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Induktion des Eintritts von Jungtieren aus Bursaphelenchus xylophilus im dritten Stadium der Ausbreitung in die Kryptobiose durch osmotische Regulation

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DOI:

10.3791/67350

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27. Dezember 2024

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion der Ausbreitung von Jungtieren im dritten Stadium (Prädauer-Jungtiere, JIII.) von Bursaphelenchus xylophilus in die Kryptobiose durch osmotische Regulation von Kaliumchlorid (KCl)-Ionen. Diese Methode kann die Erforschung der Stressresistenzmechanismen von B. xylophilus technisch unterstützen.

Zusammenfassung

Kryptobiose ist ein Zustand, in dem Organismen fast ihr gesamtes inneres Wasser verlieren und unter extremem Umweltstress in die Anhydrobiose eintreten. Die ausbreitenden Jungtiere im dritten Stadium (Prä-Dauer-Jungtiere, figure-abstract-1) von Bursaphelenchus xylophilus können durch Dehydration in die Kryptobiose eintreten und sich bei Rehydrierung wieder beleben, wenn sich die Umweltbedingungen verbessern. Die osmotische Regulation ist entscheidend für ihr Überleben in diesem Prozess. In dieser Studie wurden Proben von figure-abstract-2 B. xylophilus von toten Pinus massoniana aufgrund einer Kiefernwelkekrankheit in Ningbo, Provinz Zhejiang, China, gesammelt. Nach dem Eintauchen in 8%ige Kaliumchlorid (KCl)-Lösung figure-abstract-3 ging B. xylophilus nach allmählicher Dehydrierung aufgrund des erhöhten externen osmotischen Drucks figure-abstract-4 durch natürliche Wasserverdunstung in einen kryptobiotischen Zustand über. B. xylophilus konnte dem Stress bei niedrigen Temperaturen bei -20 °C standhalten. figure-abstract-5 B. xylophilus konnte nach Rehydratation wiederbelebt werden, mit einer Überlebensrate von 92,1 %. Dieser Prozess kann den Eintritt von figure-abstract-6 B. xylophilus in die Kryptobiose regulieren und es ihnen ermöglichen, extremen Umgebungen zu widerstehen. Diese in unserer Studie beschriebene Methode ist einfach und zuverlässig und bietet technische Unterstützung für die Untersuchung der Stressresistenzmechanismen von B. xylophilus.

Einleitung

Die Kiefernwelkekrankheit ist eine der schwersten Waldkrankheiten in China1. Der Kiefernfadenwurm Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) stellt eine erhebliche Bedrohung für Kiefernarten wie Pinus massoniana (P. massoniana) dar, indem er sich im Wirt fortpflanzt, was zu schnellem Welken und Absterben führt. Unter ungünstigen Umweltbedingungen nach dem Tod des Wirts können die fortpflanzungsfähigen Jungtiere von B. xylophilus in prä-dauer-Jungtiere eindringen (figure-introduction-1). Diese Jungtiere suchen nach Insektenvektoren, um ihre Übertragung und Ausbreitung fortzusetzen, was zu einem ausgedehnten Sterben der Kiefernwälder führt2.

Kryptobiose ist ein Zustand, in dem Organismen fast ihr gesamtes inneres Wasser verlieren und unter extremem Umweltstress in die Anhydrobiose eintreten3. In diesem Prozess dehydrieren die Organismen allmählich, was zu Bewegungsstopps, vermindertem Stoffwechsel und einem unterbrochenen Lebenszyklus führt4. Unter geeigneten Bedingungen können sie sich nach der Rehydrierung erholen. Die Kryptobiose ermöglicht es Organismen, extremen Umgebungen wie niedrigen Temperaturen zu widerstehen und ihre Lebensdauer zu verlängern5. Nematoden, die 30.000 Jahre lang in der Kryptobiose überlebten, wurden im antarktischen Permafrostgefunden 6.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Nematoden sich während der Dehydrierung an verschiedene abiotische Stressoren anpassen können - wie niedrige Temperaturen, Trockenheit und hoher osmotischer Druck -- indem sie ihre Oberflächenpermeabilität anpassen7. Darüber hinaus können Nematoden ihren Körper einrollen, um die Oberfläche zu verkleinern und die Wasserverlustrate zu minimieren. Zum Beispiel reguliert Caenorhabditis elegans das osmotische Gleichgewicht, indem es Ionen und kleine Moleküle frei durch seine Kutikula passieren lässt, während größere Moleküle dies nicht können8. figure-introduction-2 B. xylophilus weist ebenfalls eine Kryptobiose auf. Während der Dehydratisierungs- und Rehydrationsphasen der Kryptobiose ist die osmotische Regulation essentiell für die Kontrolle des Substanzaustauschs in der Kutikula und damit entscheidend für den Eintritt in die Kryptobiose oder die Erholung von der Kryptobiose9.

