Method Article

Ein Hochdurchsatz-Screening-Ansatz zur Bewertung der Bindungsaffinität von Umweltschadstoffen zu nukleären Rezeptoren

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt ein Hochdurchsatz-Screening-System, das die Fluoreszenzpolarisation einer spezifischen Fluoreszenzsonde, die an einen Kernrezeptor bindet, als Auslesung für das Screening von Umweltschadstoffen verwendet.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der Umwelt wurden immer mehr Verbindungen nachgewiesen, die zu einer weit verbreiteten Umweltverschmutzung führen und Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen. Trotz ihres hohen Vorkommens in der Umwelt gibt es jedoch nur sehr begrenzte Informationen über ihre toxikologischen Wirkungen. Es ist dringend erforderlich, Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) zu entwickeln, um toxikologische Studien zu leiten. In dieser Studie wurde ein Rezeptor-Liganden-Bindungsassay unter Verwendung eines HTS-Systems entwickelt, um die Bindungspotenz von Umweltschadstoffen an nukleäre Rezeptoren zu bestimmen. Der Test wird mit einem Mikroplatten-Reader (d. h. einer 96-Well-Platte, die verschiedene Chemikalien enthält) durchgeführt, indem die Fluoreszenzpolarisation (FP) einer bestimmten Fluoreszenzsonde gemessen wird. Dieser Assay besteht aus vier Teilen: dem Aufbau und der Transformation rekombinanter Vektoren, der Expression und Reinigung des Rezeptorproteins (Ligandenbindungsdomäne), der Rezeptor-Sonden-Bindung und der kompetitiven Bindung von Chemikalien an den Rezeptor. Zur Veranschaulichung des Assay-Verfahrens wurde die Bindungspotenz von zwei Umweltschadstoffen, Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Triphenylphosphat (TPHP), mit Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-gamma (PPARγ) bestimmt. Abschließend wurden auch die Vor- und Nachteile dieser Methode und ihre Einsatzmöglichkeiten diskutiert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine große Anzahl von Chemikalien wurde in großem Umfang in der Umwelt und im menschlichen Körper nachgewiesen, was erhebliche Bedenken hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die ökologische Umwelt und die menschliche Gesundheit aufwirft 1,2,3. Trotz ihres hohen Vorkommens in der Umwelt gibt es nur wenige Informationen über ihre toxikologischen Wirkungen. Daher ist es dringend erforderlich, Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) zu entwickeln, um die Bewertung der chemischen Toxizität zu erleichtern.

Für die Bewertung der chemischen Toxizität wurden mehrere Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) beschrieben, wie z. B. die HTS-Bioassays, die in den Programmen Tox21 und ToxCast verwendet werden 4,5. Diese Methoden können potenzielle Giftstoffe schnell identifizieren und wertvolle Informationen über die Mechanismen der chemischen Toxizität liefern. Diese HTS-Bioassays basieren jedoch hauptsächlich auf zellbasierten Systemen, die komplex und teuer sein können. Darüber hinaus wurden Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden auch für die Bewertung der chemischen Toxizität verwendet, aber das Erreichen einer Hochdurchsatzbewertung von Chemikalien bleibt eine Herausforderung6. In früheren Studien wurden Rezeptor-Liganden-Bindungsassays auf Basis der Fluoreszenzpolarisation (FP) entwickelt, um die Bindungswirkung verschiedener Umweltschadstoffe zu bestimmen, darunter Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS)7,8,9, Bisphenol A (BPA)10,11 und Feinstaub (PM)12 mit nukleären Rezeptoren wie dem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)7, 8,9,10,13, Farnesoid-X-Rezeptor (FXR)11,12 und Schilddrüsenrezeptor (TR)14,15. Dieser Ansatz ist effizient, kostengünstig und liefert mechanistische Erkenntnisse.

