Methodenartikel

Präklinische Positronen-Emissions-Tomographie mit körperkonformen tierischen Schimmelpilzen für die cloudbasierte automatisierte Bildanalyse bei Mäusen

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DOI:

10.3791/67370

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25. Oktober 2024

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1Drug Safety R&D, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc., 2Comparative Medicine, Discovery & Early Development, Pfizer, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung von in vivo PET-Bildgebung an Mäusen unter Verwendung von Body Conforming Animal Molds (BCAMs) im G8 PET/CT-Scanner. Technische Details zur Vorbereitung der Maus, einschließlich der richtigen Tumorimplantation, der optimalen Positionierung, der BCAM-gestützten PET/CT-Bildaufnahme und der Datenanalyse, werden bereitgestellt.

Zusammenfassung

Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist eine molekulare Bildgebungsmethode, mit der eine Vielzahl pharmakologischer Fragen untersucht werden können, wie z. B. die Modulation von Biomarkern, die Rezeptorbelegung und die Bioverteilung von Verbindungen von Interesse. In Biodistributionsstudien werden Versuchspersonen nach Erhalt des Testartikels häufig in Längsschnitt abgebildet. Die Bilder werden dann analysiert, um das Verteilungsprofil der Verbindung in verschiedenen Organen zu unterschiedlichen Zeitpunkten abzuleiten. Dies stellt einen entscheidenden Schritt in der Wirkstoffentwicklung dar, um die Verteilung und das potentielle Bindungsprofil einer untersuchenden Substanz zu verstehen. Standardmäßige/manuelle Methoden der PET-Bildgebungs-basierten Biodistributionsanalyse sind jedoch arbeits- und zeitintensiv und oft mit einer hohen Variabilität zwischen den Bedienern verbunden. Darüber hinaus ist es eine Herausforderung, die Positionen der Tiere über verschiedene Zeitpunkte hinweg konsistent zu halten. Um diese Mängel zu beheben, wurde eine Reihe von Body Conforming Animal Molds (BCAMs) für Mäuse verwendet, um eine starre und konsistente Positionierung der Tiere während der PET/CT-Bildgebung zu ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine Software-as-a-Service (SaaS)-Plattform, bestehend aus einer Cloud-basierten Organ Probability Map (OPM) und einem auf künstlicher Intelligenz basierenden Segmentierungstool, eingesetzt, um eine zuverlässige und automatisierte Quantifizierung von in vivo PET-Bildgebungsdaten zu ermöglichen. Der hier vorgestellte Arbeitsablauf umfasst (1) die Vorbereitung von Mäusen für die Bildgebung mit den BCAMs, einschließlich der korrekten Implantation von subkutanen Tumoren, um sie mit den Formen kompatibel zu machen, (2) die Aufnahme von PET/CT-Bildern mit BCAMs mit dem G8-Scanner und 3) die Durchführung einer automatisierten Organsegmentierung und Bioverteilungsanalyse mit der Cloud-basierten SaaS. [18F]FDG wurde hier als exemplarischer Tracer verwendet, aber auch andere Biomarker und/oder radioaktiv markierte Verbindungen können problemlos in den Arbeitsablauf übernommen werden. Dieses Verfahren kann mit minimalem Schulungsaufwand genau und effektiv durchgeführt werden, und die automatisierte PET-Datenanalyse lieferte zufriedenstellende Ergebnisse, die mit der manuellen Methode übereinstimmen.

Einleitung

Molekulare In-vivo-Bildgebungstechnologien sind wichtige Werkzeuge in der Arzneimittelentwicklung, um die Bewertung aller drei Säulen der Pharmakologie zu erleichtern - Biodistribution, Zielbindung und Modulation der Pharmakodynamik 1,2,3. Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) gehört mit ihrer klinischen Übertragbarkeit und hohen Sensitivität zu den am häufigsten verwendeten molekularen Bildgebungsmodalitäten sowohl in der Klinik als auch im präklinischen Forschungs- und Entwicklungsbereich. Das aufstrebende Feld der präklinischen PET-Bildgebung und der Radiootheranostik ist wertvoll für die Entwicklung sowohl tumor-intrinsischer Therapeutika, zielgerichteter Therapeutika als auch neuartiger Immunonkologie-Therapien (IO). Das kontinuierliche Aufkommen und die Entwicklung neuer Immuno-PET-Radiotracer haben das Potenzial, spezifische, maßgeschneiderte IO-Medikamentenschemata zu beeinflussen und Responder im Vergleich zu Non-Respondern zu identifizieren 4,5,6. In der Zwischenzeit können metabolisch-spezifische Radiotracer wie [18F]FDG und [18F]FLT das Ansprechen eines Tumors auf die Therapie überwachen und Aufschluss darüber geben, ob ein Tumor aktiv proliferiert oder Glukose7 verbraucht oder ob Tumorzellen durch Hemmung einen Zellzyklusstillstand durchlaufen 8,9.

