Identifizierung und Quantifizierung gestörter Metaboliten bei kritisch kranken Patienten mittels NMR-basierter Metabolomik

Summary

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) wird eingesetzt, um eine Fehlregulation der Metaboliten bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der gestörten Metaboliten und entwirrt die pathophysiologischen Erkenntnisse. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt das Vorgehen des NMR-basierten Ansatzes zur metabolischen Charakterisierung der Patienten.

Abstract

Die Metabolomik entwickelt sich zu einem wichtigen Ansatz, um die Reaktion des Individuums auf pathophysiologische Bedingungen widerzuspiegeln. Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) hat sich zu einem Instrument entwickelt, um metabolische Fehlregulationen bei kritisch kranken Patienten zu identifizieren, die an Erkrankungen wie dem akuten Atemnotsyndrom (ARDS), der schweren akuten Pankreatitis (SAP), dem akuten Nierenversagen (AKI) und der Sepsis leiden. Die spektralen Daten der Serumprobe der Studien- und Kontrollgruppe werden mit einem 800 MHz NMR-Spektrometer aufgezeichnet und mit NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen verarbeitet. Darüber hinaus wird eine strenge statistische Analyse, wie z. B. univariate und multivariate Tests, durchgeführt, um signifikante Metaboliten zu lokalisieren, die dann mit Hilfe von NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware genau identifiziert und quantifiziert werden. Darüber hinaus hebt die Signalweganalyse die gestörten biochemischen Zyklen hervor, die zur Schwere der Erkrankung führen. Durch diesen umfassenden Ansatz wollen die Forscher tiefere Einblicke in die metabolischen Veränderungen gewinnen, die mit diesen kritischen Krankheiten verbunden sind, und so möglicherweise den Weg für ein besseres Verständnis der Krankheit und verbesserte Diagnose- und Behandlungsstrategien ebnen.

Introduction

Trotz kontinuierlicher Bemühungen, weltweit eine effiziente Krankheitsdiagnose zu ermöglichen, hat die zielgerichtete Therapie ihr wahres Potenzial noch nicht ausgeschöpft. Verschiedene Ansätze, wie z.B. Transkriptomik, Proteomik usw., haben zur Identifizierung mehrerer Biomarker geführt, die jedoch aufgrund der mangelnden Sensitivität und Spezifität keinen ausreichenden klinischen Nutzen hatten ^1,2. Die zielgerichtete Therapie ist bei einigen multifaktoriellen Erkrankungen eine große Herausforderung, die schließlich zu einer höheren Sterblichkeit führt. Es besteht ein Bedarf an einem besseren Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus und der Pathophysiologie komplexer Krankheiten, die mit einer großen Heterogenität bestehen. In dieser Hinsicht hat die Entwicklung der Metabolomik die therapeutische Entwicklung revolutioniert, was schließlich dazu beitragen kann, die Behandlungsschemata für verschiedene kritische Krankheiten wie das akute Atemnotsyndrom (ARDS), die Sepsis und die schwere akute Pankreatitis (SAP) anzupassen.

Die Metabolomik ist ein umfassender Ansatz, der darauf abzielt, Moleküle mit kleinem Molekulargewicht (Metaboliten wie Aminosäuren, Lipide, Peptide, organische Säuren und Vitamine) in verschiedenen Bioflüssigkeiten, Zellen oder Gewebeextrakten zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Metaboliten, die typischerweise weniger als 1500 Da wiegen, spielen eine aktive Rolle in biochemischen Prozessen und spiegeln einen progressiven Abriss des biologischen Zustands des Organismus wider. Dazu gehören Substrate für wichtige enzymatische Prozesse, Zwischenprodukte in biologischen Stoffwechselwegen und Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Folglich erfasst die Metabolomik einen detaillierten Fingerabdruck von Ernährungseinflüssen, Arzneimittelwechselwirkungen und Krankheitszuständen. Metabolitenveränderungen sind hochempfindliche Indikatoren für den Stoffwechsel und die biologischen Signalwege, die Korrelationen mit phänotypischen Expressionen und daraus resultierenden pathophysiologischen Anomalien ermöglichen ^3,4. Anfängliche Schwankungen der Metaboliten können als Frühindikatoren für den Schweregrad der Erkrankung dienen, während zeitliche Veränderungen bei der Überwachung der Behandlungswirksamkeit, des Krankheitsverlaufs und der klinischen Ergebnisse hilfreich sein können ^5,6,7. Die Metabolomik verbessert somit klinische Assays und verschiedene andere Omics-Ansätze, indem sie Krankheiten durch klinische, physiologische und biochemische Endpunkte neu definiert 8,9,10,11,12,13. Die analytischen Fähigkeiten der Metabolomik werden genutzt, um die Krankheitsanfälligkeit durch veränderte Metabolitenkonzentrationen zu überwachen und zu bestimmen^14,15.

In diesem Zusammenhang haben sich sowohl die Massenspektrometrie (MS) als auch die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) als primäre analytische Plattformen für die Erstellung von Metabolitenprofilen in biologischen Proben herausgestellt. Diese Methoden werden sowohl zur gezielten als auch zur ungezielten Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten verwendet 16,17,18. Jede Plattform hat ihre Vor- und Nachteile, aber die zerstörungsfreie Natur der NMR macht sie in verschiedenen In-vivo-Studien und für die Charakterisierung der Struktur unbekannter Verbindungen, insbesondere in der Anfangsphase der Metabolomik-Forschung, vorzuziehen. Die Probenfraktionierung, Derivatisierung und Ionisation, die vor der MS erforderlich sind, kann zu Verzerrungen führen und häufig zu Probenverlusten führen, was sich auf die dynamischen Merkmale auswirkt, die die NMR-Spektroskopie mit minimaler oder keiner Probenvorbereitung erfassen kann. Die Haupteinschränkung der NMR ist ihre geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu MS, die eine niedrigere Nachweisgrenze bietet, was es schwierig macht, weniger häufig vorkommende Metaboliten nachzuweisen¹⁹. Fortschritte wie hochauflösende supraleitende Magnete, kryogenisch gekühlte NMR-Sonden und Techniken, die die Empfindlichkeit erhöhen, haben diese Einschränkung jedoch gemildert 20,21,22. Als komplementärer Ansatz zur Genomik und Proteomik gewinnt die Erstellung von Stoffwechselprofilen mittels NMR-Spektroskopie als bevorzugte Technik an Bedeutung 23,24,25. Die minimale Probenvorbereitung, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit der NMR machen sie trotz ihrer Empfindlichkeitsprobleme zu einem wertvollen Werkzeug für die Erfassung der inhärenten dynamischen Merkmale von Metaboliten²⁶.