In dieser Arbeit wird das Protokoll für den Rezeptor-Liganden-Bindungsassay beschrieben, das auf der Detektion der Fluoreszenzpolarisation (FP) einer kleinen Fluoreszenzsonde basiert. Das Prinzip des FP-basierten Rezeptor-Liganden-Bindungsassays ist in Abbildung 1 dargestellt. Wenn ein kleines fluoreszierendes Molekül durch planpolarisiertes Licht angeregt wird, wird das emittierte Licht aufgrund der schnellen molekularen Rotation stark depolarisiert. Wenn der Tracer jedoch an einen größeren Rezeptor bindet, wird seine Rotation verlangsamt. Ein hoher FP-Wert wird detektiert, wenn der Tracer an den großen Rezeptor gebunden ist, während ein niedriger FP-Wert beobachtet wird, wenn der Tracer frei ist. Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma (PPARγ) wurde für die Bindung der Sonde an den Rezeptor aufgereinigt. Rosiglitazon (Rosi), Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Triphenylphosphat (TPHP) wurden verwendet, um um die Bindung der Sonde an den Rezeptor zu konkurrieren. Rosi, ein spezifischer Agonist von PPARγ, wurde als Positivkontrolle in den Rezeptor-kompetitiven Bindungsassays verwendet. Darüber hinaus wurden PFOS und TPHP bereits in früheren Studien als schwache Agonisten von PPARγ identifiziert 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Darüber hinaus gehören sie zu verschiedenen Strukturkategorien von Verbindungen, die für ihre Umweltbelastung bekannt sind, und zeichnen sich durch ihre relativ hohen Nachweisraten in menschlichen Populationen aus. Diese Verbindungen wurden verwendet, um die breite Anwendbarkeit des Wettbewerbsbindungsassays weiter zu validieren. Das Verfahren besteht aus vier Schritten: Aufbau und Transformation rekombinanter Vektoren, Expression und Reinigung des Rezeptorproteins (Ligandenbindungsdomäne), Rezeptor-Sonden-Bindung und kompetitive Bindung von Chemikalien an den Rezeptor.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Details zu den Reagenzien und der Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konstruktion und Transformation rekombinanter Vektoren

HINWEIS: PPARγ ist ein ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor mit einer klassischen nukleären Rezeptorstruktur, die eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die Zielgene reguliert, und eine Ligandenbindungsdomäne, die durch Liganden aktiviert wird. Bei Aktivierung des Liganden bildet PPARγ ein Heterodimer mit einem anderen nukleären Rezeptor, dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR), und bindet an Reaktionselemente von PPARγ, wodurch die Transkription nachgeschalteter Zielgene reguliertwird 9,16.

  1. Entwerfen Sie Primer für das PPARγ-LBD (siehe Tabelle 1) und amplifizieren Sie das PPARγ-LBD-DNA-Segment (siehe Tabelle 2 und Tabelle 3).
  2. Linearisieren Sie den His×6-markierten pET28a-Vektor, indem Sie ihn mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und BamHI18 verdauen.
  3. Klonieren Sie das PPARγ-LBD-DNA-Segment mit dem kommerziell erhältlichen Klonierungskit in den His×6-markierten pET28a-Vektor, was zu dem rekombinanten Plasmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His18 führt.
  4. Transfizieren Sie das rekombinante Expressionsplasmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His in BL21 (DE3) Escherichia coli-Zellen für die Proteinexpression18.
  5. Geben Sie 5 μl des rekombinanten Vektors in kompetente BL21(DE3)-Zellen, inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, führen Sie einen Hitzeschock bei 42 °C für 45 s durch und kehren Sie dann sofort zum Eis zurück.
  6. 900 μl LB-Medium zugeben, 1 h (160-200 U/min) bei 37 °C schütteln und dann bei ~3000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  7. Der Überstand wird verworfen, das Bakterienpellet in 100 μl LB-Medium resuspendiert und auf ein festes Medium verteilt. Die Platten umdrehen und bei 37 °C 12-16 h lang kultivieren.
  8. Wählen Sie einzelne Kolonien für die Sequenzierung, Identifizierung und anschließende Proteinexpression und -reinigung aus.

