) zeigen, die aus dem Hippocampus gereinigt wurden, was bestätigt, dass es sich bei den isolierten Zellen um Mikroglia handelt. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Aufzeichnung von Kaliumströmen der Mikroglia der gesamten Zell. (A) Eine Aufzeichnungselektrode wird auf der Oberfläche isolierter hippocampaler Mikroglia positioniert. Maßstabsbalken: 20 μm. (B) Repräsentative Kaliumströme von akut isolierten hippokampalen Mikroglia unter Bedingungen der Spannungsklemme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kultivierte Mikroglia von fötalen oder neugeborenen Mäusen sind eindeutig ungeeignet für die Untersuchung adulter Mikroglia. Darüber hinaus können Mikroglia, die aus dem gesamten Gehirn isoliert wurden, angesichts der Heterogenität der Mikroglia über verschiedene Hirnarealehinweg 21 die Eigenschaften von Mikroglia in einer spezifischen Gehirnstruktur möglicherweise nicht genau repräsentieren. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von Mikroglia im Hippocampus, um die elektrischen Eigenschaften dieser Zellen zu bewerten. Es umfasst Methoden zur Aufzeichnung der Ströme, die von mikroglialen Kaliumkanälen gesteuert werden.

Es ist allgemein bekannt, dass die Gewebeverdauung bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen streng kontrolliert werden muss, um die Eigenschaften dieser Zellen während der primären Zellkultur und der nachfolgenden Experimente nicht zu beeinträchtigen. Typischerweise wird eine Einzelzellsuspension aus dem gesamten Gehirn durch Verdau von Pankreasenzymen und physikalische Homogenisierung gewonnen. Bei der Isolierung von Mikroglia aus einem bestimmten Hirnareal, wie z.B. dem Hippocampus, ergibt die physikalische Homogenisierung allein jedoch keine ausreichende Menge an Zellen für aussagekräftige Experimente. Darüber hinaus haben Pankreasenzyme eine starke Verdauungsaktivität, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann.

Um diese Probleme anzugehen, wurde in der Studie ein relativ mildes Dissoziationsverfahren angewendet und die Verdauungszeit manuell auf nicht mehr als 15 Minuten mit dem Dissoziationskit für das Gehirn von Erwachsenen kontrolliert. Dieser Ansatz hält die Mikroglia in einem aktiven Zustand, was für nachfolgende Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen entscheidend ist. Das milde Dissoziationsverfahren bietet zudem Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit und Wirtschaftlichkeit.

Zu den Methoden zur Aufreinigung primärer Mikroglia gehören die stratifizierte Schüttelmethode (SSM)22, die Dichtegradientenzentrifugationsmethode (DGCM)23 und die fluoreszenzaktivierte Zellsortiermethode (FACS)11,24. Unter diesen wird das SSM häufig zur Reinigung von Neuronen oder Gliazellen eingesetzt. Eine wesentliche Einschränkung des SSM ist jedoch seine Unfähigkeit, einen hohen Reinheitsgradzu erreichen 25. In ähnlicher Weise führt die DGCM auch zu niedrigen Reinheitsgraden. Bei der FACS-Methode müssen die Zellen 15 Minuten bis 1 Stunde lang gefärbt werden, gefolgt von einer Sortierung mit einem Hochgeschwindigkeits-Zellsortierer, was die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann. Im Gegensatz dazu verwendet dieses Protokoll die MACS-Methode, die eine verkürzte Isolationszeit bietet und den wiederholten und zeitaufwändigen Einsatz von Instrumenten und Färbeverfahren vermeidet. Als Ergebnis werden hochreine Mikroglia gewonnen, wenn auch in potenziell geringeren Mengen im Vergleich zu einigen alternativen Methoden.

Diese Technik hat ihre Grenzen. So liefert die Methode der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) relativ wenige Mikroglia, und akut isolierte Mikroglia können nicht über längere Zeiträume kultiviert werden. Dieser Ansatz ist jedoch wertvoll, da er die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften von Mikroglia ermöglicht, die frisch aus dem Hippocampus der adulten Maus hergestellt wurden, anstatt sich auf Zellen zu verlassen, die über einen langen Zeitraum kultiviert wurden.

Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik ist ein wichtiges und weit verbreitetes Werkzeug zur Untersuchung zellulärer, insbesondere neuronaler, elektrophysiologischer Eigenschaften in Bereichen wie Neurowissenschaften, Pharmakologie und Zytobiologie26. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung wurde in zahlreichen Studien eingesetzt, um die Eigenschaften von akut präparierten Hirnschnitten, Primärkulturen und Zelllinien zu untersuchen. Bis zu unseren Untersuchungen fehlten jedoch Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von akut isolierten Mikroglia aus dem Gehirn von adulten Mäusen.

Diese Studie liefert nicht nur ein Protokoll für die Isolierung adulter hippokampaler Mikroglia, sondern demonstriert auch die erfolgreiche Aufzeichnung von Kaliumströmen in diesen isolierten Mikroglia. Insbesondere gilt dieses Protokoll wahrscheinlich für die Untersuchung von Mikroglia in anderen Gehirnstrukturen als dem Hippocampus.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32170950, 32371065), der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, Nr. 2023A1515010899 und 2021A1515010804, unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm PetrischaleCorning353003
15 mL Falcon RöhrchenBD352096
24-Well-PlattenBD353047
35 mm PetrischaleCorning
353001-50 mL Falcon RöhrchenBD352070
70 μ m-Zell-ScreeningMiltenyi130-095-823Zur Entfernung von Zellklumpen vor der Zellsortierung
Erwachsenenmaus Gehirn DissoziationskitMiltenyi130-107-677
Anti-CD11b AntikörperBio-RadMCA74Ziege Anti-Maus IgG ebenfalls erhältlich. Zur Blockierung endogener Immunglobuline.
Anti-Iba 1 AntikörperSYSY234308Ziege Anti-Meerschweinchen IgG) ebenfalls erhältlich. Zur Blockierung endogener Immunglobuline.
Axon Digidata 1440AUSA
Axon MultiClamp 700B VerstärkerUSA
BSA Albumin Fraktion VBioFrox4240GR500Serum
C57BL/6 Mäuse Guangdong Medical Laboratory Animal Center
CD11 b/c MikroperlenMiltenyi130-105-634
ChloralhydratAbsinabs47051394Weit verbreitet als Anästhesie bei Mäusen
Clampfit 10.6USA
Konfokales MikroskopZeiss  LSM 800
NährmediumFisher ScientificC11995500BT-DAPI
FarbstoffBeyotimeC1002
ElektrodenabzieherNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Horizontaler SchüttlerSCILOGEXSLK-O3000-S
BildanalysesoftwareFidschi
MACS-SäulenMiltenyi130-042-201
MACS-SeparatorenMiltenyi130-042-102
ParaformaldehydFisher ScientificT353-500Verwenden Sie eine frische 4%ige Lösung in 1X PBS, pH 7,2-7,4.
Poly-L-lysinBeyotime  C0313Deckglasbeschichtung
Triton X-100SigmaX100

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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