Methodenartikel

Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

DOI:

10.3791/67360

⸱

4. Oktober 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein wichtiges Wirtschaftsinsekt mit einer jahrtausendealten Geschichte in China. Mittlerweile ist die Seidenraupe das Modellinsekt der Schmetterlinge mit einer guten Ansammlung von Grundlagenforschung. Es ist auch das erste Insekt bei Schmetterlingen, dessen vollständiges Genom sequenziert und zusammengesetzt wurde, was eine solide Grundlage für die Erforschung der Genfunktion bietet. Obwohl RNA-Interferenz (RNAi) in der reversen Genfunktionsforschung weit verbreitet ist, ist sie bei Seidenraupen und anderen Lepidopterenarten refraktär. Frühere erfolgreiche RNAi-bezogene Forschungen zur Verabreichung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) wurden ausschließlich durch Injektion durchgeführt. Die Verabreichung von dsRNA durch Fütterung wird nie berichtet. In diesem Artikel beschreiben wir Schritt für Schritt Verfahren zur Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel, die durch Verschlucken an die Seidenraupenlarven verfüttert werden. Das Protokoll umfasst (i) die Auswahl des geeigneten Stadiums der Seidenraupenlarven, (ii) die Synthese von dsRNA, (iii) die Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und (iv) die Fütterung der Seidenraupenlarven mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln. Repräsentative Ergebnisse, einschließlich der Bestätigung des Gentranskripts und der Beobachtung des Phänotyps, werden vorgestellt. Die dsRNA-Fütterung ist eine einfache Technik für RNAi in Seidenraupenlarven. Da Seidenraupenlarven leicht zu züchten und groß genug sind, um sie zu betreiben, bietet sie ein gutes Modell zum Nachweis von RNAi von Larven bei Insekten. Darüber hinaus regt die Einfachheit dieser Technik die Beteiligung der Schüler an der Forschung an, was Seidenraupenlarven zu einem idealen genetischen System für den Einsatz im Klassenzimmer macht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Seidenraupe, Bombyx mori, ist ein Insekt, das vor mehr als 5000 Jahren in China domestiziert wurde. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Seide zu produzieren, ist die Seidenraupe ein wichtiges Nutzinsekt in der chinesischen Landwirtschaft und Seidenzucht. Die Seidenraupe steht nach der Fruchtfliege als Modellinsekt an zweiter Stelle. Als Modellinsekt bei den Schmetterlingen ist die Seidenraupe leicht zu züchten, mit einer großen Körpergröße und vielen Mutanten. Inzwischen ist die Seidenraupe das erste Lepidoptera-Insekt, dessen vollständiges Genom sequenziert wurde1. Viele Datenbanken mit Informationen für Genom2, Transkriptom3, exprimiertes Sequenz-Tag (EST)4, nicht-kodierende RNA5 und Mikrosatellit6 sind ebenfalls für die Öffentlichkeit zugänglich. Die oben genannten Fakten machen die Seidenraupe zu einem perfekten Modell für die Genforschung.

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein zellulärer Prozess, bei dem doppelsträngige RNA (dsRNA)-Moleküle die komplementäre Boten-RNA (mRNA) binden und in Scheiben schneiden, wodurch der Silencing-Effekt des Zielgens erreicht wird. Dieser Mechanismus ist in Bakterien natürlich vorhanden, um sich gegen das Eindringen von Viren zu verteidigen7. Später wurde festgestellt, dass RNAi in Tieren, Pflanzen und Mikroben konserviert ist. Aufgrund ihres starken sequenzspezifischen Silencing-Effekts wird RNAi in der Grundlagenforschung eingesetzt, um die Genexpression zu manipulieren und die Genfunktion zu untersuchen. RNAi wird durch die Abgabe von dsRNA in die Zellen erreicht.

