Enthüllung von Histon-Proteoformen mit 2D-TAU-Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Diese Methode beschreibt eine einfache und schnelle Strategie zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen.

Zusammenfassung

Histone durchlaufen verschiedene posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Acylierung und Ubiquitinierung, die die Nukleosomendynamik steuern und das Zellschicksal bestimmen. Das Nukleosom, das die funktionelle Einheit des Chromatins darstellt, besteht aus DNA, vier Paaren von Histonen (H3, H4, H2A und H2B), die den globulären Kern bilden, und dem Linker-Histon H1, das die Chromatinstruktur stabilisiert. Die Amino(N)-terminalen Schwänze der Histone ragen aus den kugelförmigen Kerndomänen heraus und durchlaufen unterschiedliche PTMs, die die Chromatinlandschaft beeinflussen. Einige Hinweise deuten darauf hin, dass die Histon-PTM-Homöostase für die Erhaltung aller physiologischen Aktivitäten von entscheidender Bedeutung ist. Die Deregulierung von Histon-PTMs ist die Hauptursache für abnormale zelluläre Proliferation, Invasion und Metastasierung. Daher ist die Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Histon-PTMs von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir eine effektive Technik zur Isolierung und Analyse von Histon-Isoformen. Die Methode, die auf der Kombination von zwei orthogonalen Trennungen basiert, ermöglicht die Anreicherung von Histon-Isoformen und die anschließende massenspektrometrische Identifizierung. Die Technik, die ursprünglich von Shechter et al. beschrieben wurde, kombiniert Säure-Harnstoff-Polyacrylamid-Gele (TAU-GEL), die basische Histonproteine basierend auf Größe und Ladung trennen können, und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gele (SDS-PAGE), die Proteine nach Molekulargewicht trennen können. Das Ergebnis ist eine zweidimensionale Karte der Histon-Isoformen, die sich für den In-Gel-Aufschluss eignet, gefolgt von der massenspektrometrischen Identifizierung und der Western-Blot-Analyse. Das Ergebnis ist eine zweidimensionale Karte der Histon-Isoformen, die sowohl für den In-Gel-Aufschluss gefolgt von der massenspektrometrischen Identifizierung als auch für die Western-Blot-Analyse geeignet ist. Dieser proteomische Ansatz ist eine robuste Methode, die die Anreicherung einer einzelnen Histon-Isoform und die Charakterisierung neuer Histon-PTMs ermöglicht.

Einleitung

Der Beginn, das Fortschreiten und die Chemoresistenz von Krebs hängen mit genetischen und epigenetischen Ereignissen zusammen, einschließlich Histon-PTMs. Histone durchlaufen eine Vielzahl von PTMs, die die Chromatindynamik regulieren und das Zellschicksal bestimmen¹.

Das Nukleosom ist die funktionelle Einheit des Chromatins und ist ein molekularer Komplex aus DNA und Proteinen, der es ermöglicht, DNA in den Zellkern zu packen. Es besteht aus vier Paaren von Histonen (H3, H4, H2A und H2B), die den Nukleosomenkern bilden, sowie dem Linker-Histon H1, das zur Stabilisierung der Chromatinstruktur beiträgt. Die Amino-(N)-terminalen Schwänze der Histone ragen aus ihren kugelförmigen Kerndomänen heraus und durchlaufen spezifische posttranslationale Modifikationen, die die Chromatinlandschaft beeinflussen².

Bisher sind mindestens 23 Klassen von Histon-PTMs bekannt. Bei diesen PTMs handelt es sich um kovalente Modifikationen, die hauptsächlich aus Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitylierung, SUMOylierung und ADP-Ribosylierung^{bestehen 3}. Darüber hinaus wurde kürzlich eine enge Korrelation zwischen der Epigenomhomöostase und der metabolischen Neuverdrahtung vorgeschlagen, was das exponentielle Wachstum der möglichen Anzahl von Histonen PTMs 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 erklärt . Histon-PTMs, die von Modifikatorenzymen abgeschieden, gelöscht und transduziert werden, werden jeweils als Writer, Eraser und Reader bezeichnet. Sie beeinflussen die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Chromatinstruktur und beeinflussen das Genexpressionsprofil, einschließlich der Expression von Tumorsuppressorgenen und Onkogenen 14,15,16.

Die Anzahl der Histon-Proteoformen nimmt zu, wenn sie als Histonvarianten in das Nukleosom eingebaut werden. Diese Varianten sind nicht-allelische Isoformen von kanonischen Histonen und erhöhen die Komplexität, indem sie die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Chromatins verändern. Im Vergleich zu kanonischen Histonen weisen Histonvarianten funktionelle Domänen auf, die einzigartige posttranslationale Modifikationen durchlaufen oder mit spezifischen Chromatinkomponenten interagieren, was sich auf die Dynamik und Stabilität des Nukleosoms auswirkt¹⁷.