Mehrere Forschungsgruppen haben erfolgreich Metabolomik durchgeführt und das dysregulierte Stoffwechselprofil von Patienten für verschiedene Krankheiten²⁷ wie ARDS 28,29,30,31,32,33, Lungenentzündung ³⁴, Sepsis⁷, Gallensteine³⁵ und Pankreatitis³⁶ bestimmt. NMR-basierte Metabolomik-Studien an kritisch kranken Patienten haben maßgeblich dazu beigetragen, das Fortschreiten vom systemischen Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS) zum Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS) zu verfolgen, das eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität auf Intensivstationen ist³⁷. In einer Studie von Stringer et al. wurden Plasmaproben verwendet, um metabolische Veränderungen bei Patienten mit Sepsis-induzierter akuter Lungenschädigung (ALI) im Vergleich zu Kontrollpatienten zu untersuchen³⁸. Die in dieser Pilotstudie als erhöht eingestuften Schlüsselmetaboliten spiegelten die beteiligten Stoffwechselwege und ihre Assoziation mit den klinischen Ergebnissen wider. Diese Forschung wurde auf die Serummetabolomik ausgeweitet, um die Sepsis von den frühen Stadien der Lungenverletzungsmechanismen bei ARDS^{zu unterscheiden 32}. Darüber hinaus identifizierte eine weitere Studie in ARDS potente Serum-Biomarker, die eindeutig zwischen akutem Lungenversagen/ARDS und gesunden Kontrollen unterscheiden und Einblicke in systemische metabolische Veränderungen bieten, die dem akuten Auftreten von Lungenschäden entsprechen^39,40.

Die NMR-Spektroskopie ist eine automatisierte Hochdurchsatz-Analysetechnik, die robuste und unvoreingenommene Informationen über den metabolischen Fingerabdruck liefert, die die zugrunde liegende Pathophysiologie aufdecken³⁸. Die klinische Anwendung und biologische Interpretation von NMR-Daten hängt von der Gewinnung hochwertiger Spektren ab, die reichhaltige Informationen enthalten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine genaue, einheitliche und gut formulierte Datenerfassung, -verarbeitung und -analyse zu gewährleisten. Daher ist es das Ziel dieser Arbeit, die wesentlichen Schritte der NMR-basierten Metabolomik für die Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten zu nutzen. Diese Studie beleuchtet die wichtigsten Schritte des Protokolls, die für klinische Metabolomik-Studien erforderlich sind (Abbildung 1), wie z. B. die Auswahl geeigneter Proben, die Entnahme und Lagerung, die Probenverarbeitung und -vorbereitung, die Datenerfassung und -analyse, die Identifizierung und Quantifizierung des interessierenden Metaboliten und schließlich die Interpretation der Ergebnisse in einem klinischen Kontext, um relevante Erkenntnisse abzuleiten. Jeder dieser Schritte ist unerlässlich, um die NMR-Spektroskopie in der Metabolomik zu nutzen, um wichtige biologische und klinische Erkenntnisse zu gewinnen.

Protocol

Die ethische Zulassung (IEC-Code: 2022-71-PhD-126) wurde von der IEC des Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences (SGPGIMS), Lucknow, erhalten. Es wurden schriftliche und informierte Einwilligungen von den Patienten oder ihren Angehörigen eingeholt, um die Studie durchzuführen und die Daten zu Forschungszwecken zu veröffentlichen. Darüber hinaus wurde die Forschung nach den institutionellen Richtlinien durchgeführt.

1. Studiendesign und ethische Freigabe

1. Bestimmen Sie den Stichprobenumfang für jede Gruppe. Überprüfen Sie die Auswahlkriterien für die Teilnehmer sorgfältig und legen Sie sie fest. Wenn das Studiendesign die Einbeziehung von menschlichen oder tierischen Proben erfordert, holen Sie außerdem die ethische Freigabe der zuständigen institutionellen Ethikkommission (IEC) ein, bevor Sie mit der Probenentnahme beginnen.
2. Ausgewählte ARDS-Patienten, die als leicht, mittelschwer und schwer eingestuft werden, basierend auf den diagnostischen Kriterien der Definition von Berlin 2012, die auf dem Partialdruck des Sauerstoffs im arteriellen Blut (PaO2) zum Anteil des eingeatmeten Sauerstoffs (FiO2) (P/F) basiert. Die ARDS-Patienten mit einem P/F-Bereich von 300-200 gelten als leicht, 200-100 als mittelschwer und unter 100 als schwer³⁸. Hier haben wir uns auf zwei Gruppen konzentriert: leichte und mittelschwere ARDS-Patienten (siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Studie umfasst die Verwendung von Serum, das aus Blutproben gewonnen wird, um NMR-basierte Metabolomik durchzuführen. In dieser Studie hatten die als Referenz eingeschlossenen Teilnehmer ein Durchschnittsalter von 42 Jahren (± 10,9 Jahre) mit einer Geschlechterverteilung von 2 Männern und 6 Frauen.

Kategorie	P/F-Verhältnis
Leicht	300-200
Mäßig	200-100
Schwer	100-0

Tabelle 1: Kategorisierung von ARDS-Patienten.

