Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein Insekt, das vor mehr als 5000 Jahren in China domestiziert wurde. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Seide zu produzieren, ist die Seidenraupe ein wichtiges Nutzinsekt in der chinesischen Landwirtschaft und Seidenzucht. Die Seidenraupe steht nach der Fruchtfliege als Modellinsekt an zweiter Stelle. Als Modellinsekt bei den Schmetterlingen ist die Seidenraupe leicht zu züchten, mit einer großen Körpergröße und vielen Mutanten. Inzwischen ist die Seidenraupe das erste Lepidoptera-Insekt, dessen vollständiges Genom sequenziert wurde¹. Viele Datenbanken mit Informationen für Genom², Transkriptom³, exprimiertes Sequenz-Tag (EST)⁴, nicht-kodierende RNA⁵ und Mikrosatellit⁶ sind ebenfalls für die Öffentlichkeit zugänglich. Die oben genannten Fakten machen die Seidenraupe zu einem perfekten Modell für die Genforschung.

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein zellulärer Prozess, bei dem doppelsträngige RNA (dsRNA)-Moleküle die komplementäre Boten-RNA (mRNA) binden und in Scheiben schneiden, wodurch der Silencing-Effekt des Zielgens erreicht wird. Dieser Mechanismus ist in Bakterien natürlich vorhanden, um sich gegen das Eindringen von Viren zu verteidigen⁷. Später wurde festgestellt, dass RNAi in Tieren, Pflanzen und Mikroben konserviert ist. Aufgrund ihres starken sequenzspezifischen Silencing-Effekts wird RNAi in der Grundlagenforschung eingesetzt, um die Genexpression zu manipulieren und die Genfunktion zu untersuchen. RNAi wird durch die Abgabe von dsRNA in die Zellen erreicht.

Bei Insekten gibt es drei gängige Möglichkeiten, dsRNA zu verabreichen, nämlich Mikroinjektion, Fütterung und Einweichen⁸. Zurzeit werden erfolgreiche RNAi-Berichte in den Seidenraupen durch nackte dsRNA-Verabreichung durch dsRNA-Injektion durchgeführt⁹. Die Vorteile der Mikroinjektion sind die sofortige Abgabe von dsRNA in die Hämolymphe und die präzise Kontrolle der dsRNA-Menge. Es gibt jedoch auch gewisse Nachteile der Mikroinjektion. Zum Beispiel ist es zeitaufwändig und erfordert empfindliche Geräte. Es ist auch wichtig, die Injektionsnadeln, das Injektionsvolumen und die dsRNA-Menge zu optimieren. Daher wird ein alternativer Weg zur Verabreichung von dsRNA an Seidenraupen notwendig. Da das Exoskelett eines Insekts eine wasserdichte Barriere ist, die aus Chitin besteht, wird selten über das Einweichen von Insektenlarven berichtet, um RNAi zu erhalten, was für RNAi bei Insekten keine gute Option ist. Die Fütterung von dsRNA ist arbeitssparend, kostengünstig und einfach durchzuführen¹⁰. Diese Methode ist auch für das Hochdurchsatz-Genscreening anwendbar¹¹. Es zeigt sich jedoch, dass eine DNA/RNA-unspezifische Nuklease, nämlich BmdsRNase, im Mitteldarm und Mitteldarmsaft der Seidenraupenlarven vorhanden ist¹². Es wird gezeigt, dass diese Nuklease dsRNA, vorzugsweise¹³, verdaut. Daher scheint es schwierig zu sein, der Seidenraupe nackte dsRNA zu füttern, um die Genexpression zum Schweigen zu bringen.