Bei Insekten gibt es drei gängige Möglichkeiten, dsRNA zu verabreichen, nämlich Mikroinjektion, Fütterung und Einweichen8. Zurzeit werden erfolgreiche RNAi-Berichte in den Seidenraupen durch nackte dsRNA-Verabreichung durch dsRNA-Injektion durchgeführt9. Die Vorteile der Mikroinjektion sind die sofortige Abgabe von dsRNA in die Hämolymphe und die präzise Kontrolle der dsRNA-Menge. Es gibt jedoch auch gewisse Nachteile der Mikroinjektion. Zum Beispiel ist es zeitaufwändig und erfordert empfindliche Geräte. Es ist auch wichtig, die Injektionsnadeln, das Injektionsvolumen und die dsRNA-Menge zu optimieren. Daher wird ein alternativer Weg zur Verabreichung von dsRNA an Seidenraupen notwendig. Da das Exoskelett eines Insekts eine wasserdichte Barriere ist, die aus Chitin besteht, wird selten über das Einweichen von Insektenlarven berichtet, um RNAi zu erhalten, was für RNAi bei Insekten keine gute Option ist. Die Fütterung von dsRNA ist arbeitssparend, kostengünstig und einfach durchzuführen10. Diese Methode ist auch für das Hochdurchsatz-Genscreening anwendbar11. Es zeigt sich jedoch, dass eine DNA/RNA-unspezifische Nuklease, nämlich BmdsRNase, im Mitteldarm und Mitteldarmsaft der Seidenraupenlarven vorhanden ist12. Es wird gezeigt, dass diese Nuklease dsRNA, vorzugsweise13, verdaut. Daher scheint es schwierig zu sein, der Seidenraupe nackte dsRNA zu füttern, um die Genexpression zum Schweigen zu bringen.

In jüngster Zeit hat sich gezeigt, dass nanopartikelabgeschirmte dsRNA eine gute Alternative ist, um die RNAi-Effizienz durch Fütterung von14 zu erhöhen. Chitosan ist ein kostengünstiges, ungiftiges und biologisch abbaubares Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin hergestellt werden kann, einem natürlich vorkommenden und nach Cellulose15 das am zweithäufigsten vorkommende Biopolymer. Da die Aminogruppe im Chitosan positiv geladen und die Phosphatgruppe auf dem Rückgrat der dsRNA negativ geladen ist, könnten die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel durch Selbstorganisation von Polykationengebildet werden 16. Chitosan/dsRNA-Nanopartikel sind wirksam bei der Gewinnung von RNAi durch Larvenfütterung bei Stechmücken wie Aedes aegypti und Anopheles gambiae17, dem Baumwollfleckenkapselwurm Earias vittella18 und der Karminspinnmilbe Tetranychus cinnabarinus19.

Um eine Methodik für die dsRNA-Verabreichung durch Fütterung von Seidenraupen zu entwickeln, um eine erfolgreiche RNAi-Effizienz zu erreichen, konzentriert sich dieser Bericht auf die Beschreibung von Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Vorbereitung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel und zur Verfütterung der Nanopartikel an die Seidenraupenlarven. Diese Methode ist relativ kostengünstig, arbeitssparend und einfach zu befolgen und kann für Gen-Silencing-Studien an anderen Insekten angepasst werden. Unser Ziel ist es, ein einfacheres Protokoll für die Lepidoptera-dsRNA-Verabreichungsmethode mit höherer RNAi-Effizienz bereitzustellen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Seidenraupenarten und Aufzucht

  1. Ziehen Sie mindestens 120 frisch geschlüpfte Seidenraupenlarven des 1. Stadiums von B. mori P50 mit frischen Maulbeerblättern bei 25 ± 1 °C, photoperiodisch 12 h hell: 12 h dunkel und 75 % ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit auf.

2. Auswahl der Seidenraupenlarven

  1. Wählen Sie Tag 1 der Larven des 5. Stadiums für das RNAi-Experiment; Die Seidenraupenlarven wachsen nach Tag 3 des 5. Stadiums schnell, was ideal ist, um die Unterschiede im Aussehen der Larven zu vergleichen.
    HINWEIS: Alternativ können jüngere Stadien, wie z. B. das 3. oder 4. Instar, für das RNAi-Experiment verwendet werden. Es erfordert jedoch eine konstante dsRNA-Behandlung bis zum 5. Instar, was relativ teuer und materialkostenintensiv ist.