Die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu traditionellen, nicht-bildgebenden pharmakologischen Experimenten. Die Bildgebung ermöglicht beispielsweise eine systemische, ganzheitliche Bewertung der Verteilung und/oder der pharmakologischen Wirkung eines Medikaments im gesamten Probanden, was nicht nur die Überwachung der Wirksamkeit am Zielort, sondern auch die Erkennung unerwarteter Aktivitäten außerhalb des Ziels ermöglicht. Aufgrund ihres nicht-invasiven Charakters kann dieselbe Gruppe von Tieren über verschiedene Zeitpunkte und/oder mit unterschiedlichen Biomarkern im Längsschnitt beurteilt werden, um unterschiedliche biologische Fragestellungen zu beantworten10. Dies reduziert nicht nur die Anzahl der für die Studie benötigten Tiere erheblich, sondern ermöglicht auch eine orthogonale Kontrolle über die Zeitpunkte hinweg und hilft so, Korrelationen zu verbessern und individuelle Variabilitäten zu reduzieren. Trotz dieser vielversprechenden Entwicklung von bildgebenden Biomarkern besteht der Bedarf, Untersuchungssubstanzen in vivo mit PET-Bildgebungs-basierten Biodistributionsstudien zu bewerten, jedoch an effizienten automatisierten Prozessen für die Analyse. PET-Biodistributionsstudien liefern wertvolle Informationen über die Kinetik, die Gewebeakkumulation, die Bindung und den Stoffwechsel einer Verbindung. Die Gewinnung hochgradig reproduzierbarer quantitativer Daten ist für die Entwicklung pharmazeutischer Therapien von entscheidender Bedeutung.

Um diesen unerfüllten Bedarf in der automatisierten PET-Bildanalyse zu decken, hat InVivo Analytics eine Reihe von körperkonformen Tierformen (BCAMs) für Mäuse entwickelt11. Dabei handelt es sich um 3D-gedruckte Kunststoffformen, die den Kopf, den Rumpf (und die inneren Organe), den Schwanz und die Gliedmaßen einer Maus in starren, vordefinierten Positionen halten. Je nach Körpergewicht des Tieres können unterschiedlich große Formen ausgewählt werden, und in bestimmten Bereichen wie der Schulter oder der unteren Flanke können Ausschnitte erstellt werden, damit subkutane Tumore herausragen können. PET/CT-Bilder, die mit diesen BCAMs aufgenommen werden, sind hochgradig einheitlich und können von der Cloud-basierten automatisierten Segmentierungsplattform des Unternehmens in Chargen analysiert werden11. In diesem Artikel wird ein automatisierter In-vivo-Workflow für die Biodistributionsanalyse vorgestellt, der auf der physischen Erfassung von Bildern mit BCAMs und der Durchführung von Bildsegmentierung und -analyse durch die SaaS basiert.

Protokoll

Alle Eingriffe, die an Tieren durchgeführt wurden, entsprachen den Vorschriften und festgelegten Richtlinien und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von Pfizer oder durch einen ethischen Überprüfungsprozess überprüft und genehmigt. Die PET-Bildgebungsstudie wurde unter Beachtung aller institutionellen Strahlenschutzprotokolle durchgeführt. In dieser Studie wurden weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 10-12 Wochen mit einem Körpergewicht von 18-26 g verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung und Bereitstellung von Tieren

HINWEIS: Dieser Schritt umfasst das Staging der Tiere für die PET-Bildgebung mit BCAM-Template-gesteuerter Tumorimplantation.