2. Expression und Reinigung des Rezeptorproteins

  1. Inkubieren Sie die transformierten BL21 (DE3)-Zellen in 200 mL LB Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin, auf einem Orbitalschüttler (230 U/min) für 1-2 h bei 37 °C.
  2. Induzieren Sie die Zellen, wenn der OD600 0,4-0,6 Absorptionseinheiten erreicht, indem Sie 10 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzufügen und 16 h bei 16 °C inkubieren.
  3. Die Bakteriensuspension auffangen und bei 8000 × g, 4 °C, 10 min zentrifugieren.
  4. Lysieren Sie die Zellen in 20 mL löslichem Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) und fügen Sie 200 μl Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 200 μl Lysozym hinzu. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet mit einer 5-ml-Pipette und fahren Sie dann mit der Beschallung bei 30 % Leistung für 20 Minuten fort.
  5. Fügen Sie Lysepuffer hinzu, der dem 5-fachen des Säulenvolumens entspricht, um die Nickelsäule auszugleichen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen und beiseite stellen.
  6. Die beschallte Bakteriensuspension wird bei 8000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um das bakterielle Überstandslysat (CL) zu erhalten.
  7. Laden Sie das CL auf die Nickelsäule (für die Proteinadsorption), um den Durchfluss (FT) zu erhalten.
  8. Waschen Sie die Säule mit dem 5-fachen Säulenvolumen des Waschpuffers (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0), um das Wascheluat (W1-W6) zu erhalten.
  9. Waschen Sie die Säule mit 1 mL Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0), um das Zielprotein zu eluieren und die Proteinfraktionen (E1-E5) zu erhalten.
  10. Nehmen Sie ein 20-μl-Aliquot jeder Fraktion (CL, FT, W1-W6 und E1-E5) und analysieren Sie mit SDS-PAGE18 und Coomassie Brilliant Blue-Färbung. PPARγ-LBD läuft als 34,9 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel.

3. Rezeptor-Bindungs-Assay

HINWEIS: In diesem Assay wurde C1-BODIPY-C12 als ortsspezifische Fluoreszenzsonde verwendet, um das Rezeptor-Liganden-Bindungssystem zu etablieren. C1-BODIPY-C12, ein spezifischer Ligand für PPARγ, ist ein fluoreszierendes Analogon der Fettsäure, bei dem die BODIPY-Fluoreszenzgruppe an der C1-Position in die Fettsäure eingebaut ist.

  1. Verdünnen Sie das gereinigte humane PPARγ-LBD in Tris-HCl-Puffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0) auf einen Konzentrationsbereich von 1 nM bis 6400 nM. Verdünnen Sie außerdem die C1-BODIPY-C12-Sonde in Tris-HCl-Puffer auf eine Konzentration von 50 nM.
  2. Mischen Sie die verdünnte PPARγ-LBD-Lösung (55 μl pro Well) und die C1-BODIPY-C12-Sondenlösung (55 μl pro Well) in einer schwarzen 96-Well-Platte. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Messen Sie die Fluoreszenzpolarisation (FP) mit dem Mikroplatten-Reader.
  4. Plotten Sie die FP-Werte gegen die Rezeptorkonzentration, passen Sie die Kurve unter Verwendung der spezifischen Bindung mit der Hill-Slope-Gleichung unter Verwendung von Statistik- und Grafiksoftware an und berechnen Sie den Kd-Wert .

4. Kompetitiver Bindungsassay

HINWEIS: In diesem Assay wurden 800 nM humane PPARγ-LBD- und 50 nM C1-BODIPY-C12-Sonde für die Rezeptorbindung verwendet. Rosiglitazon (Rosi), Triphenylphosphat (TPHP) und Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) wurden verwendet, um mit der Bindung der Sonde an PPARγ zu konkurrieren.