In Krebszellen beeinflusst die Deregulierung von Histon-PTMs und -Varianten das Genexpressionsprofil, was zu einer abnormalen zellulären Proliferation, Invasion, Metastasierung und Aktivierung von Arzneimittelresistenzwegen führt 3,18,19,20. Mutationen in Histonen oder Chromatin-Remodeling-Komplexen können den Zellphänotyp verändern und zur neoplastischen Transformation beitragen. Die Akkumulation epigenetischer Veränderungen, wie z. B. der Histonmethylierung, ist ein Schlüsselfaktor bei der Aktivierung von Arzneimittelresistenzwegen 21,22,23. Mutationen innerhalb des SWI/SNF-Komplexes, der aus 15 Untereinheiten besteht, die von 29 Genen kodiert werden, betreffen über 20 % der menschlichen Krebserkrankungen bei vielen Tumorarten. In den letzten zehn Jahren wurden epigenetisch basierte Arzneimittelstrategien (Epi-Drugs) entwickelt, und viele Medikamente, die auf Krebs mit abnormalen Histon-Modifikationsmustern abzielen, wurden von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) ^zugelassen23.

Die Analyse von Histonproteinen ist eine große Herausforderung und damit ein anspruchsvolles Forschungsgebiet. In jüngster Zeit haben sich massenspektrometrische Methoden zur bevorzugten Methode zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen entwickelt. Die drastischen Extraktionsbedingungen in Kombination mit der schlechten Löslichkeit einiger Varianten und der hohen Sequenzhomologie machen ihre Analyse jedoch zu einer Herausforderung.

In den letzten zehn Jahren wurden mehrere massenspektrometrische Methoden für die Erstellung und Untersuchung von Histonprofilen entwickelt 24,25,26,27. In dieser Studie stellen wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode vor, um eine zweidimensionale Karte von Histon-Proteoformen zu erstellen, die die Chancen auf die Entdeckung neuer posttranslationaler Modifikationen erhöhen kann.

Die 2D-TAU-Elektrophorese kombiniert die Trennung unter sauren Bedingungen mit SDS PAGE. In der ersten Dimension gibt der saure Zustand des Mediums den basischen Proteinen eine positive Nettoladung. Da Histone sehr basische Proteine sind und im Vergleich zum Medium einen höheren isoelektrischen Punkt (pH) haben, werden sie positiv geladen und wandern unter einem elektrischen Feld. In der zweiten Dimension werden Histone mittels SDS denaturiert und anhand ihres Molekulargewichts getrennt. Die resultierende 2D-Karte kann als Werkzeug zur Anreicherung spezifischer Proteoformen mit Einzelpunktauflösung für massenspektrometrische Analysen und immunologische Studien verwendet werden^28,29. Nach der Elektrophorese können 2D-TAU-Spots entfärbt, mit Trypsin verdaut und mittels Massenspektrometrie analysiert werden. Alternativ kann die 2D-TAU-Karte auf einen Nitrozellulose/PVDF-Filter geblottet und durch Immunfärbung untersucht werden²⁷.

In diesem Zusammenhang könnten die Methoden strategisch sein, um die Identifizierung und Analyse neuer posttranslationaler Modifikationen, die mit metabolischer Neuverdrahtung korrelieren, zu verbessern^30,31.

Wir haben die ursprüngliche Methode weiter verbessert, indem wir einen Ultraschallschritt eingebaut haben, der für den DNA-Abbau und die Verbesserung der Proteinlöslichkeit hilfreich ist. Darüber hinaus haben wir den Inkubationsschritt für die Histonextraktion verlängert, um eine Proteinprobe mit hoher Reinheit zu erhalten. Darüber hinaus haben wir in unserem Protokoll die erste Dimension über einen längeren Zeitraum bei niedriger Spannung laufen lassen, um eine bessere Auflösung zu erreichen. Das resultierende Gel wurde zur Untersuchung kanonischer Histone PTMs und zur Charakterisierung neuartiger Modifikationen wie der Glykation^{verwendet 10,32}.

Insgesamt haben wir eine Methode zur Extraktion und Reinigung von Histonen entwickelt, gefolgt von der Auflösung von Histon-Proteoformen mit Hilfe einer zweidimensionalen Karte. Die Arbeit umfasst auch ein Verfahren zum In-Gel-Aufschluss für die massenspektrometrische Analyse und die Schritte zur zweidimensionalen Western-Blot-Analyse.