  1. Vor der Zellimplantation wird das Fell der Mäuse in der gewünschten Region des Tumorwachstums rasiert.
  2. Richten Sie die Anästhesiestation ein und befestigen Sie eine BCAM-Form in der entsprechenden Größe an der Vorklammer, wobei die Oberseite um 90 Grad nach oben geklappt ist. Diese dient als Basis für die Tumorimplantation (Abbildung 1A).
  3. Tiere in einer geeigneten Induktionsbox mit 2,0 % Isofluran und 98 % Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 0,5-1,5 l/min anästhesieren.
    HINWEIS: Alle Anästhesiesysteme sind variabel.
    1. Verwenden Sie ein kalibriertes System und testen Sie vor der Verwendung. Platzieren Sie eine betäubte Maus auf der Basis und strecken Sie ihre Gliedmaßen aus (Abbildung 1B).
  4. Platzieren Sie vorsichtig eine BCAM-Tumor-Injektionsschablonenform (Abbildung 1C) auf der dorsalen Seite der Maus (Abbildung 1D).
  5. Erstellen Sie vorsichtig eine temporäre kreisförmige Referenzmarkierung an der gewünschten Ausschnittstelle (z. B. Schulter oder Flanke, links oder rechts) mit einer Markierung (Abbildung 1D). Entferne die Schablonenform.
  6. Bereiten Sie die Zellen für die Injektion vor, indem Sie das gewünschte Volumen in eine Spritze aufziehen. Befestigen Sie eine 27-G-Nadel an der Spritze und füllen Sie den Totvolumenraum. Es wird ein Volumen von 0,1-0,2 mL pro Inokulation empfohlen.
  7. Heben Sie die Haut mit den Fingern oder einer Pinzette an, indem Sie die provisorischen Markierungen aus Schritt 1.5 als Referenz verwenden, um ein Zelt zu erstellen, führen Sie die Nadel langsam ein und injizieren Sie die Zellen subkutan an der gewünschten Stelle. Entsorgen Sie die Nadel in einem Behälter für biologisch gefährliche scharfe Gegenstände.
  8. Überwachen Sie das Tumorwachstum. Das durchschnittliche Tumorvolumen bei der Aufnahme betrug in diesem Beispiel 200-300 mm3.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Metallkomponenten wie Ohrmarken oder Mikrochips, um CT-Bildgebungsartefakte zu vermeiden.

2. Entnahme radioaktiver Dosen

  1. Gemäß allen institutionellen Strahlenschutzprotokollen ist eine Zieldosis von [18F]FDG im Bereich von ca. 70-80 μCi sorgfältig in eine sterile Spritze aufzuziehen, die für die intravenöse Injektion geeignet ist.
    HINWEIS: Der Bereich von 70-80 μCi ist optimal für den Dynamikbereich des Sofie G8 PET-Scanners. Andere Imager können unterschiedliche Dynamikbereiche haben, die eine andere Zieldosis erfordern.
  2. Messen Sie die radioaktive Dosis vorsichtig in einem Dosiskalibrator, indem Sie die Spritze in die Vertiefungskammer einführen und den Löffel absenken. Achten Sie vor der Messung auf die Auswahl des geeigneten Isotops oder der Kalibriernummer.
  3. Nehmen Sie einen stabilen Messwert. Datum und Uhrzeit der Aufnahme. Passen Sie die Dosis bei Bedarf an.
  4. (Fakultativ) Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung, um das endgültige Dosisvolumen auf 0,1-0,2 ml zu bringen.
    HINWEIS: Das gewünschte Injektionsvolumen kann variieren.
  5. Die Dosis kann verabreicht werden.

3. Intravenöse Verabreichung der Dosis

  1. Bereiten Sie den Mausschwanz gemäß den institutionellen IACUC- und Strahlenschutzprotokollen für die IV-Injektion vor, indem Sie die Schwanzvene erweitern. In dieser Studie wurde die Schwanzvene erweitert, indem der Tierkäfig oder die Induktionskammer auf einen auf 42 °C eingestellten Objektträgerwärmer gestellt wurde.
    HINWEIS: Es kann bis zu 10 Minuten dauern, bis sich die Schwanzvene vollständig erweitert hat.
  2. Erfassen Sie vor der Injektion das Gewicht der Maus. Dadurch wird bestimmt, welches gewichtsspezifische BCAM für die PET/CT-Bildgebung verwendet werden soll.
  3. Sobald sie fertig ist, wird die Maus in einen geeigneten Halteapparat überführt (z. B. wurde in der vorliegenden Studie eine Schwanzvenen-Injektionsplattform verwendet) und lokalisiert die Schwanzvene.
  4. Behandeln Sie die radioaktive Spritze vorsichtig und injizieren Sie die Dosis intravenös in eine bewusste Maus. Notieren Sie die Injektionszeit.
  5. Legen Sie die Spritze vorsichtig beiseite und reinigen Sie überschüssige Blutstropfen mit Gaze vom Schwanz. Nehmen Sie die Maus aus dem Rückhaltesystem und setzen Sie sie wieder in das entsprechende Gehäuse ein.
  6. Setzen Sie die Spritze vorsichtig wieder in die Dosiskalibratorkammer ein und notieren Sie alle Restmesswerte, um eine korrekte Dosisberechnung zu ermöglichen. Notieren Sie das Datum und die Uhrzeit des Messwerts der Restaktivität.
  7. Sobald die Injektionen abgeschlossen sind, seien Sie vorsichtig und platzieren Sie Kohorten von Mäusen hinter Bleigehegen und/oder vom Personal fern, wobei Sie die einrichtungssicheren Bestrahlungspraktiken befolgen. Beachten Sie, dass alle verwendeten Materialien einer geringfügigen radioaktiven Kontamination unterliegen. Überwachen Sie alle Bereiche mit einem kalibrierten Geigerzähler und reinigen Sie sie gemäß den Strahlenschutzrichtlinien.

