Flowzytometrie-Analyse der Gewebefaktor-Expression bei menschlichen Thrombozyten

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Quantifizierung des Prozentsatzes an Gewebefaktor-(TF)-positiven Blutplättchen mittels Vollblutzytometrie und bewertet das Protein: (1) intrazellulär unter Ruhebedingungen und (2) auf der Zelloberfläche, sowohl in Ruhezustand als auch in aktivierten Bedingungen. Für die Bewertung von TF-positiven Blutplättchen im plättchenreichen Plasma wird auch eine Anleitung bereitgestellt.

Zusammenfassung

Eine Teilmenge der zirkulierenden menschlichen Blutplättchen speichert den Tissue Factor (TF) intrazellulär, den wichtigsten Aktivator der Blutgerinnungskaskade und Thrombusbildung. Bei der Aktivierung der Blutplättchen wird TF auf der Zellmembran freigesetzt, wo es an FVII bindet, was letztlich zur Thrombinbildung führt. Da (1) die Werte der TF-positiven Blutplättchen in verschiedenen klinischen Kontexten steigen, was zum prothrombotischen Phänotyp des Patienten beiträgt, und (2) verschiedene Medikamente die thrombotenassoziierte TF-Expression modulieren können, ist eine standardisierte Methode zur Beurteilung TF-positiver Blutplättchen wertvoll, da deren Bewertung in der Vergangenheit umstritten war. Hier skizzieren wir ein Protokoll zur Messung des Prozentsatzes der TF-positiven Blutplättchen mittels Durchflusszytometrie in Vollblut- und plättchenreichem Plasma (PRP)/gewaschenen Thrombozyten. Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Anweisungen zur Quantifizierung des Prozentsatzes der TF-positiven Blutplättchen zu geben, indem das Protein (1) intrazellulär unter Ruhebedingungen und (2) auf der Zelloberfläche, sowohl in Ruhe- als auch in aktivierten Bedingungen, bewertet wird. Der erste Abschnitt liefert wichtige Informationen für die korrekte Durchführung der Blutabnahme, um sicherzustellen, dass die Voranalyseverfahren die Ergebnisse nicht beeinflussen. Als nächstes konzentriert sich das Protokoll auf die Probenvorbereitung und Kennzeichnung für die Flowzytometrie-Analyse. Detaillierte Schritte für Zellstimulation, Markierung, Fixierung und Permeabilisierung – wo nötig – sind dargelegt. Abschließend werden Anweisungen für Flowzytometrie-Einstellungen beschrieben, um die Blutplättchenpopulation korrekt zu identifizieren und TF-positive Ereignisse zu analysieren. Schließlich umfasst die Methode das Verfahren zur Herstellung von PRP, wenn TF-positive Thrombozyten in isolierten Blutplättchen gemessen werden sollen. Da nur eine Teilmenge der Thrombozyten TF enthält, ist es wichtig sicherzustellen, dass diese Thrombozyten während der Zentrifugationsschritte, die zur Gewinnung von PRP erforderlich sind, nicht verloren gehen.

Einleitung

Tissue Factor (TF), ein transmembranes Glykoprotein und Schlüsselaktivator der Blutgerinnungskaskade, wird durch eine Teilmenge von ~20 % bis 30 % der zirkulierenden menschlichen Blutplättchen¹ exprimiert, insbesondere solche mit größerer^{Größe 2}. Bei der Aktivierung durch klassische Thrombozytenagonisten wie Adenosindiphosphat (ADP) und Thrombin setzen Thrombozyten funktionell aktives TF auf ihrer Oberfläche in konzentrationsabhängiger Weise frei, wodurch es an den Faktor VII/VIIa binden kann, was letztlich zur Thrombingeneration ^1,3,4,5,6 führt. Bemerkenswert ist, dass bei pathologischen Erkrankungen wie koronarer Herzkrankheit (CAD)⁷, schwerer akuter respiratorischer Syndrom-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)-Infektion⁸, Migräne mit Aura assoziiert mit patentem Foramen ovale (MHA-PFO)⁹, Krebs¹⁰ und Sepsis¹¹ die Zahl der TF-positiven Thrombozyten signifikant ansteigt, was zum erhöhten thrombotischen Risiko in diesen klinischen Einrichtungen beiträgt.

Trotz dieser überzeugenden Belege bleibt der Nachweis von TF-positiven Blutplättchen ein Diskussionsthema in der wissenschaftlichen Gemeinschaft ^6,12,13. Methodische Herausforderungen, darunter präanalytische Variablen, Probenvorbereitung und Antikörperspezifität, wurden als mögliche Gründe für die widersprüchlichen Ergebnisse in der Literatur 2,4,12,14 vorgeschlagen. Daher ist es entscheidend, einen standardisierten Test auf Basis eines klar definierten Protokolls zur Messung der TF in menschlichen Blutplättchen einzurichten.

In diesem Zusammenhang ist die Vollblutzytometrie die einzige Technologie, die die Analyse von TF-positiven Blutplättchen mit minimaler Probenbehandlung ermöglicht, was entscheidend ist, um den Verlust dieser Thrombozytengruppe zu vermeiden.

