Methodenartikel

Vergleichende Karyotyp-Analyse von Lycoris aurea Kräuterpopulationen mittels Fluorochrom-Banding und 45S und 5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

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29. November 2024

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1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll untersucht die Heterochromatinverteilung in acht Populationen von Lycoris aurea (L'Her) Herb unter Verwendung von kombinierter PI- und DAPI-Chromosomenfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit 18S-5.8-26S rRNA-Genregionen (45S rDNA-Regionen) und 5S ribosomalen DNA-Sonden.

Zusammenfassung

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Um die Variation des Karyotyps in acht Populationen zu verstehen, wurden detaillierte Karyotypen anhand von Chromosomenmessungen, Fluoreszenzbanden und rDNA-FISH-Signalen akribisch ermittelt. Die Anzahl der 45S-rDNA-Stellen variiert zwischen einem und fünf Paaren pro Population, wobei die häufigste Anzahl pro Karyotyp vier Paare beträgt. Der 45S rDNA-Locus befindet sich überwiegend in den kurzen Armen und terminalen Regionen der Chromosomen, während der 5S rDNA-Locus hauptsächlich im kurzen Arm und in den terminalen oder proximalen Regionen zu finden ist. Die Populationen HBWF, HNXN, HBBD und HNZX zeigten eine ähnliche Verteilung der 45S-rDNA-Stellen, ebenso wie GXTL, HBFC und SCLS, was auf eine enge Beziehung zwischen Populationen mit ähnlichen 45S-rDNA-Stellenverteilungen hinweist. Die Karyotypen aller untersuchten Populationen sind symmetrisch und bestehen aus stabilen und metastabilen Zentroeren oder ausschließlich stabilen Zentromeren. Streudiagramme von MCA und CVCL unterscheiden effektiv ihre karyotypischen Strukturen. Die Analyse umfasst sechs quantitative Parameter (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). Darüber hinaus deuten die Ergebnisse darauf hin, dass PCoA, das auf diesen sechs Parametern basiert, eine robuste Methode zur Bestimmung biologischer Karyotyp-Beziehungen zwischen den acht Populationen ist. Die Chromosomenzahl in Lycoris-Populationen beträgt x = 6-8. Basierend auf der aktuellen Studie und Literatur wird die genomische Differenzierung dieser Populationen in Bezug auf Genomgröße, Heterochromatin, 45S- und 5S-rDNA-Stellen und Karyotyp-Asymmetrie diskutiert.

Einleitung

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Lycoris ist eine Familie, zu der mehrere wichtige Gartenbaupflanzen gehören1. Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut. ist eine traditionelle chinesische Heilpflanze mit einer langen Geschichte. Phytochemische Analysen haben gezeigt, dass Lycoris aurea (L'Her.) Das Kraut enthält Galantamin und andere Alkaloide, die die Acetylcholin-Empfindlichkeit erhöhen können und als Cholinesterase-Hemmer das Potenzial haben, die Alzheimer-Krankheit zu behandeln2.

Bei höheren Pflanzen ist die Karyotypanalyse entscheidend für die Integration genetischer und physikalischer Karten, mit erheblichen praktischen Auswirkungen auf die Pflanzenbiologie. Diese Analyse ermöglicht die Charakterisierung des Genoms auf Chromosomenebene, die Klärung zellulärer taxonomischer Beziehungen zwischen Populationen, die Identifizierung genetischer Aberrationen und das Verständnis chromosomaler Evolutionstrends 3,4,5. Typischerweise umfasst eine Karyotypbeschreibung die Chromosomenzahl, absolute und relative Chromosomenlängen, primäre und sekundäre Verengungslokalisationen, heterochromatische Fragmentverteilung, rDNA-Stellennummern und -Positionen und andere DNA-Sequenzmerkmale sowie Karyotyp-Asymmetrie 6,7,8. Unter den Karyotyp-Parametern wird die Asymmetrie durch Variationen der Chromosomenlänge (interchromosomale Asymmetrie) und der Zentromerposition (intrachromosomale Asymmetrie) bestimmt. Die Karyotyp-Asymmetrie ist ein signifikantes Merkmal, das die Chromosomenmorphologie widerspiegelt und in der Pflanzenzelltaxonomie 9,10,11,12 weit verbreitet ist.

Oft schränkt das Fehlen von Chromosomenmarkern die Karyotyp-Analyse ein und erschwert die Identifizierung einzelner Chromosomen. In den letzten Jahren haben sich die Giemsa-Färbung, das Fluoreszenzbanding und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in der Pflanzenchromosomenanalyse durchgesetzt. Duale Fluoreszenzfärbemethoden, wie z. B. die CMA- (Chromomycin A3) / DAPI-Färbung (4, 6-Diamino-2-phenylindol) und die PI (Propyliodid) / DAPI-Färbung (bekannt als CPD-Färbung), zeigen GC- und AT-reiche heterochromatische Regionen auf den Chromosomen 4,13. Während der Metaphase oder Pachyten der Pflanzenmitose können wiederholte DNA-Sequenzen oder lange DNA-Abschnitte durch FISH-Hybridisierung spezifische Signale in Pflanzenpopulationen erzeugen 14,15,16.

Fluoreszierende Banden und FISH-Signale liefern nützliche Marker für die Chromosomenidentifizierung. Durch die Messung der Chromosomenlänge, die Analyse der Fluoreszenzbandeneigenschaften und den Vergleich von FISH-Signalunterschieden können detaillierte molekularzytogenetische Karyotypen verschiedener pflanzlicher Keimplasmen oder Populationen konstruiert werden. Diese Karyotypen zeigen effektiv die Chromosomenmorphologie in verschiedenen Keimplasmen oder Populationen, was Vergleiche der Heterochromatinverteilung und der DNA-Sequenzlokalisierung ermöglicht und weitere Forschungen anregt 4,8,17. Molekularzytogenetische Karyotypvergleiche können wertvolle Einblicke in die phylogenetischen Beziehungen und die chromosomale Evolution verwandter Populationen bieten 8,14,18,19.

Die Gattung Lycoris , eine vielfältige und faszinierende Gruppe innerhalb der Familie der Amaryllis, ist bekannt für ihre mehrjährigen Zwiebeln. Mit etwa 20 Arten, von denen 15 in China endemisch sind, weist er eine reiche Artenvielfalt auf. Diese Gattung kommt ausschließlich in warmgemäßigten und subtropischen Regionen Ostasiens vor, einschließlich Südwestchina, Südkorea und Japan, mit einigen Populationen, die sich bis nach Nordindien und Nepal erstrecken20. Frühe zytogenetische Studien befassten sich hauptsächlich mit der Chromosomenzählung, um die grundlegende Chromosomenzahl der Gattung zu bestimmen und die Chromosomenmorphologie in bestimmten Populationen zu beschreiben, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf Lycoris radiata21 lag. Die in dieser Gattung beobachteten Gesamtchromosomenzahlen reichen von 12 bis 33 oder 44 und repräsentieren den diploiden bzw. abnormalen diploiden, triploiden, tetraploiden und aneuploiden Niveaus. Die grundlegenden Chromosomennummern x sind 6, 7, 8 und 11.

Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut, eine bemerkenswerte Art innerhalb der Gattung Lycoris , ist in ganz China weit verbreitet22. Sie gedeiht in entspannten, feuchten Umgebungen und vermehrt sich durch kleine Zwiebeln. Diese Zwiebeln, die Lycorin und Galantamin enthalten - zwei wichtige medizinische Verbindungen - werden seit Jahrhunderten in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet. Auch Lycoris aurea fasziniert Gärtner mit ihren auffällig roten Blüten im Herbst und den immergrünen Blättern im Winter. Die morphologische Ähnlichkeit aller untersuchten Lycoris aurea (L'Hér.) Kräuterpopulationen stellen eine große Herausforderung für die chromosomale Identifizierung mit herkömmlichen zytologischen Methoden dar.

Die Klonierung von FISH, Fosmid oder BAC (bakterielle künstliche Chromosomen) mit repetitiven DNA-Sequenzen und Oligonukleotidsonden auf Metaphase- oder pachydermatoösen Chromosomen wurde für die Karyotypanalyse23,24,25, die vergleichende zytogenetische Analyse26,27, die Erstellung zytogenetischer Karten28,29 und chromosomenspezifische Assays30 verwendet . In jüngster Zeit wurde die FISH-Technik auf die Chromosomenanalyse von Lycoris-Populationen angewendet31. Obwohl die Chromosomenzahl und der Karyotyp in Lycoris-Populationen variieren, bleibt die Gesamtchromosomenzahl konstant, wobei drei Grundtypen beobachtet werden: das zentrale Zentromer-Chromosom (M-), das distale Zentromer-Chromosom (T-) und das proximale Zentromer-Chromosom (A-). Darüber hinaus werden in natürlichen Populationen unterschiedliche Chromosomenformen und -größen beobachtet32.

Die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist nützlich für den Nachweis von Chromosomenveränderungen, wie z. B. Zentromerfusion, Inversion, Genamplifikation und Fragmentdeletion. Die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstechnologie (RNA-FISH) ermöglicht die hochauflösende visuelle Analyse von Chromosomen, um mehrere komplexe Veränderungen zu erkennen und zu identifizieren, einschließlich der Fusion zentraler Chromosomenregionen, der Bildung neuer Chromosomenstrukturen, der Umkehrung von Chromosomenregionen, der Amplifikation von Genen oder Genfragmenten und des Verlusts von Gensequenzen in bestimmten Chromosomenregionen33. Fünf der 500 Klone zeigten starke FISH-Signale auf der Zentromerregion des zentralen Zentromer-Chromosoms (M-), nicht aber auf dem distalen Zentromer-Chromosom (T-)34. Das einzigartige FISH-Signalverteilungsmuster auf jedem Chromosom ermöglichte die Identifizierung einzelner Chromosomen, was zuvor in Lycoris-Populationen mit herkömmlichen Färbemethoden eine Herausforderung darstellte31. Derzeit gibt es nur wenige Studien zur molekularen Zytogenetik von Lycoris aurea (L'Hér.) Herb und betonte den dringenden Bedarf an weiterer Forschung auf diesem Gebiet.

In dieser Studie wurden acht gut differenzierte Metaphase-Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Die Kräuterpopulationen wurden mit Hilfe von Enzymimmersions- und Flammentrocknungsmethoden (EMF) präpariert. CPD-Färbung und 45S- und 5S-rDNA-Sonden wurden für die FISH-Identifizierung verwendet. Detaillierte molekularzytogenetische Karyotypen dieser Populationen wurden unter Verwendung kombinierter Daten aus Chromosomenmessungen, Fluoreszenzbanden und 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signalen konstruiert. Für jede Population wurden sechs verschiedene karyotypische Asymmetrieindizes berechnet, um karyotypische Beziehungen zwischen ihnen zu identifizieren. Die Auswertung der molekularzytogenetischen Karyotypdaten lieferte wichtige Einblicke in die genomische Differenzierung und die evolutionären Beziehungen der acht Populationen, was das Verständnis der Lycoris-Chromosomen möglicherweise verändern wird.

Protokoll

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Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt, während die verwendeten Sonden in der Zusatzdatei 1 aufgeführt sind.

1. Präparation der apikalen Chromosomen

  1. Wurzel schlagen durch Hydrokultur. Nachdem Sie den oberirdischen Teil der Zwiebel entfernt haben, legen Sie ihn in eine konische Flasche, die mit Wasser gefüllt ist, und ersetzen Sie das Wasser alle 3 Tage, nach der von Song et al.35 beschriebenen Methode.
  2. Entfernen Sie aktiv wachsende Wurzelspitzen, wenn sie eine Länge von etwa 1,0 bis 2,0 cm erreichen, und behandeln Sie sie 1,0 h lang mit gesättigtem α-Bromonaphthalin bei 28 °C.
  3. Schneiden Sie die Wurzelspitzen auf ca. 1 cm ab und legen Sie sie in ein frisch zubereitetes Gemisch aus Methanol und Eisessig im Volumenverhältnis 3:1 bei Raumtemperatur (ca. 20-25 °C) für 2-3 h. Lagern Sie sie dann im Kühlschrank bei 4 °C, wie von She et al.36 beschrieben.
  4. Waschen Sie die festen Wurzelspitzen (2-3 mm) gründlich in doppelt destilliertem Wasser.
  5. Bereiten Sie eine Mischung aus Cellulase und Pektinhydrolase in 0,01 mM Zitronensäure-Natriumcitrat-Puffer bei einem pH-Wert von 4,5 vor, wobei Celluase und Pektinhydrolase jeweils 1 % betragen. Legen Sie die vorbehandelten Wurzelspitzen in die Mischung und verdauen Sie sie bei 28 °C für 1,0-1,5 h.
  6. Waschen Sie die verdauten Wurzelspitzen mit doppelt destilliertem Wasser, geben Sie sie auf einen Objektträger und zerdrücken Sie sie gründlich mit dem Fixiermittel mit einer feinen Zange.
  7. Trocknen Sie die Objektträger über der Flamme einer Alkohollampe, bis der Wassernebel einfach verschwindet. Unter einem Phasenkontrastmikroskop werden Objektträger mit mehr als fünf Spaltphasen und ohne überlappende Chromosomen ausgewählt. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C für die zukünftige Verwendung.

2. CPD-Färbung

  1. Bereiten Sie eine CPD-Lösung her, indem Sie PI und DAPI zu einem 30 % (v/v) Antifluoreszenz-Dämpfungsglied hinzufügen, wobei die Konzentration von PI 0,6 μg·mL-1 und die Konzentration von DAPI 3 μg·mL-1 beträgt.
  2. Trocknen Sie den Chromosomenträger bei 65 °C für 30 min.
  3. Pro Chromosomenträger werden 100 μl RNase A-Verdünnungsmittel (die RNase A-Speicherlösung, die 100-mal mit 2x SSC (Kochsalzlösung) verdünnt wird, was zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml führt, zugegeben. Decken Sie den Objektträger ab und erwärmen Sie ihn in einer 37 °C feuchten Kammer für 30-60 Minuten.
  4. Waschen Sie den Chromosomenpräparat mit 2x SSC bei Raumtemperatur für drei Intervalle von je 5 min.
  5. Waschen Sie den Chromosomenträger bei Raumtemperatur für 1-2 Minuten.
  6. Pro Chromosomenträger werden 200 μl Pepsin-Verdünnungsmittel (die Pepsin-Aufbewahrungslösung, die 100-mal mit 0,01 N HCl verdünnt wird, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erreichen) zugegeben. Decken Sie den Objektträger ab und inkubieren Sie ihn in einer feuchten Kammer bei 37 °C für 5-20 Minuten.
  7. Waschen Sie die Chromosomenabschnitte mit Reinstwasser bei Raumtemperatur für 2 min, gefolgt von einem Waschen mit 2 xSSC bei Raumtemperatur für zwei Intervalle von jeweils 5 min.
  8. Befestigen Sie die Objektträger mit Methanol: Eisessig (3:1) Lösung für 10 min.
  9. Mit 2x SSC bei Raumtemperatur in drei Intervallen von je 5 min waschen.
  10. Mit 70 %, 95 % und 100 % Ethanol bei -20 °C jeweils 5 min behandeln, dann bei Raumtemperatur trocknen.
  11. Nehmen Sie die behandelten und getrockneten Chromosomen-Objektträger, fügen Sie jedem Objektträger 30 μl CPD-Färbelösung hinzu, bedecken Sie sie mit einem 24 mm x 50 mm großen Deckglas und färben Sie es mehr als 30 Minuten lang im Dunkeln. Ausgedehntes Chromosomenmaterial sollte über Nacht angefärbt werden.
  12. Betrachten Sie die Chromosomen-Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem grünen Anregungsfilter (WG) für die PI-Färbung und einem Ultraviolett-Filter (UV) für die DAPI-Färbung. Nehmen Sie Bilder mit der kompatiblen Software auf.
    1. Passen Sie die Belichtungszeit durch die beiden Filter an, um während der Bildaufnahme eine ähnliche rote und blaue Fluoreszenzintensität zu erzielen. Das CPD-Bild wird aus den Graustufenbildern gewonnen, die mit PI und DAPI gefärbt wurden. Die Chromosomenvermessung und die Bildbearbeitung wurden mit der Software Adobe Photoshop durchgeführt.

3. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

  1. Bereiten Sie die Hybridlösung vor: FAD (10 μl), ssDNA (2 μl), 20× SSC (2 μl), 5S rDNA (1 μl), 45S rDNA (1 μl) und 50 % Glucansulfat (4 μl). Nach der Zubereitung die Hybridlösung zentrifugieren (2500 x g, 5-10 min, bei Raumtemperatur) und auf Eis legen.
  2. Legen Sie die gescannten Dias für 30-60 Minuten bei 65 °C in den Ofen.
  3. Entfernen Sie die gebackenen Objektträger, fügen Sie 100 μl 70%ige FAD-Denaturierungslösung hinzu, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und denaturieren Sie sie 2,5 Minuten lang in einem 85 °C Molekularhybridisierungsofen.
  4. Entfernen Sie das Deckglas und tauchen Sie die Objektträger sofort in 70 %, 90 % und 100 % kaltes Ethanol und trocknen Sie sie nacheinander jeweils 5 Minuten lang.
  5. Nehmen Sie die Objektträger heraus und lassen Sie sie mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
  6. Geben Sie 20 μl Hybridlösung in den Objektträger, legen Sie das Deckglas vorsichtig darauf, bis die Flüssigkeit vollständig verteilt ist, und lassen Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um den abgedeckten Bereich des Objektträgers zu befeuchten.
  7. Legen Sie die Objektträger in eine Hybridschale, die mit 2× SSC getränkt ist (die Hybridschale sollte eine große Petrischale mit einem Deckel sein, der in Alufolie eingewickelt ist, um den Betrieb vor Licht zu erleichtern) und inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht (mindestens 6 Stunden).
  8. Die Chromosomen werden durch Einbetten mit 3 μgηmL-1 DAPI in einer 30%igen (v/v) Lösung von Vectashield H-100 gegengefärbt. Nehmen Sie das Bild mit kompatibler Software auf, wobei die blaue Fluoreszenz von DAPI durch das violette Licht des Filters und die rote Fluoreszenz von PI durch das grüne Licht angeregt wird.
    HINWEIS: Die FISH-Hybridisierung wurde unter Verwendung von 45S- und 5S-rDNA-Sonden auf zuvor CPD-gefärbten Objektträgern nach der von She et al.36 beschriebenen Methode durchgeführt.

4. Karyotyp-Analyse

  1. Wählen Sie fünf mitotische Metaphasenzellen für jede Population aus, in denen die Chromosomen gut verteilt (ohne Überlappung) und mäßig kondensiert sind (die Chromosomen sollten nicht maximal aggregiert sein, aber die Enden sollten nicht verklumpt sein), gemäß der von She et al.4 beschriebenen Methodik.
  2. Bestimmen Sie die absolute Länge jedes Chromosoms, indem Sie fünf Chromosomen mit der höchsten Konzentration während der Zellteilung auswählen.
  3. Messen Sie akribisch und präzise die Länge des langen Arms (L) und des kurzen Arms (S) jedes Chromosoms sowie die Größe jeder fluoreszierenden Pigmentbande auf dem Chromosom.
  4. Berechnen Sie die folgenden Parameter: (1) relative Chromosomenlänge (RL, haploider Prozentsatz); (2) Armverhältnis (AR = L/S, langer Arm/kurzer Arm); (3) Gesamtlänge des haploiden Chromosoms (TCL; Länge des Karyotyps); (4) durchschnittliche Chromosomenlänge (C); (5) Größe der Fluoreszenzbande (der prozentuale Anteil der Fluoreszenzbande im Verhältnis zur Länge des Chromosoms); (6) Abstand vom Zentromer zur rDNA-Stelle; (7) durchschnittlicher Zentromer-Index (KI, berechnet als die kurze Armlänge jedes Chromosoms dividiert durch die Gesamtlänge dieses Chromosoms, dann unter Mittelung dieser Werte); (8) vier verschiedene Indikatoren für die Asymmetrie des Karyotyps, darunter der Zentromerindex (CVCI), der Variationskoeffizient (CVCI), der Variationskoeffizient der Chromosomenlänge (CVCL), der mittlere Asymmetriekoeffizient des Zentromers (MCA) und die Kategorie der Stebbins-Asymmetrie.
    HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die Methoden von Paszko10 und Peruzzi et al.11 , um den Asymmetrieindex zu berechnen. Klassifizieren Sie Chromosomen mit unterschiedlichen Armverhältnissen gemäß den fünf Klassifikationsmethoden von Levan. Ordnen Sie die Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Kraut in absteigender Reihenfolge der Länge, wie im Protokoll von Han et al.beschrieben 37.
  5. Stellen Sie die Präzision und Genauigkeit der Methodik sicher, indem Sie Chromosomenkaryotypmuster auf der Grundlage von Chromosomenmessdaten in Kombination mit Fluoreszenzbandeninformationen und der Position und Größe des rDNA-FISH zeichnen.
  6. Die Visualisierung der asymmetrischen Beziehungen des Karyotyps der acht Populationen ist ein wichtiger Schritt, der klare Erkenntnisse liefert. Dies wird durch zweidimensionale Streudiagramme erreicht, die zur Ermittlung ihrer MCA und CVCL verwendet werden.
  7. Führen Sie eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) unter Verwendung des Gower-Ähnlichkeitskoeffizienten, einer entscheidenden Komponente, nach den Methoden von She et al.38 durch.
  8. Berechnen Sie sechs quantitative Parameter (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI), um die zytogenetischen Karyotypen der acht Populationen zu bestimmen.
  9. Führen Sie statistische Analysen mit einem Datenanalyse- und Visualisierungsprogramm durch, um das UPGMA-basierte Dendrogramm und das PCoA-Streudiagramm zu erstellen.

Ergebnisse

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Unter Anwendung der sorgfältigen Methode der Enzymimmersion und Flammentrocknung (EMF) wurden verstreute und gut differenzierte Metaphase-Chromosomen von Lycoris aurea (L'Hér.) Es wurden Kräuter gewonnen und der zytogenetische Chromosomenkaryotyp von Lycoris aurea konstruiert (Abbildung 1). Die Metaphase-Chromosomen mit dem höchsten Kondensationsgrad sind aufgrund der reduzierten morphologischen Unterschiede für die Karyotypanalyse ungeeignet. Da jedoch die Gesamtlänge der haploiden Chromosomen (TCL) zwischen den Populationen vergleichbar ist, ist die Unterscheidung der Karyotypen verschiedener Lycoris aurea-Populationen durch den Vergleich von Unterschieden in den TCL-Werten möglich. Die Karyotypmerkmale und der Kern-DNA-Gehalt von acht Populationen von Lycoris aurea sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Verteilung der Fluoreszenzbanden und die Positionen der 45S- und 5S-rDNA-Stellen sind in Tabelle 2 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Messungen der Chromosomen zusammen mit den Fluoreszenzbanding-Eigenschaften und der Position und Größe der 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signale.

Die diploiden Chromosomenzahlen sind wie folgt: 2n = 16 = 8m + 8t für GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t für HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t für GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t für HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t für HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t für HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t für HBWF und 2n + 1 = 15 = 7m + 8t für SCLS (Tabelle 1). Wie im Protokoll von She et al.4 beschrieben, sind die Metaphasenchromosomen der acht L. aurea-Populationen klein, mit mittleren Chromosomenlängen von 1,01 μm (HNZX) bis 2,08 μm (GZDS) und einer TCL von 16,14 μm (HNZX) bis 29,13 μm (GZDS). Die TCLs der acht Populationen korrelieren mit den berichteten Gehalten an nukleärer DNA (Tabelle 1). Der kleinste relative Längenbereich (RRL) wird bei HNXN (1,52-3,81) beobachtet, während der größte bei GZDS (2,73-5,86) zu sehen ist. Die Populationen HNXN und GZDS wiesen die geringste bzw. größte Variation der Chromosomenlänge auf. Der mittlere Zentromerindex (CI) des Genoms schwankte zwischen 61,02 ± 5,63 (Populations-HBFC) und 70,70 ± 4,63 (Populations-HBWF). Die HBFC der Population wies die geringste Veränderung des Zentromerindex auf, während die HBWF der Population die umfangreichsten Veränderungen aufwies.

Die Karyotypen setzen sich aus metazentrischen (m) und telozentrischen (t) Chromosomen zusammen (Tabelle 1; Abbildung 2), die die häufigsten Chromosomenformen in den acht untersuchten Populationen darstellt. Die acht verschiedenen Karyotyp-Asymmetrie-Indizes sind in Tabelle 1 aufgeführt. Unter diesen Indizes charakterisieren der Variationskoeffizient des Zentromerindex (CVCI) und die mittlere Zentromerasymmetrie (MCA) die intrachromosomale Asymmetrie, während der Variationskoeffizient der Chromosomenlänge (CVCL) die interchromosomale Asymmetrie misst. Die Bereiche für CVCI und MCA sind wie folgt: CVCI = 10,97 (HBBD) bis 18,25 (HBWF) und MCA = 28,85 (HNZX) bis 39,30 (HBWF). Diese Werte zeigen übereinstimmend, dass HBBD die niedrigste und HBWF die höchste intrachromosomale Asymmetrie aufweist. Die Spanne für CVCL liegt zwischen 14,98 (GZDS) und 23,32 (HBWF), was darauf hindeutet, dass GZDS den am wenigsten asymmetrischen Karyotyp aufweist, während HBWF den asymmetrischsten Karyotyp unter den acht Populationen aufweist. Nach den Klassifikationsprinzipien von Stebbins9 gehören diese Karyotypen zur Klasse 1B, was darauf hindeutet, dass alle untersuchten Populationen relativ symmetrische Karyotypen aufweisen.

Die Asymmetriebeziehungen des Karyotyps zwischen den acht Lycoris aurea (L'Hérit.) Die Kräuterpopulationen werden anhand von bidimensionalen Streudiagrammen von CVCI versus CVCL und MCA versus CVCL dargestellt (Abbildung 3). Die Karyotypstruktur dieser Populationen, wie sie sich aus den drei Parameterpaaren CVCI, CVCL und MCA ergibt, hat signifikante Auswirkungen. Diese Parameter weisen ähnliche Karyotyp-Asymmetrien auf. Die Ergebnisse der Streudiagramme unterstreichen die potenziellen Auswirkungen der Forschung und zeigen, dass die Population HNXN den symmetrischsten Karyotyp aufweist, während die Populationen HBFC und HBWF die meisten intrachromosomalen bzw. interchromosomalen Asymmetrien aufweisen (Abbildung 3).

In dieser Studie wurden die acht Lycoris aurea-Populationen auf der Grundlage des UPGMA-Baumdiagramms mit fünf Karyotyp-Parametern akribisch in drei Hauptgruppen eingeteilt (Abbildung 4). Der erste Cluster, der durch die SCLS der Population repräsentiert wird, bildet eine unabhängige Klade. Die zweite Gruppe besteht aus HNXN und HBWF. Der dritte Cluster ist in zwei Untergruppen unterteilt: Eine enthält nur die HBFC der Grundgesamtheit, während die andere die HBWF-, GZDS- und GXTL-Grundgesamtheiten umfasst, wobei die HBBD- und GZDS-Grundgesamtheiten in einem kleineren Zweig zusammengefasst sind. Die karyologischen Beziehungen zwischen den untersuchten Populationen, wie sie durch die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) aufgedeckt wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Das PCoA-Streudiagramm zeigt, dass die acht Grundgesamtheiten in zwei Gruppen mit einem Konfidenzniveau von 68,36 % unterteilt werden können. Die erste Gruppe umfasst HBWF, HBBD und GXTL, wobei die ersten drei Populationen eng beieinander liegen. Die zweite Gruppe besteht aus HBFC, HNXN, HNZX und SCLS, wobei HBFC die mittlere Position zwischen den beiden Gruppen einnimmt und SCLS am isoliertesten positioniert ist (Abbildung 5).

CPD (Kombination aus Propidiumiodid und DAPI) und DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) sind Standardtechniken zur Beobachtung der Kernstruktur und der Chromatinverteilung. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten offensichtliche Heterochromatin-Phänomene in acht Populationen von Lycoris aurea (L'Hérit.) Kraut (Abbildung 1 und Abbildung 2; Tabelle 2). Die Ergebnisse der FISH-Hybridisierung für jede Population zeigten, dass alle chromosomalen Regionen den 45S- und 5S-rDNA-Loci entsprechen. Die Eigenschaften der CPD-Bänder sind in Abbildung 1A,C,E,G,I,K,M,O dargestellt.

In den Populationen HBFC und HBBD wurden CPD-Banden in den zentromerischen und perizentromeren Regionen beobachtet (Abbildung 1G,K; Abbildung 2D,F). Bestimmte Chromosomen wiesen jedoch keine CPD-Banden auf: das 3. und 8. Chromosom in SCLS, das 1. Chromosom in HNXN, das 1. Chromosom in HNZX, das 1. Chromosom in HBWF, das 2. Chromosom in GZDS und das 2. Chromosom in GXTL (Abbildung 1A,C,E,I,J,M,O; Abbildung 2A-C,E,G,H). Bemerkenswert ist, dass CPD-Banden auch an den Enden der kurzen Arme der Chromosomenpaare 5, 6 und 7 bei SCLS und HNXN, an den Paaren 4, 5, 6, 7 und 8 bei HNZX und an den Paaren 5, 6 und 7 bei HBFC gefunden wurden. Darüber hinaus waren CPD-Banden an den kurzen Armenden der Chromosomen 4, 5, 6, 7 und 8 bei HBWF, an den kurzen Armenden der Chromosomen 5, 6 und 7 bei HBBD und an den kurzen Armenden der Chromosomen 5, 6, 7 und 8 bei GXTL vorhanden (Abbildung 1A und Abbildung 2A).

Nach der FISH-Hybridisierung bildete die DAPI-Reverse-Färbung helle fluoreszierende Banden um die zentrischen Partikel der Chromosomen 5, 6 und 7 in GZDS. Diese Banden, die als Post-FISH-DAPI+-Banden bezeichnet werden, deuten darauf hin, dass diese Heterochromatinregionen eine hohe Anzahl von A-T-Basenpaaren enthalten (Abbildung 2G). Die Bandbreite der in den acht Populationen beobachteten (peri)zentromeren CPD-Banden betrug 25,00 % bis 57,14 % (Tabelle 2), während die Gesamtanzahl der terminalen CPD-Banden zwischen 40,00 % und 71,43 % lag (Tabelle 2). In der Populations-GZDS korrelierten die Post-FISH-DAPI+-Banden mit der Karyotyplänge und machten 42,86 % der Gesamtlänge aus. Die Größen der rDNA-CPD-Banden, der nicht-rDNA-CPD-Banden und der DAPI+-Banden nach FISH unterschieden sich signifikant zwischen den verschiedenen Chromosomenpaaren von Lycoris aurea (L'Hérit.) Kraut (Abbildung 2; Tabelle 2).

Die FISH-Technik wurde verwendet, um 45S- und 5S-rDNA-Sonden in CPD-gefärbte Chromosomen einzufügen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Zusammenfassung der Anzahl und Lokalisation von 45S- und 5S-rDNA-Stellen in den acht Populationen von Lycoris aurea (L'Hérit.) Kraut ist in Tabelle 2 dargestellt und in Abbildung 2 dargestellt. Insbesondere signifikante Unterschiede in der Anzahl, Größe und Lage der rDNA-Loci zwischen den acht Populationen unterstreichen die Bedeutung dieser Ergebnisse. Insgesamt gab es 30 45S rDNA-Loci in den acht Populationen. Davon befanden sich 4 Loci (13,33 %) in der zentralen Zentromerregion, 9 (30,00 %) in der nahe zentralen Zentromerregion und 17 (56,67 %) in den terminalen Regionen ihrer jeweiligen Chromosomenarme (Abbildung 2; Tabelle 2).

In der GXTL-Population wurde ein 45S rDNA-Locus-Signal in der Zentromerregion des kurzen Arms von Chromosom 4 gefunden, während vier weitere Signale in der Zentromerregion der langen Arme der Chromosomen 5, 6, 7 und 8 lokalisiert wurden (Abbildung 1P; Abbildung 2G). In der HBFC-Population wurde ein 45S rDNA-Locus in der Zentromerregion auf dem kurzen Arm von Chromosom 4 positioniert, wobei drei Loci in perizentromeren Heterochromatinregionen auf den kurzen Armen der Chromosomen 5, 6 und 8 gefunden wurden (Abbildung 1H; Abbildung 2D). In der GZDS-Population befand sich ein 45S-Locus in der Zentromerregion des kurzen Arms des metazentrischen Chromosoms 4 (Abbildung 1N; Abbildung 2G). In HNZX wurden fünf 45S rDNA-Loci in den terminalen Bereichen der kurzen Arme der Chromosomenpaare 4, 5, 6, 7 und 8 beobachtet (Abbildung 1H; Abbildung 2D). Die Verteilung der 45S-Stellen in HBBD (Abbildung 1J; Abbildung 2E) und HNXN (Abbildung 1L; Abbildung 2F) war ähnlich, mit einem Locus in der Zentromerregion des kurzen Arms von Chromosom 4 und drei Loci in der zentromeren Region der kurzen Arme der Chromosomen 5, 6 und 7.

In HBWF traten fünf 45S rDNA-Loci-Signale in den Centromer-Regionen mit kurzem Arm der Chromosomenpaare 4, 5, 6, 7 und 8 auf (Abbildung 1N; Abbildung 2G). In SCLS wurde ein 45S rDNA-Locus-Signal in den Zentromerregionen mit kurzen Armen der Chromosomenpaare 1 und 2 sowie in den perizentromeren Regionen der kurzen Arme der Chromosomenpaare 5 und 6 gefunden (Abbildung 1P; Abbildung 2H). Für die 5S-rDNA-Loci wurden insgesamt neun in den acht Taxa identifiziert, wobei 3 (33,33 %) in den proximalen Regionen, 3 (33,33 %) in den perizentromeren Regionen und 3 (33,33 %) in den terminalen Regionen der jeweiligen Chromosomenarme lokalisiert waren (Abbildung 2; Tabelle 2). In GXTL trat ein 5S rDNA-Locus-Signal in der Nähe des terminalen Endes des langen Arms von Chromosomenpaar 6 auf (Abbildung 1P; Abbildung 2G). Die Verteilung der 5S-Stellen war bei HBFC ähnlich (Abbildung 1H; Abbildung 2D) und GZDS (Abbildung 1N; Abbildung 2G), die beide einen 5S rDNA-Locus in der proximalen Region des kurzen Arms von Chromosom 7 enthalten. In HNZX wurde ein 5S rDNA-Locus in der Nähe des terminalen Endes des langen Arms von Chromosom 8 gefunden (Abbildung 1H; Abbildung 2D), während in HBBD ein 5S rDNA-Locus auf Chromosom 7 identifiziert wurde (Abbildung 1J; Abbildung 2E). In HBWF erschienen zwei 5S rDNA-Loci in der Nähe des terminalen Endes der langen Arme der Chromosomen 4 und 8, zwei weitere im langen Arm von Chromosom 7, einer in der Zentromerregion und einer in der Nähe des Endes (Abbildung 1N; Abbildung 2G).

Die Kombination von 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signalen zusammen mit den Merkmalen des terminalen CPD-Segments unterschied effektiv alle mitotischen Chromosomen aus verschiedenen Populationen von Lycoris aurea (L'Hérit.) Kraut. In den SCLS-, HBFC-, HBBD-, GZDS- und GXTL-Populationen zeigte Chromosom 1 starke CPD-Signale in der zentromeren Region. Chromosom 2 zeigte starke CPD-Signale in der zentromerischen Region, mit Ausnahme von GZDS und GXTL. Chromosom 3 zeigte ein starkes CPD-Signal in der zentromeren Region, mit Ausnahme von SCLS. Chromosom 4 zeigte durchweg starke CPD-Signale in der zentromeren Region. Für die Chromosomen 5, 6 und 7 wurden starke CPD-Signale an den Enden der kurzen Arme beobachtet. Chromosom 4 zeigte ebenfalls starke 45S rDNA-Signale am Ende des kurzen Arms, während die Chromosomen 5 und 6 starke 45S-Signale in ihren terminalen Regionen aufwiesen, außer bei GZDS. Bemerkenswert ist, dass in der GZDS-Population ein starkes DAPI-Signal vorhanden war. Zusätzlich trat ein schwaches 5S-rDNA-Signal in der proximalen Region von Chromosom 7 in den HBFC-, HBWF-, HBBD- und GZDS-Populationen auf.

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Abbildung 1: Mitotische Chromosomen von acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen. Untersuchung von mitotischen Metaphase-Chromosomen von acht verschiedenen Lycoris aurea (L' Herit.) Es werden Kräuterpopulationen angezeigt, einschließlich Population SCLS (A,B), Population HNXN (C,D), Population HNZX (E,F), Population HBFC (G,H), Population HBWF (I,J) und Population HBBD (K,L). Die Hybridisierung von GZDS (M,N) und GXTL (O,P) wurde unter Verwendung von FISH mit Biotin-markierten 45S- und Digoxin-markierten 5S rDNA-Sonden nach CPD-Färbung durchgeführt. Die resultierenden Bilder von Chromosomen nach der CPD-Färbung zeigen 45S (grün) und 5S (rot) rDNA-Signale. Die gesamte DNA wurde mit DAPI-Farbstoff umgekehrt gefärbt, was zu einer blauen Farbe führte. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Chromosomen-Karyotyp-Diagramme von acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen. Das Chromosomenmusterdiagramm für acht Populationen von Lycoris aurea (L' Herit.) Herb zeigt die Eigenschaften der Fluoreszenzbande sowie die Position und Größe der 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signale. Die Populationen SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS und GXTL werden jeweils durch (A-H) dargestellt. Die Ordinatenskala gibt die relative Länge des Chromosoms an (den prozentualen Anteil dieses Chromosoms im haploiden Genom), und die Zahl oben gibt die Seriennummer des Chromosoms an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Streudiagramme für acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen basierend auf drei Karyotyp-Parametern. (A) Der CVCI-Index wird gegen den CVCL-Index aufgetragen. (B) Der MCA-Index wird gegen den CVCL-Index aufgetragen. Die Populationen SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS und GXTL sind angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Das UPGMA-Dendrogramm von acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen. Das UPGMA-Dendrogramm basiert auf den Parametern x, 2n, TCL, MCA, CVCL und CVCI für die acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS und GXTL. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: PCoA der acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräutersorten basierend auf sechs Karyotyp-Parametern. Das PCoA basiert auf den Parametern x, 2n, TCL, MCA, CVCL und CVCI, die SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS und GXTL repräsentieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Namen von acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Verteilung der Fluorochrombanden und rDNA-Stellen in den acht Lycoris aurea (L' Hér.) Kräuterpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Die in dieser Studie verwendeten Sonden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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Die Zubereitung von Lycoris aurea (L'Hér.) Kräuterwurzelchromosomen umfassen mehrere kritische Schritte: (1) Kultivierung der Wurzeln durch Hydrokultur, (2) Behandlung der Wurzelspitzen mit gesättigtem α-Bromonaphthalin, (3) Fixierung der Wurzeln mit einer Alkohol-Essigsäure-Lösung, (4) Durchführung einer enzymatischen Hydrolyse an den Wurzelspitzen mit einer Enzymlösung und (5) gründliches Zerdrücken der verdauten Wurzeln und Trocknen der Objektträger über einer Alkohollampenflamme.

Eine genaue Chromosomenvermessung ist für die Karyotypanalyse in zytogenetischen Studien unerlässlich. Die Chromosomen sollten eine auffällige Kondensation und klar definierte Grenzen aufweisen; Andernfalls wird die genaue Berechnung von Chromosomenparametern zu einer Herausforderung5. Frühere zytogenetische Untersuchungen haben gezeigt, dass die morphologische Differenzierung der mitotischen Chromosomen vom Grad der Kondensation abhängt 4,36. Wenn die Kondensation nicht ausreicht, können die Enden der Chromosomenarme immer noch desagglutiniert sein, was zu unklaren Chromosomengrenzen führt. Wenn die Chromosomen jedoch die maximale Kondensation erreichen, nehmen die morphologischen Unterschiede zwischen den Chromosomen ab. Daher ist die Auswahl von Chromosomen mit mäßiger Kondensation entscheidend für die Identifizierung und Messung von Chromosomen, insbesondere in Populationen mit weniger Chromosomen.

Die Sondenmarkierung ist entscheidend für eine erfolgreiche FISH-In-situ-Hybridisierung, insbesondere für die 5S rDNA-Sondenlösung. Aufgrund der kurzen Sequenz der 5S-rDNA ist die Konzentration der durch PCR markierten Zielsequenzen in der Regel gering, was zu schwachen Hybridisierungssignalen führt. Die direkte Synthese von Fluorescein-markierten Sonden erzeugt jedoch stärkere Hybridisierungssignale und vereinfacht den Prozess. Für die 45S rDNA-Sondenlösung wurden Teilsequenzen aus den 5.8S-, 18S- und 25S-rRNA-kodierenden Regionen von Arabidopsis thaliana an den 5'- und 3'-Enden mit 6-Carboxyl-Tetramethylrhodamin (TAMRA) markiert und dann gemischt. Die Fluorescein 5S rDNA-Sondenlösung wurde unter Verwendung von 1-59 und 60-118 Nukleotidsequenzen aus der Arabidopsis 5S rRNA-Genkodierungsregion erhalten, wobei jede Sequenz am 5'-Ende mit 6-Carboxylfluorescein (6-FAM) markiert und dann gemischt wurde.

In dieser Studie nutzten wir die Unterschiede zwischen DAPI- und PI-Farbstoffen in der DNA-Bindung und kombinierten sie, um klare Fluoreszenzbanden zu erhalten. PI-Farbstoffe (Propidiumiodid) können Zellmembranen durchdringen und an DNA-Moleküle in Zellen binden. Im Gegensatz dazu bindet DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) bevorzugt an AT-reiche DNA-Regionen und sorgt so für eine klare, kontrastreiche Färbung. Aufgrund dieser komplementären Eigenschaften werden DAPI und PI oft zusammen verwendet, was als CPD-Färbung bezeichnet wird, um gleichzeitig Informationen über den Zellkern und das Zytoplasma zu sammeln. Unterschiede in Vorhandensein, Lage und Größe der CPD- und DAPI+-Banden zeigten eine signifikante Heterochromatindifferenzierung in den acht Populationen von Lycoris aurea. Die CPD-Färbung zeigte Heterochromatinregionen, die reich an GC-Gehalten waren, sowohl in zentromeren als auch perizentrischen Regionen und innerhalb telozentrischer Chromosomen.

Die Untersuchung der Karyotyp-Asymmetrie ist ein beliebter, erschwinglicher und weit verbreiteter zytogenetischer taxonomischer Ansatz, der eine Reihe von Parametern und Indikatoren umfasst, darunter sowohl qualitative als auch quantitative Messungen, Stebbins-Klassifikationsparameter und verschiedene quantitative Indizes (z. B. Paszko10; Peruzzi et al.11). Unter diesen werden das R-Verhältnis und CVCL zur Messung der Chromosomenasymmetrie verwendet, während CVCI und MCA Schlüsselindikatoren für die Chromosomenasymmetrie darstellen. Insbesondere gilt CVCL als robuster statistischer Parameter für die Abschätzung der interchromosomalen Asymmetrie10, und die Metrik für chromosomale Asymmetrie (MCA) wird als wirksames Maß für die Beurteilung der intrachromosomalen Asymmetrie anerkannt11. Um Karyotyp-Asymmetrien zwischen Populationen bestmöglich darzustellen, wird ein zweidimensionales Streudiagramm empfohlen, bei dem zwei Asymmetrieschätzer auf der x- bzw. y-Achse platziert werden, wobei jede Stichprobe als Punkt11,12 dargestellt wird. Die Ergebnisse zeigten, dass zweidimensionale Streudiagramme von CVCL vs. CVCI sowie MCA vs. CVCL veranschaulichen effektiv die Asymmetriebeziehungen des Karyotyps zwischen den acht verschiedenen Populationen von Lycoris aurea (L'Herit.) Herb, das die Zuverlässigkeit dieser Indizes bei der Beurteilung der Chromosomenasymmetrie unterstützt.

Um Karyotypen zu vergleichen und karyologische Beziehungen zwischen den acht Populationen zu rekonstruieren, wurde in dieser Studie die von Peruzzi et al.11 vorgeschlagene Methodik unter Verwendung der Parameter x, 2n, TCL, MCA, CVCL und CVCI angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass HBWF-, GZDS-, HBBD- und GXTL-Populationen eng miteinander verwandt waren, wobei HBFC zwischen diesen Gruppen positioniert war. Folglich erwies sich PCoA, das auf diesen sechs Parametern basiert, als eine sehr effektive Methode zur Differenzierung der Beziehungen zwischen den acht Populationen. Bestimmte komplexe Muster ergaben sich aber auch aus dem konstruierten molekularen Evolutionsbaum. Während beispielsweise HNZX im molekularen phylogenetischen Baum eng mit HBWF verwandt zu sein schien, war es im PCoA-Streudiagramm entfernter. Diese Komplexität unterstreicht, wie wichtig es ist, mehrere quantitative Ansätze zu verwenden, um Trends in der Karyotyp-Evolution innerhalb von Lycoris vorherzusagen und die molekularen Klassifikationsmerkmale zu ergänzen.

Die Pflanzen für diese Studie wurden aus Zentral- und Westchina beprobt, einschließlich des Landkreises Tianlin, Provinz Guangxi (GXTL), des Landkreises Fang, der Provinz Hubei (HBFC), des Landkreises Dushan, der Provinz Guizhou (GZDS), des Landkreises Zixing, der Provinz Hunan (HNZX), des Landkreises Badong, der Provinz Hubei (HBBD), des Landkreises Xinning, der Provinz Hunan (HNXN), des Landkreises Wufeng, der Provinz Hubei (HBWF) und des Landkreises Lushan, Provinz Sichuan (SCLS). Ein Belegexemplar wurde im Herbarium der Huaihua-Universität aufbewahrt. Diese Studie ergab, dass die Kombination von 45S- und 5S-rDNA-FISH-Signalen und Merkmalen des terminalen CPD-Segments alle mitotischen Chromosomen aus verschiedenen Populationen von Lycoris aurea (L'Herit.) effektiv unterschied. Kraut. Das hier vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, die Heterochromatinverteilung zwischen verschiedenen Populationen von Lycoris aurea (L'Herit.) Kraut. CPD (eine Kombination aus PI und DAPI) und DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) Reverse Färbung sind etablierte Techniken zur Beobachtung der Kernstruktur und der Chromatinverteilung. Die direkte Fluoreszenzmarkierung von 18S-5,8-26S rRNA-Genregionen (45S rDNA-Regionen) und 5S ribosomaler DNA für die Chromosomen-FISH-Hybridisierung ist unkompliziert und liefert robuste Hybridisierungssignale. Diese qualitative Unterscheidung wird bei der Analyse verschiedener Populationen immer wertvoller werden.

Diese Methode eignet sich am besten für Pflanzenarten, die in der Lage sind, eine schnelle Wurzelspitzenkultivierung durchzuführen, da während der aktiven Mitose eine Wurzelspitzenkultur erforderlich ist. Aufgrund der kurzen 5S-Sequenz wurde in der Studie die 1-118bp-Nukleotidsequenz der 5S-rRNA-Genkodierungsregion von Arabidopsis thaliana als 5S-rDNA-Sonde verwendet. Aufgrund der kurzen Sequenz und des schwachen Signals ist diese Methode nur für die Identifizierung von Spezies mit relativ konservierten Basen in der 1-118bp-Region des 5S rRNA-Gens wirksam. Die Selektion von Metaphase-Chromosomen mit moderater Kondensation ist entscheidend für den Erfolg der Methode. Die Chromosomenkondensation hängt eng mit dem Zeitpunkt der Wurzelernte, der Dauer der Vorbehandlung und dem Flammenbaden zusammen. Daher erfordert die Technik eine präzise Kontrolle über jeden Schritt, um den experimentellen Erfolg zu gewährleisten.

Offenlegungen

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Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32070367) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Verifizierter Lieferant - Sangon Biotech (Shanghai) Co.,LtdA500737-0005(70 %,  90%,  100%)
1&mal; VerifizierterLieferant - TNT Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481081&mal;, 10&mal;
2& mal; VerifizierterLieferant - SSC Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B5481092&mal;, 20&fach;
45S  VerifizierterLieferant - rDNA Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.TAMRA wird an beiden Enden (5" und 3" Enden)
(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  VerifizierterLieferant - rDNA Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop SoftwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha Brom-NaphthalinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Sättigung
Anti-Burnout-MittelSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biochemischer InkubatorShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42606810 g
ZitronensäureSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
deionisiertes Formamid (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000,7
DextransulfatVerifizierter Lieferant - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Fluoreszenz-in-situ-HybridisierungsinstrumentUSA/Abbott ThermoBriteS500-24
FluoreszenzmikroskopOlympus  China  Co.ltdBX60
EisessigVerifizierter Lieferant - Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reagenz Co. Ltd. (Shanghai)H399657500 mL
EismaschineDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biologisches MikroskopDeutschland Leica Instrument Co., LTDDM6000B
MethylalkoholSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph SoftwareMolecular DevicesVersion 7.35
OvenThermo Scientific & trade; Heratherm&Handel;THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A00429710 g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidiumiodid(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Lachsspermien-DNA(ssDNA)Aladdin-Reagenz Co. Ltd. (Shanghai)D1198711 g
NatriumcitratAladdin-Reagenz  Co. Ltd. (Shanghai)S18918310 g
Statistica für Windows 10.0 für statistische Analysen
. zugesetzt4'6-Diamidino-2-phenylindoleVerifizierter Lieferant -

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