3. Synthese von dsRNA

  1. Identifizierung des dsRNA-Zielfragments: Wählen Sie die kodierende Sequenz eines Zielgens aus und gleichen Sie sie mit anderen homologen Genen ab, um die konservierte Region zu bestimmen. Entwicklung genspezifischer Primer in der nicht konservierten Region für die anschließende Amplifikation von dsRNA-Zielfragmenten. Für RNAi-Experimente an Insekten ist das typische dsRNA-Zielfragment in der Regel 400-600 bp groß. Die Mindestgröße könnte 200 bp betragen.
    HINWEIS: Um die Effizienz und Erfolgsrate von RNAi-Experimenten zu verbessern, kann ein webbasiertes Tool zum Entwerfen des dsRNA-Ziels verwendet werden, z. B. dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. Herstellung eines PCR-Produkttemplates: Fügen Sie einen T7-RNA-Polymerase-Promotor (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') an das 5'-Ende eines der oben beschriebenen Primer hinzu. Führen Sie eine Standard-PCR durch, um das dsRNA-Zielfragment zu amplifizieren. Führen Sie ein 1%iges Agarose-Gel in 1x TAE durch, um ein einzelnes PCR-Produkt der erwarteten Größe zu verifizieren. Danach reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Aufreinigungskit (Table of Materials) und verwenden Sie es für die anschließende Transkription.
    HINWEIS: Um das Ziel-PCR-Produkt langfristig zu lagern und hohe Ausbeuten zu erzielen, wird empfohlen, das PCR-Produkt an ein Plasmid zu ligieren. Das Plasmid sollte vor der PCR-Reaktion linearisiert werden.
  3. Erzeugung von dsRNA: Verwenden Sie ein T7-RNAi-System (Table of Materials), um die dsRNA zu erzeugen. Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie die Komponenten bei Raumtemperatur gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen. Mischen Sie die Reaktion durch vorsichtiges Pipettieren und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
    HINWEIS: Um die Ausbeute zu maximieren, kann die Inkubation bei 37 °C auf bis zu 2-6 Stunden verlängert werden. Bei Templates, die eine Sekundärstruktur oder GC-reich enthalten, kann die Inkubation stattdessen bei 42 °C durchgeführt werden, um die Ausbeute an dsRNA zu verbessern.
  4. Glühen zur Bildung von dsRNA: Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten lang bei 70 °C und kühlen Sie sie dann langsam auf Raumtemperatur ab (~20 min). Dadurch wird die dsRNA geglüht.
  5. DNase- und RNase-Behandlung: Pipettieren Sie 1 μl der mitgelieferten RNase-Lösung auf 199 μl nukleasefreies Wasser, um eine frisch verdünnte RNase-Lösung herzustellen. 1 μl frisch verdünnte RNase-Lösung und 1 μl der mitgelieferten RQ1 RNase-freien DNase pro 20 μl Reaktionsvolumen zugeben, vorsichtig mischen und 30 min bei 37 °C inkubieren. Die einzelsträngige RNA (ssRNA) und die Matrizen-DNA in der Reaktion werden nach dieser Behandlung entfernt.
  6. Alkoholfällung: 1 Volumen Isopropanol oder 2,5 Volumen 95 % Ethanol zusammen mit 0,1 Volumenvol 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zur Reaktion hinzufügen. Mischen Sie die Reaktion durch Vortexen und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang auf Eis, um eine trübe Masse zu bilden. Schleudern Sie 10 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge, um ein weißes Kügelchen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 0,5 ml kaltem 70%igem Ethanol, um das restliche Salz zu entfernen. Entfernen Sie das Ethanol nach dem Waschen. Lassen Sie das Pellet 15 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie das Pellet mit nukleasefreiem Wasser im 2-5-fachen des anfänglichen Reaktionsvolumens. Bei -20 °C oder -70 °C lagern.
    HINWEIS: Das dsRNA-Pellet sollte nicht übermäßig getrocknet werden, da dies eine vollständige Resuspendierung erschweren könnte. Um eine ausreichende Resuspension zu gewährleisten, werden mindestens 2 Volumina benötigt.
  7. Mengen- und Qualitätskontrolle der dsRNA: Verdünnen Sie die dsRNA in nukleasefreiem Wasser im Verhältnis 1:100 bis 1:300. Bestimmen Sie die Konzentration von dsRNA mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um dsRNA zu quantifizieren, multiplizieren Sie die Konzentration mit dem Volumen. Um die Qualität der dsRNA zu beurteilen, verwenden Sie die Agarose-Gelelektrophorese. Bereiten Sie ein 1%iges Agarose-Gel in 1x TAE vor und verdünnen Sie die dsRNA bei 1:50 mit nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie 5 μl verdünnte dsRNA pro Spur und färben Sie das Gel mindestens 15 Minuten lang in 0,5 mg/ml Ethidiumbromid zur Visualisierung.
    HINWEIS: dsRNA migriert langsamer als dsDNA.