4. Betäubung und Positionierung der Tiere für die PET-Bildgebung

  1. Schalten Sie zu einem geeigneten Zeitpunkt (z. B. 10-15 Minuten vor dem Ende der Tracer-Aufnahmeperiode) alle Anästhesiegeräte und Tiererwärmungsinstrumente ein, die sowohl für die Anästhesieeinleitung als auch für die PET-Bildgebung erforderlich sind. Die Anästhesie kann auf 2,0 % bis 2,5 % Isofluran in 98 % Sauerstoff eingestellt werden (die Einstellungen können je nach Mausstamm und Krankheitsmodell variieren).
  2. Vergewissern Sie sich, dass alle Adapter und Ventile eingeschaltet sind und der Gasdurchfluss 0,5-1,0 l/min beträgt. Spezifische Flussraten können je nach Anästhesiesystem und bildgebendem System variieren.
  3. Setzen Sie das/die geeignete(n) Tier(e) in eine Induktionsbox und warten Sie, bis das Subjekt die richtige Anästhesietiefe erreicht hat.
  4. Tragen Sie Augenschmiersalbe auf jedes Auge auf.
  5. Übertragen Sie die Maus in ein BCAM in geeigneter Größe, basierend auf dem Körpergewicht.
  6. Nehmen Sie die Maus vorsichtig am Nacken, stecken Sie den Schwanz in den Schwanzschlitz und wickeln Sie ihn unter den BCAM. Lege den Schwanz auf die Heckplattform und klebe ihn ab, um die Position zu sichern. Vergewissern Sie sich, dass die Wirbelsäule gerade ist. Schließen Sie das BCAM vorsichtig (Abbildung 2A,B).
  7. Positionieren Sie alle vier Gliedmaßen vorsichtig so, dass sie auf jeder der BCAM-Pfotenplattformen ruhen. Verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um die Pfoten an jeder Plattform zu befestigen (Abbildung 2B).
  8. Lassen Sie das BCAM vorsichtig in das Imaging-Bett-Shuttle einrasten, indem Sie zuerst das vordere Ende einsetzen (Abbildung 2C). Das Shuttle sollte bereits mit der G8-Laderampe verbunden sein, wobei die Anästhesie fließt (Abbildung 2D). Drücken Sie die Rückseite des BCAM nach unten, und ein Klick zeigt an, dass es am G8-Shuttle befestigt ist.
    HINWEIS: Halten Sie die Anästhesieversorgung so aufrecht, dass das Tier während der Bildgebung in der gewünschten Anästhesieebene bleibt.

5. Bilderfassung

  1. Öffnen Sie die G8 PET-Erfassungssoftware. Studienordner, Scan-Parameter und Fächer-IDs können zuvor erstellt werden.
    1. Geben Sie Studiendetails in die Software ein: Mausgewicht, Datum/Uhrzeit und Menge der entnommenen Anfangsdosis, Datum/Uhrzeit der Injektion sowie Datum/Uhrzeit und Menge der Restaktivität.
  2. Setzen Sie das Shuttle mit der Maus in die Scanneröffnung ein. Eine blaue Kontrollleuchte zeigt das ordnungsgemäße Andocken an das System an.
  3. Wählen Sie die entsprechenden PET/CT-Parameter aus. Erfassen Sie Bilddaten.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde ein 7-minütiger statischer 18-F-PET-Scan durchgeführt, gefolgt von einem 70-Sekunden-Standard-CT-Scan, und ein 3D-Rekonstruktionsalgorithmus mit maximaler Wahrscheinlichkeitserwartung und Maximum-Likelihood-Maximierung (Standard und einzige Option im G8-Scanner) wurde angewendet, um die Daten zu rekonstruieren12.
  4. Nach Abschluss der Erfassung kehrt das Shuttle in seine ursprüngliche Ausgangsposition zurück. Entfernen Sie das Shuttle mit der Maus und setzen Sie es in das Dock ein. Drücken Sie auf die Rückseite der vertikalen BCAM-Lasche, um sie vom G8-Shuttle zu entfernen, und ziehen Sie das BCAM vorsichtig mit der Maus nach oben und entfernen Sie es.
  5. Drücken Sie auf die beiden Haltelaschen, um die Oberseite des BCAM hochzuklappen und zu öffnen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Maus. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus vollständig von der Narkose erholt hat und hell, wachsam und reaktionsschnell (BAR) ist, bevor sie in ihren Heimatkäfig zurückkehrt.
  7. Setzen Sie den Vorgang in festgelegten Zeitintervallen fort, um die gesamte Kohorte/Gruppe von Mäusen zu scannen.