Protokoll

1. Histon-Extraktion

1. Führen Sie eine Histonextraktion aus mindestens 1 x 10⁶ Zellen durch, die zu 80 % konfluent sind. Für dieses Experiment haben wir MCF-10A-Zelllinien von ATCC verwendet. Nach dem Plattieren die Zellen dreimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1x waschen. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus.
2. Bereiten Sie einen Zelllysepuffer vor, der 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂ enthält. Fügen Sie kurz vor Gebrauch 1 mM Dithioerythrit sowie Protease- und Phosphatasehemmer hinzu.
3. Geben Sie 800 μl Zelllysepuffer in die zellhaltige Petrischale, kratzen und sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen, dann inkubieren Sie sie auf einem Rotator bei 300 U/min und 4 °C für 1 h.
4. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g, 4 °C, für 10 min in einer vorgekühlten Mikrozentrifuge mit einem Rotator für 1,5 mL Röhrchen.
5. Waschen Sie das Pellet mit 400 μl Zelllysepuffer und zentrifugieren Sie es bei 10.000 x g, 4 °C, für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
   HINWEIS: Verwenden Sie für alle Schritte eine vorgekühlte Mikrozentrifuge (4 °C) mit einem Rotator für 1,5-ml-Röhrchen. Behandeln Sie das Pellet vorsichtig, um Materialverlust zu vermeiden.
6. Das Pellet wird in 640 μl 0,2 M H₂SO₄ resuspendiert und auf einem Rotator bei 300 U/min bei 4 °C 16 h lang inkubiert.
   ACHTUNG: Schwefelsäure ist eine gefährliche Chemikalie; Bitte verwenden Sie es unter einem chemischen Abzug.
7. Zentrifugieren bei 16.000 x g, 4 °C, für 10 min. Füllen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und lagern Sie ihn bis zu den folgenden Schritten. Entsorgen Sie den nuklearen Schutt.
8. Haustone durch Zugabe von 212 μl Trichloressigsäure tropfenweise ausfällen (die Endkonzentration von TCA beträgt 33%). Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen 10x umdrehen. Inkubieren Sie 16 Stunden lang im Dunkeln auf Eis.
   ACHTUNG: TCA ist eine gefährliche Chemikalie; Verwendung unter einem chemischen Abzug.
9. Pellet-Histone durch Schleudern in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Pellet 3x mit 200 μL kaltem Aceton.
10. Resuspendieren Sie das Pellet mit kaltem Aceton und beschallen Sie es dann 2x mit 3 Zyklen von 30 s ein/aus, abwechselnd mit einer 10-minütigen Pause auf Eis.
    HINWEIS: Der Eingriff wurde mit einem Ultraschallgerät durchgeführt. Dieser Schritt ist wichtig, um histonumhüllte DNA zu eliminieren.
11. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 16.000 x g , verwerfen Sie das Aceton und resuspendieren Sie die Probe in 100 μl doppelt destilliertem Wasser. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Assay-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellers³³.
    HINWEIS: Nach dem Zentrifugieren erscheint das Pellet manchmal weiß oder durchscheinend. Ein weißer und undurchsichtiger Niederschlag könnte auf das Vorhandensein von Salzverunreinigungen hinweisen, die die 2D-Trennung beeinträchtigen könnten. Wenn ja, wiederholen Sie die Aceton-Waschschritte, bis das Pellet durchscheinend wird.
12. Lyophilisieren Sie 70 μg Histone gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie den Gefriertrockner für 60 Minuten auf 30 °C ein. Überprüfen Sie das Volumen des Röhrchens und wiederholen Sie den Schritt bei 30 °C, bis die Probe vollständig lyophilisiert ist (in der Regel sind 90 Minuten erforderlich, um die Probe vollständig zu lyophilisieren). Nach 60 Minuten ist die Lautstärke alle 10 Minuten zu überprüfen, da der Vorgang probenabhängig ist.
    HINWEIS: Wenn die Menge an Histonproteinen gering ist, beginnen Sie mit 2 x 10⁶ Zellen. Verwenden Sie in diesem Fall das gleiche Volumen an Reagenzien, das für 1 x 10⁶ Zellen verwendet wird. Überprüfen Sie die Reinheit aller Chemikalien, die während des Eingriffs verwendet werden. Alle Reagenzien müssen HPLC-Qualität haben.