4. Herstellung der Chitosan/dsRNA-Nanopartikel

  1. 100 mM Natriumacetat (0,1 M NaC2H3O2 und 0,1 M Essigsäure, pH 4,5 in deionisiertem Wasser) und 100 mM Natriumsulfat (100 mM Na2SO4 in deionisiertem Wasser) bei Raumtemperatur puffern.
  2. Lösen Sie kommerzialisiertes Chitosan (aus Garnelenschalen, ≥75% deacetyliert; Tabelle der Materialien) in 100 mM Natriumacetatpuffer zur Herstellung einer 0,02%igen (w/v) Chitosanlösung.
  3. Löse 20 μg dsRNA in 50 μl nukleasefreiem Wasser auf und füge es zu 50 μl 100 mM Natriumsulfatpuffer hinzu, um eine 100 μl dsRNA-Lösung herzustellen.
  4. Fügen Sie 100 μl Chitosanlösung zu 100 μl dsRNA-Lösung hinzu. Bereiten Sie gleichzeitig eine Kontrolle vor, indem Sie 100 μl Chitosanlösung zu 100 μl 50 mM Natriumsulfat hinzufügen. Die Mischungen mischen und bei 55 °C 1 Min. erhitzen.
  5. Wirbeln Sie das Gemisch sofort mit einem Hochgeschwindigkeitswirbel für 30 s ein, um die Bildung der Nanopartikel zu ermöglichen.
  6. Die Mischung bei 13.000 x g bei Raumtemperatur 10 min zentrifugieren, um ein weißes Pellet zu erhalten. Den Überstand in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen umfüllen. Lassen Sie das Pellet 10 min bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
  7. Bestimmen Sie die Konzentration von dsRNA im Überstand mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer (Table of Materials). Verwenden Sie den Überstand aus dem Steuerelement als Leerzeichen. Multiplizieren Sie die Konzentration mit dem Volumen, um die Gesamtmenge an dsRNA zu berechnen, die im Überstand verbleibt. Berechnen Sie den Prozentsatz der in den Nanopartikeln verkapselten dsRNA durch die im Überstand verbleibende Menge dividiert durch die Ausgangsmenge der dsRNA.
    HINWEIS: Auch wenn die Nanopartikel vor der Verwendung mindestens 15 Tage lang bei 4-37 °C aufbewahrt werden können14, wird empfohlen, die Nanopartikel so schnell wie möglich zu verwenden.

5. Fütterung der Seidenraupenlarven mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

  1. Pflücken Sie frisch gehäutete Seidenraupenlarven des 5. Stadiums (d. h. Tag 1 des 5. Stadiums) der gleichen Größe für den Fütterungsversuch. Legen Sie die Larven einzeln in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte, bevor Sie den Deckel schließen und 24 Stunden lang hungern.
  2. Frische Maulbeerblätter mit entionisiertem Wasser abspülen und mit sauberem Küchenpapier trocknen. Die Maulbeerblätter sollten trocken und ohne Wassertropfen sein. In 1 cm x 1 cm große Maulbeerblattscheiben schneiden.
  3. Chitosan/dsRNA-Nanopartikel vor der Verwendung in nukleasefreiem Wasser bei 500 ng/μl auflösen. Die Kontroll-Chitosan-Nanopartikel (hergestellt unter Nummer 4.4) werden mit der gleichen Menge nukleasefreiem Wasser verdünnt. Bereiten Sie nackte dsRNA bis zu 500 ng/μl in nukleasefreiem Wasser vor.
  4. Verwenden Sie die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel für das RNAi-Knockdown-Experiment, die Kontroll-Chitosan-Nanopartikel als Blind-/Negativkontrolle. Verwenden Sie die nackte dsRNA, um die Unterschiede zu Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln zu vergleichen.
  5. Beschichten Sie die Oberfläche jeder Blattscheibe mit 10 μl Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln, Chitosan und nackter dsRNA. Die Nanopartikellösung und die dsRNA-Lösung auf den Blattscheiben 5 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
  6. Füttern Sie jede Larve mit einer Nanopartikel-beschichteten oder dsRNA-beschichteten Blattscheibe pro Tag. Geben Sie den Larven 5 Tage lang kontinuierlich Nanopartikel- oder dsRNA-beschichtete Blattscheiben. Frische Maulbeerblätter können bereitgestellt werden, nachdem die beschichtete Blattscheibe jeden Tag vollständig von den Larven aufgefressen wurde.
  7. Am 6. Tag betäuben Sie die Larven auf Eis, bis sie sich nicht mehr bewegen, und sezieren Sie die Larven für die Probenahme. Schneide den Thorax mit einer Schere auf einer sauberen Petrischale ab. Ziehe den Mitteldarm mit einer Pinzette heraus. Entfernen Sie den Inhalt im Mitteldarm und waschen Sie den Mitteldarm in einer anderen Petrischale, die mit nukleasefreiem Wasser gefüllt ist. Lagern Sie den Mitteldarm in einem 1,5-ml-Röhrchen und halten Sie ihn bei -70 °C.

6. Bestätigung des Gen-Silencing

  1. Führen Sie eine quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) durch, um die relative Transkriptquantifizierung zu berechnen. Mindestens drei biologische Replikate und drei technische Replikate für jedes biologische Replikat sind erforderlich. Mindestens zwei Referenzgene werden empfohlen, um das relative Transkript zu normalisieren. Ein Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) Gen wird getestet. Bewerten Sie die Effizienz des Gen-Silencing, indem Sie den Mittelwert des relativen Transkripts mit dem der Kontrollgruppe vergleichen und in Prozent umrechnen.
    HINWEIS: Die qRT-PCR-Amplifikationsbedingung, die Primerinformationen und die Berechnung des relativen Transkripts finden Sie in unserer aktuellen Veröffentlichung20.
  2. Analysieren Sie den RNAi-Phänotyp, um den Gen-Silencing-Effekt zu bewerten. Beobachte die Größe der Larven und Kokons. Machen Sie täglich Fotos, um Auftritte festzuhalten.
    HINWEIS: RNAi kann die Morphologie, Metamorphose, Physiologie und das Verhalten beeinflussen. Die Beobachtung von RNAi-verwandten Phänotypen hängt von den anvisierten Genen ab.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die RNAi-Effizienz zu bewerten, wurde ein Immungen zur Analyse ausgewählt, das auf BmToll9-2 abzielt. Das BmToll9-2-Gen ist im Labor gut charakterisiert, und das Gen-Silencing durch dsRNA-Injektion führt zu leichteren und kleineren Larven in unserer jüngsten Veröffentlichung20. Um die RNAi-Wirksamkeit durch Aufnahme durch Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zu bestätigen, wurden Chitosan-Nanopartikel als Kontrolle verwendet und gleichzeitig nackte dsRNA verglichen.

Im Vergleich zur Kontrolle, Chitosan-Nanopartikeln ohne dsRNA, zeigt nackte dsRNA, die auf das BmToll9-2-Gen abzielt, keinen Silencing-Effekt. Die Fütterung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in die Seidenraupe hemmt das Transkript signifikant, mit einem Knockdown von 79 % (Abbildung 1). Die Hemmung des relativen Transkripts deutet darauf hin, dass das BmToll9-2-Gen durch Chitosan/dsRNA-Einnahme erfolgreich zum Schweigen gebracht wurde.

Der Knockdown des BmToll9-2-Gens beeinflusst das Wachstum der Seidenraupe erheblich. Bei der Beobachtung der Larven sind die BmToll9-2-stummgeschalteten Larven kleiner als die Kontrolllarven (Abbildung 2A). Beim Vergleich der Kokons sind die BmToll9-2-gedämpften Kokons ebenfalls kleiner (Abbildung 2B). Chitosan/dsRNA-Nanopartikel zeigen erfolgreiche RNAi-Effekte sowohl im Transkript als auch im Phänotyp bei der Seidenraupe.