  1. Verdünnen Sie die drei Verbindungen in Tris-HCl-Puffer in einem Konzentrationsbereich von 0-200 μM.
  2. Bereiten Sie die Rezeptor-Sonden-Bindungslösung mit einer Endkonzentration von 800 nM humaner PPARγ-LBD und 50 nM C1-BODIPY-C12-Sonde vor.
  3. Mischen Sie die Rezeptor-Sonden-Bindungslösung (55 μl pro Well) und die Verbindungslösung (55 μl pro Well) in einer schwarzen 96-Well-Platte. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Messen Sie die Fluoreszenzpolarisation (FP) mit dem Mikroplatten-Reader.
  5. Stellen Sie die FP-Werte als Funktion der Ligandenkonzentration dar. Ermitteln Sie die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) jedes Liganden aus der Konkurrenzkurve unter Verwendung des sigmoidalen Modells, das von einer Grafik- und Analysesoftware verarbeitet wird.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinexpression und Aufreinigung von PPARγ-LBD
PPARγ-LBD wurde heterolog in BL21 (DE3) als Histidin-markiertes Protein exprimiert. Das Protein wurde in den löslichen Fraktionen nachgewiesen, und das gereinigte PPARγ-LBD zeigte eine einzelne Bande auf SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 34,9 kDa (Abbildung 2), was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des Proteins übereinstimmt.

Die Bindung der C 1-BODIPY-C12 Sonde an PPARγ-LBD
Im Rezeptorbindungsassay wurde C1-BODIPY-C12, eine BODIPY-markierte Fettsäure, die an PPARγ-LBD binden kann, als Fluoreszenzsonde verwendet, um die Bindungswirkung von Umweltschadstoffen an hPPARγ-LBD zu untersuchen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, stiegen die Werte der Fluoreszenzpolarisation (FP) nach Zugabe von PPARγ-LBD von 20 auf 250 an, was auf die Bindung von C1-BODIPY-C12 an den Rezeptor hinweist. Die Bindungskurve erreichte eine Sättigung bei 800 nM PPARγ-LBD mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von 253,5 nM ± 10,05 nM. Daher wurde 800 nM PPARγ-LBD für die nachfolgenden kompetitiven Bindungsassays ausgewählt.

Die kompetitive Bindung von Umweltschadstoffen an PPARγ-LBD
Rosiglitazon (Rosi), ein spezifischer Agonist von PPARγ, wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Fluoreszenzsonde in den kompetitiven Ligandenbindungsassays zu ersetzen. Wie in Abbildung 3B gezeigt, hemmte Rosi die Bindung der C1-BODIPY-C12-Sonde an PPARγ-LBD dosisabhängig mit einem IC50 von 6,89 μM, was die Machbarkeit des Assays demonstriert. Anschließend wurden die Bindungsaffinitäten von TPHP und PFOS zu PPARγ-LBD bestimmt. Wie in Abbildung 3C,D gezeigt, hemmten TPHP und PFOS auch die Bindung der C1-BODIPY-C12-Sonde an PPARγ-LBD in dosisabhängiger Weise, mit IC50-Werten von 60,45 μM bzw. 37,27 μM.

figure-results-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung von Fluoreszenzpolarisation (FP)-basierten Rezeptor-Bindungsassays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: SDS-PAGE-Analyse des gereinigten PPARγ-LBD. M ist der Molekulargewichtsmarker des Proteins. Cl ist das Zelllysat, FT ist die Durchflussfraktion, W1-W6 sind die Waschlösungen, E1 ist das Eluat und E2-E4 sind die gereinigten PPARγ-LBD-Proteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Rezeptorbindungskurve der Fluoreszenzpolarisation (FP) und kompetitive Bindungskurven. (A) FP-basierte Bindungskurve von C 1-BODIPY-C12 an humanes PPARγ-LBD. (B-D) FP-basierte kompetitive Bindungskurven von Rosi, TPHP und PFOS an humanes PPARγ-LBD. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung (SD) für drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

IDSeq
pET28a-Mensch PPARG-P1CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-Mensch PPARG-P2GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBD-NukleotidsequenzAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTGTATGACTCATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA
GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCTGCAGGAGCAGAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTCCTCACAGCTGTTTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG
CTCGAGGCCACCCACCC

Tabelle 1: Der Primer und die Nukleotidsequenz der PPARγ-Ligandenbindungsdomäne.

