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Methodenartikel

Ein Hochdurchsatz-Screening-Ansatz zur Bewertung der Bindungsaffinität von Umweltschadstoffen zu nukleären Rezeptoren

859 Aufrufe

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DOI:

10.3791/67327

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20. September 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Hochdurchsatz-Screening-System, das die Fluoreszenzpolarisation einer spezifischen Fluoreszenzsonde, die an einen Kernrezeptor bindet, als Auslesung für das Screening von Umweltschadstoffen verwendet.

Zusammenfassung

In der Umwelt wurden immer mehr Verbindungen nachgewiesen, die zu einer weit verbreiteten Umweltverschmutzung führen und Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen. Trotz ihres hohen Vorkommens in der Umwelt gibt es jedoch nur sehr begrenzte Informationen über ihre toxikologischen Wirkungen. Es ist dringend erforderlich, Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) zu entwickeln, um toxikologische Studien zu leiten. In dieser Studie wurde ein Rezeptor-Liganden-Bindungsassay unter Verwendung eines HTS-Systems entwickelt, um die Bindungspotenz von Umweltschadstoffen an nukleäre Rezeptoren zu bestimmen. Der Test wird mit einem Mikroplatten-Reader (d. h. einer 96-Well-Platte, die verschiedene Chemikalien enthält) durchgeführt, indem die Fluoreszenzpolarisation (FP) einer bestimmten Fluoreszenzsonde gemessen wird. Dieser Assay besteht aus vier Teilen: dem Aufbau und der Transformation rekombinanter Vektoren, der Expression und Reinigung des Rezeptorproteins (Ligandenbindungsdomäne), der Rezeptor-Sonden-Bindung und der kompetitiven Bindung von Chemikalien an den Rezeptor. Zur Veranschaulichung des Assay-Verfahrens wurde die Bindungspotenz von zwei Umweltschadstoffen, Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Triphenylphosphat (TPHP), mit Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-gamma (PPARγ) bestimmt. Abschließend wurden auch die Vor- und Nachteile dieser Methode und ihre Einsatzmöglichkeiten diskutiert.

Einleitung

Eine große Anzahl von Chemikalien wurde in großem Umfang in der Umwelt und im menschlichen Körper nachgewiesen, was erhebliche Bedenken hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die ökologische Umwelt und die menschliche Gesundheit aufwirft 1,2,3. Trotz ihres hohen Vorkommens in der Umwelt gibt es nur wenige Informationen über ihre toxikologischen Wirkungen. Daher ist es dringend erforderlich, Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) zu entwickeln, um die Bewertung der chemischen Toxizität zu erleichtern.

Für die Bewertung der chemischen Toxizität wurden mehrere Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) beschrieben, wie z. B. die HTS-Bioassays, die in den Programmen Tox21 und ToxCast verwendet werden 4,5. Diese Methoden können potenzielle Giftstoffe schnell identifizieren und wertvolle Informationen über die Mechanismen der chemischen Toxizität liefern. Diese HTS-Bioassays basieren jedoch hauptsächlich auf zellbasierten Systemen, die komplex und teuer sein können. Darüber hinaus wurden Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden auch für die Bewertung der chemischen Toxizität verwendet, aber das Erreichen einer Hochdurchsatzbewertung von Chemikalien bleibt eine Herausforderung6. In früheren Studien wurden Rezeptor-Liganden-Bindungsassays auf Basis der Fluoreszenzpolarisation (FP) entwickelt, um die Bindungswirkung verschiedener Umweltschadstoffe zu bestimmen, darunter Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS)7,8,9, Bisphenol A (BPA)10,11 und Feinstaub (PM)12 mit nukleären Rezeptoren wie dem Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)7, 8,9,10,13, Farnesoid-X-Rezeptor (FXR)11,12 und Schilddrüsenrezeptor (TR)14,15. Dieser Ansatz ist effizient, kostengünstig und liefert mechanistische Erkenntnisse.