figure-results-1
Abbildung 1: Relatives Transkript von BmToll9-2 nach Aufnahme von Chitosan/dsBmToll9-2-Nanopartikeln in Larven des 5. Stadiums von B. mori. Die relativen mRNA-Spiegel von BmToll9-2 in den Larven, die mit Chitosan-Nanopartikeln als Kontrolle, nackter dsRNA und Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln gefüttert wurden. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung von drei biologischen Replikationen dargestellt. Für jede biologische Replikation gab es drei technische Replikationen. Unterschiedliche Buchstaben auf den Balken weisen auf signifikante Unterschiede hin, die auf der unidirektionalen ANOVA-Analyse basieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Phänotypbeobachtung nach Fütterung mit Chitosan/dsBmToll9-2 Nanopartikeln. Chitosan-Nanopartikel werden als Kontrolle verwendet. (A) Das Auftreten von Seidenraupenlarven nach der Einnahme von Nanopartikeln. (B) Das Auftreten von Seidenraupenkokons nach der Einnahme von Nanopartikeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein geeignetes Stadium ist wichtig für die Beobachtung des RNAi-Phänotyps, abhängig von den Zielgenen. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass Toll9-2 am Wachstum der Seidenraupe beteiligt ist. Die Größe und das Gewicht der Seidenraupenlarven nehmen im 5. Stadium21 rapide zu. Daher werden die Larven des 5. Stadiums als Bühne für das Fütterungsexperiment mit Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln ausgewählt. Es ist auch möglich, die Larven des 3. oder 4. Stadiums für Fütterungsversuche auszuwählen und die Entwicklungsunterschiede im 5. Stadium zu beobachten. Die Fütterungsversuche mit Nanopartikeln erfordern jedoch eine kontinuierliche tägliche Fütterung14. Die Fütterung der Larven in einem jüngeren Stadium erfordert eine höhere dsRNA-Vorbereitung, die relativ teurer ist. Aus den oben genannten Gründen empfehlen wir, die frisch häutenden Seidenraupenlarven des 5. Stadiums als Ausgangspunkt für das Nanopartikel-Fütterungsexperiment zu wählen.

Wichtig ist auch die Optimierung der Fütterungsparameter der Nanopartikel. Eine konstante Fütterung von Nanopartikeln über 5-7 Tage, um eine effiziente RNAi zu erreichen, ist in aktuellen Studien üblich 14,18,22,23. Da dsRNA die teuerste Zutat in RNAi-Experimenten ist, könnten Nanopartikel jeden zweiten Tag an die Larven verfüttert werden, was dazu beitragen könnte, die Kosten für die dsRNA-Herstellung zu halbieren. Eine weitere Möglichkeit, die Kosten zu senken, besteht darin, die Menge an dsRNA zu optimieren, die bei der Fütterung verwendet wird. In diesem Protokoll werden 5 μg Chitosan/dsRNA-Nanopartikel für jede Larve verwendet, was der universellen Dosis für die dsRNA-Injektion im Labor entspricht. Wenn man bedenkt, dass 5 μg dsRNA eine hohe Dosis sind und die Hemmung durch Nanopartikelfütterung signifikant ist. Es wird empfohlen, die Menge an dsRNA im Experiment zu reduzieren. Der Einfluss der beiden oben genannten Parameter auf die RNAi-Effizienz muss jedoch in zukünftigen Experimenten evaluiert werden.

Das Verhältnis von Chitosan und dsRNA konnte optimiert werden. In diesem Protokoll werden 20 μg Chitosan in 100 μl Natriumacetat mit 20 μg dsRNA in 100 μl Natriumsulfat gemischt. Im ersten Bericht über Chitosan/dsRNA-Nanopartikel werden 20 μg Chitosan in 100 μl Natriumacetat mit 32 μg dsRNA in 100 μl Natriumsulfatgemischt 16. In einigen anderen Berichten wird 1 μg Chitosan in 100 μl Natriumacetat mit 1 μg dsRNA in 100 μl Natriumsulfatgemischt 18,23. Daher konnte die Menge an Chitosan und dsRNA optimiert werden, um die beste Ladeeffizienz der Nanopartikel und einen optimalen RNAi-Silencing-Effekt zu erzielen.

Die Lagerung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln muss in Betracht gezogen werden. Die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel werden vor dem Fütterungsexperiment hergestellt, und es wird empfohlen, sie sofort zu verwenden. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte, dass Chitosan/dsRNA-Nanopartikel 15 Tage lang bei 4 °C, 24 °C und 37 °C gelagert wurden und19 Tage lang immer noch stabil waren. So konnten die Chitosan/dsRNA-Nanopartikel im Voraus hergestellt und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert werden, da dsRNA bei niedrigen Temperaturen stabiler ist.