6. Hochladen von Bildern in die SaaS

  1. Melden Sie sich an, um zu app.invivo.ax und ein Projekt zu erstellen.
  2. Klicken Sie auf die rote Registerkarte "Hochladen" oben rechts im Fenster. Wählen Sie ein Bildgebungssystem und einen Reporter aus, die in der Bildgebungsstudie verwendet werden (d. h. [18F]FDG). Wählen Sie den Ordner mit den Bilddaten aus.
  3. Navigieren Sie zur Registerkarte Anmerkungen im Projektordner. Klicken Sie auf Kommentieren , um relevante Scan-Informationen hinzuzufügen (Name des Probanden, Geschlecht, BCAM-Größe, Gewicht des Probanden, Name der Kohorte, Zeitpunkt und Wert der injizierten Dosis). Die meisten Metadaten werden automatisch ausgefüllt.

7. Automatisierte Datenanalyse

  1. Im Projektordner sollten alle Scans ausgefüllt werden. Klicken Sie auf Scans , um von Projekt-, Gruppen- und Einzelfachebenen aus zu navigieren. Wählen Sie in der oberen rechten Ecke Analysieren aus.
  2. Wählen Sie oben rechts im Fenster des Menübands für die Analyse unter Projekt das Pluszeichen aus, und wählen Sie ROI der Organwahrscheinlichkeitskarte aus. Die Organ Probability Map (OPM) ist ein statistischer Organatlas der Maus, der mehrere vordefinierte Organe und Gewebe umfasst. Wählen Sie einzelne Organe von Interesse auf der Grundlage des Forschungsbedarfs aus.
    HINWEIS: In diesem Beispiel wurde die manuelle Segmentierung und Analyse mit VivoQuant unter Verwendung des Spline-Tools durchgeführt, gefolgt von der Interpolation innerhalb des 3D-ROI-Operators. Die Ergebnisse der automatisierten Analyse wurden als Benchmark mit den Ergebnissen der manuellen Segmentierung verglichen.

Ergebnisse

Nach dem Hochladen können die PET-Daten auf der SaaS-Website als Panel mit koronalen, sagittalen und transversalen Bildern angezeigt werden, die mit den ausgewählten Organ-ROIs überlagert sind, die vom OPM vorgegeben werden (Abbildung 3A). Die Software kann nicht nur einzelne Bilder laden, sondern mehrere Mäuse aus einer Gruppe oder einer ganzen Studie können auf einmal als ein einziges, eingeklapptes Bild betrachtet werden. In diesem Analysefenster gibt es Optionen zum Anpassen der ROI-Farben, der Intensität der Skalenleiste und anderer allgemeiner Parameter. Sobald die idealen analytischen Metriken ausgewählt sind, generiert das SaaS ein herunterladbares Bioverteilungs-Balkendiagramm der ausgewählten Organe (Abbildung 3B).

Um die Leistung der OPM-basierten SaaS-Plattform zu bewerten, wurden die Ergebnisse der automatisierten Analyse mit denen verglichen, die von einem erfahrenen Imaging-Analysten als Goldstandard abgeleitet wurden. Die lineare Regression wurde an den [18F]FDG-Aufnahmewerten von Gehirn, Herz, Niere (rechts) und Milz durchgeführt. Bemerkenswert ist, dass die Plattform eine umfassende Liste von Organen bietet, aus denen Benutzer auswählen können, darunter Skelett, Gehirn, Blase, Herz, Nieren (rechts und links), Leber, Milz, Lunge und Quadrizepsmuskulatur (rechts und links). Die vier oben genannten Organe wurden in dieser Studie nur zu Illustrationszwecken ausgewählt. Darüber hinaus wird der Tumor aufgrund der variablen Größe, Form und Tiefe/Lage der implantierten Tumoren nicht als Organ in das OPM aufgenommen und daher von dieser vergleichenden Analyse ausgeschlossen. Wie in Abbildung 4 gezeigt, lieferten die automatisierte Analyse und die manuelle Analyse insgesamt konsistente Ergebnisse, wobei das Gehirn die höchste Korrelation aufwies (r2 = 0,8466). Dies ist aufgrund der Größe des Organs und der sehr konstanten Position des Gehirns im Schädel zu erwarten. Die rechte Niere und das Herz zeigten ebenfalls vernünftige r2-Werte von 0,6874 bzw. 0,4849. Im Gegensatz dazu ergab die Korrelationsanalyse für die Milz einenr2-Wert von 0,3922, was der niedrigste Wert unter den untersuchten Organen ist. Dies ist nicht überraschend, da die Milz in der Bauchspeicheldrüse und im Fettgewebe eingebettet ist, die keine definierte Morphologie aufweisen und im CT die gleiche Weichteildichte voraussetzen. Die Milz lässt sich daher nur schwer manuell segmentieren, und das OPM kann ein präziseres Mittel zur Abgrenzung dieses Organs darstellen (d. h. den Goldstandard übertreffen). Die Steigung und der Y-Achsenabschnitt dieser Korrelationsanalysen sind ebenfalls in Abbildung 4 dargestellt. In Übereinstimmung mit den r2-Werten hatte das Gehirn eine Steigung, die 1 am nächsten lag (d.h. eine perfekte Korrelation zwischen OPM und manuellen Ergebnissen) und den kleinsten Y-Achsenabschnitt (d.h. minimale systemische Verzerrung), während die anderen Organe eine größere und variable Abweichung von einer perfekten Korrelation zeigten.