2. Mini-2D-Gel-Tritonsäure-Harnstoff-Elektrophorese (TAU)

1. Bereiten Sie ein Mini-TAU-Gel für ein vertikales Mini-Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem vor, wie unten beschrieben.
   1. Trenngel vorbereiten: 6 M Harnstoff, 15 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1), 5 % Eissäureessig, 0,25 % Triton X-100 (v/v), 0,4 % TEMED (v/v), 0,1 % APS (p/v). Zur Herstellung der Lösung Harnstoff in Acrylamid/bis und 1 ml Reinstwasser unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur auflösen; Fügen Sie die anderen Komponenten hinzu und passen Sie die Lautstärke an. Bereiten Sie für ein Mini-TAU-Gel 10 ml Lösung vor. Füllen Sie die voreingestellten Gelplatten mit der Lösung, um die Bildung von Luftblasen in nur 1,5 cm Entfernung von oben zu vermeiden. Bedecken Sie die Lösung mit 1 ml Isopropanol, um das Gel auszugleichen.
   2. Stapelgel vorbereiten: 6 M Urea, 6 % Acrylamid/Bisacrylamid (29:1), 5 % Eissäureessig, 0,25 % Triton X-100 (v/v), 0,4 % TEMED (v/v), 0,1 % APS (p/v). Zur Herstellung der Lösung Harnstoff in Acrylamid/bis und 1 ml Reinstwasser auflösen; Fügen Sie die anderen Komponenten hinzu und passen Sie die Lautstärke an. Füllen Sie die Gelplatten mit Stapellösung, platzieren Sie einen 10-Well-Gelkamm zwischen den Platten und führen Sie ihn ein, bis die Gellösung auf halber Höhe der Zähne des Kamms ankommt. Lassen Sie das Gel 16 h bei 4 °C polymerisieren.
      HINWEIS: Führen Sie den Kamm vorsichtig ein, um die regelmäßige Bildung von Vertiefungen zu gewährleisten.
2. Bereiten Sie 100 μl TAU-Probenpuffer vor, indem Sie 6 M Harnstoff, 5 % Eissäureessig und doppelt destilliertes Wasser auflösen. Die lyophilisierte Probe wird in 30 μl TAU-Probenpuffer aufgelöst.
3. Füllen Sie die Minikassette mit TAU Laufpuffer, 5% Essigsäure-Endkonzentration. Spülen Sie die Wells des TAU-Gels mit einer mit Laufpuffer gefüllten Spritze und laden Sie die Probe mit einer Mikropipette in die Well.
4. Schließen Sie die elektrophoretische Kammer an die Stromversorgung an, wobei sich die positive (rote) Elektrode an der Unterseite befindet. Achten Sie darauf, dass die Proteine bei IP > pH-Wert positiv geladen sind, sodass die Migration von der positiven zur negativen Elektrode erfolgt. Lassen Sie das Gel zuerst 70 min lang bei 30 V laufen, dann 17 h lang bei der konstanten Spannung von 25 V.
   HINWEIS: Schalten Sie während dieser Zeit gelegentlich die Stromversorgung aus und spülen Sie die Gel-Wells mit einer Einwegspritze aus. Achten Sie darauf, dass Sie mit einer Spritze Blasen von der Unterseite des Gels entfernen, um den Verlust der Probe und das Vorhandensein von Verschmierungen in den aufgelösten Proteinen zu vermeiden.
5. Entfernen Sie das Gel von den Gelplatten und schneiden Sie die Linie von Interesse mit einem sauberen Skalpell ab. Gehen Sie vorsichtig mit dem Gel um, um einen Bruch des Gels zu vermeiden. Da die interessierende Linie farblos ist, laden Sie die Probe in Vertiefung Nummer 1, um die interessierende Spur genau zu identifizieren und zu schneiden.
   HINWEIS: Um die Trennung auf Mini-TAU-Gel zu überprüfen, bereiten Sie die Probe vor und führen Sie sie in doppelter Ausführung aus. Eines dieser Gele kann mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt werden. Das Trennungsmuster ist in Abbildung 1A dargestellt.
6. Waschen Sie die Bahn mit 15 mL 0,5 M Tris-HCl pH 8,8 für 15 min.
7. Bereiten Sie 15 ml Äquilibrierungspuffer 1 mit 6 M Harnstoff, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30 % Glycerin, 20 % SDS und 2 % Dithioerythrit vor. Bereiten Sie 15 ml Äquilibrierungspuffer 2 mit 6 M Harnstoff, 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 30 % Glycerin, 20 % SDS und 2 % Jodacetamid vor. Bereiten Sie die Äquilibrierungspuffer 1 und 2 unmittelbar vor der Verwendung vor; Lagern Sie den Äquilibrierungspuffer 2 im Dunkeln.
8. Die Gelbahn wird unter leichtem Rühren 15 Minuten lang in 10 ml Äquilibrierungspuffer 1 inkubiert, dann dekantiert. Inkubieren Sie die Gelbahn unter leichtem Rühren mit 10 mL Äquilibrierungspuffer 2 für 15 Minuten im Dunkeln und dekantieren Sie sie dann.
9. Bereiten Sie ein auflösendes SDS-Gel mit 15 % Acrylamid vor, indem Sie Tabelle 1 befolgen. Stellen Sie die Gelplatte auf und füllen Sie sie mit der auflösenden Gellösung. Füllen Sie die Lösung, bis sie 1,5 cm vom Ende der langen Gelplatte entfernt ist. Geben Sie 1 ml Isopropanol auf die Oberfläche, um das Gel zu nivellieren und polymerisieren zu lassen.
10. Nach der Gelpolymerisation das Isopropanol dekantieren und die Vertiefung mit 3MM Chr Cellulosechromatographiepapier trocknen. Führen Sie die resultierende Spur aus Schritt 8 in die Gelvertiefung ein.
11. Versiegeln Sie die Spur zum auflösenden Gel mit einer Versiegelungslösung von 0,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer und 5 μl 0,003 % Bromphenolblau. Lassen Sie die Agarosegelpolymerisation 30 min einwirken.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen während der Agaroseversiegelung, um ein Verschmieren des Gels zu verhindern.
12. Legen Sie die Gelplatten in die Kassette und füllen Sie sie mit 1x Tris/Glycin/SDS-Puffer. Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden erreicht. Entfernen Sie das Gel vorsichtig von den Platten, entsorgen Sie den Überschuss an Agarose und färben Sie das Gel mit einem Verfahren, das mit der Massenspektrometrie oder dem Blot für immunologische Assays kompatibel ist.