In dieser Arbeit wird das Protokoll für den Rezeptor-Liganden-Bindungsassay beschrieben, das auf der Detektion der Fluoreszenzpolarisation (FP) einer kleinen Fluoreszenzsonde basiert. Das Prinzip des FP-basierten Rezeptor-Liganden-Bindungsassays ist in Abbildung 1 dargestellt. Wenn ein kleines fluoreszierendes Molekül durch planpolarisiertes Licht angeregt wird, wird das emittierte Licht aufgrund der schnellen molekularen Rotation stark depolarisiert. Wenn der Tracer jedoch an einen größeren Rezeptor bindet, wird seine Rotation verlangsamt. Ein hoher FP-Wert wird detektiert, wenn der Tracer an den großen Rezeptor gebunden ist, während ein niedriger FP-Wert beobachtet wird, wenn der Tracer frei ist. Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma (PPARγ) wurde für die Bindung der Sonde an den Rezeptor aufgereinigt. Rosiglitazon (Rosi), Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Triphenylphosphat (TPHP) wurden verwendet, um um die Bindung der Sonde an den Rezeptor zu konkurrieren. Rosi, ein spezifischer Agonist von PPARγ, wurde als Positivkontrolle in den Rezeptor-kompetitiven Bindungsassays verwendet. Darüber hinaus wurden PFOS und TPHP bereits in früheren Studien als schwache Agonisten von PPARγ identifiziert 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Darüber hinaus gehören sie zu verschiedenen Strukturkategorien von Verbindungen, die für ihre Umweltbelastung bekannt sind, und zeichnen sich durch ihre relativ hohen Nachweisraten in menschlichen Populationen aus. Diese Verbindungen wurden verwendet, um die breite Anwendbarkeit des Wettbewerbsbindungsassays weiter zu validieren. Das Verfahren besteht aus vier Schritten: Aufbau und Transformation rekombinanter Vektoren, Expression und Reinigung des Rezeptorproteins (Ligandenbindungsdomäne), Rezeptor-Sonden-Bindung und kompetitive Bindung von Chemikalien an den Rezeptor.

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Protokoll

Die Details zu den Reagenzien und der Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konstruktion und Transformation rekombinanter Vektoren

HINWEIS: PPARγ ist ein ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor mit einer klassischen nukleären Rezeptorstruktur, die eine DNA-Bindungsdomäne umfasst, die Zielgene reguliert, und eine Ligandenbindungsdomäne, die durch Liganden aktiviert wird. Bei Aktivierung des Liganden bildet PPARγ ein Heterodimer mit einem anderen nukleären Rezeptor, dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR), und bindet an Reaktionselemente von PPARγ, wodurch die Transkription nachgeschalteter Zielgene reguliertwird 9,16.

  1. Entwerfen Sie Primer für das PPARγ-LBD (siehe Tabelle 1) und amplifizieren Sie das PPARγ-LBD-DNA-Segment (siehe Tabelle 2 und Tabelle 3).
  2. Linearisieren Sie den His×6-markierten pET28a-Vektor, indem Sie ihn mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und BamHI18 verdauen.
  3. Klonieren Sie das PPARγ-LBD-DNA-Segment mit dem kommerziell erhältlichen Klonierungskit in den His×6-markierten pET28a-Vektor, was zu dem rekombinanten Plasmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His18 führt.
  4. Transfizieren Sie das rekombinante Expressionsplasmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His in BL21 (DE3) Escherichia coli-Zellen für die Proteinexpression18.
  5. Geben Sie 5 μl des rekombinanten Vektors in kompetente BL21(DE3)-Zellen, inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, führen Sie einen Hitzeschock bei 42 °C für 45 s durch und kehren Sie dann sofort zum Eis zurück.
  6. 900 μl LB-Medium zugeben, 1 h (160-200 U/min) bei 37 °C schütteln und dann bei ~3000 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  7. Der Überstand wird verworfen, das Bakterienpellet in 100 μl LB-Medium resuspendiert und auf ein festes Medium verteilt. Die Platten umdrehen und bei 37 °C 12-16 h lang kultivieren.
  8. Wählen Sie einzelne Kolonien für die Sequenzierung, Identifizierung und anschließende Proteinexpression und -reinigung aus.