Namen der experimentellen ReagenzienVolumen/Dosis
pET28a-Mensch PPARG-P11 μL
pET28a-Mensch PPARG-P21 μL
2×phanta Max Mastermix12,5 μl
cDNA (englisch)2 μL
ddH2Ω8,5 μl

Tabelle 2: PCR-Experimentalreagenzsystem.

Namen von ExperimentenTemperaturZeit
Vor-Denaturierung95 °C3 Minuten
Denaturierung95 °C15 Sek.
Glühen65 °C15 Sek.
Erweiterung72 °C6 Minuten
Abspeichern12 °C--

Tabelle 3: Experimentelles PCR-Reaktionsprogramm.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluoreszenzpolarisation (FP), Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Kernspinresonanz (NMR) sind gängige Techniken zur Beurteilung direkter Bindungswechselwirkungen zwischen Proteinen und Verbindungen19,20. FP wird häufig bei der Untersuchung molekularer Wechselwirkungen für die Wirkstoffforschung und das chemische Screening eingesetzt 21,22,23. Im Vergleich dazu sind SPR- und NMR-Assays teuer und zeitaufwändig, so dass sie für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen (HTS) weniger geeignet sind. Dieses Protokoll beschreibt ein Rezeptor-Liganden-Analyseverfahren auf Basis von FP mit einem Multi-Well-Plattendetektionssystem, das die HTS von Chemikalien ermöglicht.

Die Wahl der geeigneten Sonde für einen Rezeptorbindungsassay ist entscheidend. Die Sonde sollte aus zwei Komponenten bestehen: einem spezifischen Liganden für den Kernrezeptor und einer Fluoreszenzgruppe. Typischerweise können solche Sonden kommerziell erhältlich sein, wie am Beispiel der in dieser Studie verwendeten C1-BODIPY-C12-Sonde gezeigt wird. C1-BODIPY-C12 ist ein fluoreszierendes Analogon von Fettsäuren, bei dem die BODIPY-Fluoreszenzgruppe an der C1-Position eingebaut ist, und ist ein spezifischer Ligand für PPARγ. Wenn eine kommerziell erhältliche Fluoreszenzsonde keine Option ist, sollte sie chemisch synthetisiert werden, indem eine Fluoreszenzgruppe an einen bekannten spezifischen Liganden gebunden wird.

Die klassische Struktur eines nukleären Rezeptors umfasst eine DNA-Bindungsdomäne, die für die Regulierung der Zielgenexpression verantwortlich ist, und eine Ligandenbindungsdomäne (LBD), die sich typischerweise am C-Terminus24 des Rezeptors befindet. Die koregulatorische Bindungsstelle befindet sich im Allgemeinen innerhalb der transkriptionellen Aktivierungsfunktionsdomäne des nukleären Rezeptors, wo sie mit nuklearen koregulatorischen Faktoren interagiert25. Diese Coregulatoren können die transkriptionelle Aktivität des Rezeptors entweder verstärken oder unterdrücken und so die Genexpression modulieren. Das LBD, das sich in einer bestimmten Region des Rezeptorproteins befindet, reguliert die Konformationsänderungen des Rezeptors bei der Ligandenbindung, was wiederum seine transkriptionelle Aktivität aktiviert oder hemmt. Da es sich bei dem LBD um eine wohldefinierte Domäne handelt, die für die Erkennung und Bindung spezifischer niedermolekularer Ligandenentscheidend ist 24, wurde in dieser Studie nur der Rezeptor-LBD im Rezeptor-kompetitiven Bindungsassay verwendet. Dieser Ansatz, bei dem die Ligandenbindungsdomäne von PPARγ exprimiert und gereinigt wurde, reduzierte die Assay-Kosten.