3. Silberfärbung ³²

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor - Fixiermittel: 50% Methanol, 5% Essigsäure, 45% deionisiertes Wasser; Waschlösung: 50 % Methanol, 50 % entionisiertes Wasser; Sensibilisator: 0,02 % Na₂S₂O₃ 5H₂O in deionisiertem Wasser; Silberreagenz: 0,1 % Silbernitrat in kaltem (4 °C) deionisiertem Wasser; Entwickler: 0,04 % Formalin und 2 % Na₂CO₃, Formaldehyd (37 %) (kurz vor Gebrauch hinzufügen) 0,4 mL deionisiertes Wasser und bis zu 1000 mL auffüllen; Stop-Reagenz: 5% Essigsäure; Gel-Aufbewahrungslösung: 1% Essigsäure.
   HINWEIS: Da Chemikalien, die zum Färben verwendet werden, gefährlich sind, führen Sie alle Schritte unter einem chemischen Abzug durch.
2. Befolgen Sie das Verfahren in Tabelle 2 mit den folgenden Überlegungen. Führen Sie alle Inkubationen unter sanftem Rühren durch. Bereiten Sie das Stoppreagenz vor, bevor Sie mit dem Entwicklungsschritt beginnen. Dies gewährleistet die Gelentwicklung mit der richtigen Intensität. Während des Entwicklungsschritts erscheinen Flecken als gelbe Signale, die am Ende der Inkubation hellbraun werden. Die Intensität der verschiedenen Spots hängt von der Menge der Histon-Proteoformen ab. Das Gel ist bereit für die Spot-Exzision und den In-Gel-Verdau (Abbildung 1B)

4. In-Gel-Verdauung

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO3)/50 % (v/v) Acetonitril; 10 mM Dithiothreitol (DTT) in 50 mM NH₄HCO₃; 55 mM Iodacetamid (IAA) in 50 mM NH₄HCO₃; 0,1 % TFA; 50 mM NH₄HCO₃, pH 8; Acetonitril in HPLC-Qualität; 1 mL Silikonröhrchen.
   HINWEIS: Um eine Kontamination des menschlichen Keratins durch Haare oder Haut zu vermeiden, verwenden Sie saubere Handschuhe und arbeiten Sie in einem sauberen Bereich.
2. Entfernen Sie mit einem sauberen Skalpell interessante Histonflecken aus dem gefärbten Gel und geben Sie sie in ein frisches Silikonröhrchen (1,5 ml). Achten Sie darauf, einen einzelnen Punkt herauszuschneiden und in ein einzelnes Röhrchen zu geben, um eine Kreuzkontamination der Isoform zu vermeiden.
3. Zu jedem Gelfleck werden 250 μl 50 mM NH₄HCO₃/50 % Acetonitril gegeben und unter sanftem Rühren in einem Thermomischer bei Raumtemperatur inkubiert. Dekantieren Sie die Lösung und wiederholen Sie diesen Schritt 3x. Gelstücke erscheinen transparent.
4. Dehydrieren Sie Gelflecken durch Zugabe von Acetonitril (200 μl). In diesem Stadium nehmen die Gelstücke eine undurchsichtig-weiße Farbe an.
5. Acetonitril dekantieren und 10 min an der Luft trocknen lassen. Das Gelstück erscheint in der Tube getrocknet. Reduktion und Alkylierung sind nicht notwendig, da Histonproteine während des Äquilibrierungsschritts reduziert und alkyliert wurden.
6. Rehydrieren Sie Gelflecken in 20 μl Trypsinlösung (0,1 mM HCl) oder einem Volumen, das ausreicht, um die Gelstücke zu bedecken. Die Röhrchen werden in den Thermomischer gestellt und unter leichtem Rühren bei 37 °C mindestens 4 bis 16 Uhr inkubiert.
7. Den Überstand mit den tryptischen Peptiden in ein frisches Röhrchen überführen. Geben Sie 50 μL Extraktionslösung (60% Acetonitril, 1% TFA) zu den Gelstücken und beschallen Sie 2x in einem Ultraschall-Wasserbad für 10 min bei 4 °C.
8. Übertragen Sie den Überstand, der zusätzliche tryptische Peptide enthält, in das frische Röhrchen. Verwenden Sie einen Gefriertrockner, um die gepoolten extrahierten Peptide zu trocknen. Stellen Sie den Gefriertrockner auf 30 °C ein und trocknen Sie die Lösung; In der Tube erscheint ein lyophilisiertes Pellet.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist volumenabhängig. In der Regel ist 1 h ausreichend, aber überprüfen Sie das Volumen alle 10 Minuten, bis die Probe vollständig getrocknet ist.
9. Geben Sie 15 μl 0,1 % TFA in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es vorsichtig in einem Thermomischer bei 25 °C. Übertragen Sie den Überstand für die LC-MS/MS-Analyse in das Fläschchen.

5. 2DTAU Western Blot

1. Bereiten Sie den Transferpuffer, 250 mM Tris-Base, 92 mM Glycin und 10 % Methanol mit doppelt destilliertem Wasser vor.
2. Schneiden Sie die Nitrozellulosemembran und das Filterpapier auf die Maße des Gels zu.
3. Äquilibrieren Sie das Gel und weichen Sie die Membran, das Filterpapier und das Filterpapier 15 Minuten lang im Transferpuffer ein. Verwenden Sie entweder Nitrozellulose- oder PVDF-Membranen. Wenn Sie PVDF-Membranen (Polyvinylidendifluorid) verwenden, aktivieren Sie diese, indem Sie sie in 100 % MetOH einweichen.
4. Bereiten Sie das Gelsandwich in der Kassette für einen halbtrockenen Transfer wie folgt vor: Negative Elektrode/Filterpapier/Gel/Nitrozellulosemembran/Filterpapier/Positive Elektrode. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen Gel und Membran, um gute Ergebnisse zu erzielen.
5. Legen Sie die Kassette in das Halbtrockengerät und lassen Sie den Blot 30 Minuten lang bei 25 V laufen. Zerlegen Sie zum Schluss das Blotting-Sandwich und lagern Sie die Membran für den immunologischen Assay. Überprüfen Sie die Übertragungseffizienz mit der Ponceau-Färbung. Markieren Sie die Membran mit einem Schild oben rechts, um die richtige Filterausrichtung beizubehalten.
6. Inkubieren Sie je nach Experiment mit primären und sekundären Antikörpern (Abbildung 2).

