Das schwimmende Labor: Standardverfahren zum Sammeln und Filtern von Meerwasserproben von in Betrieb befindlichen Fähren für die Umwelt-DNA-Analyse

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein neuartiges Protokoll zur Gewinnung mariner eDNA durch die Entnahme und Filtration von Meerwasserproben von in Betrieb befindlichen Fähren und anderen Handelsschiffen vor.

Zusammenfassung

Genetische Werkzeuge zur Gewinnung von Informationen aus DNA-Spuren aus der Umwelt sind sowohl für die gezielte als auch für die taxonomisch breite Charakterisierung der Biodiversität gut etabliert. Im marinen Kontext kann die Entnahme von eDNA-Proben aus schwer zugänglichen Gebieten, wie z. B. in Tiefsee- oder Offshore-Gewässern, jedoch immer noch eine Einschränkung darstellen. Der Einsatz von Linienfähren oder Handelsschiffen, die große Flächen des offenen Meeres überqueren, kann wertvolle opportunistische Plattformen für die Entnahme von Umweltproben darstellen. Die Vorteile sind unzählig, von der Möglichkeit, Daten bei jedem Wetter und zu jeder Tageszeit zu sammeln, bis hin zur Wiederholbarkeit im Laufe der Zeit, da die Routen konstant sind und die Kosten und Kraftstoffemissionen vollständig reduziert werden. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass der Ansatz möglich und erfolgreich ist. Der Prozess der Entnahme von Proben aus den Bäuchen dieser großen Seeschiffe wird jedoch möglicherweise nicht sofort erfolgen. Diese Arbeit veranschaulicht bis ins Detail, wie das Sammeln und Filtern von Meerwasser von großen Schiffen aus vorbereitet, angeordnet und durchgeführt werden kann.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Analyse von Umwelt-DNA (eDNA), d.h. der Nachweis von genetischem Material, das von Organismen in der Umwelt hinterlassen wird, zu einem vielversprechenden Überwachungsinstrument für Süßwasser- und Meerestiergemeinschaften entwickelt. Diese molekulare Technik bietet die Möglichkeit, mehrere Taxa gleichzeitig innerhalb einer einzigen Probe zu identifizieren (Metabarcoding-Ansatz), was die Detektion der biologischen Gemeinschaften ermöglicht, die den beprobten Bereich 1,2,3,4,5 bewohnen oder durchqueren.

Derzeit besteht die eigentliche Herausforderung darin, Probenahmestellen zu erreichen, da es oft wirtschaftlich und/oder logistisch nicht machbar ist, Proben über große geografische Skalen zu sammeln, was dazu führt, dass pelagische Gebiete im Vergleich zu besser zugänglichen Küstengebieten in der Regel zu wenig beprobt werden⁶. Der Einsatz von Fähren oder anderen Handelsschiffen ermöglicht hochgradig replizierbare Probenahmetransekte, da sie bestimmten Schifffahrtsrouten folgen, die in der Regel über die Saison konstant sind und große Gebiete abdecken ^7,8. Darüber hinaus ermöglicht die Nutzung von Fährverbindungen als Probenahmemittel die Probenentnahme zu jeder Tageszeit und zu jeder Jahreszeit, unabhängig von Wetter- und Seebedingungen, und bietet neben zahlreichen weiteren Vorteilen zahlreiche weitere Vorteile (Ergänzende Abbildung 1). Vorläufige Studien haben sowohl die Durchführbarkeit als auch die Genauigkeit der Bewertung von Biodiversitätsindizes bewiesen ^9,10. Wasserproben können über ein Ableitungsrohr aus dem Maschinenraum der Fähre entnommen werden, das das Kühlwasser vor den Motoren auffängt. LIFE-CONCEPTU MARIS (CONconservation of CEtaceans and Pelagic sea TUrtles in Med: Managing Actions for their Recovery In Sustainability) ist das erste Projekt, bei dem dieser Machbarkeitsnachweis in großem Maßstab in die Praxis umgesetzt wurde: Es zielt auf die Entnahme von 500 Proben (über einen Zeitraum von zwei Jahren) ab und umfasst die Beteiligung nicht nur einer, sondern mehrerer Fährgesellschaften und mehrerer Reedereien. Dies ermöglicht es, kritische Probleme hervorzuheben und Sampling-Strategien zu verfeinern, um sich besser an die unterschiedlichsten Kontexte anzupassen, die an Bord auftreten können. Im Folgenden beschreiben wir die Merkmale des Projekts in Bezug auf seine Komponente, die sich auf die groß angelegte Sammlung von DNA-Proben aus der Meeresumwelt bezieht (für die Beschreibung des Projekts besuchen Sie https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

Die Entscheidung, eine Probenahmekampagne mit einer planmäßigen Fähre durchzuführen, impliziert einige Maßnahmen, die vor der eigentlichen Probenahme ergriffen werden müssen, was der Aspekt ist, der in dieser Arbeit direkt angesprochen wird. An dieser Stelle werden kurz die Maßnahmen erwähnt, die der Probenahme an Bord eines kommerziellen Schiffes vorausgehen müssen.

Dies ist ein Aspekt, der nicht außer Acht gelassen werden sollte und der über den Erfolg der Sammelaktion entscheidet. Reedereien sind gewerbliche und keine Forschungseinrichtungen und müssen daher nicht mit den Zielen und Zielen der wissenschaftlichen Forschung, die an Bord durchgeführt werden soll, vertraut sein. Dies impliziert eine wichtige und heikle Anfangsphase, in der die Ziele des vorgeschlagenen wissenschaftlichen Projekts, die multidisziplinär sein können, von der obersten Leitung der Reederei selbst vermittelt und motiviert werden müssen. Im konkreten Fall des Projekts CONCEPTU MARIS wurde dies durch eine jahrzehntelange Beziehung ermöglicht, in der die Reedereien bereits an visuellen Überwachungsprojekten (z. B. Fixed Line Transects [FLT]⁷) beteiligt waren, wodurch ein Verhältnis der gegenseitigen Wertschätzung festgestellt wurde, das notwendig war, um grünes Licht für den Zugang zu den Maschinenräumen zu erhalten, die für den in dieser Arbeit behandelten Probenahmeansatz unerlässlich sind.

Im Rahmen des Projekts CONCEPTU MARIS wurde ein zweifaches Probenahmeschema angewandt: Die Proben werden sowohl in stationären Probenahmestationen (FSS, siehe unten) als auch anlässlich der Sichtung von "seltenen" Walen entnommen. Diese repräsentieren Arten, die während der FTL-Transekte¹¹ am wenigsten gesichtet wurden, nämlich: Gemeiner Delfin (Delphinus delphis), Cuvier-Schnabelwal (Ziphius cavirostris), Grindwal (Globicephala melas), Rundkopfdelfin (Grampus griseus), Pottwal (Physeter macrocephalus) und Finnwal (Balaenoptera physalus)). Eine zusätzliche Wasserprobe wird nur entnommen, wenn die Sichtung der seltenen Art, die vom Visual Census Team (FLT-Team) gemeldet wird, mehr als eine halbe Stunde vor oder nach einem der FSS erfolgt. Die Probenahmen, die im Zusammenhang mit den Sichtungen durchgeführt werden, werden notwendigerweise alle tagtäglich sein.

Feste Probenahmestationen (FSS), deren Geoposition über die Kreuzfahrt unverändert bleibt, werden im Vorfeld identifiziert und mit dem gesamten Arbeitsteam abgestimmt. Die geografischen Positionen der FSS werden nach folgenden Kriterien ausgewählt: 1) dem Vorhandensein eines Gebiets von biologischem Interesse auf der Grundlage früherer Beobachtungs-/Literaturdaten; 2) Priorität für Punkte, die Veränderungen des Lebensraums auf bathymetrischen Karten anzeigen (z. B. Rand des Festlandsockels); 3) Homogene Abdeckung der ausgewiesenen Schifffahrtsrouten, d.h. Auswahl von ungefähr gleich weit entfernten Probenahmestellen (ca. 35-45 Seemeilen voneinander entfernt), um sowohl die gesamte Route abzudecken als auch die Entnahme von Proben in der Nacht vorzusehen.

Um sicherzustellen, dass benachbarte Proben zu unterschiedlichen Tageszeiten entnommen werden und zwischen zwei aufeinanderfolgenden Proben genügend Zeit verbleibt, um die Probenverarbeitung abzuschließen, empfiehlt es sich, Proben von benachbarten FSS zu entnehmen, eine auf dem Hinweg und eine auf dem Rückweg. Das bedeutet, dass die FSS, wenn sie nach der chronologischen Reihenfolge nummeriert sind, in der sie beprobt wurden, nicht in einer fortlaufenden Reihenfolge auf der Karte erscheinen. Wenn z. B. 6 FSS ausgewählt werden, werden 3 auf der Hinfahrt und 3 auf der Rückfahrt entnommen. "Ihre Reihenfolge entlang der Route auf der Karte lautet PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, wobei die drei kursiv gedruckten Probenahmestationen (FSS4, FSS5 und FSS6) auf dem Rückweg vermessen werden (siehe Abbildung 1).

Jedes einzelne FSS hat eine eindeutige Identifikationsnummer (d. h. keines der FSS, die auf verschiedenen Routen identifiziert wurden, hat dieselbe Identifikationsnummer). Die Nummerierung wird beim ersten Sampling eines FSS zugewiesen, und es folgt eine fortlaufende Nummerierung. Daher werden am Ende des Projekts diejenigen FSS mit niedriger Nummer sein, die seit mehreren Jahren getestet wurden oder für die die ältesten Daten verfügbar sind.

Jede Probe besteht aus ca. 13 L Meerwasser, das an jeder Probenahmestation gesammelt wird. Das Meerwasser wird direkt aus dem Ableitungsrohr der Fähre in "Bag-in-the-Box"-Container (BiB), d. h. sterile, mit Folie laminierte Plastiktüten, umgefüllt, bis die Probe verarbeitet wird (siehe unten). Die Eigenschaften und Vorteile des Bag-in-Box-Probenahmesystems (BiBSS) werden von Valsecchi et al. (2021)⁹ ausführlich dargestellt und der Einfachheit halber auch hier in Abbildung 2 dargestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung im Labor

1. Checkliste für die Ausrüstung
   1. Konsultieren Sie die Checkliste für die Gegenstände, die sowohl für die Probenentnahme als auch für die Probenfiltration an Bord genommen werden müssen. Sie ist in der Zusatzdatei 1 dargestellt. Jeder Artikel und seine Verwendung werden in den folgenden Abschnitten erläutert.
   2. Drucken Sie eine Kopie der Zusatzdatei 1 aus und füllen Sie sie vor der Abreise für die Stichprobenaktion aus.
2. Vorbereitung des Bag-in-Box-Probenahmesystems
   1. Bereiten Sie die Bags-in-Box im Labor vor, wenn möglich unter dem Abzug, bevor Sie an Bord gehen. Verschließen Sie die drei Öffnungen (die am Beutel, einen Teil der Kappe, der den Beutel verschließt, und den Auslass aus dem Wasserhahn) mit Siegelfolie (Abbildung 3, Materialtabelle).
   2. Rollen Sie die Beutel mit abgenommener und versiegelter Kappe fest und verschließen Sie sie mit einem Klebeband, um ein erneutes Öffnen während des Transports zu verhindern (Abbildung 3).
   3. Achten Sie bei diesem Vorgang darauf, dass während des oben genannten Versiegelungsmanövers keine Luft in den Beutel eindringt, um (i) eine mögliche Kontamination durch eindringende Luft in den Beutel zu vermeiden und (ii) um zu verhindern, dass der gefaltete Beutel voluminöser wird (wenn er Luft enthält).

2. Vorbereitung an Bord

1. Koordination mit den Crewmitgliedern
   1. Sobald Sie an Bord sind, teilen Sie die ausgewählten Probenahmepunkte mit dem Kapitän und seiner Besatzung, so dass die Zeiten angezeigt werden, zu denen die Fähre jedem Punkt, der als "Feste Probenahmestation" (FSS) ausgewählt wurde, am nächsten ist.
   2. Notieren Sie sich die Probenahmezeit für jedes FSS und die aktuelle (oder durchschnittliche, falls verfügbare) Reisegeschwindigkeit der Fähre für diese Strecke: Dies ermöglicht die Schätzung der Ausdehnung (km) des gemessenen Meeresabschnitts.
   3. Da die Fähre nie genau am selben Punkt vorbeifährt, korrigieren Sie die Koordinaten jeder Meerwasserprobenentnahme nach der eigentlichen Probenahme.
      HINWEIS: Das genaue Probenahmeintervall ist die wichtigste Angabe für eine genaue Identifizierung des tatsächlich beprobten Meeresgebiets. Daher ist es sinnvoll, eine Karte der groben Punkte auszudrucken, an denen die tatsächlichen Probenahmekoordinaten angegeben werden (z. B. in der Zusatzdatei 2).
   4. Wenn das Unternehmen Zugang zum Maschinenraum gewährt, bitten Sie um eine Begleitung in den Raum.
   5. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung (PSA), bevor Sie den Maschinenraum betreten. Hier ist die Umgebung unwirtlich (ohrenbetäubender Lärm und hohe Temperaturen) und voller potenziell heimtückischer Punkte (steile Treppen, große Lücken in den Böden). Sobald Sie die Erlaubnis zum Betreten des Maschinenraums eingeholt haben, rüsten Sie sich mit allen wichtigen Sicherheitsausrüstungen wie Sicherheitsschuhen, Helm und Gehörschutzkopfhörern aus.
   6. Wenn die Filterfläche von der Reederei zur Verfügung gestellt wird (es ist in der Regel ratsam, einen eigenen Klapptisch zu haben), prüfen Sie, ob dieser Bereich zwischen den Proben mit einer 10%igen Bleichlösung desinfiziert werden kann.
2. Eingewöhnung im Maschinenraum
   1. Da es auf Schiffen verschiedene Meerwassereinlässe gibt, wenden Sie sich an den Maschinenraummanager, der einen minimalen Weg für das eingesaugte Wasser durch die Schiffsleitungen zulässt, um die Kontamination der Wasserprobe mit Substanzen und Organismen, die sich in den Rohren befinden können, zu minimieren.
   2. Sobald der am besten geeignete Punkt/Einlass für das Auffangen des einströmenden Meerwassers identifiziert wurde, fragen Sie das Personal, ob der Probenentnahmehahn während der gesamten Dauer der Kreuzfahrt leicht geöffnet gehalten werden kann, um das für die Probenentnahme verwendete Rohr kontinuierlich mit "lokalem" Wasser zu spülen. Entsorgen Sie das Meerwasser, das unaufhörlich aus dem Wasserhahn fließt, in der Bilge.

3. Entnahme von Wasserproben (im Maschinenraum)

HINWEIS: Abbildung 4 zeigt die Phasen der Meerwasserprobenentnahme.

1. Vorbereitung für die Wassersammlung
   1. Bringen Sie alle notwendigen Ausrüstungsgegenstände (Checkliste für den ersten Teil, Ergänzende Datei 1 ) in den Maschinenraum. Begeben Sie sich mindestens 15 Minuten vor der geplanten Probenahmezeit in den Maschinenraum, um den Bereich, in dem die BiBs gehandhabt werden, mit einer 10%igen Bleichlösung zu sterilisieren.
   2. Wenn der dafür vorgesehene Wasserhahn während der gesamten Kreuzfahrt nicht offen gelassen wurde, öffnen Sie ihn für die Entnahme von Meerwasserproben und lassen Sie das Wasser mindestens 5 Minuten lang laufen (das Wasser wird in der Bilge entsorgt), bevor Sie tatsächlich entnommen werden (Abbildung 4A).
   3. Bereiten Sie die Filterstation vor.
      HINWEIS: Bei der Einrichtung der Filterstation gibt es mehrere Maßnahmen, die die Effizienz der Filtration erheblich verbessern können (siehe Schritt 4.3): 1) Verwenden Sie Isolierflaschen mit hoher Kapazität (2 l, 4 l oder 5 l Kolben, je nach dem zu entnehmenden Volumen). Dies spart nicht nur die Zeit, die zum Entleeren des Kolbens zwischen 1 l und dem nächsten benötigt wird, sondern minimiert auch die Handhabung des Filterzylinders und damit die Kontamination; 2) Es können mehrere in Reihe angeordnete Filterkolben verwendet werden, eine Maßnahme, die die gleichzeitige Filtration mehrerer Proben (Beutel) ermöglicht. Diese Maßnahme wird bei engen Probenahmeverfahren empfohlen, bei denen sonst die Gefahr besteht, dass nicht die erforderliche Zeit für die Verarbeitung der Säcke vor dem Erreichen des Andockhafens vorhanden ist.
   4. Verwenden Sie einen Permanentmarker, um die BiB vorzubereiten und zu beschriften, indem Sie Folgendes darauf schreiben: 1) den eindeutigen alphanumerischen Identifikationscode der Probe auf beiden Seiten der BiB (besonders wichtig, wenn die BiB nicht sofort an Bord verarbeitet und an Land filtriert werden), 2) das Datum; 3) die genaue Zeit, zu der mit dem Befüllen des BiB begonnen wird.
2. Wassersammlung
   1. Entfernen Sie die Siegelfolie von der Öffnung des BiB und beginnen Sie mit dem Befüllen, bis sie vollständig gefüllt ist (ca. 13 L) (Abbildung 4B).
   2. Wenn der Beutel fast voll ist, entfernen Sie die Dichtungsfolie vom Deckel, aber nicht von der Hahnöffnung: Halten Sie die Dichtungsfolie um den Hahn herum sicher (rote Kunststofflasche), bis sie filtriert (Abbildung 4C). Verschließen Sie das BiB mit dem Deckel und drücken Sie es fest, bis es vollständig geschlossen ist.
   3. Notieren Sie sich den genauen Zeitpunkt, zu dem die Probenentnahme abgeschlossen ist: Sie ermöglicht die Berechnung der Gesamtdauer (Minuten) der Probenentnahme.
3. Nach der Wassersammlung
   1. Schreiben Sie mit dem Permanentmarker auf das BiB den genauen Zeitpunkt, zu dem die Probenentnahme abgeschlossen ist, und geben Sie alle Daten auf dem Probenentnahme-/Filtrationsformular an (Zusatzdatei 2).
   2. Bringen Sie das eingefüllte BiB in den Lagerraum oder in den Filterbereich (ein spezieller Bereich im Maschinenraum selbst oder in einer Kabine).
   3. Übertragen Sie alle Daten auf das Probenentnahme-/Filtrationsformular (Ergänzungsdatei 2).
      HINWEIS: Die ergänzende Datei 2 zeigt das Probenentnahme-/Filterblatt, das an Bord in allen seinen Teilen auszufüllen ist.
      1. Geben Sie für den Teil, der sich auf die Entnahme der Probe bezieht (grün), die Anfangs- und Endzeiten der Meerwasserprobenahme aus dem Maschinenraum ein.
      2. Zweitens, nach Rücksprache mit den Besatzungsmitgliedern oder GPS-Aufzeichnungen, geben Sie die geografischen Koordinaten relativ zum Beginn und Ende der Probenahme und der Reisegeschwindigkeit ein. Auf diese Weise können Sie nachträglich die Länge des beprobten Meeressegments berechnen.
         HINWEIS: In Bezug auf den Teil, der sich auf die Filterung bezieht (blau), wird angezeigt, ob die Filterung an Bord oder später an Land erfolgt: Die Filterzeiten werden für jeden der 3 Filter angezeigt.

4. Filtration von Meerwasserproben

1. Vorbereiten der Filtration
   HINWEIS: Von diesem Zeitpunkt an kann der Filtrationsprozess nach verschiedenen Protokollen gesteuert werden, die auf den spezifischen Zielen des Forschungsprojekts basieren. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Filtration einer großen Menge Meerwasser (mehr als 10 Liter) direkt an Bord, wodurch die Volumenbeschränkungen vermieden werden, die bei anderen häufig verwendeten kommerziellen Kits oder Protokollen auftreten. Wenn möglich, Wasserproben an Bord filtern: Die Filtration kann entweder im Maschinenraum selbst oder in einer Kabine erfolgen, vorzugsweise in der Nähe des Maschinenraums. Es ist immer wünschenswert, Meerwasserproben unmittelbar nach der Entnahme zu filtern, sowohl um den eDNA-Abbau zu begrenzen als auch aus Gründen der Bequemlichkeit, um zu vermeiden, dass große Mengen an zu verarbeitendem Meerwasser an Land gehen. Wenn dies nicht möglich ist, können die Proben in den Bag-in-Box-Behältern gelagert und zur anschließenden Filtration transportiert werden.
   1. Bereiten Sie sich in dem für die Filtration an Bord vorgesehenen Raum (im Maschinenraum oder in einer speziellen Kabine) mit allem vor, was im zweiten Teil der Checkliste in der Zusatzdatei 1 aufgeführt ist, und montieren Sie das Filtersystem wie in Abbildung 5 gezeigt.
   2. Bereiten Sie den Filterzylinder (Materialtabelle) vor, wie in Abbildung 6 und Abbildung 7 gezeigt. Verwenden Sie für jede Station einen neuen Zylinder, eine neue Einwegpinzette oder ein Paar sterilisierte Pinzetten.
      HINWEIS: Ein einzelner Zylinder kann mehrmals verwendet werden, um Proben von derselben Stelle zu filtern. Es muss jedoch mit 10 % Bleiche sterilisiert werden, gefolgt von einer Süßwasserspülung, bevor es im Labor an der Luft trocknen gelassen und dann einzeln verpackt wird, um bis zur nächsten Kampagne gelagert zu werden.
   3. Bevor Sie mit der Filtration beginnen, füllen Sie das Datenprotokoll zur Probenentnahme/Filtration aus (Zusatzdatei 2). Dies ist sowohl notwendig, um die Anzahl der verarbeiteten Liter im Auge zu behalten als auch die Filterzeit (die die Menge an Partikeln in der Probe anzeigt) zu messen. Sobald die Vakuumpumpe aktiviert ist, starten Sie den Timer, um die Filterzeit zu messen.
2. Filtration an Bord
   1. Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren (insbesondere wenn mehrere Beutel gleichzeitig verarbeitet werden, siehe unten), isolieren Sie den zu filternden Wasserstrom von der Umgebung, indem Sie eine Isolierhülle - einen Plastikbeutel - zwischen den Wasserhahn und den Filterzylinder legen (siehe Abbildung 7).
      HINWEIS: Dies ist eine wichtige Vorsichtsmaßnahme, da die Empfindlichkeit der für die Analyse von Umwelt-DNA verwendeten Technologien den Ansatz besonders anfällig für Umweltkontaminationen (durch den Bediener oder Kreuzkontaminationen zwischen Proben) macht.
   2. Aktivieren Sie die Vakuumpumpe und filtern Sie bis zu 4 l Wasser pro Filter. Halten Sie den Zylinder während der Filtration immer voll, um das Eindringen von Luft in das System zu verhindern und den Filtrationsprozess zu verlangsamen.
      HINWEIS: Die Wahl der Porosität der Membran hängt vom Forschungszweck, den taxonomischen Zielgruppen und der Wassermenge ab, die verarbeitet werden soll. Diese Problematik wurde in den vorangegangenen Arbeiten ^9,12 behandelt.  in denen Filter unterschiedlicher Porosität verglichen wurden. Für die Untersuchung von Wirbeltieren und die Entscheidung, 4 Liter Wasser pro Filter zu verarbeiten, erwies sich eine Membran mit einer Porosität von 0,45 μm als die beste Lösung, die es ermöglichte, große Wassermengen zu verarbeiten, ohne den Filter aufgrund der Sättigung der Poren zu überladen.
   3. Wenn der Füllstand des gefilterten Wassers im Kolben die Füllstandsmarkierung von 4 l erreicht, schalten Sie die Vakuumpumpe aus und stoppen Sie den Timer, wobei der Wert der Filterzeit im Datenprotokoll angezeigt wird.
      HINWEIS: Von jedem BiB von 12/13 L werden 3 technische Repliken von je 4 L (mit den Namen A, B und C) erhalten.
   4. Lösen Sie an dieser Stelle mit der Pinzette (und ggf. einem sterilen Zahnstocher, um den Filterrand anzuheben) den ersten Filter (Filter A) aus dem Zylinder, wie in Abbildung 8 gezeigt, um eine mögliche Beschädigung des Filters zu vermeiden.
   5. Falten Sie den Filter in zwei Hälften (wobei die Seite, an der das biologische Material zurückgehalten wurde, auf sich selbst gefaltet ist) und wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie ein, wobei Sie sofort die Probennummer und die ID des Filterreplikats (z. B. 15A) auf die Verpackung schreiben. Bewahren Sie es bis zur Ausschiffung im Gefrierschrank an Bord auf.
   6. Montieren Sie einen neuen Filter (Filter B) im Filterzylinder, um eine weitere 4-Liter-Probe zu verarbeiten (Abbildung 9). Leeren Sie den Kolben und beginnen Sie erneut mit der Filterung des zweiten Replikats, bis 4 l vollständig filtriert sind. Stellen Sie Filter B wie beschrieben wieder her und wiederholen Sie die gleichen Schritte für Filter C.
3. Bewährte Praktiken
   1. Um die Filterzeiten zu verkürzen, verwenden Sie eine große Isolierflasche, die das gesamte gefilterte Wasser aufnehmen kann, das durch einen einzigen Filter verarbeitet wird (in diesem Fall also mindestens 4 l Fassungsvermögen).
   2. Reduzieren Sie die Filterzeiten erheblich, indem Sie mehrere Beutel gleichzeitig filtrieren, indem Sie die Filtergeräte parallel anordnen (d. h. mehrere Isolierflaschen, die von einer einzigen Pumpe bedient werden).
      ANMERKUNG: In der Kampagne CONCEPTU MARIS wurden beide Strategien übernommen (Abbildung 10). Beachten Sie, dass die Maximierung der Filtereffizienz sehr wichtig ist, da die Anzahl der auf einer Route gesammelten Proben groß sein kann. Es ist daher notwendig, die Beutel in kurzer Zeit zu bearbeiten, um zu vermeiden, dass sich Proben ansammeln und das Risiko besteht, dass die Säcke aussteigen müssen, wenn nicht genügend Zeit für die Bearbeitung an Bord vorhanden ist.
   3. Um das Auftreten von falsch positiven Ergebnissen (Kontaminationen) zu überwachen, schließen Sie mindestens einmal pro Kreuzfahrt einen "Blank-Bag" in das Filterverfahren ein, bei dem parallel zu den Proben ein mit Trinkwasser gefüllter Beutel aus verschlossenen Flaschen filtriert wird. Für diese Kontrollstichprobe sind keine Wiederholungen erforderlich, und sie werden wie die übrigen Proben behandelt und in den NGS-Lauf einbezogen.
4. Lagerung und Transport von Filtern
   1. Lagern Sie nach der Filtration alle Filter zwischen -4 °C und -20 °C bis zur weiteren Laborverarbeitung.
   2. Entnehmen Sie die Proben kurz vor der Ausschiffung aus dem Gefrierschrank an Bord und bereiten Sie sie mit transportablen Kühlern bei niedrigen Temperaturen für den Transport vor, wie in Abbildung 11 gezeigt.
      HINWEIS: Wenn die Proben an Bord nicht gefiltert werden, werden die Meerwasserbeutel sicherer transportiert, wenn sie vertikal mit dem Deckel auf der Oberseite aufbewahrt werden und paarweise in Einkaufstüten in Kunststoffkisten gelagert werden, um den Transport zu erleichtern (Abbildung 12).

Ergebnisse

Wenn Sie das Protokoll wie beschrieben ausführen, wird vom Operator eine Anzahl von Filtern gesammelt, die der Anzahl der FSS multipliziert mit 3 Replikaten entspricht. Jeder Filter hält biologische Spuren (Umwelt-DNA) auf einer der beiden Seiten zurück. Die analytischen Schritte nach der eDNA-Extraktion hängen stark von der Fragestellung, dem Ziel und dem Ziel der Forschung ab. In der Pilotstudie von Valsecchi et ^al.9 beispielsweise ermöglichte das beschriebene eDNA-Erfassungsprotokoll das Design...

Diskussion

Da die Protokollschritte einfach und unkompliziert sind, gibt es einige relevante Überlegungen, die bei der Arbeit auf kommerziellen Fähren zu berücksichtigen sind. Die Kühlwasserableitungsleitung befindet sich in der Regel im Bereich des Maschinenraums, zu dem der Zugang eingeschränkt oder einer vorherigen Genehmigung unterworfen sein kann. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass Sie über eine solche Genehmigung zusammen mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung verfü...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Filtermembranen mit einem Durchmesser von 4,7 cm Biosigma	S.p.A.	https://www.biosigma.com/	Filtermembranen von 0,45 μ m Porosität, einzeln verpackt
4/5 L Isolierflaschen	Duran	https://www.duran-bottle-system.com/	5 L Glaskolben mit Stopfen
Saugfähige Papierpads	Advantec MFS, Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	Saugpads für Filterpapier, Größe 47 mm.
Bag-in-Box (BiB)	G.M.V. Agricenter S.r.l.	https://www.gmvagricenter.it/	10 Liter Bags-in-Box mit Wasserhahn
Filterzylinder	Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#	Biostart 100 Monitorzylinder, mit 0,45 μ M Membran enthalten
Siegelfolie	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc& utm_campaign=Alle+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f& utm_term=%2Fproduct%2F	4 Zoll x 125 Fuß Rolle Labor-Siegelfolie
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