In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Induktion der Kryptobiose in figure-introduction-3 B. xylophilus durch osmotische Regulation vorgestellt. Diese Methode ist einfach, effizient und äußerst zuverlässig und bietet technische Unterstützung bei der Erforschung der Stressresistenzmechanismen von figure-introduction-4 B. xylophilus.

Protokoll

1. Sammlung von figure-protocol-1 B. xylophilus

  1. Sammlung infizierter Festplatten von P. massoniana
    HINWEIS: Alle Verfahren entsprachen den Verwaltungsmaßnahmen für das Epidemiegebiet der Kiefernwelkekrankheit und das infizierte Holz sowie anderen geltenden Vorschriften. Als Probenstandort wurde ein mit B. xylophilus infizierter P. massoniana-Wald im Kreis Xiangshan, Stadt Ningbo, Provinz Zhejiang, ausgewählt. P. massoniana, der an der Kiefernwelkekrankheit starb, wurde innerhalb des Probenstandorts gefällt.
    1. Sammeln Sie Rundstämme (5 cm dick) aus dem oberen, mittleren und unteren Teil des Hauptstammes der gefällten Bäume.
    2. Die gesammelten Rundstämme von P. massoniana in 0,5-1 cm dicke Scheiben schneiden und in kleine Streifen von 2-3 cm Länge schneiden.
    3. Legen Sie die kleinen Holzstreifen in versiegelte Beutel und bewahren Sie sie zur weiteren Verwendung in einem Labor auf.
  2. Extraktion von figure-protocol-2 B. xylophilus
    1. Befestigen Sie einen Gummischlauch am schmalen Ende eines langhalsigen Glastrichters mit einem Durchmesser von ca. 15 cm. Befestigen Sie den Gummischlauch mit einem Quetschhahn. Stellen Sie den zusammengebauten Trichter auf einen Trichterständer.
    2. Wickeln Sie die kleinen Holzstreifen komplett in eine einzige Lage Seidenpapier ein und legen Sie sie dann in den Trichter. Gib destilliertes Wasser in den Trichter, bis alle Holzstreifen untergetaucht sind.
      HINWEIS: Nach 12-24 h Standzeit wanderten die Nematoden aus den Holzstreifen heraus und setzten sich am Boden des Trichters10 ab. Seidenpapier verhinderte, dass sich Holzreste absetzten, und ließ Nematoden durch.
    3. Lassen Sie den Quetschhahn am Boden des Trichters langsam los und lassen Sie 2000-5000 μl des Gemisches zur mikroskopischen Untersuchung und morphologischen Identifizierung in eine Petrischale (5 cm Durchmesser) austreten.
    4. Identifizieren Sie figure-protocol-3 B. xylophilus , indem Sie Merkmale wie Stilette, mediane Ösophagusknollen, Lipidtröpfchen und "fingerähnliche" Schwanzformen beobachten11.
    5. Unter dem Mikroskop wird ein einzelner figure-protocol-4 B. xylophilus auf einen Objektträger übertragen, indem jedes Mal 10 μl Flüssigkeit zusammen mit einem Fadenwurm mit einer 10-μl-Pipette aspiriert wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal, um etwa 300 μl der Nematodenmischung zu sammeln.
    6. Nach der Extraktion von figure-protocol-5 B. xylophilus die restlichen Holzstreifen und infizierten Holzmaterialien sterilisieren, um eine weitere Kontamination zu verhindern.

2. Prozesssteuerung zur osmotischen Regelung

  1. Herstellung eines osmotischen Regulationsgemisches
    1. Bereiten Sie eine wässrige Lösung mit 8 % KCl vor.
    2. Geben Sie mit einer Pipette 10 μl der 8%igen wässrigen KCl-Lösung in den Objektträger, der die Mischung von figure-protocol-6 B. xylophilus enthält, wodurch etwa 310 μl einer Mischung aus den Nematoden und der KCl-Lösung erhalten werden.
  2. Regulation des erhöhten osmotischen Drucks und der Dehydrierung von figure-protocol-7 B. xylophilus
    1. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch, so dass das Wasser auf natürliche Weise verdunsten kann. Es würde allmählich den osmotischen Druck der Umgebung erhöhen, was dazu führt, dass Nematoden über etwa 30-60 Minuten dehydrieren.
      HINWEIS: Der Bediener muss nur warten, bis das Wasser auf natürliche Weise verdunstet ist, bis die KCL-Kristalle ausgefällt sind, und den Zustand der Nematoden unter einem Mikroskop beobachten. Es dauert etwa 30-60 Minuten, bis 310 μl der Mischung auf natürliche Weise verdampft sind, bis die KCL-Kristalle ausfällt.
    2. Beobachten Sie den Dehydratisierungsprozess (z. B. Körperkräuseln, Aggregation usw.) von figure-protocol-8 B. xylophilus unter dem Mikroskop. Wenn das Wasser vollständig verdunstet ist und KCl-Kristalle ausfallen, hört B. xylophilus auf, figure-protocol-9 sich zu bewegen und tritt in die Kryptobiose ein.
  3. Behandlung von Stress bei niedrigen Temperaturen mit dem Kryptobiotikum figure-protocol-10 B. xylophilus
    1. Setzen Sie das Kryptobiotikum figure-protocol-11 B. xylophilus für 24 h in eine Umgebung mit konstanter Temperatur von -20 °C.
  4. Regulierung des verminderten osmotischen Drucks und der Rehydratation von figure-protocol-12 B. xylophilus
    1. Etwa 300 μl destilliertes Wasser werden um die Jungtiere herum gegeben, die bei niedriger Temperatur mit der Pipette behandelt wurden. Der Rehydratisierungsprozess, der etwa 30-60 Minuten dauert, verringert allmählich den osmotischen Druck der Umgebung.
    2. Beobachten Sie den Rehydratationsprozess von figure-protocol-13 B. xylophilus (z. B. Körperdehnung, Wiederaufnahme der Bewegung usw.) unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Überlebensrate nach 24 h.

Ergebnisse

In der 8%igen KCl-Lösung zeigte B. xylophilus beim Verdampfen figure-results-1 des Wassers zunächst ein merkliches "Kräuseln", während es beweglich blieb (Abbildung 1A). Sobald das Wasser vollständig verdunstet war, hörten die Nematoden auf, sich zu bewegen und kräuselten sich, mit eingedrückten Oberflächen und angesammelten Lipidtröpfchen (Abbildung 1B), was auf ihren Eintritt in den kryptobiotischen Zustand hinweist. Nach der Zugabe von destilliertem Wasser zu ihrer Umgebung rehydrierten die Nematoden und belebten sich (Abbildung 1C). Nachdem das Wasser verdunstet ist, erscheinen KCL-Kristalle (Abbildung 1D). Abbildung 1E zeigt die morphologischen Merkmale von figure-results-2 B. xylophilus.

Ein Dehydratisierungsexperiment zeigte, dass in einer anfänglichen 8%igen KCl-Lösung die Wasserverdunstung dazu führte figure-results-3, dass B. xylophilus Wasser verlor. Nach der Dehydratisierung figure-results-4 wurden B. xylophilus 24 Stunden lang bei niedrigen Temperaturen bei -20 °C unter Stress gesetzt; die durchschnittliche Überlebensrate lag bei 92,1 %11. Verglichen mit einer Überlebensrate von 0% in der Kontrollgruppe, die nicht in einen kryptobiotischen Zustand übergegangen war, deuteten die obigen Daten darauf hin, dass Dehydratisierung die Überlebensrate von figure-results-5 B. xylophilus unter niedrigen Temperaturbedingungen signifikant erhöhen könnte.

Während der Rehydrationsphase nach der Kryptobiose von figure-results-6 B. xylophilus beobachteten wir, dass 100% der Nematoden in vivo "Blasen" aufwiesen, wenn sie von 40%iger KCl-Lösung in destilliertes Wasser überführt wurden (Abbildung 2).

figure-results-7
Abbildung 1: Der Dehydrations-Kryptobiose-Rehydratationsprozess von figure-results-8 B. xylophilus. Dieses Bild zeigt den Kryptobioseprozess bei figure-results-9 B. xylophilus, einschließlich des (A) Dehydratisierungsstadiums, des (B) Kryptobiosestadiums, des (C) Rehydrationsstadiums, des (D) KCL-Kristallisationsstadiums und (E) figure-results-10 B. xylophilus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-11
Abbildung 2: Akkumulation von Fettgranulaten in nicht wiederbelebten figure-results-12 B. xylophilus. Dieses Bild zeigt den Zustand von figure-results-13 B. xylophilus nach der Rehydration, der durch das Vorhandensein von in vivo blasenförmigen Fettgranulaten gekennzeichnet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In dieser Studie figure-discussion-1 wurde B. xylophilus aus toten P. massoniana in Ningbo, Provinz Zhejiang, gesammelt. Es ist zu beachten, dass figure-discussion-2 B. xylophilus aus einer gemischten Population mit unterschiedlichen Instadien ausgewählt wurde. Konkret wurden Rundstämme mit einer hohen Dichte an B. xylophilus ausgewählt, gefolgt von einem Screening auf figure-discussion-3 B. xylophilus. Im Winter, wenn die tägliche Tiefsttemperatur in der Provinz Liaoning bei etwa -20 °C liegt, kann eine große Anzahl von B figure-discussion-4 . xylophilus aus toten Pinus tabuliformis gewonnen werden, was den Selektionsprozess in diesem Experiment vereinfachte12.

Während des kryptobiotischen Prozesses fördert die langsame Dehydratisierungsrate der Nematoden ihr Überleben und verhindert strukturelle Schäden an ihren Proteinen13. Die Dehydratisierungszeit ist entscheidend für die Bestimmung der Überlebensrate von figure-discussion-5 B. xylophilus. In dieser Studie wurde eine KCl-Lösung in einer Anfangskonzentration von 8 % verwendet, deren Konzentration durch die natürliche Verdunstung von Wasser allmählich erhöht wurde, so dass B. xylophilus langsam dehydrieren und in die Kryptobiose eintreten konntefigure-discussion-6. Verdunstet Wasser zu schnell oder werden die Nematoden direkt in eine hochkonzentrierte KCl-Lösung gegeben, sinkt ihre Überlebensrate erheblich.

Die in dieser Studie beschriebene Methode hat mehrere Vorteile. Die experimentellen Materialien sind leicht zugänglich und benötigen nur KCl-Lösung und destilliertes Wasser, um die Dehydratisierung und Rehydrierung von figure-discussion-7 B. xylophilus zu regulieren. Die Verfahren sind einfach: Die Dehydrierung erfolgte durch natürliche Verdunstung, und die Rehydrierung wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser erreicht. Der gesamte Vorgang kann innerhalb von 2 h abgeschlossen werden. Diese Methode weist hohe Erfolgs- und Überlebensraten auf, wobei der größte Teil von figure-discussion-8 B. xylophilus nach der Dehydrierung in die Kryptobiose eintritt und der Großteil nach der Rehydrierung wiederbelebt wird11.

Die vorgeschlagene Methode ist anwendbar für die Regulierung des kryptobiotischen Zustands sowohl von B. xylophilus als auch figure-discussion-9 von Jungtieren im vierten Stadium der Ausbreitung (figure-discussion-10)14. Es ist jedoch möglicherweise nicht wirksam für das Vermehrungsprodukt B. xylophilus.

In den letzten Jahren hat sich die durch B. xylophilus verursachte Kiefernwelkekrankheit von Südchina in die nördlichen Gebiete ausgebreitet. figure-discussion-11 B. xylophilus, der die Kiefern in diesen kälteren nördlichen Regionen bewohnt, neigt zu einer größeren Kälteresistenz15. Die vorgeschlagene Methode kann bei B. xylophilus eine Kryptobiose figure-discussion-12 induzieren und so ihre Widerstandsfähigkeit gegen Kälte und Trockenheit erhöhen. Insgesamt kann diese Methode eine technische Unterstützung für die Untersuchung der Stressresistenzmechanismen von B. xylophilus und des Übertragungsmechanismus der Kiefernwelkekrankheit bieten.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund des State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Fördernummer CAFYBB2020ZY001-2), Enterprise Research Projects (202404016-4320) und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 32271896) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Glas-RutscheBiolandNr. GS7101-752575 mm & mal; 25 mm & mal; 1 mm
Langhalsiger GlastrichterNanjing Kangluoda Experimentelle TechnologieN/Aca. 150 mm
MikroskopPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
PetrischaleNanjing Kangluoda Experimentelle Technologie  TB-62493579274550 mm & mal; 50 mm
PinchcockNanjing Kangluoda Experimentelle Technologie  TB-62497331174336 mm & mal; 11 mm  &mal; 55 mm
PipetteEppendorf312300001210– 100 &Mikro; L
Kaliumchlorid (KCL)Solarbio LebenswissenschaftenNr. P9921500 g
GummischlauchNanjing Kangluoda Experimentelle TechnologieTB-6249234570947 mm & mal; 5 mm
SterilisatorBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75L
Seidenpapier Herz-zu-Herz-AbdruckM322,5 cm &mal; ca. 21,5 cm

Referenzen

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Schlagwörter

Induktion der KryptobioseKiefernholznematodeJuvenilstadium 3AnhydrobioseDehydratisierungsprotokollNiedrigtemperaturstressKaliumchloridl sungberlebensrate nach Rehydratisierung

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