Ergebnisse

In Abbildung 1A ist zu beobachten, wie Histonproteine in einem 1D-Gel wandern. Dies ist ein wichtiger vorbereitender Schritt, um die Laufzeit der ersten Dimension zu verstehen. Sobald der richtige Zeitpunkt für die Trennung bestimmt ist, führen Sie die zweite Dimension aus. Die 2D-Karte der Histon-Proteoformen zeigt ein charakteristisches topographisches Muster (Abbildung 1B). Jeder Punkt in Abbildung 1B stellt einen bestimmten Histontyp dar. Beobachten Sie die genaue Region des Gels, in der sich jedes Histon-Proteoform befindet. Die massenspektrometrische Identifizierung für jedes Histon-Proteoform wird in Perri et ^al.32 beschrieben. Daher ist jeder Punkt in diesem Zustand mit einem bestimmten Histontyp verbunden. Das Vorhandensein zusätzlicher Flecken neben den kanonischen Flecken könnte auf das Vorhandensein neuer Modifikationen hinweisen. Gelbilder können mit Hilfe der Densitometrie aufgenommen werden, und das resultierende Bild kann mit einer Bildanalysesoftware analysiert werden.

Die Zuverlässigkeit der 2D-TAU-Karte hängt von der Rundheit des Spots ab. Wenn der Lauf korrekt durchgeführt wurde, erscheinen die Flecken als deutliche Signale und es sind keine horizontalen und vertikalen Streifen sichtbar. Umgekehrt können Verunreinigungen in der Probe, den Lösungen und der Agarose-Überlagerung Schlieren und/oder Streifen im Gel verursachen. Die Qualität des Gels wirkt sich auf die Bilddigitalisierung und die anschließende quantitative und qualitative Analyse aus. Darüber hinaus könnte es den Erfolg der Western-Blot-Analyse und der MS-Untersuchung beeinflussen. Um die Zuverlässigkeit der Methode zu überprüfen, untersuchten wir die Nitrozellulosemembran von aufgelösten Histon-Proteoformen mit dem primären Antikörper Acetyliertes Lysin (Ac-K2-100) Kaninchen^{mAb 32} (Abbildung 2). Ein Anti-Kaninchen-HRP-Sekundärantikörper wurde zum Nachweis von Histonsignalen verwendet. Wie erwartet, ist es mit einem Densitometer möglich, die eigentümliche posttranslationale Modifikation jeder im Blot vorhandenen Histonvariante zu quantifizieren.

Abbildung 1: 1D- und 2D-TAUgel. (A) Repräsentatives Bild des topographischen Histonenmusters, das mit 1D-TAUgel aufgenommen wurde. (B) Repräsentatives Bild eines topographischen Histonenmusters, das mit 2D-TAUgel aufgenommen wurde. Datenidentifikationen werden von Perri et al. ^{berichtet 32}. Wie erwartet, repräsentiert jeder Fleck ein spezifisches Histon-Proteoform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentativer 2DTAU Western Blot. Im Bild ist es möglich, den Grad der Lysinacetylierung in jedem Histon-Proteoform zu beobachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Reagenzien	Konzentration: 15%
40% Acrylamid/Bis	3.75
1,5 M Tris pH 8,8	2,5 mL
MilliQ Wasser	3,6 mL
10% Sicherheitsdatenblatt	100 μL
10% APS	50 μL
TEMED	5 μL

Tabelle 1: Zusammensetzung der Gellösung auflösen.

Schritt	Zeit
Fixierung von 50 % Methanol / 5 % Essigsäure	1 h
30% Ethanol waschen	2 x 20 Minuten
Waschen Sie deionisiertes Wasser	1 x 20 Minuten
Sensibilisator Thiosulfat Reagenz	ca. 1 min
Waschen Sie deionisiertes Wasser	3 x 20 Sek.
Silber Silbernitrat	30 Minuten
Waschen Sie deionisiertes Wasser	3 x 1 min
Entwicklungsentwickler	ca. 25-30 min Hinweis: Entwickeln Sie das Gel, bis die Flecken sichtbar sind (hellbraun)
Stopp-Lösung	1 x 10 Minuten
Waschen Sie deionisiertes Wasser	2 x 5 Minuten
Waschen Sie deionisiertes Wasser	1 h

Tabelle 2: Methode der Silberfärbung.