Die bei dieser Methode verwendeten Reagenzien, einschließlich Puffer für die Proteinaufreinigung, C1-BODIPY-C12-Sonde und Tris-HCl, sind kommerziell verfügbar und kostengünstig, was ein wesentlicher Vorteil für den Assay ist. Die Detektion der Fluoreszenzpolarisation (FP) erfolgt in einer Multi-Well-Platte (entweder 96-Well oder 384-Well) mit einer schnellen Lesezeit von 3-5 Minuten pro Platte, wodurch der Testdurchsatz und die Effizienz verbessert werden. Der Rezeptor-Liganden-Bindungsansatz ist hochflexibel und kann leicht an verschiedene Rezeptoren angepasst werden, sofern die Rezeptorproteine verfügbar sind. Diese Anpassungsfähigkeit erweitert den Umfang der Forschung, die mit dieser Methode durchgeführt werden kann. Insgesamt macht die Kombination dieser Vorteile - einfache Handhabung, Kosteneffizienz, hohe Durchsatzkapazität, schnelle Verarbeitung und Flexibilität bei der Rezeptoranpassung - diese Methode zu einer vielversprechenden Option für das Screening toxischer Umweltschadstoffe.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PFOS und TPHP an PPARγ binden können, was mit früheren Ergebnissen aus molekularen Docking- und Reportergen-Assays übereinstimmt 9,26. Darüber hinaus wurde die in diesem Manuskript beschriebene Methode verwendet, um die Bindungskraft verschiedener Umweltschadstoffe an nukleäre Rezeptoren zu bewerten. Unter Verwendung des FP-basierten Rezeptor-Liganden-kompetitiven Bindungsassays wird beispielsweise die Bindungspotenz von 19 per- und polyfluorierten Alkylsubstanzen (PFAS) und 7 Bisphenol A (BPA)-Verbindungen an den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor β/δ (PPARβ/δ)7,10, 12 PFAS an PPARγ 9,13, 7 BPA-Verbindungen und 3 Feinstaubkomponenten (PM2,5) an den Farnesoid-X-Rezeptor (FXR)11, 12 und 8 polybromierte Diphenylether (PBDEs) und 6 polychlorierte Biphenyle (PCBs) zum Schilddrüsenrezeptor (TR)14,15 wurden bestimmt. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial dieser Methode für das Screening der Bindungswechselwirkungen zwischen Umweltschadstoffen und nuklearen Rezeptoren.

Frühere Studien haben über Fluoreszenzpolarisations-(FP)-Assay-Methoden für PPARγ berichtet, die die Verwendung von Gelfiltration zur Messung der Bindung beinhalten, die mindestens 1,5 Stunden benötigt, um die Bindung einer einzelnen Verbindung zu erkennen23. Im Gegensatz dazu ermöglicht diese Methode den Nachweis von Bindungsaffinitäten für mindestens 12 Verbindungen mit PPARγ innerhalb von 10 min. Darüber hinaus kosten einige kommerziell erhältliche Assay-Kits (siehe Materialtabelle) über 3000 US-Dollar für ein 800- × 20-μl-Format. Diese Methoden sind besonders teuer und zeitaufwändig. In dieser Studie werden Verbesserungen gegenüber diesen bestehenden Methoden vorgestellt.

Eine mögliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Fluoreszenzsonde ein Ligand für den Rezeptor sein muss und Fluoreszenzsonden nicht direkt mit Umweltschadstoffen interagieren. Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass die Sonde und die Umweltschadstoffe in der Lösung getrennt gehalten werden. Darüber hinaus spiegelt dieser Assay eine in vitro-Situation wider und kann in vivo Wechselwirkungen nicht vollständig erfassen, da Rezeptoren in vivo heterodimer sind 27. Obwohl diese Methode als schnelles Screening-Instrument dient, sind daher weitere Untersuchungen der Rezeptoraktivierung und der damit verbundenen toxikologischen Mechanismen in vivo erforderlich.