2. Expression und Reinigung des Rezeptorproteins

  1. Inkubieren Sie die transformierten BL21 (DE3)-Zellen in 200 mL LB Medium, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin, auf einem Orbitalschüttler (230 U/min) für 1-2 h bei 37 °C.
  2. Induzieren Sie die Zellen, wenn der OD600 0,4-0,6 Absorptionseinheiten erreicht, indem Sie 10 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzufügen und 16 h bei 16 °C inkubieren.
  3. Die Bakteriensuspension auffangen und bei 8000 × g, 4 °C, 10 min zentrifugieren.
  4. Lysieren Sie die Zellen in 20 mL löslichem Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) und fügen Sie 200 μl Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 200 μl Lysozym hinzu. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet mit einer 5-ml-Pipette und fahren Sie dann mit der Beschallung bei 30 % Leistung für 20 Minuten fort.
  5. Fügen Sie Lysepuffer hinzu, der dem 5-fachen des Säulenvolumens entspricht, um die Nickelsäule auszugleichen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen und beiseite stellen.
  6. Die beschallte Bakteriensuspension wird bei 8000 × g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert, um das bakterielle Überstandslysat (CL) zu erhalten.
  7. Laden Sie das CL auf die Nickelsäule (für die Proteinadsorption), um den Durchfluss (FT) zu erhalten.
  8. Waschen Sie die Säule mit dem 5-fachen Säulenvolumen des Waschpuffers (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0), um das Wascheluat (W1-W6) zu erhalten.
  9. Waschen Sie die Säule mit 1 mL Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0), um das Zielprotein zu eluieren und die Proteinfraktionen (E1-E5) zu erhalten.
  10. Nehmen Sie ein 20-μl-Aliquot jeder Fraktion (CL, FT, W1-W6 und E1-E5) und analysieren Sie mit SDS-PAGE18 und Coomassie Brilliant Blue-Färbung. PPARγ-LBD läuft als 34,9 kDa Protein auf einem denaturierenden Gel.

3. Rezeptor-Bindungs-Assay

HINWEIS: In diesem Assay wurde C1-BODIPY-C12 als ortsspezifische Fluoreszenzsonde verwendet, um das Rezeptor-Liganden-Bindungssystem zu etablieren. C1-BODIPY-C12, ein spezifischer Ligand für PPARγ, ist ein fluoreszierendes Analogon der Fettsäure, bei dem die BODIPY-Fluoreszenzgruppe an der C1-Position in die Fettsäure eingebaut ist.

  1. Verdünnen Sie das gereinigte humane PPARγ-LBD in Tris-HCl-Puffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0) auf einen Konzentrationsbereich von 1 nM bis 6400 nM. Verdünnen Sie außerdem die C1-BODIPY-C12-Sonde in Tris-HCl-Puffer auf eine Konzentration von 50 nM.
  2. Mischen Sie die verdünnte PPARγ-LBD-Lösung (55 μl pro Well) und die C1-BODIPY-C12-Sondenlösung (55 μl pro Well) in einer schwarzen 96-Well-Platte. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Messen Sie die Fluoreszenzpolarisation (FP) mit dem Mikroplatten-Reader.
  4. Plotten Sie die FP-Werte gegen die Rezeptorkonzentration, passen Sie die Kurve unter Verwendung der spezifischen Bindung mit der Hill-Slope-Gleichung unter Verwendung von Statistik- und Grafiksoftware an und berechnen Sie den Kd-Wert .

4. Kompetitiver Bindungsassay

HINWEIS: In diesem Assay wurden 800 nM humane PPARγ-LBD- und 50 nM C1-BODIPY-C12-Sonde für die Rezeptorbindung verwendet. Rosiglitazon (Rosi), Triphenylphosphat (TPHP) und Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) wurden verwendet, um mit der Bindung der Sonde an PPARγ zu konkurrieren.