Diskussion

In den letzten zehn Jahren wurde die Therapie von Krebspatienten revolutioniert, indem verschiedene molekulare Veränderungen identifiziert wurden, die die Entwicklung und das Fortschreiten von Krebs vorantreiben. Der bedeutendste Fortschritt in der modernen Onkologie ist die Entwicklung von Therapien, die auf einer umfassenden molekularen Analyse basieren. Technologische Fortschritte in der Genomik und Proteomik haben eine entscheidende Rolle bei der Profilierung spezifischer Biomarker für die Früherkennung, Überwachung, Prognose und Arzneimittelüberwachung gespielt. Proteomik ist definiert als die Analyse des vollständigen Proteinkomplements einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus unter einer bestimmten Bedingung und umfasst auch die Untersuchung von Proteininteraktionen, posttranslationalen Modifikationen und Lokalisation³⁴. Ein spezifischer Bereich der Proteomik ist die Epi-Proteomik, bei der posttranslationale Modifikationen des Histons systematisch untersucht werden. Diese wurden mit der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs in Verbindung gebracht³⁵. In der Arbeit wird eine Methode zur Identifizierung spezifischer Histon-Isoformen beschrieben, die zum zellulären Phänotyp beitragen.

Der kritische Schritt der Methode ist die Extraktion von Histonen aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und hohen Basizität. Die größten Einschränkungen sind die Komplexität der 2D-Karte und die geringe Anzahl von Varianten, die die MS/MS-Analyse erschweren können.

Insgesamt besteht der Hauptvorteil dieses Ansatzes darin, dass er in jedem Labor durchgeführt werden kann und ein Mini-Gel-Gerät mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen besessen werden kann. In diesem Zusammenhang sind wir zuversichtlich, dass diese Methode einer großen Anzahl von Wissenschaftlern, wie z.B. solchen, die nicht von einer großen Einrichtung in ihrer Institution profitieren können, helfen könnte, neue Epimarker zu identifizieren, mit dem Ziel, das Wissen über das Epiproteom zu verbessern. Darüber hinaus kann diese Methode mit der Massenspektrometrie kombiniert werden, die als Dienstleistung ausgelagert werden kann, um neuartige Proteoformen zu entdecken. Es kann auch mit immunologischen Assays verwendet werden, um die Veränderungen in einer spezifischen posttranslationalen Modifikation zu bestätigen, für die ein kommerzieller Antikörper verfügbar ist.

Die Methode wurde verwendet, um die typischen Veränderungen der Histonmodifikationen im Zusammenhang mit der Entwicklung von Brustkrebs zu untersuchen²⁸und um die Modifikationen von H1 in embryonalen Stammzellen der Maus^{zu untersuchen 36}. Darüber hinaus wurde die Methode erfolgreich eingesetzt, um den Grad der Histoncarbonylierung³⁷ in schnell wachsenden Fibroblasten zu messen und neue Histonmodifikationen wie die Histonglykation und die Histon-MARylierung³⁸ zu erforschen.