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Abbildung 1: BCAM und schablonengesteuerte Tumorimplantation. (A) Der Pre-Clip (1) wird mit einer angeschlossenen Anästhesieleitung (3) am unteren Stück einer BCAM-Form (2) befestigt. Diese dient als Basis für die Tumorimplantation. (B) Eine Maus, bei der die Zielimplantatstelle rasiert ist (in diesem Fall die rechte Schulter), wird vor der Zellinjektion unter Narkose auf die Basis gelegt. (C) Tumorimplantationsschablone (4) mit vordefinierten Ausschnitten zur Führung der Platzierung der Tumorzellinokulation. (D) Herstellen einer temporären Referenzmarkierung vor der Zellinjektion mit der Schablonenform, die auf der dorsalen Seite der Maus platziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Positionieren einer Maus in einem BCAM. (A) Draufsicht - Platzieren Sie eine Maus kuschelig in einem BCAM in geeigneter Größe (5). (B) Seitenansicht - Das Klebeband wird verwendet, um die Hinterpfoten an den Plattformen (6) zu befestigen. Der Schwanz wird mit Klebeband an der Schwanzplattform (7) direkt unter der Maus befestigt. (C) Die Maus wird im BCAM in das Imaging-Shuttle (8) eingesetzt. (D) Maus, BCAM und Shuttle sind mit einer anästhesiebetriebenen Dockingstation (9) verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentative Bilder und Datenausgaben, wie sie vom SaaS-Tool angezeigt bzw. analysiert wurden. (A) Repräsentative Bilder, wie sie auf der SaaS-Website angezeigt werden. Koronale, sagittale und transversale Ansichten des PET/CT-Bildes, überlagert mit Organ-ROIs, die aus der Organwahrscheinlichkeitskarte (OPM) ausgewählt wurden. Rosa: Gehirn; rot: Herz; dunkelblau: Lunge; Lachs: Leber; orange: Niere (rechts). Der Tumor wird nicht durch das OPM definiert. (B) Ein repräsentatives herunterladbares Diagramm, das aus der automatisierten Analyse generiert wurde. Eine Liste der ausgewählten Organe ist im oberen linken Bereich zu sehen. Die Daten werden hier in %ID/ml angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Lineare Regressionsanalyse zum Vergleich von Organ-[18F]FDG-Aufnahmewerten, die durch manuelle Analyse und den OPM-basierten Automatisierungsworkflow abgeleitet wurden. Es wurden zehn PET/CT-Scans von weiblichen C57BL/6-Mäusen verwendet. r2-Werte , 95 %-Konfidenzlinien, Steigung und Y-Abschnitte werden im Diagramm für jedes angegebene Organ angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Der vorliegende Bericht beschreibt das Verfahren zur Durchführung von Maus-in-vivo-PET-Bildgebung mit den BCAM-Formen und zur Analyse der Daten mit dem automatisierten SaaS-Tool. Es werden Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Mausvorbereitung, zur Bildaufnahme und zur Datenverarbeitung bereitgestellt. Dieser Automatisierungsworkflow lieferte auch Daten, die mit der manuellen Analyse konsistent waren. Im Folgenden werden einige wichtige technische Überlegungen hervorgehoben.

Obwohl ein Tumor nicht zu den Organen gehört, die durch das OPM definiert werden, ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll die korrekte Implantation von subkutanen Tumoren, um letztendlich eine optimale Ausrichtung aller Mausorgane in der Körperhöhle und BCAM zu gewährleisten. Das OPM kann nur dann genaue Daten liefern, wenn die Wirbelsäule einer Maus relativ gerade ist und die inneren Organe neutral positioniert sind. Zu große oder falsch platzierte Tumore könnten die Haltung der Maus beeinträchtigen und in ihre Körperhöhle drücken, wodurch sich die inneren Organe verschieben. Diese Verschiebung wiederum wird die resultierende quantitative Analyse des OPM-Algorithmus verzerren. Andere haben über die Auswirkungen einer ungeraden Wirbelsäule auf die Ausrichtung innerer Organe unter Verwendung verschiedener Bildgebungsmodalitäten und Segmentierungsalgorithmen berichtet13,14. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Schablone zu verwenden, um die Tumorimplantation zu steuern und das Tumorwachstum genau zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Tumore sowohl richtig positioniert als auch im idealen Größenbereich sind.

Ein weiterer Bereich, in dem eine Abweichung möglich ist, ist die Auswahl eines BCAM in der richtigen Größe. BCAMs werden in 2-g-Integralen mit einem Bereich von 18-26 g erstellt. Da Mäuse mit unterschiedlicher Körperzusammensetzung (z. B. mehr Muskeln versus mehr Fett) jedoch das gleiche Körpergewicht, aber unterschiedliche Körpergrößen haben können, ist es wichtig, den am besten geeigneten BCAM zu wählen und dabei ihr Körpergewicht als allgemeine Referenz zu verwenden. Steigen Sie durch Versuch und Irrtum auf oder ab, und denken Sie daran, dass die richtige Ausrichtung entscheidend ist. Die Wahl eines zu großen BCAM führt dazu, dass die inneren Organe der Maus näher an den Boden des Bettes "sinken", was sich insbesondere auf die Genauigkeit der Analyse der dorsalen Organe wie Nieren und Wirbelsäule auswirkt. Im Gegensatz dazu könnte das Platzieren einer zu kleinen Maus in einem BCAM auf ihre Körperhöhlen drücken, die Organpositionierung verzerren und möglicherweise Schwierigkeiten beim Atmen verursachen. Die Verwendung von Klebeband, um sicherzustellen, dass die Gliedmaßen auf Pfotenplattformen befestigt sind, hilft bei der Einrichtung und Positionierung.

Obwohl dieser berichtete Workflow eine standardisierte und automatisierte PET-Bildanalyse ermöglicht, ist es erwähnenswert, dass das aktuelle OPM auf dem immunkompetenten Mausstamm C57BL/6 und gesunden Mäusen basiert. Andere Stämme und Gesundheitszustände von Mäusen können unterschiedliche anatomische Merkmale aufweisen, die eine zusätzliche Anpassung, Optimierung und Validierung des Algorithmus erfordern. Zum Beispiel haben immundefiziente Stämme wie NSG oder NCG eine kleinere Milz. In ähnlicher Weise können Mäuse, die orthotope Tumorimplantate tragen, je nach Krankheitsstatus unterschiedliche Größen, Formen und Positionen der inneren Organe aufweisen. Eine weitere Einschränkung dieses Workflows ist der Gesamtdurchsatz während der Aufnahmephase eines Experiments. Das liegt vor allem an der zusätzlichen Zeit, die benötigt wird, um eine Maus im BCAM richtig einzurichten. Schulung und Übung könnten die Effizienz des Bedieners bei der richtigen Platzierung steigern. Das Hinzufügen einer zweiten Dockingstation kann auch den Gesamtdurchsatz erhöhen, wobei eine Dockingstation für die BCAM-Einrichtung und die andere für das Entfernen einer Maus in einen Wiederherstellungskäfig dienen kann. Trotz des erhöhten Zeitaufwands, der für die Einrichtung von BCAM vor dem Scannen erforderlich ist, zahlt sich die Zeitinvestition aus, indem Zeit bei der Datenanalyse gespart wird. In der vorliegenden Studie dauerte es beispielsweise weniger als 10 Minuten, bis das OPM zehn Bilder (mit 4 ROIs) analysiert hatte, während es für einen sehr erfahrenen Analysten 3-4 Stunden dauerte, um denselben Satz von Bildern und ROIs manuell zu segmentieren und zu analysieren. Ein unerfahrener Analyst würde noch mehr Zeit für die manuelle Analyse benötigen. Die SaaS-Plattform ermöglicht die Analyse von PET-Scans in großen Chargen, wobei eine vollständige In-vivo-Biodistributionsanalyse innerhalb von Minuten nach dem Hochladen der Daten abgeschlossen werden kann. Dies ist eine äußerst hilfreiche Funktion, wenn große Datenmengen aus mehreren Gruppen und/oder über mehrere Zeitpunkte hinweg verarbeitet werden, wie im Folgenden erläutert wird.