  1. Verdünnen Sie die drei Verbindungen in Tris-HCl-Puffer in einem Konzentrationsbereich von 0-200 μM.
  2. Bereiten Sie die Rezeptor-Sonden-Bindungslösung mit einer Endkonzentration von 800 nM humaner PPARγ-LBD und 50 nM C1-BODIPY-C12-Sonde vor.
  3. Mischen Sie die Rezeptor-Sonden-Bindungslösung (55 μl pro Well) und die Verbindungslösung (55 μl pro Well) in einer schwarzen 96-Well-Platte. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Messen Sie die Fluoreszenzpolarisation (FP) mit dem Mikroplatten-Reader.
  5. Stellen Sie die FP-Werte als Funktion der Ligandenkonzentration dar. Ermitteln Sie die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) jedes Liganden aus der Konkurrenzkurve unter Verwendung des sigmoidalen Modells, das von einer Grafik- und Analysesoftware verarbeitet wird.

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Ergebnisse

Proteinexpression und Aufreinigung von PPARγ-LBD
PPARγ-LBD wurde heterolog in BL21 (DE3) als Histidin-markiertes Protein exprimiert. Das Protein wurde in den löslichen Fraktionen nachgewiesen, und das gereinigte PPARγ-LBD zeigte eine einzelne Bande auf SDS-PAGE mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 34,9 kDa (Abbildung 2), was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des Proteins übereinstimmt.

Die Bindung der C 1-BOD...

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Diskussion

Fluoreszenzpolarisation (FP), Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Kernspinresonanz (NMR) sind gängige Techniken zur Beurteilung direkter Bindungswechselwirkungen zwischen Proteinen und Verbindungen19,20. FP wird häufig bei der Untersuchung molekularer Wechselwirkungen für die Wirkstoffforschung und das chemische Screening eingesetzt 21,22,23.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82103875) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C1-BODIPY-C12 SondeThermo Fisher Scientific, China102209-82-3Bindet an PPARγ-LBD und emittiert Fluoreszenz.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2Färben Sie die Proteinbanden.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
ImidazolSolarbio, ChinaI8090Bereiten Sie Puffer für den Proteinaufreinigungsprozess vor.
Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranosidSolarbio, China367-93-1Induzieren Sie die Expression von PPARγ -LBD
Mikroplatten-ReaderBiotek , USASynergy H1 Ermitteln des FP-Werts
NaClShanghai Reagenz7647-15-5Bereiten Sie Puffer für den Proteinaufreinigungsprozess vor.
NaH2PO4 · 2H2OShanghai Reagenz13472-35-0Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, ChinaSA005005Proteinreinigung.
Herkunft 8.5 OriginLab, Northampton, MA, U.S.A.
Perfluoroctansulfonsäure (PFOS)J& K Scientific Ltd, China1763-23-1Die nachgewiesenen Umweltschadstoffe
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)Solarbio, ChinaP0100hemmen den Proteinabbau.
PPARγ-Competitor Assay KitThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Screening Assay KitCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazon (Rosi)aladdin, China122320-73-4Die Agonisten von PPARγ
ShakerZHICHENG, ChinaZWY-211CExpansion der Bakterienkultur und Induktion der Proteinexpression
Triphenylphosphat (TPHP)Macklin, ChinaT819317Die nachgewiesenen Umweltschadstoffe
TrisSolarbio, ChinaT8230Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
TryptoneOXOID Limited, ChinaLP0042BLysogeny Broth (LB) Medium zubereiten.
UltraschallreinigerKimberly, ChinaLHO-1Zerkleinern Sie die Bakterien, um eine vollständige Lyse zu erreichen
HarnstoffSolarbio, ChinaU8020Bereiten Sie Puffer für den Proteinreinigungsprozess vor.
HefeextraktOXOID Limited, ChinaLP0021BLysogeny Broce (LB) Medium zubereiten.

Referenzen

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