2. Probenauswahl, -entnahme und -verarbeitung

1. Führen Sie die Serumisolierung durch, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
   1. Entnehmen Sie zu Experimenten 2 ml Blutproben aus den Arterien mit einer sterilen Nadel in einem glatten (ohne Zusatzstoffe) und sterilen Fläschchen. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Für diese Studie wurden 4 Patienten mit leichtem ARDS und 4 Patienten mit mittelschwerem ARDS ausgewählt.
   2. Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3100 x g , um das Serum²⁵ zu trennen. Das Serum wird in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführt, wobei Aliquots mit kleinerem Volumen (d. h. 400-500 μl) erstellt werden, sie entsprechend gekennzeichnet werden (Name des Patienten, CR-Nr., Tagespunkt usw.) und für zukünftige Analysen bei -80 °C gelagert werden.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Experiment zu einem geeigneten Zeitpunkt angehalten und fortgesetzt werden.
2. Verarbeiten Sie die Serumprobe vor NMR-Experimenten mit den folgenden Schritten.
   1. Tauen Sie die Probe auf, bevor Sie die NMR-Experimente durchführen. Mischen Sie 250 μl Aliquot des Serums mit 250 μl Kochsalzphosphat-Pufferlösung (enthält 100 % D₂O, 0,9 % NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4), um pH-Schwankungen zu minimieren.
   2. Wirbeln Sie die Mischung einige Sekunden lang (~15 s) ein, um sicherzustellen, dass sie homogen vermischt wird. Schließlich wird die vorbereitete Probe in ein sauberes NMR-Röhrchen mit einem koaxialen Einsatz überführt, der Trimethylsilylpropionat (TSP) in einer Konzentration von 0,05 mM enthält, das als externer Standard für die Kalibrierung und Quantifizierung dient⁴¹.
      HINWEIS: Als Referenz wird eine inerte und nicht reaktive Verbindung verwendet, die nicht mit den Analyten interagiert. Weitere häufig verwendete Referenzverbindungen sind Tetramethylsilan (TMS) und Natriumtrimethylsilylpropansulfonat (DSS).

3. NMR-Experimente

HINWEIS: Der Schwerpunkt liegt auf der Identifizierung kleiner Moleküle in den Serumproben, daher haben wir die Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)-Pulssequenz verwendet, die Makromolekülsignale unterdrückt. Alle Serumproben in dieser Studie wurden mit einem 800 MHz NMR-Spektrometer aufgezeichnet, das mit einem kryogenisch gekühlten Dreifachresonanz-TCI-Sondenkopf mit 5 mm Breitband und einem abgeschirmten Z-Gradienten ausgestattet war.

1. Legen Sie die Probe in den Magneten. Schreiben Sie den Befehl wrpa (Experimentnummer angeben) und drücken Sie die Eingabetaste, um ein Protonenexperiment mit dem cpmg-Pulsprogramm einzurichten. Nennen Sie den Namen des Patienten und andere notwendige Details, indem Sie auf die Option Titel klicken.
2. Sperren Sie das Magnetfeld, indem Sie den Befehl Lock schreiben , drücken Sie die Eingabetaste und wählen Sie die Option 90% H₂O und 10% D₂O weiter. Stimmen Sie die Sonde manuell mit ATMM ab, um die Effizienz von Hochfrequenzimpulsen zu optimieren und die Empfindlichkeit zu maximieren. Führen Sie das 1D-Gradienten-Shimming durch, indem Sie auf topshim klicken.
3. Stellen Sie die folgenden Erfassungsparameter ein, darunter eine Relaxationsverzögerung von 5 s, eine spektrale Sweep-Breite von 12 parts per million (ppm) und eine Echozeit von 300 μs. Alle diese Parameter können einfach geändert werden, indem Sie die Option Erfassungsparameter im oberen Bereich auswählen.
4. Wenden Sie eine Linienverbreiterung von 0,3 Hz mit einer Exponentialfensterfunktion an und sammeln Sie Daten in 64.000 Punkten über 128 Scans. Diese Parameter können auf ähnliche Weise geändert werden, indem Sie die Option Erfassungsparameter im oberen Bereich auswählen. Wenn Sie auf Akquisitionsparameter klicken, erscheint eine Liste der Spezifikationen, und die genannten Attribute können zusammen mit anderen Parametern während der Optimierung geändert werden.
5. Erfassen Sie die NMR-Spektren mit NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen. Sobald die endgültigen Spektren erhalten sind, schreiben Sie den Befehl apk und absn und drücken Sie die Eingabetaste, um die Phasenkorrektur bzw. die Basislinienkorrektur durchzuführen. Klicken Sie auf die Option Achse kalibrieren im oberen Bereich und kalibrieren Sie den TSP-Peak entweder automatisch oder manuell auf 0 ppm.
6. Übertragen Sie die erfassten Daten vom System auf die Workstation, wo die weitere Verarbeitung und Analyse erfolgt.
   HINWEIS: Die Versuchsphase ist nun abgeschlossen und kann pausiert werden. Die Vorverarbeitung, Analyse und Interpretation von Daten kann bequem durchgeführt werden.