Neben dsRNA können auch einige kleine RNAs, wie z. B. kleine interferierende RNA (siRNA) und kurze Haarnadel-RNA (shRNA), in der Nanopartikelpräparation für RNAi-Experimente verwendet werden. So verbessern siRNA-Nanopartikel beispielsweise die Resistenz der Pflanzen gegen Pseudomonas syringae24. Die Verabreichung von shRNA-Nanopartikeln führte zu einem erfolgreichen RNAi-Effekt bei der neotropischen Braunen Baumwanze Euschistus heros25. Daher können Nanopartikel auf alle RNA-Moleküle angewendet werden, die im RNAi-Experiment verwendet werden.

Die RNAi-Effizienz in Schmetterlingen, einschließlich Seidenraupen, wird als refraktär berichtet26. Die Verabreichung von dsRNA erfolgt nur durch Injektion in Seidenraupen, was zeitaufwändig und arbeitskostend ist. Bei dieser Chitosan/dsRNA-Nanopartikel-Verabreichungsmethode wird ein signifikanter Silencing-Effekt entweder im Transkript oder im Phänotyp in den Seidenraupenlarven und Kokons beobachtet, der aufgrund des geringeren Abbaus von dsRNA durch den Schutz von Chitosan19 möglich ist. Diese Methode ist arbeitssparend und einfach durchzuführen und kann an andere Insekten angepasst werden. Die Leichtigkeit dieses Protokolls kann nicht nur in der wissenschaftlichen Forschung, sondern auch im Klassenzimmer, in der Lehre, in der Demonstration und in der Praxis angewendet werden. Die Verabreichungsmethode von Nanopartikeln ist eine neue Richtung für die zukünftige biologische Kontrolle und Schädlingsbekämpfung27.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (31501898), dem Science and Technology Program von Guangzhou (202102010465), dem Guangzhou Higher Education Teaching Quality and Teaching Reform Project (2022JXGG057) und dem Forschungsprojekt des Open Online Course Steering Committee der Guangdong Provincial Universities (2022ZXKC381) finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL ZentrifugenröhrchenSangonF601620für dsRNA oder Nanopartikel Reaktion
10 μ l PipetteEppendorfP13473Gzum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit
100 μm; l PipetteEppendorfQ12115Gzum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit
2,5 μ; l PipetteEppendorfP20777Gzum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit
20 μm; l PipetteEppendorfH19229Ezum Ansaugen oder Resuspendieren von Flüssigkeit
200 μm; l PipetteEppendorfH20588Ezum Aspirieren oder Resuspendieren von Flüssigkeit
6-Wells Clear TC-treated Multiple Well PlattenCostar3516für die individuelle Aufzucht von Seidenraupen
EssigsäureAladdinA116165zur Herstellung von TAE
Agarose MBBI Life SciencesA610013für Agarose-Gel-Elektrophose
AnalysenwaageSartoriusBSA224Szum Gewicht der Zutaten
Zentrifuge SartoriusCentrisart A-14Czur Zentrifugation zur Bildung von dsRNA oder Nanopartikeln
ChitosanSigma-AldrichC3646zur Kombination mit dsRNA zur Herstellung von Nanopartikeln
EDTASangonA500895zur Herstellung von TAE
EthanolAladdinE130059zur Herstellung von TAE, oder zur dsRNA-Fällung
GefrierschrankSiemensiQ300zur Lagerung von dsRNA oder Nanopartikel
GoTaq Green Master MixPromegaM712für PCR-Reaktion
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002für qRT-PCR-Reaktion
Isopropanol AladdinI112011für dsRNA-Fällung
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpektralphotometerThermoFisherOnezur Bestimmung der Konzentration von dsRNA
ph meterSartorius  PB-10zur Herstellung von Puffern
SanPrep Column PCR Product Purification KitSangonB518141für die PCR-Produktreinigung
NatriumacetatSigma-AldrichS2889zur Herstellung von 100 mM Natriumacetat-Puffer
Natriumsulfat Sigma-Aldrich239313zur Herstellung von 100 mM Natriumsulfatpuffer
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700für die dsRNA-Synthese
ThermoMixerEppendorfCfür die dsRNA-Erzeugung oder Nanopartikel zum Erhitzen
TrisSangonA501492zur Herstellung von TAE
Vortex IKAVortex 3zur Herstellung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln
, von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Chitosan NanopartikeldsRNA DeliveryGene SilencingRNAi F tterungdoppelstr ngige RNANanopartikelbildungGenfunktionsstudieLepidoptera Modell

Verwandte Artikel