Aus unserer Sicht sind wir zuversichtlich, dass diese Methode erfolgreich für die Profilierung neuartiger Histon-PTMs eingesetzt werden kann, insbesondere solcher, die mit der abnormalen Aktivierung spezifischer Stoffwechselwege wie Acetylierung, Malonylierung, Methylierung, Lipidierung, Laktylierung, Butylierung und anderen verbunden sind. Letztendlich könnte die Methode auch als mikropräparatives Werkzeug für die Isolierung einzelner Proteoformen dienen und die Analyse von stoffwechselgebundenen PTMs erleichtern, wodurch unser Verständnis dieses wichtigen Forschungsbereichs verbessert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,4-Dithioerythrit	SIGMA- ALDRICH	D8255	Reagenz zur Aufrechterhaltung − SH-Gruppen im reduzierten Zustand; Reduziert quantitativ Disulfide.
1,5 M Tris-HCL Puffer, pH 8,8	BIO-RAD	161-0798	Auflösender Gelpuffer
10x Tris/Glycin/SDS	BIO-RAD	1610772	Verwenden Sie diesen vorgemischten 10x Tris/Glycin/SDS-Laufpuffer, um Proteinproben mittels SDS-PAGE zu trennen.
2-Propanol	SIGMA-ALDRICH	33539	2-Propanol (Isopropanol) ist ein sekundärer Alkohol. Es wurde als Ersatz für Kraftstoff für den Einsatz in verschiedenen Brennstoffzellen getestet. In 2-Propanol gelöstes CuO-Pulver wird für die laserablationsunterstützte Synthese von Cu-Kolloiden verwendet. Die Suspension von 2-Propanol mit Zn(NO3)2 wurde für die Herstellung einer mit Titandioxid beschichteten Photoanode aus rostfreiem Stahl (P25-TiO2/SS) verwendet, die mit einer gleichmäßig dicken Schicht aus P25-TiO2 beschichtet ist. Diese Photoanode wurde für den elektrochemischen photokatalytischen (ECPC) Degradationsprozess verwendet.
30% Acrylamid/Bis-Lösung	BIO-RAD	1610158	2,6 % Vernetzer. Reagenz zur Elektrophorese-Reinheit
Essigsäure Gletscher	Carlo Erba Reagennts 401392		Essigsäure ist ein wichtiges chemisches Reagenz mit vielen industriellen Anwendungen.
Aceton	Panreac Applichem	211007.1214	Aceton  ist ein Lösungsmittel, das für seine Vielseitigkeit in verschiedenen Labor-, Fertigungs- und Reinigungsanwendungen bekannt ist.
Acetonitil	VWR	83640320	für HPLC
Agarose	Invitrogen	15510-027	ist a  Heteropolysaccharid  Häufig in der Molekularbiologie verwendet.
Ammoniumbicarbonat	SIGMA-ALDRICH	A6141	mindestens 99,0%
Ammoniumpersulfat	SIGMA-ALDRICH	A3678	Für die Molekularbiologie, Für die Elektrophorese, ≥ 98%
Bioruptor plus	Diagenode	B01020001 - B01020002- B01020003	Ultraschallgerät
Dithiothreitol	SIGMA- ALDRICH	D9163-5G	Reduktionsmittel zur Reduzierung von Disulfidbindungen in Proteinen.
Dodeca Silber-Flecken-Kit	BIO-RAD	161-0480	Das Dodeca-Silberfärbekit ist einfach zu verwenden für den Nachweis von Nicht-Agramm-Spiegeln von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen.
Glycerol	GE - Gesundheitswesen Life Sciences	171325010L	Glycerin ist eine einfache Triolverbindung, die an der Unterstützung beim Gießen von Gradientengelen, Proteinstabilisatoren und Speicherpufferkomponenten beteiligt ist.
Stopp Phosphatase-Hemmer	Thermo SCIENTIFIC	78428	Thermo Scientific Halt Phosphatase-Inhibitor-Cocktail bewahrt den Phosphorylierungszustand von Proteinen während und nach der Zelllyse oder der Extraktion von Gewebeproteinen. Einweg-Cocktail (100x).
Stoppen Sie den Proteasehemmer	Thermo SCIENTIFIC	78430	Thermo Scientific Halt Proteaseinhibitor Cocktail (100X) sind gebrauchsfertige konzentrierte Stammlösungen von Proteaseinhibitoren zur Zugabe zu Proben, um den proteolytischen Abbau während der Zelllyse und Proteinextraktion zu verhindern. Einweg-Cocktail (100x).
Salzsäure	SIGMA-ALDRICH	H1758	BioReagenz, für die Molekularbiologie
Iodacetamid	SIGMA-ALDRICH	I6125	≥ 99% (NMR), kristallin
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541	Kaliumchlorid, KCl, ist  Wird in der Regel in Laborroutinen verwendet. Seine Verwendung als Speicherpuffer für pH-Elektroden und als Referenzlösung für Leitfähigkeitsmessungen ist gut etabliert.
MCF10 Zelllinie	atcc	CRL-10317	Epithelzelllinie, die 1984 aus der Brustdrüse einer weißen, 36-jährigen Frau mit fibrozystischen Brüsten isoliert wurde. Diese Zelllinie wurde von der Michigan Cancer Foundation hinterlegt.
MgCl2	SIGMA-ALDRICH	208337	Magnesiumchlorid ist ein farbloser kristalliner Feststoff.
N,N,N',N'-Tetramethylethylen-diamin	SIGMA-ALDRICH	T9281	Für die Elektrophorese, ca. 99%
Phosphat-Kochsalzpuffer 1X	Corning	15373631	1 x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ist  a gepuffert  ausgewogene Salzlösung  Wird für eine Vielzahl von biologischen und zellkulturellen Anwendungen verwendet, wie z. B. das Waschen von Zellen vor der Dissoziation, den Transport von Zellen oder Gewebe, das Verdünnen von Zellen für die Zählung und die Vorbereitung von Reagenzien.
Kaliumhexacyanoferrat	SIGMA-ALDRICH	60299	Elektronenakzeptor, eingesetzt in Systemen mit Elektronentransport,
SDS Lösung 20% (w/v)	BIO-RAD	161-0418	Natriumdodecylsulfat. Reagenz zur Elektrophorese-Reinheit
Natriumthiosulfat, ReagenzPlus 99%	SIGMA- ALDRICH	21.726-3	Natriumthiosulfat, ReagenzPlus 99%
Schwefelsäure	SIGMA-ALDRICH	339741	Schwefelsäure, Reagenz, ist  Eine extrem ätzende Säure, die in einer gelblichen, leicht viskosen Flüssigkeit vorliegt. Es ist wasserlöslich und eine diprotische Säure. Es hat sehr stark korrosive, dehydrierende und oxidierende Eigenschaften und ist hygroskopisch.
Trichloressigsäure	SIGMA-ALDRICH	T6399-5G	Trichloressigsäure (TCA) ist  wird als Reagenz für die Fällung von Proteinen1,2 und Nukleinsäuren3.
Trifluoressigsäure	Riedel-de Haë n	34957	Trifluoressigsäure
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	T9284-1L	Triton X-100 ist ein nichtionisches Polyoxyethylen-Tensid, das am häufigsten zur Extraktion und Solubilisierung von Proteinen verwendet wird.
Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins	SIGMA-ALDRICH	T6567	Proteomics Grade, BioReagenz, dimethylierter
Harnstoff	SIGMA-ALDRICH	33247	Harnstoff ist ein chaotropes Mittel und wird zur Denaturierung von Proteinen verwendet. Es stört die Wasserstoffbrückenbindungen in der Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen. Es kann auch die Wasserstoffbrückenbindung in der DNA-Sekundärstruktur stören