4. Vorverarbeitung von Daten

1. Führen Sie die Datenvorverarbeitung mit NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeugen und NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware durch.
   1. Manchmal reicht eine automatische Korrektur nicht aus, und in diesem Fall ist auch eine manuelle Korrektur erforderlich. Um die Phasenkorrektur manuell durchzuführen, klicken Sie auf die Option Verarbeiten in der oberen Menüleiste der NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeuge. Klicken Sie dann auf Phase anpassen, ziehen Sie die Maus und beobachten Sie, bis die Spektren phasenkorrigiert sind. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Option Speichern und Zurückkehren (in Form eines Symbols), die in derselben Menüleiste verfügbar ist.
   2. Um eine manuelle Baseline-Korrektur (Whittaker-Methode) durchzuführen, öffnen Sie die Spektraldatei im Prozessormodul der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware. Wählen Sie die Option Baseline-Korrektur aus. Wählen Sie dann die Option Whittaker-Methode. Setzen Sie nun die Punkte an die Basis der Peaks in den gesamten Spektren (0,0 bis 10 ppm, normalerweise im Falle von Serum oder je nach Verfügbarkeit des Metaboliten in den Spektren), um die Basis anzupassen. Nachdem alle Spektraldateien grundlegend korrigiert wurden, speichern Sie sie in einem einzigen Ordner. Die weitere Verarbeitung, entweder unter Verwendung des Prozessors oder des Profiler-Moduls der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware, kann mit derselben Datei durchgeführt werden, die in dem spezifischen Format gespeichert ist.
   3. Führen Sie das Binning mit dem Profiler-Modul derselben Software durch. Wählen Sie die Option Extras, dann Stapelverarbeitung und dann Spektrales Binning aus.
2. Um das endgültige Binning-Sheet für die statistische Analyse zu generieren, wählen Sie den Ordner aus, der alle baseline-korrigierten Spektraldateien enthält, nachdem Sie auf Spektral-Binning geklickt haben.
3. Teilen Sie die Spektren in eine festgelegte Anzahl gleich großer Bins mit einer definierten spektralen Breite auf, die von 0,01 bis 0,04 ppm reicht (kann gemäß der Studie optimiert werden). Dieser Prozess vereinfacht und organisiert die Spektraldaten und ermöglicht so eine konsistentere Analyse. Geben Sie die Bucket-Größe zusammen mit den ppm-Werten für Start und Ende an und legen Sie den Ordner fest, in dem die Ausgabe-Binning-Blätter gespeichert werden.
4. Die chemischen Verschiebungsbereiche, die Wasser und dem Lösungsmittel TSP entsprechen (4,8-5,2 und 0,0-0,7 ppm), sind auszuschließen, um spektrale Interferenzen^{zu vermeiden} 42,43,44.
5. Diese Tabelle enthält die Stichprobennamen in einer Zeile und die verschiedenen Klassenwerte zusammen mit ppm in den anderen Zeilen. Bevor Sie dieses Blatt für die statistische Analyse verwenden, ändern Sie es, indem Sie die Stichproben für die Analyse in Gruppen organisieren und nur im CSV-Format (Comma-Limited) speichern.
   HINWEIS: Beim Vergleich der milden Gruppe mit der moderaten Gruppe von ARDS-Patienten haben wir beispielsweise die Daten mit leichten und mittelschweren Beschriftungen versehen, eine Seriennummer hinzugefügt und die Datei im CSV-Format gespeichert.

5. Statistische Analyse

HINWEIS: Das Binning-Sheet, das Sie im vorherigen Schritt erhalten haben, dient als Eingabedatei für die statistische Analyse. In dieser Studie wurde das Modul für die statistische Analyse (ein Faktor) der statistischen Analysesoftware für die Metabolomik verwendet.

1. Führen Sie vor der statistischen Analyse den Normalisierungsschritt mit Summe, Logarithmus und Pareto durch, der jedoch in verschiedenen Studien variieren^{kann 45}.
2. Führen Sie univariate und multivariate Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu unterscheiden und die Genauigkeit der identifizierten Metaboliten zu bestimmen.
   1. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA), eine partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) und eine orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) durch, um die Unterscheidung zwischen den Gruppen zu beobachten, die für jeden Metaboliten, der für den Unterschied im Stoffwechselprofil verantwortlich ist, zu VIP-Werten (Variable Importance of Projection) führt.
   2. Führen Sie univariate Methoden durch, wie z. B. den studentischen t-Test und die ANOVA, um die signifikanten Metaboliten auf der Grundlage des Kriteriums eines p-Werts von weniger als 0,05 zu identifizieren. Beide Tests liefern Box-Whisker-Diagramme, die den Unterschied in der relativen Konzentration der Metaboliten zeigen.
   3. Führen Sie eine Biomarker-Analyse durch, die einen Bereich unter dem AUROC-Diagramm (Receiver Operating Characteristic Curve) ergibt. Der AUC-Wert (Fläche unter der Kurve) > 0,8 gilt als signifikant⁴⁶.
   4. Wählen Sie die endgültige Liste der signifikanten Metaboliten anhand der Kriterien VIP-Score>1, Bonferroni-korrigierter p-Wert<0,05⁴⁴ und AUC > 0,8⁴⁶ aus.
3. Identifizieren Sie die Metaboliten wie unten beschrieben.
   1. Binning liefert signifikante Metaboliten in Form von ppm-Werten anstelle von Namen. Identifizieren Sie die Metaboliten, die bestimmten ppm-Werten entsprechen, mithilfe von Datenbanken wie der Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB)⁴⁷und der Human Metabolome Database (HMDB).
   2. Verwenden Sie außerdem bereits veröffentlichte Literatur^42,44 zur Identifizierung und Validierung.
   3. Verwenden Sie das Profiler-Modul der NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware, um die identifizierten Metaboliten mit ihren ppm-Werten zu bestätigen.

6. Quantifizierung von Metaboliten mit Hilfe von NMR-Software zur Quantifizierung von Metaboliten

HINWEIS: Das Profiler-Modul der Software wird häufig verwendet, um die identifizierten Metaboliten zu quantifizieren.

1. Bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen, kalibrieren Sie die für die Studie ausgewählte Referenzsubstanz (in dieser Studie verwendeter TSP) mit dem Prozessormodul. Klicken Sie auf die Option CSI kalibrieren (chemischer Formindikator). Nennen Sie die Konzentration der Referenzverbindung (0,05 mM für diese Studie). Ziehen Sie dann den Software-Peak auf den spektralen Referenzpeak und passen Sie dessen Höhe und Breite richtig an. Sobald die spektralen Referenzpeaks mit dem Peak der Software übereinstimmen, klicken Sie auf Akzeptieren.
2. Öffnen Sie die gewünschten Spektren im Profiler-Modul und wählen Sie die entsprechende Verbindungsbibliothek für die Studie aus.
3. Am unteren Rand des Bildschirms wird eine Liste der Metaboliten angezeigt. Wählen Sie den gewünschten Metaboliten aus dieser Liste aus. Nach der Auswahl erscheinen die möglichen ppm des gewählten Metaboliten in der oberen Ecke der Spektren.
4. Wählen Sie den ppm-Wert in der oberen Ecke aus und zoomen Sie in die Spektren auf die spezifische ppm-Skala des Metaboliten.
5. An diesem Punkt erscheinen zwei Peaks auf dem Bildschirm: Einer stellt die aufgezeichneten Daten dar und der andere, der als gepunktete Linie dargestellt wird und den Software-Peak darstellt. Richten Sie beide Spitzen aus. Ziehen Sie den Software-Peak und passen Sie seine Höhe und Position an den im Sample vorhandenen Peak an.
6. Nach der richtigen Ausrichtung kann die Konzentration des Metaboliten aus dem Wert ermittelt werden, der unter der Überschrift Konzentration in mM für diesen Metaboliten angezeigt wird (Abbildung 1).
7. Befolgen Sie das gleiche Verfahren für alle Metaboliten und Proben und exportieren Sie die quantifizierten Werte in eine Tabelle. Um die Ausgabedatei zu generieren, klicken Sie im Menü Extras auf die Option Batch-Operationen. Geben Sie den gewünschten Ordner zum Speichern der Ausgabedatei an.

7. Analyse des Signalwegs

HINWEIS: Die nach der Analyse identifizierten signifikanten Metaboliten werden verwendet, um die Hauptsignalwege zu bestimmen, die das Ergebnis in Krankheitsgruppen direkt beeinflussen. Hierfür werden in der Regel das Modul Signalweganalyse der statistischen Analysesoftware Metabolomics und die Datenbank KEGG eingesetzt.

1. Geben Sie die erhaltene Liste der signifikanten Metaboliten in das Modul ein. Es wird eine Liste mit den Namen der Pfade generiert.
2. Wählen Sie die endgültigen Pfade basierend auf dem Kriterium eines Impact-Faktors größer als 0,1 aus. Signifikante Wirkungswerte deuten auf krankheitsbezogene Signalwege^{hin 30}.
3. Analysieren Sie die resultierenden Signalwege gründlich, um die mit der Schwere der Erkrankung verbundene Dysregulation aufzuklären. Einer der Nachteile dieser Methode ist ihre Ineffizienz bei der Identifizierung der fehlregulierten Signalwege, wenn die signifikanten Metaboliten weniger als 3 betragen.
4. Um dies zu bewältigen, kann der identifizierte Metabolit und seine Korrelation mit dem Schweregrad der Erkrankung auch anhand der zuvor veröffentlichten Literatur bestimmt werden. Führen Sie eine gründliche Literaturrecherche durch und beobachten Sie, ob der identifizierte Metabolit auch dem gleichen Trend folgt, der Ihren Interessen entspricht.

Abbildung 1: Grundlegende Schritte in der NMR-basierten Metabolomik. Die Abbildung zeigt die wichtigsten Schritte der NMR-basierten Metabolomik: Entnahme und Aufbereitung von Proben, Durchführung der NMR-Spektroskopie, Vorverarbeitung von Daten, Durchführung statistischer Analysen, Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten und Interpretation der biologischen Signifikanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Results

Um eine Metabolomik-Studie durchzuführen, ist es wichtig, die Stichprobengröße und die spezifischen Gruppen zu bestimmen, die analysiert werden sollen. Die Auswahl einer angemessenen Stichprobengröße ist unerlässlich, um signifikante Ergebnisse zu erhalten, die genau mit dem Schweregrad der Erkrankung korrelieren⁴⁸. In dieser speziellen Arbeit haben wir jedoch eine kleine Stichprobengröße verwendet, um die Schritte bei der Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten mit Hilfe der NMR-basierten Metabolomik zu demonstrieren, die in erster Linie als Referenz gedacht war. In dieser Studie untersuchten wir die metabolischen Unterschiede zwischen Patienten im leichten und mittelschweren Stadium des ARDS am Tag 1 ihrer Aufnahme auf die Intensivstation, an denen insgesamt 8 Probanden teilnahmen. Gemäß dem Protokoll wurden die NMR-Spektren aller Proben erfasst und verarbeitet, und schließlich wurde eine Tabelle mit den Binning-Ergebnissen erstellt.

Anschließend führten wir eine strenge statistische Analyse durch, bei der die Binning-Sheets als Eingabedateien verwendet wurden, wobei die Daten mit Summe, Protokoll und Pareto normalisiert wurden. Wir führten PCA (Abbildung 2A) und OPLS-DA (Abbildung 2B) durch, wobei erstere eine Clusterbildung zeigten, letztere jedoch eine klare Unterscheidung zwischen den Gruppen aufwies und metabolische Unterschiede hervorhob. Die statistische Analyse des Permutationstests (20x) ergab Werte von R2Y = 0,99 und Q2 = 0,47. Anschließend führten wir einen studentischen t-Test (Abbildung 2C) und eine Biomarker-Analyse (Abbildung 2D) durch, um fehlregulierte Metaboliten zu identifizieren. Den im Protokollabschnitt beschriebenen Kriterien folgend, filterten wir die Ergebnisse nach den signifikanten Metaboliten (Tabelle 2).

Abbildung 2: Multivariate und univariate Analyse. (A) Hauptkomponentenanalyse (PCA) und (B) Orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) von milden ARDS-Patienten (dargestellt durch rote Farbe) und moderaten ARDS-Patienten (dargestellt durch grüne Farbe). (C) Die Box-cum-Whisker-Diagramme verdeutlichen die Unterschiede in der relativen Konzentration von Metaboliten zwischen leichten und mittelschweren ARDS-Patienten, die mittels Protonenkernspinresonanzspektroskopie in Serumproben nachgewiesen wurden. Die x-Achse stellt die Studiengruppen dar, und die y-Achse zeigt die relative Konzentration, wenn leichte ARDS-Patienten (dargestellt durch rote Farbe) und mittelschwere ARDS-Patienten (dargestellt durch grüne Farbe) am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation verglichen wurden. (D) Das Diagramm der Fläche unter der Kurve (AUC) mit signifikanten Metaboliten, die den Schweregrad vorhersagen, erhalten nach Durchführung einer Biomarker-Analyse zum Vergleich von leichten und mittelschweren ARDS-Patienten am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

S.No.	Name	Spektrale Lage (ppm)	p-Wert	VIP	AUC-Wert
1	Lactat	1.34	0.04	1.99	1
2	Isoleucin	1.42	0.03	2.01	0.875

Tabelle 2: Liste signifikanter Metaboliten, die nach dem Vergleich von leichten und mittelschweren ARDS-Patienten am Tag 1 der Aufnahme auf die Intensivstation erhalten wurden.