Die manuelle Segmentierung von Organen für ein einzelnes Subjekt kann zeitaufwändig sein und erfordert in der Regel eine erhebliche Vorabschulung des Bedieners. Selbst bei angemessener Schulung sind manuelle Analysen unweigerlich mit Schwankungen zwischen den Bedienern konfrontiert, die die quantitativen Ergebnisse verzerren können15,16. Im Gegensatz dazu können durch automatisierte Segmentierung und Datenanalyse die gesamte Bioverteilung eines Radiotracers genau und effizient bestimmt und Variabilitäten eliminiert werden, die auf menschliche Vorgänge zurückzuführen sind. Solche Vorteile der Automatisierung wurden sowohl in der klinischen Bildanalyse als auch im präklinischen Bereich gesehen. Zum Beispiel zeigten Sluis et al., dass ein einziger Scan 4 Stunden benötigte, um die interessierenden Organe zu segmentieren, verglichen mit 30 Minuten mit KI-Cloud-basierten Methoden17. Eine weitere Studie von Nazari et al. berichtete ebenfalls, dass die algorithmusbasierte Analyse von Leber und Nieren im Vergleich zu zwei menschlichen Medizinphysikern genaue Ergebnisse mit einer Genauigkeit von 7,0 % zeigte18. Die Daten in Abbildung 4 zeigten auch deutlich die Zuverlässigkeit des SaaS-basierten Arbeitsablaufs für die PET-Bildgebungsanalyse und dass die automatisierte Analyse im Vergleich zur manuellen Analyse konsistente Ergebnisse lieferte.

Zusammenfassend veranschaulicht dieser Artikel den Arbeitsablauf bei der Verwendung von BCAM-Formen, um eine standardisierte präklinische PET/CT-Bilderfassung sowie eine SaaS-fähige automatisierte PET-Datenanalyse zu ermöglichen. Es wird gezeigt, dass diese Plattformtechnologie relativ einfach einzusetzen ist und die Qualität der durch die Automatisierung generierten Daten mit der manuellen Analyse übereinstimmt, aber erhebliche Zeitersparnisse bietet. Daher kann dieser Workflow Forschern Hunderte von Stunden an Zeit bei der Datenanalyse einsparen und dazu beitragen, die Variabilität zwischen den Bedienern zu standardisieren und zu reduzieren. Dieses Verfahren kann bei der Entwicklung einer Vielzahl von Wirkstoffen über Modalitäten und Indikationen hinweg helfen. Insbesondere können großmolekulare Modalitäten wie therapeutische Antikörper, bispezifische Antikörper-Immunzell-Engager, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und sogar Nanopartikel leicht mit Radiometallen (z. B. Zr-89, Cu-64) markiert werden, um eine PET-Bildgebungs-vermittelte Biodistributionsbewertung zu ermöglichen19,20. In ähnlicher Weise kann diese Plattformtechnologie dazu beitragen, die Dosimetrie neuartiger Radiotherapeutika bei Mäusen zu bestimmen21. Die Anwendung dieses Verfahrens wird einen großen Mehrwert für die Arzneimittelentwicklung darstellen.

Offenlegungen

Alle Autoren sind aktuelle oder ehemalige Mitarbeiter von Pfizer, Inc.

Danksagungen

Besonderer Dank geht an das Forschungs- und technische Team von Pfizer La Jolla Comparative Medicine.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[18F]FDGPETNet Solutions, Culver City, CANARadiotracer für die PET-Bildgebung
verwendet 27 G Nadel Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA305136Wird für die Zellinjektion verwendet 
app.invivo.ax/loginInvivo Analytics, Seattle, WANASoftware-as-a-Service-Webseite
Körperkonforme tierische SchimmelpilzeInvivo Analytics, Seattle, WANABCAMs mit einem Gewichtsbereich von 18 - 26 g
Dosiskalibrator; CRC-55twCapintec, Florham Park, NJCRC-55twMessung radioaktiver Dosen
G8 PET/CT ScannerSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANATischscanner mit Laderampe
G8-DockingstationSofie Biosciences/Xodus Imaging, Torrence, CANADockingstation zum Staging
Implantation Mold TemplateInvivo Analytics, Seattle, WANASchablone für eine optimale Tumorimplantation
Gleitgel AugensalbeBAUSCH & LOMB, Ontario, KanadaBeruhigung der NachtAugenschmiermittel für Mäuse
Modifiziertes G8-ShuttleInvivo Analytics, Seattle, WANAShuttle für BCAM-Unterkunft
Maus-Anästhesie InduktionsboxPatterson Scientific, Waukesha, WI78933388Wird zur Betäubung einer Maus
verwendet PRE-ClipInvivo Analytics, Seattle, WANABCAM-Adapter für den Anästhesieanschluss
Premiere Slide WarmerLabScientific, Danvers, MAXH-2001Einstellbarer Temperaturwärmer für die Schwanzvenenerweiterung und Anästhesieeinleitungsspritze
(1 mL)Becton, Dickinson and Company, San Diego, CA309659Wird für die Zellinjektion verwendet 
Injektionsplattform für die Schwanzvene Braintree Scientific, Pembroke, MAIL-300Resstrain zur Verabreichung von intravenösen Injektionen.
Vivoqaunt Software Invicro, Needham, MANASoftware für die manuelle Segmentierung

Referenzen

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