In diesem Artikel schlagen wir ein Protokoll zur Messung des thrombozytassoziierten TF mittels Vollblutflusszytometrie vor, wobei das Protein (1) intrazellulär unter Ruhebedingungen und (2) auf der Zelloberfläche sowohl in Ruhe- als auch in aktivierten Zuständen bewertet wird. Es werden auch Anweisungen gegeben, wenn die Bewertung von TF-positiven Blutplättchen im plättchenreichen Plasma (PRP) erforderlich ist.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Ethischen Ausschuss der Institution (Nr. 70/24, 18.06.24 n. Chr.) genehmigt, und von allen Blutspendern wurde eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Das Protokoll führt den Benutzer durch sieben Hauptschritte (Abbildung 1). Der erste Schritt behandelt das Verfahren zur Durchführung der Blutprobennahme. Die Schritte 2 und 3 beschreiben das Antikörpertitrationsprotokoll und die Probenvorbereitung für die Analyse der intrazellulären TF-Expression mit einem phycoerythrin-(PE)-markierten αCD142/HTF1-monoklonalen Antikörper (mAb). Schritt 4 beschreibt das Protokoll zur Bewertung des auf der Thrombozytenoberfläche exponierten Proteins mittels einer indirekten Färbungsmethode mit αCD142/HTF1 mAb. Aufgrund der sterischen Behinderung durch das Fluorochrom bindet das für die intrazelluläre Färbung verwendete PE-markierte mAb nicht an die katalytische Domäne des oberflächenexponierten Proteins. Daher wird ein Protokoll für die indirekte Färbung mit einem Alexa-Fluor-633-markierten sekundären mAb vorgeschlagen. Die Schritte 5 und 6 beschreiben die Phasen der Durchflusszytometrieanalyse. Der letzte Schritt beschreibt das Verfahren zur Herstellung von plättchenreichem Plasma (PRP), um den Verlust der großen Thrombozytensubpopulation zu vermeiden. Details zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Blutentzug

HINWEIS: Die Blutentnahme sollte nur nach Einhalt der Genehmigung des Ethischen Ausschusses durchgeführt werden.

1. Nehmen Sie Blutproben durch periphere Venen- oder Nadelkanüleproben aus einem Arm, der nicht von peripheren venösen Infusionen betroffen ist, vorzugsweise aus der Antecubitalvene.
   1. Für periphere venöse Probenahmen wird das Tourniquet angelegt und nach dem Einführen einer G19-Schmetterlingsnadel in die Vene entfernt, um eine Thrombozytenaktivierung zu verhindern (Abbildung 2).
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Schmetterlingsnadel, die kleiner als G21 ist, um eine Thrombozytenaktivierung zu vermeiden.
   2. Bei venöser Probenahme mit Nadelkanüle wird das Tourniquet während der Probenahme zu keinem Zeitpunkt angewendet. Falls nötig, waschen Sie die Probe vor der Entnahme mit 0,9 % Kochsalzlösung. Entsorge immer die ersten 5 ml Blut, bevor du mit dem Befüllen der Röhrchen beginne.
2. Entnehmen Sie 2 ml Blut in einen EDTA-Vakuumbehälter (zur Verwendung zur Blutzellzählung). Rühren Sie den Schlauch vorsichtig dreimal, um eine vollständige Vermischung von Blut und Antikoagulans sicherzustellen.
3. Nehmen Sie Blut in einen 0,129 M natriumcitrathaltigen Vakuumbehälter zur Analyse der thrombozytenassoziierten TF-Expression. Füllen Sie den Vakuumbehälter vorsichtig auf das angegebene Niveau, um das korrekte Blut-/Antikoagulanzien-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Wenden Sie die Röhren vorsichtig fünfmal um, um eine gründliche Vermischung des Blutes mit dem Antikoagulans sicherzustellen und so Gerinnselbildung und Hämolyse der Proben zu verhindern.
   HINWEIS: Der Einsatz von 0,129 M Citrat-Antikoagulans wird empfohlen, um den Nachweis der thrombozytenassoziierten TF mit dem HTF1-Klon des αCD142 mAb zu optimieren. Wenn es notwendig ist, Thrombozyten aus Vollblut zu isolieren, entnehmen Sie einen zweiten 0,129 M Natriumcitrat-Vakuumbehälter für die plättchenreiche Plasmapräparation (PRP).
4. Halten Sie die Staubsauger aufrecht in einem Schlauchhalter. Schütteln Sie sie nicht auf rotierenden oder kippbaren Platten und vermeiden Sie pneumatische Fördersysteme. Kühlen Sie die Blutproben nicht, um eine Thrombozytenaktivierung zu verhindern.
   HINWEIS: Blutproben sollten vorzugsweise innerhalb von 15 Minuten nach dem Absetzen verarbeitet werden, wenn ein weiterer granularassoziierter Thrombozytenaktivierungsmarker zusammen mit TF gemessen werden soll. Andernfalls sollten die Proben spätestens 3 Stunden vor der Entnahme verarbeitet werden (Abbildung 3).

2. Titration des Anti-TF-Antikörpers (zur intrazellulären TF-Bewertung)

HINWEIS: Die Bestimmung des intrazellulär gespeicherten TF erfolgt mit dem PE-αCD142/HTF1 mAb.

1. Antikörpertitration mittels Perlen
   HINWEIS: Die Verwendung von Perlen ermöglicht es, die korrekte Menge an Antikörpern zu definieren (d. h. die Antikörperkonzentration, die die größte Trennung der Fluoreszenzspitzen zwischen positiven und negativen Proben erzeugt). Diese Analyse erfolgt mit zwei Proben, einer wirklich positiven und einer wirklich negativen. Die Antikörperkonzentration wird vom Hersteller nicht angegeben (siehe Materialtabelle), daher wird die Antikörpertitration mit fünf Verdünnungspunkten durchgeführt.
   1. Zentrifugiere den Antikörper bei 17.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Um die fünf Antikörperverdünnungspunkte vorzubereiten, pipettieren Sie 40 μL Antikörper in Tube 1 und 20 μL PBS in Tuben 2 bis 5. Führen Sie vier aufeinanderfolgende serielle 1:2-Verdünnungen durch, indem Sie 20 μL von Röhre 1 auf Röhre 2 übertragen und dann weiter.
   2. Bereiten Sie für jedes Antikörpervolumen ein Reagenzglas vor. Gib jedem Reagenzglas einen Tropfen negative Perlen und einen Tropfen positiven Perlen. Geben Sie sofort 20 μL jeder Antikörperverdünnung ins Reagenzglas und Wirbel. 20 Minuten im Dunkeln bei Zimmertemperatur ausbrüten.
   3. Gib 1 ml 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jeder Röhre und jedem Wirbel.
   4. Nehmen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers auf und speichern Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen im "Beads"-Gate. Die optimale Antikörperkonzentration ist diejenige, die die größte Trennung zwischen positiven und negativen Peaks bietet.
2. Antikörpertitration an Thrombozyten
   HINWEIS: In der Regel sollte die optimale Antikörperkonzentration, die mit den Perlen identifiziert wurde, an den zu färbenden Zellen verifiziert werden – in diesem Fall Thrombozyten im Vollblut – überprüft werden.
   1. Fixierung
      1. Wenden Sie den Natriumcitrat-Vakuumbehälter fünfmal vorsichtig um, um Blut und Antikoagulans gründlich zu mischen. 50 μL Blut in ein 1,5 ml Rohr übertragen, 950 μL 1%-Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, vorsichtig mischen und die Probe 90 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
      2. Zentrifugiere die Probe bei 1.500 x g für 5 Minuten mit Bremse bei Raumtemperatur.
      3. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet wieder, indem Sie vorsichtig 1 ml 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ pipetieren, pH 7,4.
   2. Permeabilisierung
      1. Bereiten Sie für jedes zu testende Antikörpervolumen ein Rohr vor (testen Sie das mit der Perlentitration identifizierte Volumen sowie eine höhere und eine niedrigere Verdünnung, z. B. 10 μL, 5 μL, 2,5 μL bei 5 μL) und ein Rohr für die Fluoreszenz-Minus Eins (FMO)-Kontrolle.
      2. Geben Sie 100 μL fixiertes Blut in jedes Rohr und zentrifugieren Sie sie bei 1.500 x g für 5 Minuten mit Bremse bei Raumtemperatur.
      3. Entfernen Sie das Supernatant, suspendieren Sie das Pellet in 100 μL 0,1 % Triton-PBS, um die Proben zu permeabilisieren, und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Flecken
      1. Zentrifugieren Sie den Antikörper bei 17.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Fügen Sie die erforderlichen Antikörpervolumina zu jedem Reagenzglas gemäß 2.2.2.1 hinzu und mischen Sie.
      2. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      3. Gib 300 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jeder Tube und mische. Nehmen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer auf (siehe Schritt 5).
      4. Berechnen Sie den Fleckindex gemäß folgender^{Formel 15}:
                                
         wobei MFI_pos die mittlere Fluoreszenzintensität der positiven Ereignisse ist, MFI_neg die der negativen Ereignisse und SD die Standardabweichung der negativen Population.
      5. Wählen Sie die niedrigste Antikörperkonzentration, die den höchsten Färbeindex bietet.
         HINWEIS: Unter den aktuellen experimentellen Bedingungen wird der höchste Färbeindex für PE-αCD142/HTF1 mAb mit 5 μL Antikörper erreicht.

3. Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrieanalyse der intrazellulären TF-Expression

1. Vollblutfixierung und Permeabilisierung
   1. Für die intrazelluläre TF-Analyse fixieren und permeabilisieren Sie Vollblut gemäß dem in Schritt 2 beschriebenen Verfahren.
2. Färbeverfahren
   HINWEIS: Im folgenden Protokoll wird die Thrombozytenpopulation mittels αCD61-PerCP-Färbung identifiziert. Weitere Populationsmarker können nach Ermessen des Betreibers verwendet werden.
   1. Bereiten Sie ein Rohr für die Fluoreszenz-Minus Eins (FMO)-Kontrolle und ein Rohr für TF-Färbung vor. Fügen Sie 100 μL fixiertes und permeabilisiertes Vollblut zu jedem Röhrchen zusammen mit den in Tabelle 1 aufgeführten Antikörpern hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   3. Gib 300 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jeder Tube und mische. Bewahren Sie die gefärbten Proben im Dunkeln auf, bis zur Durchflusszytometrieanalyse (siehe Schritt 5).
      HINWEIS: Um die Kompensationsmatrix zu berechnen, bereiten Sie die Proben wie in Tabelle 2 beschrieben vor.

4. Probenvorbereitung zur Durchflusszytometrieanalyse der zelloberflächenassoziierten TF-Expression in ruhenden und aktivierten Thrombozyten

HINWEIS: Für den Nachweis von zelloberflächenassoziierter TF verwenden Sie unmarkiertes αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) und Alexa Fluor 633 Ziegen-anti-Maus-IgG (2 mg/ml) als sekundären Antikörper zur Signalerkennung. Adenosin 5'-Diphosphat (ADP) wird als Thrombozytenagonist verwendet, um die Exposition von TF auf der Zelloberfläche zu induzieren. Ein PE-markierter Antikörper wird als Thrombozytenpopulationsmarker verwendet, um Überlauf zu minimieren, was durch Signalkompensation überprüft wird.

1. TF-Färbung
   1. Verdünne αCD142/HTF1 mAb 1:100 in 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg^++, pH 7,4, um eine Arbeitskonzentration von 10 μg/mL zu erhalten. Verdünne Alexa Fluor 633 Ziegen-Anti-Maus-IgG 1:10 in 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, um eine Arbeitskonzentration von 200 μg/mL zu erhalten.
   2. Bereiten Sie die drei Probenröhrchen vor und geben Sie 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg^++, pH 7,4, wie in Tabelle 3 angegeben.
   3. Geben Sie 7,5 μL verdünntes αCD142/HTF1 mAb ab und fügen Sie 5 μL ADP (200 μM) hinzu, um eine Endkonzentration von 10 μM ADP zu erhalten. Wenden Sie den Citrat-Vakuumbehälter vorsichtig fünfmal um, um Blut und Antikoagulans gründlich zu mischen, und geben Sie dann 5 μL Vollblut in jedes Rohr. Mische die Proben vorsichtig.
   4. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Probenfixierung
   1. Jede Probe wird fixiert, indem man 300 μL 1% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügt und die Proben 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
      HINWEIS: Markierte Proben, die mit 1 % PFA fixiert und bei 4 °C gelagert sind, bleiben bis zu 4 Tage stabil.
   2. Fügen Sie 300 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie bei 1500 x g für 5 Minuten mit der Pause bei Raumtemperatur.
   3. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 95 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, durch sanftes Pipetteren.
3. Färbung mit dem sekundären Antikörper
   1. Geben Sie 5 μL verdünntes Alexa Fluor 633 IgG ab und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   2. Fügen Sie 300 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie bei 1500 x g für 5 Minuten mit der Pause bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 95 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4.
   3. Gib 5 μL αCD41-PE in jedes Rohr (siehe Tabelle 4). Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   4. Gib 300 μL 1x PBS ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺, pH 7,4, zu jeder Tube und mische.
   5. Bewahren Sie die gefärbten Proben im Dunkeln auf, bis zur Durchflusszytometrieanalyse (siehe Schritt 6).
      HINWEIS: Um die Kompensationsmatrix zu berechnen, bereiten Sie die Proben gemäß den Schritten 4.1-4.3 und wie in Tabelle 5 und Tabelle 6 beschrieben vor.

5. Durchflusszytometrieanalyse der intrazellulären TF-Expression

HINWEIS: Das folgende Verfahren bezieht sich auf Ermittlungen an einem Referenzdurchflusszytometer; daher sollten die berichteten Schauplätze und Handlungen als repräsentativ betrachtet werden. Das Protokoll kann auf jedes hochempfindliche Durchflusszytometer der neuen Generation angewendet werden. Schalten Sie das Durchflusszytometer lange vor der Probenentnahme ein, um die Stabilität des Lasers zu gewährleisten. Waschen Sie die Fluidik und die Flusszelle gründlich, da Thrombozyten klein sind und etwaige Zellreste die Visualisierung der Thrombozytenpopulation im Punktdiagramm des Vorwärts-Streu-/Seitenstreubereichs (FSC-A/SSC-A) beeinträchtigen können. Führen Sie eine Qualitätskontrolle mit Qualitätsperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und reinigen Sie erneut die Fluidik, um eventuelle Rückstände zu entfernen.

1. Aufbau der Übernahme
   1. Erstellen Sie ein FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm auf einer Log-Skala, das alle Ereignisse darstellt (Abbildung 4A). Erstellen Sie ein CD61-A/SSC-A-Punktdiagramm auf einer Log-Skala, das alle Ereignisse darstellt (Abbildung 4B).
   2. Passen Sie die PE (Y-585) und PerCP (B690) Verstärkung entsprechend der täglichen Qualitätskontrolle an. Stellen Sie die Schwelle bei SSC-H ungefähr auf 2000 und auf 1000 bei PerCP (B690-H), um die Thrombozytenpopulation zu visualisieren. Stelle die Durchflussrate auf NIEDRIG.
   3. Zeichnen Sie einen Bereich zwischen 10³ und 10⁵ namens "CD61⁺", um die Thrombozytenpopulation zu identifizieren.
   4. Ermittle Einzelflecken-Kontrollen, um die Kompensationsmatrix zu berechnen, und dann die Proben. Speichern Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen innerhalb des "CD61^+"-Gattes (Abbildung 4D, E). Beginnen Sie mit der Aufnahme 5-10 Sekunden nach Beginn der Sample-Aufnahme.

6. Durchflusszytometrieanalyse der Oberflächen-TF-Expression

1. Erstellen Sie ein FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm auf einer Log-Skala, das alle Ereignisse zeigt (Abbildung 5A), und ein CD41-A/SSC-A-Punktdiagramm auf einer Log-Skala, das alle Ereignisse zeigt (Abbildung 5B).
2. Passen Sie die Alexa-Fluor-633-Verstärkung und die PE-Verstärkung (Y-585) entsprechend der täglichen Qualitätskontrolle an, setzen Sie die Schwelle ungefähr auf 1000 bei SSC-H und auf 2500 bei PE (Y585-H), um die Thrombozytenpopulation wie in Abbildung 5B dargestellt zu visualisieren. Stelle die Durchflussrate auf NIEDRIG.
3. Zeichnen Sie einen Bereich zwischen 10⁴ und 10⁵ namens "CD41⁺", um die Thrombozytenpopulation zu identifizieren.
4. Ermittle Einzelflecken-Kontrollen, um die Kompensationsmatrix zu berechnen, und dann die Proben. Zeichnen Sie eine Datendatei mit 10.000 Ereignissen innerhalb des "CD41^+"-Gattes auf (Abbildung 5D,E). Beginnen Sie mit der Aufnahme 5-10 Sekunden nach Beginn der Sample-Aufnahme.

7. Analyse von TF-positiven Blutplättchen im plättchenreichen Plasma

1. Thrombozytenreiches Plasma (PRP)-Präparat
   HINWEIS: Die Thrombozytenisolierung muss bei Raumtemperatur erfolgen, um eine Zellaktivierung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Reagenzien und Instrumente zwischen 18 °C und 22 °C liegt. Vermeiden Sie schnelles Pipettern und starkes Schütteln während des gesamten Verfahrens.
   1. Mischen Sie den 0,129 M Natriumcitrat-Vakuumbehälter vorsichtig fünfmal und messen Sie die Thrombozytenzahl zweimal auf einem Blutzellzähler, um den Prozentsatz der wiedergewonnenen Thrombozyten zu berechnen.
      HINWEIS: Verwenden Sie den Mittelwert der beiden Bestimmungen als Thrombozytenkonzentration.
   2. Zentrifugieren Sie den 0,129 m großen Natriumcitrat-Vakuumbehälter bei 100 x g für 10 Minuten ohne Bremsung bei Raumtemperatur (Abbildung 6). Sammeln Sie das gewonnene PRP, übertragen Sie es in ein 10-ml-Polypropylenrohr und notieren Sie das gesammelte Volumen.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Polystyrolröhrchen, um eine Thrombozytenaktivierung zu vermeiden.
   3. Zählen Sie die Blutplättchen zweimal im PRP mit einem Blutzellzähler und berechnen Sie den prozentualen Prozentsatz der Thrombozytenerheilung wie folgt:
      
      HINWEIS: Wenn die Erzielung unter 65 % liegt, ist die Thrombozytenpopulation im Vollblut nicht vollständig repräsentativ. Überlegen Sie, die Vorbereitung wegzuwerfen.
2. Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrieanalyse der intrazellulären und oberflächenassoziierten TF-Expression in PRP
   1. Zur Analyse der intrazellulären und oberflächenassoziierten TF-Expression bei PRP verwenden Sie dasselbe Protokoll wie für die Vollblutanalyse beschrieben (siehe Schritte 3-6).

Ergebnisse

Eine Zusammenfassung der thrombozytenassoziierten TF-Expressionsanalyse ist im in Abbildung 1 gezeigten Flussdiagramm beschrieben. Die Schritte umfassen: (1) Blutentnahme: Blut aus der menschlichen peripheren Vene, vorzugsweise aus der antecubitalen Vene, mit einer G19-Schmetterlingsnadel oder einer Nadelkanüle ohne Tourniquet und mit antikoagulantenhaltigen Vakuumbehältern. (2) Probenverarbeitung: Verarbeiten Sie die Proben entsprechend der Art der durchzuführenden TF-Bewertung. (3) Probenkennzeichnung: Kennzeichnung der Proben mit bestimmten Antikörpern. (4) Flowzytometrie-Analyse: Analyse der Proben, um Oberflächen- und intrazelluläre TF zu erkennen.

Während des Blutentzugs muss besonders darauf geachtet werden, eine Thrombozytenaktivierung zu vermeiden. Zu diesem Zweck werden zwei Vorsichtsmaßnahmen getroffen: Das Turniquet kurz nach dem Einführen der Nadel in die Vene entfernen und das Blut im ersten entnommenen Vakuumbehälter entsorgen. Ohne den Einsatz des Tourniquets hat die Thrombozytenpopulation, die in einem FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm dargestellt ist, eine typische Form, wie in Abbildung 2A dargestellt. Umgekehrt führen die physikalischen Eigenschaften der Thrombozytenpopulation durch den Einsatz des Tourniquets zu einer verlängerten Form, die der Morphologie ähnelt, die nach der Stimulation mit einem klassischen Thrombozytenagonisten wie ADP beobachtet wird (Abbildung 2B,C).

Experimente, die zur Bewertung der Stabilität der thrombozytenassoziierten TF-Expression über die Zeit durchgeführt wurden, zeigten, dass sie nach der Blutentnahme 3 Stunden stabil war (Abbildung 3). Bei der Kombination der Messung der TF-Expression mit der eines Markers der Thrombozytenaktivierung, wie P-Selectin, wird empfohlen, die Blutprobe so früh wie möglich zu verarbeiten, um eine Thrombozytendegranulation zu vermeiden.

Zur Analyse der intrazellulär gespeicherten TF wird Vollblut in 1 % PFA fixiert, mit PBS-Triton permeabilisiert und anschließend mit einem PE-markierten Antikörper gefärbt. Die Thrombozytenpopulation wird auf einem logarithmischen FSC-A/SSC-A-Diagramm (Abbildung 4 A,D) und durch αCD61 mAb-Färbung (Abbildung 4 B,E) identifiziert. Die Ergebnisse der Analyse der intrazellulären TF bei gesunden Probanden (n = 377) zeigten, dass TF innerhalb von 26,8 % ± 4,8 % der zirkulierenden Blutplättchen vorhanden ist (Abbildung 4F).

Eine Flowzytometrieanalyse der oberflächenassoziierten TF-Expression wurde unter Ruhebedingungen und nach Zellstimulation mit ADP 10 μM durchgeführt. Die Vollblutplättchenpopulation, markiert mit αCD41 mAb, wurde auf einem logarithmischen FSC-A/SSC-A-Diagramm identifiziert (Abbildung 5A,B). Die Ergebnisse zeigten, dass bei gesunden Probanden (n = 377) der TF bei 2,8 % ± 1,4 % der Ruheplättchen (Abbildung 5D-F) angegeben wird und bei der Aktivierung bis zu 24,5 % ± 5,8 % ansteigt (Abbildung 5G-I). TF wird durch die Thrombozyten-Teilmenge mit der größten Größe ausgedrückt (Abbildung 5D, G, grüne Punkte). Darüber hinaus zeigt eine Analyse durch bildgebende Flowzytometrie, dass das TF-Signal nur mit αCD61-positiven Ereignissen und nicht mit αCD45-positiven Ereignissen assoziiert ist (Abbildung 7).

Wie bereits erwähnt, wird TF in einer Teilmenge von Thrombozyten gespeichert, die durch die größte Größe innerhalb der gesamten Population gekennzeichnet sind. Daher ist es wichtig, diesen Thrombozytenanteil während der PRP-Vorbereitung nicht zu verlieren. Nach den im Methodenabschnitt (Schritt 7) angegebenen Indikationen ist es möglich, eine Thrombozytenpopulation innerhalb des PRP zu isolieren, die repräsentativ für die im Vollblut vorhandene ist. Wie in Abbildung 6 gezeigt, ist das Flowzytometrie-Dot-Plot der Thrombozytenpopulation, das durch 100 x g Vollblutzentrifugation erhalten wird, dem von Vollblut hinsichtlich der FSC-Verteilung sehr ähnlich (Abbildung 6 A,B). Im Gegensatz dazu hat die wiedergewonnene Blutplättchenpopulation bei höherer Kraft und längerer Zentrifugationszeit, wie oft in der Literatur 12,14,16 berichtet, einen niedrigeren FSC im Vergleich zu Vollblut (Abbildung 6C), was auf den Verlust der größeren Blutplättchen hindeutet, also die hoch TF-positiven.

Abbildung 1: Schematisches Diagramm zur Analyse der thrombozytenassoziierten TF-Expression und zur Isolierung der Blutplättchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Dichtediagramme der Thrombozytenpopulation, analysiert mit Vollblutflusszytometrie. (A) Thrombozytenpopulation analysiert in einer Blutprobe ohne Tourniquet oder (B) mit Tourniquet. (C) Die mit ADP stimulierte Blutplättchenpopulation wird zum Vergleich gemeldet. WBC: Weiße Blutkörperchen; RBC: Rote Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Stabilität der zelloberflächenassoziierten TF-Expression über die Zeit. Die thrombozytenassoziierte TF-Expression ruhender Thrombozyten wurde zu 4 verschiedenen Zeitpunkten nach Blutentzug in der X-Achse wie folgt analysiert: T0 = unmittelbar nach der Blutentnahme; T1 = 1 Stunde nach Blutentnahme; T2 = 2 Stunden nach der Blutentnahme; T3 = 3 Stunden nach der Blutentnahme. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Repräsentative Flowzytometrieanalyse der intrazellulär gespeicherten TF. Die Thrombozytenpopulation (rot) im Vollblut wird im FSC/SSC-A-Punktdiagramm (A,D) und durch αCD61 mAb-Färbung (B,E) identifiziert. Die TF-Expression wird mit einem PE- αCD142/HTF1 mAb (grüne Punkte) analysiert. Histogrammdiagramme werden verwendet, um negative (C) und positive (F) Ereignisse zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Repräsentative Flusszytometrieanalyse oberflächenassoziierter TF-positiver Thrombozyten. Frisches Vollblut wird mit αCD142/HTF1 mAb markiert, dann mit 1 % PFA fixiert und mit dem sekundären mAb sowie αCD41 mAb markiert. Die Blutplättchenpopulation (rot) im Vollblut wird im FSC/SSC-A-Punktdiagramm (A,D,G) und durch αCD41 mAb-Färbung (B,E,H) identifiziert. Die TF-Expression im Ruhezustand (D-F) und nach ADP-Stimulation (G-I) wird durch Etikettierung mit αCD142/HTF1 mAb (grüne Punkte) quantifiziert. Repräsentative Histogrammdiagramme von negativen (C) und positiven (F,I) Proben werden gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Einfluss unterschiedlicher Zentrifugationskräfte auf die PRP-Präparation. (A-C) Durchflusszytometrieanalyse der Blutplättchenpopulation im Vollblut, PRP bei 100 x g und bei 350 x g hergestellt. Der Referenzbereich der Thrombozytenpopulation auf FSC-H/SSC-H wird durch gestrichelte Linien angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Bewertung der TF-Expression in Thrombozyten und Leukozyten mittels bildgebender Durchflusszytometrie. Repräsentative Kanalbilder von Brightfield (BF, grau), Tissue Factor (TF, grün), αCD61 (rot), αCD45 (grau), Kernfärbung mit Hoechst (magenta) und dem zusammengesetzten Bild (Merge), aufgenommen mit 60-facher Vergrößerung, werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Probenröhrchen-ID	Fix/perm Vollblut (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tabelle 1: Färbungsprotokoll zur Durchflusszytometrieanalyse der intrazellulären TF-Expression.

Probenröhrchen-ID	Fix/perm Vollblut (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Unbefleckt	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tabelle 2: Einzelfärbungskontrolle für die Kompensationsmatrix der intrazellulären TF-Expression.

Probenröhrchen-ID	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Frisches Vollblut (μL)	PFA 1 % (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Ruhe	87.5	7.5	-	5	300
ADP aktiviert	82.5	7.5	5	5	300

Tabelle 3: Färbungsprotokoll für die Durchflusszytometrieanalyse der Oberflächen-TF-Expression.

Probenröhrchen-ID	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Ruhe	90	5	5
ADP aktiviert	90	5	5

Tabelle 4: Sekundäres Antikörperfärbungsprotokoll für die oberflächenassoziierte TF-Analyse.

Probenröhrchen-ID	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Frisches Vollblut (μL)	PFA 1 % (μL)
Unbefleckt	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tabelle 5: Vorbereitung der Kompensationsmatrix für intrazelluläre TF-Analyse.

Probenröhrchen-ID	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Unbefleckt	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tabelle 6: Vorbereitung der Kompensationsmatrix für die oberflächenassoziierte TF-Analyse.

Diskussion

Dieses Manuskript berichtet detaillierte Protokolle zur Bewertung von TF-positiven Blutplättchen mittels Vollblutzytometrie, wobei die Analyse des Proteins sowohl innerhalb als auch auf der Thrombozytenoberfläche berücksichtigt wird.

In den letzten 20 Jahren ist das Vorkommen von TF in menschlichen Blutplättchen gut belegt: 1,2,3,4,5,17,18. Eine Teilmenge der Thrombozyten, die 20–30 % der gesamten zirkulierenden Thrombozytenpopulation^ausmacht, exprimiert das Protein und verstärkt damit das Konzept der Thrombozytenheterogenität, das im Fachgebiet immer relevanter wird^19,20. Es ist erwähnenswert, dass TF-positive Thrombozyten ein hohes mittleres Thrombozytenvolumen haben, wie zuvor durch hochsensitive bildgebende Flowzytometrie² gezeigt wurde. Es ist von entscheidender Bedeutung, dieses Merkmal zu berücksichtigen, insbesondere wenn die TF-Expression in Blutplättchen analysiert werden muss, die von den anderen Blutzellkomponenten isoliert sind. Es ist tatsächlich möglich, dass der Zentrifugationsschritt, der zur Thrombozytenisolierung verwendet wird, zum Verlust großer Thrombozyten² führt. Dieses voranalytische Problem ist wahrscheinlich einer der Haupttreiber der Kontroverse – die bis vor wenigen Jahren andauerte – um das Vorhandensein von TF in den Thrombozyten^{7, 12, 13}. Die Vollblutflusszytometrie ist in diesem Zusammenhang ein äußerst nützlicher Ansatz, da sie die Analyse aller Blutplättchen-Untergruppen ermöglicht, ohne sie isolieren zu müssen.

Ein zweiter Grund, der die Diskussion über das Vorhandensein von TF in Thrombozyten begünstigte, war die Wahl des für die Analyse verwendeten antihumanen TF-Antikörpers. Es gibt viele kommerziell erhältliche Antikörper, die zur Untersuchung von plättchenassoziierten TF verwendet wurden und verschiedene Epitope des Proteins erkennen. Einige Antikörper, wie die TF9-10H10 ^3,21,22 und die VIC7 ^1,3-Klone, binden an eine nicht-funktionelle TF-Region, ohne die Bindung von FVII/FVIIa zu beeinträchtigen. Andere Antikörper, darunter die VD8 ^1,2,3 und die HTF1^18-Klone – letztere werden in den aktuellen Protokollen verwendet – erkennen die katalytische Stelle des Proteins und konkurrieren mit FVII/FVIIa um die Bindung an TF und blockieren so dessen Prokoagulantenfunktion. Es ist wichtig zu beachten, dass je nach dem Glykosylierungszustand der extrazellulären Domäne und der Konformation der katalytischen Stelle von TF²³, die unter bestimmten Bedingungen (wie Zellaktivierung oder -erkrankung) modifiziert werden könnte, einige dieser Antikörper durch Durchflusszytometrie die Oberflächenexpression der thrombozytassoziierten TF unterschiedlich erkennen können. Außerdem könnten auch die Färbungsbedingungen, also ob die zu analysierende Probe frisch, fixiert und/oder permeabilisiert ist, die Epitop-Konformation und damit die Antigen-Antikörper-bindende¹⁴ beeinflussen.

Ein weiterer Aspekt, der Aufmerksamkeit verdient, ist die Wahl des an den Antikörper gebundenen Fluorochroms. Da TF nur von 20 % bis 30 % der Thrombozytenpopulation exprimiert wird, sind emissionsarme Fluorochrome zusammen mit dem Einsatz von Flusszytometern mit geringer Empfindlichkeit möglicherweise nicht geeignet, um niedrig positive Signale zu unterscheiden. Aus diesem Grund sind Antikörper mit leuchtenden Fluorochromen wie PE oder APC zu bevorzugen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die große Größe eines Fluorochroms wie PE die Bindung des markierten Antikörpers an das^{Protein 24} behindern kann. Um dieses Problem zu überwinden, wurde im vorliegenden Protokoll die Oberflächen-TF-Färbung als indirekte Markierung mit einem unkonjugierten αCD142/HTF1 mAb durchgeführt und anschließend durch die Verwendung eines sekundären Antikörpers freigelegt. Die PE-sterische Hindernis beeinflusst nicht die αCD142/HTF1 mAb-Bindung an intrazellulär gespeicherte TF, wo die katalytische Stelle für die Antikörperbindung besser zugänglich ist. Es ist klar, dass die Bewertung der Oberflächenexpression des plättchenassoziierten TF durch direkte Markierung im Vergleich zur indirekten – wenn möglich – vorzuziehen wäre, um die Probenverarbeitungszeit zu verkürzen. Dieser Ansatz muss jedoch die oben genannten kritischen Probleme berücksichtigen, die die Bindungsfähigkeit der verschiedenen kommerziell erhältlichen Antikörper gegen Thrombozyten-TF betreffen, bedingt durch die Konformation des Proteins selbst, durch die Färbungsbedingungen und die sterische Behinderung der verschiedenen verwendeten Fluorochrome. Daher erfordert die direkte Markierung der oberflächenexprimierten, plättchenassoziierten TF zur Vermeidung von falsch-negativen Ergebnissen einen obligatorischen sorgfältigen Optimierungsprozess. Diese Aspekte sind Gegenstand einer laufenden Studie, die darauf abzielt, die Effizienz der direkten Färbung mit den verschiedenen kommerziell erhältlichen Antikörperklonen zu bewerten, die mit allzweckmäßigen Fluorochromen gekennzeichnet sind.

Mehrere Studien zeigten, dass die Expression von TF in verschiedenen pathologischen Erkrankungen erhöht ist, die durch ein hohes thrombotisches Risiko^{gekennzeichnet sind} 8,9,10,11,17. Kürzlich wurden Belege vorgelegt, dass die Werte von TF-positiven Blutplättchen, die durch Durchflusszytometrieanalyse präzise quantifiziert werden, kardiovaskuläre Patienten identifizieren können, die trotz einer optimalen Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung mit Aspirin und P2Y-12-Antagonisten ein hohes thrombotisches Risiko^{von 25} aufrechterhalten. Tatsächlich ist die thrombozytenassoziierte TF funktional aktiv und somit potenziell in der Lage, die Thrombingeneration ^1,3,4 zu unterstützen. In diesem Zusammenhang ist die Möglichkeit, eine Durchflusszytometrieanalyse an wenigen Mikrolitern Blut durchzuführen, ein bedeutender Vorteil, der es ermöglicht, die thrombozytoassoziierte TF-Analyse auf den klinischen Bereich auszuweiten. Zu diesem Zweck ist erwähnenswert, dass die Validierung der thrombozytoassoziierten TF-Messung mittels Durchflusszytometrie das Ziel eines internationalen Projekts war, das wir kürzlich mit Unterstützung der International Society of Haemostasis and Thrombosis koordiniert haben, um methodische Leitlinien für dessen Bewertung zu geben.

Im Gegensatz zu anderen klassischen Markern der Thrombozytenaktivierung, wie P-Selectin und Thrombozyten-Leukozytenaggregaten, die unmittelbar nach der Blutentnahme analysiert werden müssen, um Artefakte zu vermeiden, ist die TF-Expression deutlich stabiler. Tatsächlich kann die Blutprobe innerhalb weniger Stunden nach dem Blutentzug ohne nennenswerte Veränderung der Thrombozyten-TF-Expression verarbeitet werden; Darüber hinaus macht die Möglichkeit, die Probe zu reparieren und sie anschließend zu kennzeichnen/bearbeiten, diese Analyse für viele Krankenhäuser/Labore geeignet. Bemerkenswert ist, dass, obwohl das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll relativ einfach durchzuführen ist, die Flowzytometrie-Technik dennoch eine spezialisierte technische Ausbildung erfordert. Aus diesem Grund bewegt sich die Technologie in Richtung der Entwicklung immer einfacherer Zytometer für Point-of-Care-Assays.

Abschließend bietet das vorgeschlagene Protokoll Methoden zur korrekten Analyse der thrombozytenassoziierten TF und betont die Vorteile einer auf Flusszytometrie basierenden Methode zur Bestimmung seiner Methode. Darüber hinaus werden die präanalytischen Variablen hervorgehoben, die die Analyse dieses Proteins beeinflussen können, und die Maßnahmen hervorgehoben, um sie zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenosin 5'-Diphosphat (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Thrombozyten-Agonist
Alexa Fluor 633 Ziege & alpha;-Maus IgG	Invitrogen	A21052	Sekundärer Antikörper
Biotube 10 mL	Biosigma	BSP048	Für PRP-Sammlung
Schmetterlingsnadel G19	PIC-Lösung	02044019030010	Wegen Blutentzug
CytExpert-Software	Beckman Coulter		Analyse von Flusszytometriedaten
Cytoflex S	Beckman Coulter		Durchflusszytometer
Eppendorf-Röhren 1,5 mL	Eppendorf	1,20,086	Blutfixierung
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Bildgebendes Durchflusszytometer
Kaluza Software	Beckman Coulter		Analyse von Durchflusszytometriedaten
Paraformaldehyd	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Um Blut und Blutplättchen zu reparieren.
PerCP-Α CD45	BD	345809	Leukozytenpopulationsmarker
PerCP-Α CD61	BD	347408	Plättchen-Poulation-Marker
PE-& Alpha; CD142	BD	550312	Antihumaner Gewebefaktor-Antikörper
PE-& Alpha; CD41	Beckman Coulter	A07781	Plättchen-Poulation-Marker
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) 1x ohne Kalzium und Magnesium	Gibco	10010-015	Für Antikörper und Probenverdünnung
Pipet-Tipps 10 & Micro; L	Gilson	F161630	Um Proben vorzubereiten
Pipet-Tipps 1000 & Mikro; L	Gilson	F161670	Um Proben vorzubereiten
Pipet Tips 200 & Micro; L	Gilson	F161930	Um Proben vorzubereiten
Rundbodenrohr 5 mL	Corning	352052	Zur Aufnahme des Durchflusszytometers
Natriumchlorid 0,9 %	BD	306575	Zum Waschen der Nadelkanüle nach Blutentzug
Sysmex XN-450	Dasit		Blutzellanalysator
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Um die Membran der Blutzellen zu permeabilisieren
Vakuum-Citrat 0,129M-Röhrchen	BD	363079	Zur Blutentnahme
Vacutainer K2 EDTA-Schläuche	BD	368857	Zur Blutentnahme
Vakuumer-Mehrproben-Luer-Adapter	BD	367300	Wegen Blutentzug
Vakuumhalter für einen Gebrauch	BD	364815	Wegen Blutentzug
Versacomp Antikörperfang-Perlen-Kit	Beckman Coulter	B22804	Antikörpertitration
α CD142 (Klon HTF-1)	Invitrogen	16-1429-82	Antihumaner Gewebefaktor-Antikörper