Da die Ergebnisse in ppm-Werten erhalten wurden, haben wir die Metaboliten anhand der bisherigen Literatur zugeordnet und mit dem Profiler validiert. Nach der Zuordnung wurden Laktat und Isoleucin als signifikante Metaboliten erhalten, die auch in einigen früheren ARDS-Studien berichtet wurden^30,40. Wir stellten sicher, dass gut aufgelöste, nicht überlappende Peaks ausgewählt wurden. Nach der Identifizierung filterten wir die Liste der signifikanten Metaboliten anhand der im Protokoll genannten Kriterien. Anschließend quantifizierten wir die interessierenden Metaboliten mit dem Profiler-Modul, indem wir die Spektren öffneten, nach dem interessierenden Metaboliten suchten und den Software-Peak an den in den Spektren erhaltenen Peak anpassten. Daraus ergaben sich die quantifizierten Werte der Metaboliten in mM. Als Referenz wurde eine Tabelle mit Probennamen, Metabolitennamen und Konzentrationen erstellt. Nach der Quantifizierung mit der Software kann eine Validierung durch andere Ansätze, wie z.B. Proteomik, durchgeführt werden.

Darüber hinaus werden die identifizierten Metaboliten gründlich analysiert, um ihre Korrelation mit der Schwere der Erkrankung zu bestimmen und die biochemischen Signalwege zu identifizieren, an denen diese Metaboliten aktiv beteiligt sind. Da nach Anwendung der im Material- und Methodenabschnitt genannten Kriterien nur zwei signifikante Metaboliten identifiziert werden konnten, war eine Signalweganalyse mit der Software nicht möglich. Daher wurde eine gründliche Literaturrecherche durchgeführt, um die gestörten Stoffwechselzyklen hervorzuheben. Die beiden in dieser Studie identifizierten Metaboliten korrelierten erfolgreich mit dem Schweregrad von ARDS. Erhöhtes Laktat bedeutete Lungenentzündung und anaerobe Atmung, während erhöhtes Isoleucin auf Proteinkatabolismus hindeutete, der mit Lungenverletzungen, Infektionen und Energiestoffwechsel verbunden war⁴⁰. Das Verständnis dieser Stoffwechselwege dient einem doppelten Zweck. Zum einen zeigt es die Komplexität der Krankheit auf und gibt Einblicke in ihre biologischen Mechanismen. Zweitens unterstützt es den therapeutischen Fortschritt, indem es Ärzte bei der Anpassung von Behandlungen an Patienten anleitet und letztendlich die klinischen Ergebnisse verbessert.

Discussion

Die Metabolomik identifiziert und quantifiziert effizient Metaboliten und zielt auf die Stoffwechselzyklen ab, die während der Krankheit gestört werden. Die Qualität der Ergebnisse hängt von der sorgfältigen Ausführung jedes Schritts im Metabolomik-Ansatz ab. Jede Phase, von der Probenauswahl und -entnahme bis zur Identifizierung des Signalwegs, ist entscheidend für die genaue Identifizierung der Hauptfaktoren, die zur Krankheit beitragen. Vor der Durchführung von Metabolomics ist eine gründliche Überprüfung der Literatur unerlässlich, und in jeder Phase muss sorgfältig darauf geachtet werden.

Bei der Konzeption einer Metabolomik-Studie ist die Auswahl einer Probe entscheidend, um signifikante Informationen zu extrahieren und eine ideale Probenvorbereitung zu gewährleisten, unabhängig davon, ob es sich um ein gezieltes oder ungezieltes metabolisches Fingerprinting des betreffenden klinischen Zustands handelt. Die ordnungsgemäße Verarbeitung der Erstprobe ist von entscheidender Bedeutung, und die Protokolle sollten während der gesamten Studie für alle Proben konsequent befolgt werden⁴⁹. Bei der Arbeit mit klinischen Proben ist besondere Vorsicht geboten. Zu den häufig verwendeten Proben für die NMR-basierte Metabolomik gehören Bioflüssigkeiten, Zellextrakte und Gewebeextrakte^50,51. Liquor cerebrospinalis (CSF) und Urin erfordern oft eine minimale Vorbehandlung und werden häufig in Kontexten wie Nierenerkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen und Arzneimitteltoxizität untersucht. Vollblut, Plasma und Serum liefern umfassende Informationen für ein breites Spektrum kritischer Erkrankungen und werden aufgrund der einfachen Entnahme bevorzugt. Eine breite Palette anderer Bioflüssigkeiten, wie z. B. Samenflüssigkeit, Speichel, Galle, Dialyseflüssigkeit, Fruchtwasser, ausgeatmetes Atemkondensat, Lungenaspirate, Synovialflüssigkeit und Mini-bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (mBALF), wurden aufgrund ihrer Spezifität und Genauigkeit unter Verwendung von NMR 52,53,54 ausgiebig verwendet. Jedes Biofluid stellt seine Vorteile und Herausforderungen in Bezug auf Sammlung, Verfügbarkeit und Informationsgehalt dar, abhängig von der Studie oder dem Versuchsdesign⁵⁵. Wir haben uns für diese Studie auf Serumproben von ARDS-Patienten konzentriert, da Blutproben in der Regel Informationen auf Ganzkörperebene liefern und nicht signifikant von extremen täglichen Schwankungen beeinflusst werden. Auf der anderen Seite unterliegen Urinproben verschiedenen Schwankungen und können durch Ernährung, Lebensstil, Medikamente und Umweltfaktoren beeinflusst werden²⁷. Die richtige Lagerung der Proben ist auch wichtig, um enzymatische Aktivität oder mikrobiellen Abbau zu vermeiden. Die Proben werden in der Regel bei -80 °C mit minimalen Gefrier-Tau-Zyklen kryokonserviert, um einen Stoffwechselabbau zu verhindern und die Stabilität der Probe zu erhalten. Die Probe kann über einen längeren Zeitraum bei -80 °C gelagert werden, so dass NMR-Experimente bequem durchgeführt werden können. Für ein optimales Ergebnis ist es jedoch ratsam, das Experiment so früh wie möglich zu planen und durchzuführen.

In dieser Studie haben wir ein 800 MHz NMR-Spektrometer zur Datenerfassung eingesetzt, das hochauflösende Spektraldaten liefert. Für dieses Experiment haben wir uns an die gleichen Erfassungsparameter gehalten, die oben erwähnt wurden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die gleichen Erfassungsparameter, die in diesem Protokoll beschrieben sind, mit NMR-Spektrometern angewendet werden können, die bei anderen Magnetfeldstärken arbeiten. Die Anzahl der Scans kann erhöht werden, wenn bei einem niedrigeren Magnetfeld gearbeitet wird, um die Auflösung zu verbessern. Während höhere Feldstärken eine höhere Auflösung bieten können, bleiben die Kernaspekte des Erfassungsprozesses, wie z. B. Pulssequenzen, Relaxationsverzögerungen und Temperaturregelung, über verschiedene Geräte hinweg konsistent, wodurch die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse gewährleistet wird.

Die Einhaltung eines standardisierten Vorgehens ist unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Unparteilichkeit zu wahren, da Abweichungen die spätere Datenanalyse und -auswertung behindern können. Jeder Schritt der NMR-Experimente muss akribisch durchgeführt werden, da die Qualität der Spektren von ihnen abhängt. Besonderes Augenmerk sollte auf das Shimming gelegt werden, da es die Peakform definiert, und die Erfassungsparameter sollten entsprechend dem Proben- und Studiendesign optimiert werden. Bei Proben mit geringer metabolischer Konzentration in der Probe kann die Anzahl der Scans erhöht werden. Die Datenerfassung in der NMR beinhaltet eine Standardoptimierung sowohl von 1D- als auch von 2D-Experimenten, die auf die Wahl der Probe und die spezifisch benötigten Informationen zugeschnitten ist. Verschiedene NMR-Experimente wurden optimiert, um qualitativ hochwertige Spektren aus Bioflüssigkeiten zu erhalten und die Auswirkungen unerwünschter Makromoleküle zu minimieren. Die CPMG-Pulssequenz⁵⁶ wird bevorzugt für Proben wie Serum, Plasma oder Liquor cerebrospinalis verwendet. Diese Technik unterdrückt die breiten Signale von Makromolekülen wie Lipiden und Proteinen, die lange transversale Relaxationszeiten haben und die Resonanzen von Metaboliten mit niedrigem Molekulargewicht verdecken können.

Die Datenvorverarbeitung umfasst die Zwischenmethoden, mit denen eine einheitliche und homogene Datenanalyse und deren Interpretation sichergestellt wird. Dazu gehört die Vermeidung unerwünschter Signale oder inkonsistenzanfälliger Spektralbereiche sowie die Korrektur von Peak-Shifts. In Bioflüssigkeiten bedeutet der Ausschluss unerwünschter Bereiche oft, Signale wie die aus Wasser zu entfernen, die den Bereich von 4,6 ppm bis 5 ppm dominieren. Peak-Shifts, die durch Schwankungen des pH-Werts, der Temperatur, der Salzkonzentration, der Verdünnungsfaktoren und der Ionenzusammensetzung verursacht werden, können durch die Verwendung von Puffern bei einem homöostatischen pH-Wert minimiert werden. Darüber hinaus kann die Verwendung von Standardreferenzverbindungen, Peak-Alignment und Binning dazu beitragen, Peak-Shifts zu reduzieren. Die Ausrichtung der Peaks ist entscheidend, um Muster über verschiedene Spektren hinweg zu korrelieren, die unter identischen Bedingungen aufgenommen wurden.

Die Spektrenverarbeitung muss ordnungsgemäß durchgeführt werden, um später in der Analyse ein genaues Binning zu gewährleisten. Alle Spektren sollten gleichmäßig kalibriert und ausgerichtet werden, und Basis- und Phasenkorrekturen können manuell oder automatisch durchgeführt werden. Die richtige Phasen- und Basiskorrektur sowie die Kalibrierung sind von entscheidender Bedeutung. Die Durchführung einer Baseline-Korrektur ist unerlässlich, um Verzerrungen zu vermeiden, die die Identifizierung und Quantifizierung von Metaboliten beeinträchtigen können⁵⁷. Eine Phasenkorrektur ist notwendig, um sicherzustellen, dass keine verzerrten oder invertierten Peaks die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen können. Entscheiden Sie sorgfältig über die Kriterien für die Auswahl signifikanter Metaboliten und filtern Sie die Ergebnisse entsprechend. Da das Binning Ergebnisse in Form von ppm-Werten liefert, können Sie den Namen des Metaboliten anhand verschiedener im Protokoll erwähnter Quellen genau identifizieren. Wenn mehrere Metaboliten mit denselben ppm-Werten vorhanden sind, sind sie durch die Peakform zu identifizieren.

Vor der Durchführung der statistischen Analyse wird eine Normalisierung durchgeführt, um Schwankungen im Datensatz zu reduzieren, unabhängig davon, ob sie induziert oder nicht induziert sind, aufgrund von Unterschieden in der Größe und Schwankungen der Metabolitenkonzentrationen. Dieser Prozess umfasst verschiedene Methoden der Zentrierung, Skalierung und Transformation, die basierend auf der Verteilung und Variabilität der Daten ausgewählt werden. Ziel ist es, unerwünschte systematische Verzerrungen zu minimieren und gleichzeitig die biologischen Faktoren von Interesse zu erhalten. Multivariate Methoden, einschließlich PCA, PLS-DA und OPLS-DA, werden verwendet, um differentielle Metaboliten mit VIP-Werten größer als 1 zu ermitteln. Die Vorhersagbarkeit des Modells und die Kreuzvalidierung werden anhand der Werte R2 (Güte der Anpassung) und Q2 (Güte der Vorhersage) bestimmt, während die Permutationsteststatistik das Modell validiert. Eine auf Korrelation basierende Pearson-Heatmap bewertet die Robustheit des Modells, indem sie hoch- und herunterregulierte Metaboliten in Subphänotypen und die daraus resultierenden Endotypen aufzählt.

Univariate Methoden wie der Student t-Test und ANOVA, wie die Bonferroni-Korrektur oder die Minimierung von FDR (False Discovery Rate) und Benjamini-Hochberg, werden verwendet, um die Wahrscheinlichkeit von falsch positiven Ergebnissen zu verringern. Diese Methoden liefern ein grobes Maß für potenziell wichtige Merkmale, unabhängig von ihrer Korrelation innerhalb oder zwischen Molekülen und anderen Störfaktoren. Anhand eines p-Wertes von weniger als 0,05 werden signifikante Metaboliten identifiziert, die dann zur Untermauerung der metabolischen Endotypen in den Ergebnisuntergruppen⁴⁵ verwendet werden.

Einzelne Box-Whisker-Plots und AUROC werden verwendet, um die Spezifität und Sensitivität der Endotypen in den Ergebnis-Subgruppen zu bewerten. Der klinische Score wird mit dem Modell in AUROC kombiniert, um die Genauigkeit des Modells zu validieren. Der AUC-Wert > 0,8 gilt als signifikant⁴⁶. Verschiedene andere Tests sind online verfügbar, um die Genauigkeit der Unterscheidung und Wirksamkeit der identifizierten Metaboliten zu testen. Einige davon sind die Klassifizierung von zufälligen Wäldern, Heatmaps, Korrelationen ^usw.45.

Verschiedene Ansätze werden verwendet, um signifikante Metaboliten zu quantifizieren, einschließlich der Peak-Integration, die für Anfänger aufgrund ihres fortgeschrittenen Charakters eine Herausforderung darstellen kann. Identifizieren Sie charakteristische Peaks für Metaboliten, indem Sie sich auf einzelne chemische Verschiebungen beziehen, um eine genaue Identifizierung zu ermöglichen. Bestimmen Sie die Fläche dieser charakteristischen Peaks relativ zur Fläche des Referenzpeaks TSP. Um die absolute Konzentration eines Metaboliten (Cm) zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Dabei ist Cr die Konzentration der Referenzverbindung (TSP) in der Lösung, Im und Ir sind die integrierten Peakbereiche (können mit einem NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeug erhalten werden) des Metaboliten bzw. der Referenz (TSP) und nm und nr die Anzahl der Protonen, die den Metaboliten bzw. den Referenzpeak repräsentieren,²⁴.

Alternativ wird eine automatisierte NMR-Metaboliten-Quantifizierungssoftware verwendet, um Metabolitenkonzentrationen für einzelne oder mehrere Spektren basierend auf der Konzentration des Referenzstandards TSP zu erhalten. Die Quantifizierung mit Software vereinfacht den Prozess und verringert die Wahrscheinlichkeit von Fehlern im Vergleich zu anderen Methoden. Während diese Forschungsarbeit die Verwendung von Software zur Quantifizierung von Metaboliten hervorhebt, kann es zu Problemen kommen, wenn der interessierende Metabolit nicht in der Softwarebibliothek vorhanden ist. Darüber hinaus wird die Software kostenpflichtig, so dass nur Forscher mit einer autorisierten Lizenz sie verwenden können.

Die Metabolomik hat sich als hilfreich erwiesen, um die Komplexität verschiedener Krankheiten zu entschlüsseln, indem sie dysregulierte Stoffwechselzyklen identifiziert, die zur Schwere der Krankheit beitragen. Die Umsetzung dieser Erkenntnisse in die klinische Praxis war jedoch eine Herausforderung. Die medizinische Gemeinschaft legt nun den Schwerpunkt auf einen personalisierten Medizinansatz, um die Krankheitsergebnisse zu verbessern. Während die Identifizierung von fehlregulierten Metaboliten bisher ausreichend war, konzentrieren sich die aktuellen Bemühungen auf eine präzise Quantifizierung, um krankheitsspezifische Bereiche zu definieren. Diese Informationen sind für Ärzte von unschätzbarem Wert bei der Anpassung von Behandlungsstrategien. Die Fortschritte bei den Quantifizierungstechniken haben die Forschungsbemühungen erleichtert, wobei zahlreiche Forschungsgruppen weltweit diese Ansätze erfolgreich mit spezieller Software einsetzen.

Dieser Fortschritt unterstreicht das Potenzial der Metabolomik, die personalisierte Medizin erheblich zu beeinflussen und die klinischen Ergebnisse zu verbessern. Darüber hinaus verspricht die Integration von Metabolomik-Daten mit anderen Omics-Daten, wie z. B. Genomik und Proteomik, ein umfassenderes Verständnis der Krankheitsmechanismen zu ermöglichen und therapeutische Interventionen weiter zu verfeinern. Mit der Weiterentwicklung der Technologie wird erwartet, dass die Präzision und der Nutzen der Metabolomik im klinischen Umfeld zunehmen und den Weg für effektivere und personalisiertere Lösungen im Gesundheitswesen ebnen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR-Suite	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Kanada		Software zur Quantifizierung von NMR-Metaboliten
Co-axialer Einsatz	Sigma aldrich	Z278513
Deuterimoxid	Sigma aldrich	151882
Eppendorf Röhrchen	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Research Group		Metabolomics statistische Analysesoftware
NMR-Röhrchen	Wilmad	Z412007	5mm Durchmesser
Pipette	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μ l
Fläschchen für die Probenentnahme	Tarsons Kryo-Kühlfläschchen	523194
Natriumazid	Sigma aldrich	S2002
Natriumchloridkristall	Sigma aldrich	S9625
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma aldrich	567550
Natriumphosphat monobasisch	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Bruker		NMR-Verarbeitungs- und Analysewerkzeug
Tsp-Salz	Sigma aldrich	269913