In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass nanopartikelabgeschirmte dsRNA eine gute Alternative ist, um die RNAi-Effizienz durch Fütterung von¹⁴ zu erhöhen. Chitosan ist ein kostengünstiges, ungiftiges und biologisch abbaubares Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin hergestellt werden kann, einem natürlich vorkommenden und nach Cellulose¹⁵ das am zweithäufigsten vorkommende Biopolymer. Da die Aminogruppe im Chitosan positiv geladen und die Phosphatgruppe auf dem Rückgrat der dsRNA negativ geladen ist, könnten die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationen^{gebildet werden 16}. Chitosan/dsRNA-Nanopartikel sind wirksam bei der Gewinnung von RNAi durch Larvenfütterung bei Stechmücken wie Aedes aegypti und Anopheles gambiae¹⁷, dem Baumwollfleckenkapselwurm Earias vittella¹⁸ und der Karminspinnmilbe Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

Um eine Methodik für die dsRNA-Verabreichung durch Fütterung von Seidenraupen zu entwickeln, um eine erfolgreiche RNAi-Effizienz zu erreichen, konzentriert sich dieser Bericht auf die Beschreibung von Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Vorbereitung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und zur Verfütterung der Nanopartikel an die Seidenraupenlarven. Diese Methode ist relativ kostengünstig, arbeitssparend und einfach zu befolgen und kann für Gen-Silencing-Studien an anderen Insekten angepasst werden. Unser Ziel ist es, ein einfacheres Protokoll für die Lepidoptera-dsRNA-Verabreichungsmethode mit höherer RNAi-Effizienz bereitzustellen.

1. Seidenraupenarten und Aufzucht

1. Ziehen Sie mindestens 120 frisch geschlüpfte Seidenraupenlarven des 1^. Stadiums von B. mori P50 mit frischen Maulbeerblättern bei 25 ± 1 °C, photoperiodisch 12 h hell: 12 h dunkel und 75 % ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit auf.

2. Auswahl der Seidenraupenlarven

1. Wählen Sie Tag 1 der Larven des 5^. Stadiums für das RNAi-Experiment; Die Seidenraupenlarven wachsen nach Tag 3 des 5^. Stadiums schnell, was ideal ist, um die Unterschiede im Aussehen der Larven zu vergleichen.
   HINWEIS: Alternativ können jüngere Stadien, wie z. B. das 3^. oder 4^. Instar, für das RNAi-Experiment verwendet werden. Es erfordert jedoch eine konstante dsRNA-Behandlung bis zum 5^. Instar, was relativ teuer und materialkostenintensiv ist.

3. Synthese von dsRNA

1. Identifizierung des dsRNA-Zielfragments: Wählen Sie die kodierende Sequenz eines Zielgens aus und gleichen Sie sie mit anderen homologen Genen ab, um die konservierte Region zu bestimmen. Entwicklung genspezifischer Primer in der nicht konservierten Region für die anschließende Amplifikation von dsRNA-Zielfragmenten. Für RNAi-Experimente an Insekten ist das typische dsRNA-Zielfragment in der Regel 400-600 bp groß. Die Mindestgröße könnte 200 bp betragen.
   HINWEIS: Um die Effizienz und Erfolgsrate von RNAi-Experimenten zu verbessern, kann ein webbasiertes Tool zum Entwerfen des dsRNA-Ziels verwendet werden, z. B. dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Herstellung eines PCR-Produkttemplates: Fügen Sie einen T7-RNA-Polymerase-Promotor (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') an das 5'-Ende eines der oben beschriebenen Primer hinzu. Führen Sie eine Standard-PCR durch, um das dsRNA-Zielfragment zu amplifizieren. Führen Sie ein 1%iges Agarose-Gel in 1x TAE durch, um ein einzelnes PCR-Produkt der erwarteten Größe zu verifizieren. Danach reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Aufreinigungskit (Table of Materials) und verwenden Sie es für die anschließende Transkription.
   HINWEIS: Um das Ziel-PCR-Produkt langfristig zu lagern und hohe Ausbeuten zu erzielen, wird empfohlen, das PCR-Produkt an ein Plasmid zu ligieren. Das Plasmid sollte vor der PCR-Reaktion linearisiert werden.
3. Erzeugung von dsRNA: Verwenden Sie ein T7-RNAi-System (Table of Materials), um die dsRNA zu erzeugen. Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie die Komponenten bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen. Mischen Sie die Reaktion durch vorsichtiges Pipettieren und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
   HINWEIS: Um die Ausbeute zu maximieren, kann die Inkubation bei 37 °C auf bis zu 2-6 Stunden verlängert werden. Bei Templates, die eine Sekundärstruktur oder GC-reich enthalten, kann die Inkubation stattdessen bei 42 °C durchgeführt werden, um die Ausbeute an dsRNA zu verbessern.
4. Glühen zur Bildung von dsRNA: Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten lang bei 70 °C und kühlen Sie sie dann langsam auf Raumtemperatur ab (~20 min). Dadurch wird die dsRNA geglüht.
5. DNase- und RNase-Behandlung: Pipettieren Sie 1 μl der mitgelieferten RNase-Lösung auf 199 μl nukleasefreies Wasser, um eine frisch verdünnte RNase-Lösung herzustellen. 1 μl frisch verdünnte RNase-Lösung und 1 μl der mitgelieferten RQ1 RNase-freien DNase pro 20 μl Reaktionsvolumen zugeben, vorsichtig mischen und 30 min bei 37 °C inkubieren. Die einzelsträngige RNA (ssRNA) und die Matrizen-DNA in der Reaktion werden nach dieser Behandlung entfernt.
6. Alkoholfällung: 1 Volumen Isopropanol oder 2,5 Volumen 95 % Ethanol zusammen mit 0,1 Volumenvol 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zur Reaktion hinzufügen. Mischen Sie die Reaktion durch Vortexen und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang auf Eis, um eine trübe Masse zu bilden. Schleudern Sie 10 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge, um ein weißes Kügelchen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 0,5 ml kaltem 70%igem Ethanol, um das restliche Salz zu entfernen. Entfernen Sie das Ethanol nach dem Waschen. Lassen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das Pellet mit nukleasefreiem Wasser im 2-5-fachen des anfänglichen Reaktionsvolumens. Bei -20 °C oder -70 °C lagern.
   HINWEIS: Das dsRNA-Pellet sollte nicht übermäßig getrocknet werden, da dies eine vollständige Resuspendierung erschweren könnte. Um eine ausreichende Resuspension zu gewährleisten, werden mindestens 2 Volumina benötigt.
7. Mengen- und Qualitätskontrolle der dsRNA: Verdünnen Sie die dsRNA in nukleasefreiem Wasser im Verhältnis 1:100 bis 1:300. Bestimmen Sie die Konzentration von dsRNA mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um dsRNA zu quantifizieren, multiplizieren Sie die Konzentration mit dem Volumen. Um die Qualität der dsRNA zu beurteilen, verwenden Sie die Agarose-Gelelektrophorese. Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel in 1x TAE vor und verdünnen Sie die dsRNA bei 1:50 mit nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie 5 μl verdünnte dsRNA pro Spur und färben Sie das Gel mindestens 15 Minuten lang in 0,5 mg/ml Ethidiumbromid zur Visualisierung.
   HINWEIS: dsRNA migriert langsamer als dsDNA.

4. Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel

1. 100 mM Natriumacetat (0,1 M NaC₂H₃O₂ und 0,1 M Essigsäure, pH 4,5 in deionisiertem Wasser) und 100 mM Natriumsulfat (100 mM Na₂SO₄ in deionisiertem Wasser) bei Raumtemperatur puffern.
2. Lösen Sie kommerzialisiertes Chitosan (aus Garnelenschalen, ≥75% deacetyliert; Tabelle der Materialien) in 100 mM Natriumacetatpuffer zur Herstellung einer 0,02%igen (w/v) Chitosanlösung.
3. Löse 20 μg dsRNA in 50 μl nukleasefreiem Wasser auf und füge es zu 50 μl 100 mM Natriumsulfatpuffer hinzu, um eine 100 μl dsRNA-Lösung herzustellen.
4. Fügen Sie 100 μl Chitosanlösung zu 100 μl dsRNA-Lösung hinzu. Bereiten Sie gleichzeitig eine Kontrolle vor, indem Sie 100 μl Chitosanlösung zu 100 μl 50 mM Natriumsulfat hinzufügen. Die Mischungen mischen und bei 55 °C 1 Min. erhitzen.
5. Wirbeln Sie das Gemisch sofort mit einem Hochgeschwindigkeitswirbel für 30 s ein, um die Bildung der Nanopartikel zu ermöglichen.
6. Die Mischung bei 13.000 x g bei Raumtemperatur 10 min zentrifugieren, um ein weißes Pellet zu erhalten. Den Überstand in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen umfüllen. Lassen Sie das Pellet 10 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
7. Bestimmen Sie die Konzentration von dsRNA im Überstand mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer (Table of Materials). Verwenden Sie den Überstand aus dem Steuerelement als Leerzeichen. Multiplizieren Sie die Konzentration mit dem Volumen, um die Gesamtmenge an dsRNA zu berechnen, die im Überstand verbleibt. Berechnen Sie den Prozentsatz der in den Nanopartikeln verkapselten dsRNA durch die im Überstand verbleibende Menge dividiert durch die Ausgangsmenge der dsRNA.
   HINWEIS: Auch wenn die Nanopartikel vor der Verwendung mindestens 15 Tage lang bei 4-37 °C aufbewahrt werden können¹⁴, wird empfohlen, die Nanopartikel so schnell wie möglich zu verwenden.

5. Fütterung der Seidenraupenlarven mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

1. Pflücken Sie frisch gehäutete Seidenraupenlarven des 5^. Stadiums (d. h. Tag 1 des 5^. Stadiums) der gleichen Größe für den Fütterungsversuch. Legen Sie die Larven einzeln in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, bevor Sie den Deckel schließen und 24 Stunden lang hungern.
2. Frische Maulbeerblätter mit entionisiertem Wasser abspülen und mit sauberem Küchenpapier trocknen. Die Maulbeerblätter sollten trocken und ohne Wassertropfen sein. In 1 cm x 1 cm große Maulbeerblattscheiben schneiden.
3. Chitosan/dsRNA-Nanopartikel vor der Verwendung in nukleasefreiem Wasser bei 500 ng/μl auflösen. Die Kontroll-Chitosan-Nanopartikel (hergestellt unter Nummer 4.4) werden mit der gleichen Menge nukleasefreiem Wasser verdünnt. Bereiten Sie nackte dsRNA bis zu 500 ng/μl in nukleasefreiem Wasser vor.
4. Verwenden Sie die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel für das RNAi-Knockdown-Experiment, die Kontroll-Chitosan-Nanopartikel als Blind-/Negativkontrolle. Verwenden Sie die nackte dsRNA, um die Unterschiede zu Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln zu vergleichen.
5. Beschichten Sie die Oberfläche jeder Blattscheibe mit 10 μl Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln, Chitosan und nackter dsRNA. Die Nanopartikellösung und die dsRNA-Lösung auf den Blattscheiben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
6. Füttern Sie jede Larve mit einer Nanopartikel-beschichteten oder dsRNA-beschichteten Blattscheibe pro Tag. Geben Sie den Larven 5 Tage lang kontinuierlich Nanopartikel- oder dsRNA-beschichtete Blattscheiben. Frische Maulbeerblätter können bereitgestellt werden, nachdem die beschichtete Blattscheibe jeden Tag vollständig von den Larven aufgefressen wurde.
7. Am 6. Tag betäuben Sie die Larven auf Eis, bis sie sich nicht mehr bewegen, und sezieren Sie die Larven für die Probenahme. Schneide den Thorax mit einer Schere auf einer sauberen Petrischale ab. Ziehe den Mitteldarm mit einer Pinzette heraus. Entfernen Sie den Inhalt im Mitteldarm und waschen Sie den Mitteldarm in einer anderen Petrischale, die mit nukleasefreiem Wasser gefüllt ist. Lagern Sie den Mitteldarm in einem 1,5-ml-Röhrchen und halten Sie ihn bei -70 °C.

6. Bestätigung des Gen-Silencing

1. Führen Sie eine quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) durch, um die relative Transkriptquantifizierung zu berechnen. Mindestens drei biologische Replikate und drei technische Replikate für jedes biologische Replikat sind erforderlich. Mindestens zwei Referenzgene werden empfohlen, um das relative Transkript zu normalisieren. Ein Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) Gen wird getestet. Bewerten Sie die Effizienz des Gen-Silencing, indem Sie den Mittelwert des relativen Transkripts mit dem der Kontrollgruppe vergleichen und in Prozent umrechnen.
   HINWEIS: Die qRT-PCR-Amplifikationsbedingung, die Primerinformationen und die Berechnung des relativen Transkripts finden Sie in unserer aktuellen Veröffentlichung²⁰.
2. Analysieren Sie den RNAi-Phänotyp, um den Gen-Silencing-Effekt zu bewerten. Beobachte die Größe der Larven und Kokons. Machen Sie täglich Fotos, um Auftritte festzuhalten.
   HINWEIS: RNAi kann die Morphologie, Metamorphose, Physiologie und das Verhalten beeinflussen. Die Beobachtung von RNAi-verwandten Phänotypen hängt von den anvisierten Genen ab.

Um die RNAi-Effizienz zu bewerten, wurde ein Immungen zur Analyse ausgewählt, das auf BmToll9-2 abzielt. Das BmToll9-2-Gen ist im Labor gut charakterisiert, und das Gen-Silencing durch dsRNA-Injektion führt zu leichteren und kleineren Larven in unserer jüngsten Veröffentlichung20. Um die RNAi-Wirksamkeit durch Aufnahme durch Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zu bestätigen, wurden Chitosan-Nanopartikel als Kontrolle verwendet und gleichzeitig nackte dsRNA verglichen.

Im Vergleich zur Kontrolle, Chitosan-Nanopartikeln ohne dsRNA, zeigt nackte dsRNA, die auf das BmToll9-2-Gen abzielt, keinen Silencing-Effekt. Die Fütterung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in die Seidenraupe hemmt das Transkript signifikant, mit einem Knockdown von 79 % (Abbildung 1). Die Hemmung des relativen Transkripts deutet darauf hin, dass das BmToll9-2-Gen durch Chitosan/dsRNA-Einnahme erfolgreich zum Schweigen gebracht wurde.

Der Knockdown des BmToll9-2-Gens beeinflusst das Wachstum der Seidenraupe erheblich. Bei der Beobachtung der Larven sind die BmToll9-2-stummgeschalteten Larven kleiner als die Kontrolllarven (Abbildung 2A). Beim Vergleich der Kokons sind die BmToll9-2-gedämpften Kokons ebenfalls kleiner (Abbildung 2B). Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zeigen erfolgreiche RNAi-Effekte sowohl im Transkript als auch im Phänotyp bei der Seidenraupe.

Abbildung 1: Relatives Transkript von BmToll9-2 nach Aufnahme von Chitosan/dsBmToll9-2-Nanopartikeln in Larven des 5. Stadiums von B. mori. Die relativen mRNA-Spiegel von BmToll9-2 in den Larven, die mit Chitosan-Nanopartikeln als Kontrolle, nackter dsRNA und Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln gefüttert wurden. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikationen dargestellt. Für jede biologische Replikation gab es drei technische Replikationen. Unterschiedliche Buchstaben auf den Balken weisen auf signifikante Unterschiede hin, die auf der unidirektionalen ANOVA-Analyse basieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Phänotypbeobachtung nach Fütterung mit Chitosan/dsBmToll9-2 Nanopartikeln. Chitosan-Nanopartikel werden als Kontrolle verwendet. (A) Das Auftreten von Seidenraupenlarven nach der Einnahme von Nanopartikeln. (B) Das Auftreten von Seidenraupenkokons nach der Einnahme von Nanopartikeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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