Ein weiterer Nachteil ist das Phänomen der "Rechtsverschiebung", das bei Fluoreszenzpolarisationsassays (FP) bei der Bewertung der Bindungsaffinität beobachtet wird und zu einer systematischen Unterschätzung der gemessenen Affinitäten führen kann. In früheren Studien wurde die Bindungsaffinität von Rosiglitazon zu PPARγ mit dem zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanz-Energietransfer-Assay (TR-FRET)28 bewertet, einer hochempfindlichen Methode zur Messung der Liganden-Rezeptor-Bindungsaffinität. Der TR-FRET-Assay ist jedoch relativ zeitaufwändig und umständlich, da eine 4-stündige Inkubation der Reaktionslösung bei Raumtemperatur vor dem Nachweis erforderlich ist. Obwohl der FP-Assay im Vergleich zum TR-FRET-Assay eine geringere Sensitivität aufweist, eignet er sich besser für das Hochdurchsatz-Screening von Umweltliganden, die an Kernrezeptoren binden. Nichtsdestotrotz kann es vorkommen, dass der FP-Assay einige schwache Umweltliganden übersieht. Darüber hinaus wurde in früheren Studien die Bindungsaffinität von PFOS zu PPARγ mittels Gleichgewichtsdialyse (EqD)29 bestimmt, einer weiteren hochsensitiven Methode zur Messung der Liganden-Rezeptor-Bindungsaffinität. EqD ist jedoch auf teure Analysegeräte (LC-MS/MS) angewiesen, was seine Anwendung einschränkt und Hochdurchsatz-Screening-Funktionen ausschließt.

Obwohl dieser Fluoreszenzpolarisations-Assay (FP) ein "Rechtsverschiebungs"-Phänomen aufweist, das zu allgemein höheren berechneten IC50-Werten führen kann, hat dies keinen Einfluss auf das relative Affinitätsranking oder nachfolgende Vorhersagen zur Risikobewertung. Darüber hinaus ist der FP-Assay kostengünstig, zeiteffizient und in der Lage, eine Vielzahl von Verbindungen auf ihre Affinität zu mehreren nukleären Rezeptoren zu untersuchen. Insgesamt ermöglicht das FP-basierte Hochdurchsatz-Screening von Umweltliganden die schnelle Identifizierung toxischer Umweltschadstoffe.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82103875) unterstützt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 SondeThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Bindet an PPARγ-LBD und emittiert Fluoreszenz.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Färben Sie die Proteinbanden.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
ImidazolSolarbio, ChinaI8090Bereiten Sie Puffer für den Proteinaufreinigungsprozess vor.
Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranosidSolarbio, China367-93-1Induzieren Sie die Expression von PPARγ -LBD
Mikroplatten-ReaderBiotek , USASynergy H1 Ermitteln des FP-Werts
NaClShanghai Reagenz7647-15-5Bereiten Sie Puffer für den Proteinaufreinigungsprozess vor.
NaH2PO4 · 2H2OShanghai Reagenz13472-35-0Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Proteinreinigung.
Herkunft 8.5 OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluoroctansulfonsäure (PFOS)J& K Scientific Ltd, China1763-23-1Die nachgewiesenen Umweltschadstoffe
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Solarbio, ChinaP0100hemmen den Proteinabbau.
PPARγ-Competitor Assay KitThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay KitCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazon (Rosi)aladdin, China122320-73-4Die Agonisten von PPARγ
ShakerZHICHENG, ChinaZWY-211CExpansion der Bakterienkultur und Induktion der Proteinexpression
Triphenylphosphat (TPHP)Macklin, ChinaT819317Die nachgewiesenen Umweltschadstoffe
TrisSolarbio, ChinaT8230Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BLysogeny Broth (LB) Medium zubereiten.
UltraschallreinigerKimberly, ChinaLHO-1Zerkleinern Sie die Bakterien, um eine vollständige Lyse zu erreichen
HarnstoffSolarbio, ChinaU8020Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
HefeextraktOXOID Limited, ChinaLP0021BLysogeny Broce (LB) Medium zubereiten.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).">Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).">Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).">Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).">Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).">Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).">Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).">Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).">Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).">Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).">Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).">Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).">Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).">Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).">Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).">Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).">Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).">Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).">Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).">Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).">Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).">LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).">Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).">Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).">Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).">Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).">Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).">de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).">Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).">Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles