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Ein Mausmodell der hämorrhagischen Transformation, die durch akute Hyperglykämie in Kombination mit transienter fokaler Ischämie induziert wird

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DOI:

10.3791/67371

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15. November 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

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Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein Protokoll zur Etablierung eines hochgradig reproduzierbaren Tiermodells der hämorrhagischen Transformation (HT) unter Verwendung von Verschluss/Reperfusion der mittleren Hirnarterie (MCAO/R) bei C57BL/6-Mäusen mit akuter Hyperglykämie vorgestellt.

Zusammenfassung

Die hämorrhagische Transformation (HT) ist eine schwerwiegende Komplikation, die als Folge einer thrombolytischen Therapie nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten kann und die klinische Anwendung des rekombinanten Gewebeplasminogenaktivators (rt-PA) erheblich einschränkt. Leider gibt es derzeit keine wirksamen Interventionen für HT in der klinischen Praxis. Daher besteht ein dringender Bedarf an stabilen und zuverlässigen Versuchstiermodellen, um die Pathogenese der HT aufzuklären und effektive Interventionsstrategien zu entwickeln. In dieser Studie wurde ein Protokoll zur Etablierung eines Mausmodells für HT vorgestellt, das durch akute Hyperglykämie in Kombination mit transienter fokaler Ischämie (tMCAO) induziert wird. Männlichen C57BL/6J-Mäusen wurde 30 % Glukose injiziert, um eine Hyperglykämie zu induzieren, und dann einer 60-minütigen tMCAO-Behandlung mit Reperfusion unterzogen. Das Infarktvolumen, die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und der Grad der intrakraniellen Blutung wurden 24 Stunden nach MCAO beurteilt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Glukoseinjektion zu einer vorübergehenden Hyperglykämie (14,3-20,3 mmol/L) führte, die sowohl das Infarktvolumen als auch die Inzidenz von HT signifikant erhöhte. Die Färbung von Hämatoxylin-Eosin (H&E) deutete bei hyperglykämischen Mäusen auf signifikante hämorrhagische Läsionen innerhalb der Infarktzone hin. Darüber hinaus zeigten hyperglykämische Mäuse eine verschlimmerte BHS-Störung, wie eine schwerere Leckage von Evans-Blau (EB) und FITC-Dextran zeigte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine akute Hyperglykämie in einem Mausmodell von tMCAO zuverlässig und konsistent zu makroskopischer HT führte. Dieses reproduzierbare Modell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die pathologischen Mechanismen der HT zu untersuchen und entsprechende therapeutische Interventionen zu entwickeln.

Einleitung

Hirninfarkt ist die Hauptursache für Behinderungen und die zweithäufigste Todesursache bei Erwachsenen weltweit1. Die akute Phase spielt eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten des Hirninfarkts und dient als entscheidender Zeitpunkt für die Behandlung der Erkrankung. Eine frühzeitige und rechtzeitige Wiederherstellung des Blutflusses im Bereich des Halbschattens ist unerlässlich, um einen weiteren Tod von Hirnzellen zu verhindern, wobei Thrombolyse und interventionelle Therapie die Hauptstützen für die Behandlung des akuten Hirninfarkts (ACI) darstellen. Die hämorrhagische Transformation (HT) stellt jedoch nach Thrombolyse und interventioneller Therapie eine signifikante Komplikation dar, die bei 15 % bis 30 % der Patienten mit ischämischem Schlaganfall auftritt, wodurch ihre Anwendung in gewissem Maße eingeschränktwird 2,3. Das Auftreten von HT erhöht das Risiko für Mortalität und Behinderung erheblich, was sich auf die Prognose der ACI auswirkt. Daher ist es von großer klinischer Bedeutung, die pathologischen Mechanismen der HT zu untersuchen und wirksame therapeutische Ziele zu identifizieren.

Derzeit wird der durch Fadenembolien induzierte Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) häufig als Modell für HT bei Nagetieren verwendet4. Eine anhaltende Obstruktion kann zu einem massiven Hirninfarkt führen, an dem die Hirnrinde und das Striatum beteiligt sind, was möglicherweise zu einer sekundären HT führt. Faden-MCAO erfordert keine Kraniotomie, ist hochgradig reproduzierbar und führt zu fokalen Hirnschäden und HT, ähnlich wie ein menschlicher Schlaganfall. Dieses mechanische Modell hat jedoch einige deutliche Nachteile, darunter hohe Frühsterblichkeitsraten und niedrige Langzeitüberlebensraten5. Ein weiteres häufig verwendetes HT-Modell ist das Thrombolysemodell, bei dem die Bildung von Blutgerinnseln zunächst im Zielgefäß induziert wird, gefolgt von der Verwendung von Thrombolytika (z. B. rt-PA, Warfarin) zur Auflösung des Gerinnsels, was den klinischen Prozess der HT beim ischämischen Schlaganfall nachahmt 6,7. Obwohl sie den pathologischen Prozess der klinischen thrombolytischen Therapie weitgehend replizieren, sind HT-Tiermodelle, die durch rt-PA oder Warfarin induziert werden, kompliziert zu implementieren und mit einer hohen Tiersterblichkeit sowie einer variablen Inzidenz und Lokalisation von Blutungen verbunden. Um die grundlegende und klinische translationale Forschung zur HT nach Hirninfarkt voranzutreiben, ist es unerlässlich, ein reproduzierbares Tiermodell der HT zu etablieren, das einfach zu bedienen ist und eine hohe Stabilität bietet.

Hyperglykämie ist ein wesentlicher Faktor für HT nach zerebraler Ischämie/Reperfusion (I/R)8. Mehrere retrospektive Studien haben die klinischen Daten von Patienten analysiert, die sich einer mechanischen Thrombektomie unterzogen haben, und gezeigt, dass erhöhte Blutzuckerspiegel bei der Aufnahme mit einer höheren Inzidenz von spontanem HT3 verbunden sind. Bei diabetischen Schlaganfallpatienten erhöht Hyperglykämie das HT-Risiko signifikant und führt zu schwereren neurologischen Defiziten 9,10. Forscher haben HT-Modelle entwickelt, indem sie zerebrale I/R in diabetischen Tiermodellen durch MCAO induziert haben. Das Diabetes-MCAO-Modell hat jedoch eine lange Versuchsdauer, ein komplexes Verfahren und hohe Kosten11,12. Ein zuverlässiges Modell der HT kann etabliert werden, indem eine akute Hyperglykämie durch intraperitoneale Injektion von Glukose induziert und mit einem zerebralen I/R-Modell integriert wird, das durch die Nahttechnik erzeugt wird. Diese Methode lässt sich leicht mit gleichbleibender Blutungsposition durchführen und imitiert effektiv die klinischen Merkmale der Hyperglykämie nach einem Schlaganfall. Es gibt jedoch signifikante Unterschiede bei kritischen Bedingungen wie der ischämischen Zeit und der Glukosekonzentration; Darüber hinaus sind die Stabilität des Modells und die Inzidenz von HT in der Literatur inkonsistent.

Unsere Forschungsgruppe nutzte ausgiebig die akute Hyperglykämie-MCAO-Methode, um ein HT-Modell zu etablieren. Darüber hinaus haben wir eine umfassende Versuchsreihe durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen ischämischer Zeit, Blutzuckerkonzentration, HT-Inzidenzrate und Tiersterblichkeit zu untersuchen. Diese Experimente führten schließlich dazu, optimale Bedingungen für die Erstellung eines HT-Modells nach dem Hirninfarkt zu identifizieren. Diese Studie stellt ein detailliertes Protokoll zur Etablierung eines akuten Hyperglykämie-induzierten HT-Modells unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von 30% Glukose in Kombination mit embolischem MCAO vor.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Jianghan University (JHDXLL2024-080) genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für Versuchstiere durchgeführt, die vom Center for Disease Control of China herausgegeben wurden. In dieser Studie wurden adulte männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 21–26 g verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Gruppierung von Tieren und akute Hyperglykämie, die

  1. Halten Sie die Mäuse im Versuchstierzentrum der Universität Jianghan in einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus-kontrollierten Umgebung (20–22 °C, 50 % – 55 % Luftfeuchtigkeit) mit Futter und Wasser ad libitum.
  2. Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen ein: Sham + Kochsalzlösung (n = 12), Sham + Glukose (n = 12), MCAO + Kochsalzlösung (n = 12) und MCAO + Glukose (n = 20).

2. Präoperative Vorbereitung

HINWEIS: Alle Versuchsmäuse fasteten vor der Operation 12 Stunden lang.

  1. Systemische Analgesie (Meloxicam, 5 mg/kg subkutan) und Lokalanästhesie an der Inzisionsstelle (Bupivacain, 2 mg/kg subkutan) perioperativ verabreichen.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, Wattestäbchen und chirurgischen Nähte durch Autoklavieren bei 121 °C und 15 psi für 30 Minuten.
  3. Wischen Sie die Operationsplattform und den umgebenden Arbeitsbereich mit 75 % Ethanol ab und schalten Sie den Heizschalter bei einer Temperatur von 37 °C ein.
  4. Betäuben Sie die Maus mit einem 3%igen Isofluran-20%igen Sauerstoffgasgemisch in der Anästhesie-Induktionskammer. Bewerten Sie dann den Zehenkneifreflex, um die Tiefe der Anästhesie zu testen.
  5. Bewegen Sie die Maus auf der Operationsplattform in Bauchlage und führen Sie die Nase der Maus schnell in den Nasenkonus ein. Öffnen Sie den Gasfluss zum Nasenkonus und schließen Sie den Durchfluss zur Anästhesie-Induktionskammer. Passen Sie den Anteil an Isofluran auf 2 % an und stellen Sie den Durchfluss des Gasgemisches auf 0,4 ml/min für die Anästhesieerhaltung ein.
  6. Tragen Sie Augengel auf die Augen der Maus auf, um die Feuchtigkeit während der Operation zu erhalten.
  7. Rasieren Sie die Haare im Nackenbereich mit der Tierschermaschine. Reinigen und desinfizieren Sie die Haut, indem Sie abwechselnd mit Jod und 70% Ethanol mit einem desinfizierenden Wattestäbchen auftragen.
  8. Decken Sie eine sterile Gaze am Hals ab und schneiden Sie eine Öffnung auf, um den Operationsbereich freizulegen.

3. Ausgangsmessung des zerebralen Blutflusses

  1. Rasieren Sie das Haar der Kopfhautregion mit der Tierschermaschine. Reinigen und desinfizieren Sie die Kopfhaut, indem Sie abwechselnd Jod und 70% Ethanol mit einem desinfizierenden Wattestäbchen auftragen.
  2. Machen Sie einen 1,0 cm langen Mittellinienschnitt in der Haut über der Frontalregion, um die kraniale Fontanelle freizulegen. Halten Sie den Schädel mit normaler Kochsalzlösung feucht.
  3. Bereiten Sie das Laser-Doppler-Flowmetrie-Instrument (LDF) vor und halten Sie die LDF-Sondenspitze senkrecht zur Oberfläche des linken Parietalschädels (1 mm posterior und 5 mm lateral zum Bregma); sobald der FLUX stabil ist, und zeichnen Sie den Ausgangswert auf.
    HINWEIS: Die Maßeinheit für FLUX ist Perfusionseinheiten (PU) mit einem Messbereich von 0-1000 PU. Die ideale Ausgangs-CBF bei einer Laser-Doppler-Flowmetrie beträgt >600 PU. Ein kontinuierlicher Zeitraum von 5 Sekunden mit einem Schwankungsbereich von weniger als 10 % gilt als gültiger FLUX-Messwert.
  4. Nähen Sie den Muskel und die Haut separat mit resorbierbarem 5.0 PGA-Nahtmaterial. Tragen Sie Diclofenac-Natriumgel und Mupirocin-Salbe auf die Wunde auf.

4. Chirurgischer Eingriff der MCAO

HINWEIS: MCAO wird mit einer modifizierten Fadenokklusionsmethode durchgeführt, wie zuvor von Chiang et al.13 beschrieben.

  1. Drehen Sie die Maus vorsichtig in Rückenlage und verabreichen Sie den Mäusen 15 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff intraperitoneal 30 % Glukose (7,2 ml/kg) oder normale Kochsalzlösung.
    HINWEIS: Mäuse aus den Gruppen Sham + Glucose und MCAO + Glucose erhielten intraperitoneale Injektionen von Glukose. Mäuse aus den Gruppen Sham + Kochsalzlösung und MCAO + Kochsalzlösung erhielten intraperitoneale Injektionen von normaler Kochsalzlösung.
  2. Rasieren Sie die Haare im Nackenbereich mit der Tierschermaschine. Reinigen und desinfizieren Sie die Haut, indem Sie abwechselnd mit Jod und 70% Ethanol mit einem desinfizierenden Wattestäbchen auftragen. Decken Sie eine sterile Gaze am Hals ab und schneiden Sie eine Öffnung auf, um den Operationsbereich freizulegen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt gerade gehalten wird, um eine optimale Visualisierung der Halsschlagader zu erreichen.
  3. Machen Sie mit einem Skalpell einen 1,5 cm langen Schnitt in der Mittellinie an der ventralen Seite des Halses. Ziehen Sie das Unterhautgewebe und die oberflächlichen Faszien mit einer chirurgischen Pinzette auseinander.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, dass der Schnitt gerade gehalten wird, um eine optimale Visualisierung der Halsschlagader zu erreichen.
  4. Unterhalb der oberflächlichen Faszie befindet sich die Unterkieferdrüse und ein umgekehrtes Dreieck, das aus drei Muskeln besteht: dem Sternohyoid, das sich an der Mittellinie über der Luftröhre befindet; der hintere Bauch des Musculus digastricus, erkennbar an seinem glänzenden weißen Sehnenteil; und schließlich der M. sternomastoideus.
  5. Führen Sie eine stumpfe Dissektion innerhalb des umgekehrten Dreiecks durch, um die linke Arteria carotis communis (CCA) zu identifizieren und zu trennen.
  6. Präparieren Sie den Vagusnerv neben dem CCA und das Schleimhautgewebe, das die Blutgefäße umgibt, mit einer Augenzange. Machen Sie einen Ringer auf CCA mit einer resorbierbaren Naht mit 5,0 Polyglykolsäure (PGA), aber lassen Sie die Naht ungespannt.
  7. Entlang der CCA nach oben kann eine "Y"-Bifurkation beobachtet werden, um die CCA in die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA) zu unterteilen.
  8. Trennen Sie die Bifurkation, um ECA und ICA vollständig freizulegen. Schlingen Sie eine resorbierbare Naht 5.0 PGA um den ECA distal von der Bifurkation und binden Sie sie fest.
    HINWEIS: Achten Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen der permanenten Ligaturstelle und der Gefäßbifurkation, um zu verhindern, dass sich der Faden während der Rotation der ECA löst.
  9. Klemmen Sie sowohl den CCA als auch den ICA vorübergehend mit zwei 8 mm x 2 mm leichten Mikro-Serrafin-Arterienklemmen ein, um den Blutfluss vom CCA zum ICA zu blockieren.
  10. Dehnen Sie den Nahtbinder an der distalen ECA und der CCA, um das ECA-Segment zu begradigen.
  11. Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen kleinen Schnitt zwischen den beiden Nahtbindern auf dem ECA zu machen.
  12. Führen Sie ein siliziumbeschichtetes monofiles Nahtmaterial (30 mm lang, 3–4 mm beschichtetes Silikon) in die ECA ein. Schlingen Sie ein zweites resorbierbares 5,0 PGA-Nahtmaterial auf dem ECA in der Nähe der Bifurkation und binden Sie es leicht zusammen, um zu verhindern, dass sich das monofile Nahtmaterial zurückzieht.
  13. Schneiden Sie die ECA distal der permanenten Ligatur vollständig ab und entfernen Sie die Arterienzange aus der ICA.
  14. Ziehen Sie die Naht bis zur Bifurkation des CCA zurück, ziehen Sie dann den ECA-Stumpf vorsichtig zurück und drehen Sie ihn. Passen Sie die Einführrichtung der Naht an und führen Sie sie langsam etwa 9,0 bis 10,0 mm von der CCA-Bifurkation in die ICA ein, um die MCA zu verschließen.
  15. Ziehen Sie die zweite resorbierbare PGA-Naht um die ECA fest und entfernen Sie die Arterienklemme aus der CCA.
  16. Nähen Sie den Muskel und die Haut separat mit resorbierbarem 5.0 PGA-Nahtmaterial. Tragen Sie Diclofenac-Natriumgel und Mupirocin-Salbe auf die Wunde auf.
  17. Drehen Sie die Maus vorsichtig in die Bauchlage und wiederholen Sie Schritt 3.4. zur Aufzeichnung des Blutflusses nach MCA-Okklusion.
    HINWEIS: Mäuse, die nach MCAO eine Verringerung des Blutflusses um weniger als 40 % des Ausgangswerts zeigten, wurden aus der Studie ausgeschlossen14.
  18. Schalten Sie den Heizungsschalter des Rückgewinnungskäfigs bei einer Temperatur von 37 °C ein. Platzieren Sie die Maus während der Zeit nach der Okklusion (60 Minuten) in den Erholungskäfig.

5. Entfernung und Reperfusion von Monofilamenten

  1. Betäuben Sie die Maus wie zuvor beschrieben, kurz bevor die Okklusionsphase enden sollte.
  2. Klemmen Sie den CCA mit einer Microclip-Arterienklemme fest.
  3. Ziehen Sie das Monofilament teilweise aus dem ICA zurück, bis die silikonbeschichtete Spitze durch den ICA sichtbar wird.
  4. Platzieren Sie eine weitere Microclip-Arterienklemme auf dem ICA oberhalb der silikonbeschichteten Spitze.
  5. Ziehen Sie das Monofilament vollständig zurück und binden Sie den ECA-Stumpf fest.
  6. Entfernen Sie die Microclip-Arterienklemme von ICA bzw. CCA.
  7. Vernähen Sie den Muskel und die Haut Schicht für Schicht mit resorbierbarem 5.0 PGA-Nahtmaterial.
  8. Platzieren Sie die Maus in der Aufwachkammer und überwachen Sie alle Mäuse, bis sie vollständig wach sind. Meloxicam (5 mg/kg, subkutan) zur Schmerzlinderung alle 12 Stunden für bis zu 24 Stunden verabreichen.

6. Blutzuckermessung

HINWEIS: Die Blutzuckerspiegel wurden zu folgenden Zeitpunkten gemessen: (1) kurz vor der MCAO-Operation (Ausgangswert), (2) unmittelbar nach dem Einsetzen des Monofilaments (15 Minuten nach der Glukoseinjektion), (3) unmittelbar nach dem Herausziehen des Monofilaments unmittelbar nach dem Einsetzen des Monofilaments (75 Minuten nach der Glukoseinjektion).

  1. Wischen Sie den Schwanz der Maus mit einem alkoholischen Wattebausch ab, um die Schwanzvene vollständig hyperämisch zu machen.
  2. Schneide die Schwanzspitze mit einer chirurgischen Schere um 1–2 mm ab.
  3. Drücke sanft entlang der Schwanzwurzel bis zur Schwanzspitze, damit das Blut aus dem Schnitt fließen kann.
  4. Positionieren Sie den Probenabsorptionsbehälter des Testpapiers am Rand des Blutstropfens.
    HINWEIS: Das Blut wird aufgrund des Saugeffekts in das Testpapier gezogen.
  5. Lesen Sie den Messwert des Blutzuckermessgeräts ab und notieren Sie das Ergebnis.
    HINWEIS: Ausschließen Sie Mäuse, deren Blutzuckerspiegel nach 15 Minuten Glukoseinjektion nicht über 10 mmol/l gestiegen ist.
  6. Entfernen Sie überschüssiges Blut mit einem Wattebausch und üben Sie Druck aus, um die Blutung zu stoppen.

7. Färbung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)

  1. Euthanasieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion einer Überdosis Pentobarbital (300 mg/kg).
  2. Sobald die Maus aufhört zu atmen, legen Sie sie sofort in Rückenlage ruhig.
  3. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere und schneiden Sie das Zwerchfell heraus, um das Herz freizulegen.
  4. Führen Sie eine 23-G-Injektionsnadel in den linken Ventrikel der Maus ein und schneiden Sie den Ohranhang mit einer Schere ein.
  5. Perfundieren Sie 15 ml normale Kochsalzlösung, bis die aus dem Ohranhang abfließende Flüssigkeit klar und transparent erscheint.
  6. Enthaupte die Maus und schneide die Kopfhaut mit einer Schere auf, um den Schädel vollständig freizulegen. Führen Sie die Scherenspitze 2 mm leicht vor der Kronennaht des Schädels ein, um sie aufzuhebeln.
  7. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirngewebe der Maus intakt zu entfernen.
  8. Legen Sie das Hirngewebe in eine Nagetier-Hirnmatrize und schneiden Sie es in 2 mm große Kronscheiben.
  9. Die Scheiben auf eine 24-Well-Platte geben und mit 2%iger TTC-Lösung bei 37 °C 15 min inkubieren.
  10. Starten Sie die Scan-Software und stellen Sie die Parametereinstellungen auf eine Auflösung von 1200 dpi und ein JPG-Format für die Bildanalyse ein.
  11. Schneiden Sie die Gewebeschnitte mit einer gebogenen Pinzette aus der 24-Well-Platte heraus und ordnen Sie die Schnitte auf der Glasscanplatte an.
  12. Scannen Sie die Gewebeschnitte und exportieren Sie die Bilder dann für die Messanalyse.
  13. Messen Sie die Infarktfläche, indem Sie die Schwellung des Gewebes korrigieren. Subtrahieren Sie den Nicht-Infarktbereich der ipsilateralen Seite von dem Bereich der kontralateralen Seite mit der ImageJ-Software15. Beurteilen Sie die Infarktgröße als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre. Für weitere Details zur Analyse von Infarktgebieten siehe Friedländer et al.16.

8. Gross Beobachtung

  1. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.8.
  2. Schneiden Sie die Gewebeschnitte mit einer gebogenen Pinzette aus der Hirnmatrize heraus und ordnen Sie die Schnitte auf der Glasscanplatte an.
  3. Scannen Sie die koronalen Hirnschnitte wie in den Schritten 7.10 und 7.12 beschrieben.

9. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)

  1. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.4. Perfundieren Sie langsam 15 ml normale Kochsalzlösung, gefolgt von einer Perfusion von etwa 15 ml Paraformaldehyd (PFA).
  2. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 bis 7.7. Fixieren Sie das Hirngewebe mit 4% PFA für 24 h bei Raumtemperatur.
  3. Legen Sie das fixierte Hirngewebe zur Dehydratisierung, Vitrifikation und Wachsimmersion in den automatisierten Gewebedehydrator.
  4. Betten Sie das Gewebe in Paraffinwachs ein und schneiden Sie das Hirngewebe mit dem Mikrotom in 5 μm dicke koronale Scheiben.
  5. Entwachse die Scheibe, indem du sie dreimal in Xylol tauchst, wobei jedes Eintauchen 8 Minuten dauert. Tauchen Sie dann die Scheibe nach und nach in Ethanollösungen mit abnehmenden Konzentrationen (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %), gefolgt von destilliertem Wasser, wobei jeder Schritt 5 Minuten dauert.
  6. Die Scheibe 3 Minuten lang mit Hämatoxylinlösung färben. Differenzieren Sie es dann, indem Sie es 5 s lang in 5%igen Salzsäurealkohol tauchen.
  7. Inkubieren Sie die Scheibe 1 Minute lang mit Eosinlösung, dehydrieren und hyalinisieren Sie sie dann mit Gradientenethanollösung (90%, 95%, 100%) und Xylol.
  8. Montieren Sie den Abschnitt mit neutralen Harzen.
  9. Nehmen Sie die Bilder von H&E-gefärbten Hirnschnitten unter einem hellen Feld mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie auf.

10. Bestimmung des Evans-Blau-Lekagegehalts (EB)

HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie unter Wang et al.17.

  1. Injizieren Sie 23 h nach der MCAO 2% (w/v) Evans Blue (EB) Lösung (2 ml/kg) über die Schwanzvene.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.7 eine Stunde nach der EB-Injektion und machen Sie ein Foto des gesamten Gehirns.
  3. Legen Sie das Gehirn in eine Nagetierhirnmatrize und schneiden Sie es koronal in 2 mm dicke Scheiben. Scannen Sie die koronalen Schnitte des Gehirns, wie in den Schritten 7.10–7.12 beschrieben, um eine EB-Leckage zu beobachten.
  4. Die Scheiben in die rechte und die linke Portion teilen und jeweils in ein Zentrifugenröhrchen geben.
  5. Homogenisieren Sie jede Scheibe Hirngewebe in 50 % Trichloressigsäure mit einem Verhältnis von 100 mg Hirngewebe zu 0,4 ml Trichloressigsäure.
  6. Nach der Inkubation bei 4 °C über Nacht wird das Homogenat 30 min lang bei 10.000 x g (bei 4 °C) zentrifugiert.
  7. Füllen Sie die überstehende Flüssigkeit in ein anderes Zentrifugenröhrchen um und verdünnen Sie es vierfach mit Ethanol.
  8. Die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit bei 620 nm wird mit einem Spektralphotometer gemessen.
  9. Rechnen Sie die Absorptionswerte in die EB-Konzentration um, indem Sie eine Standardkurve von EB in Ethanol verwenden (z. B. bei 31,25, 62,5, 125 und 250 μg/ml).
    HINWEIS: Das Ergebnis wird als Mikrogramm EB pro Gramm Hirngewebe dargestellt.

11. Bestimmung der FITC-Dextran-Leckage

  1. Injizieren Sie FITC-Dextran (10 KDa, 6 mg /ml, verdünnt in 0,01 M PBS; 4 ml/kg) 24 h nach MCAO in die Schwanzvene und lassen Sie es 10 Minuten lang im Blut zirkulieren.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.7, um eine Perfusion durchzuführen und das intakte Hirngewebe zu entfernen.
  3. Fixieren Sie das Hirngewebe in 4% PFA für 24 h bei Raumtemperatur in der Dunkelheit.
  4. Übertragen Sie das fixierte Hirngewebe zur Dehydrierung in die Saccharoselösung mit Gradientenkonzentrationen von 10 %, 20 % und 30 % (verdünnt in 0,01 M PBS).
  5. Betten Sie das Hirngewebe mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) ein und schneiden Sie es in 30 μm dicke Hirngewebeschnitte. Übertragen Sie die Schnitte mit einer Impfschlaufe auf einen Objektträger und stellen Sie sicher, dass sie auf der Oberfläche des Objektträgers haften.
  6. Montieren Sie die Hirngewebeschnitte mit einem Einbettmedium, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält.
  7. Starten Sie die konfokale Lasermikroskopie und ihre Steuerungssoftware.
  8. Fixieren Sie den Objektträger auf dem Objekttisch und lokalisieren Sie die Infarktfläche unter dem 200x-Okular.
  9. Stellen Sie die Auflösung auf 1024 x 1024 ein und passen Sie den Verstärkungswert und die Belichtungszeit an, um ein möglichst klares Bild zu erhalten.
  10. Erfassen Sie die Bilder der FITC-Dextran-gefärbten Region des Hirninfarkts unter einer Anregungswellenlänge von 488 nm.

Ergebnisse

Das experimentelle Vorgehen dieser Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, die Mäuse wurden 60 Minuten lang einer Fadenokklusions-induzierten MCAO unterzogen, gefolgt von einer Reperfusion. Glukose (30 % in normaler Kochsalzlösung, 7,2 ml/kg Körpergewicht) wurde intraperitoneal 15 Minuten vor MCAO verabreicht. Die Blutzuckerspiegel wurden zu Studienbeginn (vor der Glukoseinjektion), unmittelbar nach der MCAO und zum Zeitpunkt der Reperfusion gemessen. Nach 24 Stunden Reperfusion wurden die Mäuse eingeschläfert und Hirngewebe zur Analyse des Infarktvolumens, der Leckage der Blut-Hirn-Schranke und der Histopathologie entnommen. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wiesen alle vier Gruppen ähnliche Blutzuckerspiegel zu Studienbeginn auf. Die Mäuse, die Glukoseinjektionen erhielten, zeigten jedoch signifikant erhöhte Blutzuckerspiegel im Vergleich zu denen in den Kochsalzgruppen.

Wie in Abbildung 3A dargestellt, wurde kein sichtbarer Infarkt an Hirnschnitten in der Gruppe Sham + Kochsalzlösung oder Sham + Glukose beobachtet, während ein ausgeprägter Hirninfarkt durch TTC-Färbung an Hirnschnitten aus beiden MCAO-Gruppen deutlich sichtbar wurde. Darüber hinaus wiesen Mäuse, die mit Glukose injiziert wurden, ein größeres Infarktvolumen auf als Mäuse, die in den verschiedenen MCAO-Gruppen mit normaler Kochsalzlösung injiziert wurden. Laut statistischer Analyse betrug das Infarktvolumen 20,8 % ± 0,8 % bzw. 45,1 % ± 1,6 % in der MCAO+-Kochsalzlösungsgruppe bzw. der MCAO+Glukose-Gruppe (Abbildung 3B).

Makroskopische Beobachtungen zeigten keine Blutungen in der linken Gehirnhälfte der MCAO + Kochsalzlösung Gruppe oder der Sham + Kochsalzlösung/Glukose-Gruppe. Im Gegensatz dazu wurden multiple punktförmige Blutungen in der ischämischen Hirnhälfte der MCAO + Glukosegruppe beobachtet (Abbildung 4A). Scan-Bilder von aufeinanderfolgenden koronalen Hirnschnitten zeigten, dass die Blutungen in der MCAO + Glukose-Gruppe innerhalb der Infarktregionen des Kortex und des Striatums verteilt waren (Abbildung 4A). Darüber hinaus zeigte die histologische Analyse mittels H&E-Färbung eine signifikante Infiltration von Blutzellen in die Inthematregionen des Kortex und des Striatums in der MCAO+Glukose-Gruppe (Abbildung 4B). Umgekehrt wurde weder in der MCAO+Kochsalzlösung-Gruppe noch in der Sham+Kochsalzlösung/Glukose-Gruppe eine Infiltration von Blutzellen beobachtet.

Wie in Abbildung 5A dargestellt, wurde kein Austreten von EB in den Hirnschnitten der Sham + Glucose-Gruppe beobachtet. Beide MCAO-Gruppen zeigten jedoch eine deutliche Blaufärbung aufgrund von EB-Leckagen. Darüber hinaus zeigten diejenigen, die mit Glukose injiziert wurden, im Vergleich zu Mäusen, die mit Kochsalzlösung injiziert wurden, eine erhöhte EB-Permeabilität 24 Stunden nach MCAO. Im Vergleich zur Gruppe Sham + Kochsalzlösung zeigte die MCAO + Kochsalzlösung Gruppe einen signifikanten Anstieg des EB-Gehalts (4,2 μg/g ± 1,8 μg/g vs. 28 μg/g ± 0,7 μg/g, p < 0,01), der in der MCAO + Glukosegruppe weiter erhöht war (28 μg/g ± 0,7 μg/g vs. 65,5 μg/g ± 6,0 μg/g, p < 0,01) (Abbildung 5B). Wie in Abbildung 5C dargestellt, war die Leckage von FITC-Dextran in der ischämischen Großhirnrinde und im Striatum der MCAO + Glukose-Gruppe im Vergleich zur MCAO + Kochsalzlösung intensiver.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Vorgehens. Den Mäusen wurde vor der MCAO-Operation intraperitoneal 30 % Glukose oder Kochsalzlösung injiziert, wobei der Blutzuckerspiegel während des Eingriffs überwacht wurde. 24 h nach der Reperfusion wurden die Mäuse für die pathologische und histologische Analyse euthanasiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Veränderungen des Blutzuckerspiegels zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von 30 % Glukose. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. N = 10-20. p < 0,001 im Vergleich zur Gruppe Scham + Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Hyperglykämie verschlimmerte die ischämische Hirnschädigung 24 h nach der Reperfusion. (A) Repräsentative Bilder von TTC-gefärbten Koronalschnitten, wobei normales Hirngewebe rosa-rot und ischämische Infarktbereiche grau-weiß erschienen. Maßstabsbalken = 5 mm. (B) Statistische Analyse des Infarktvolumens. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. N = 3. p < 0,001 im Vergleich zur Gruppe Sham + Kochsalzlösung, ##p < 0,01 im Vergleich zur Gruppe MCAO + Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Hyperglykämie erhöhte das HT-Risiko 24 Stunden nach der Reperfusion. (A) Repräsentative Bilder der groben Beobachtung und der koronalen Schnitte. Das Sternchen kennzeichnete die sichtbaren hämorrhagischen Herde. Maßstabsbalken = 5 mm. (B) Repräsentative H&E-gefärbte Halbhirnbilder (oben) und vergrößerte Bilder (unten). Maßstabsleiste = 200 μm für Halbhirnbilder; Maßstabsleiste = 20 μm für vergrößerte Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Hyperglykämie verschlimmerte die BHS-Störung 24 Stunden nach der Reperfusion. (A) Repräsentative Bilder der Evans-Blau-Leckage. Maßstabsbalken = 5 mm. (B) Statistische Analyse der Evans-Blau-Leckage in den ischämischen Hemisphären. Die Daten werden als Mittelwert ± SD, N = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001 im Vergleich zur Sham+Kochsalzlösungsgruppe, ##p < 0,01 im Vergleich zur MCAO + Kochsalzlösungsgruppe dargestellt. (C) Repräsentative Bilder von FITC-Dextran-gefärbter ischämischer Großhirnrinde und Striatum. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das aktuelle Protokoll ist darauf ausgelegt, ein zuverlässiges Tiermodell für die hämorrhagische Transformation nach ischämischem Schlaganfall zu schaffen, das die schädlichen Auswirkungen der Revaskularisation der Gefäße unter hyperglykämischen Bedingungen replizieren kann. Unter den verschiedenen Risikofaktoren für einen ischämischen Schlaganfall korreliert der Blutzuckerspiegel innerhalb von 24 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls positiv mit der Verschlimmerung der Hirnschädigung und einer erhöhten Mortalität 3,18. Zahlreiche klinische Untersuchungen haben auch gezeigt, dass Hyperglykämie nach einem Schlaganfall einer der kritischsten Risikofaktoren für HT und schlechtere neurologische Ergebnisse ist19. Im vorliegenden Protokoll wurden 19 von 20 Mäusen unter akuter Hyperglykämie erfolgreich zur HT induziert, was zu einer erfolgreichen Modellierungsquote von etwa 95% führte. Leider starben vier Mäuse innerhalb von 24 h nach der MCAO-Operation an einem schweren zerebralen Hämatom und wurden daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Hyperglykämie-induzierte HT-Tiermodelle wurden in der jüngsten präklinischen Forschung verwendet. Won et al. zeigten, dass Hyperglykämie HT in einem Rattenmodell der tPA-Schlaganfallbehandlungförderte 20. Die pathogenen Faktoren in Wons HT-Modell waren jedoch komplexer, da tPA selbst das HT-Risiko erhöhen kann. Im Gegensatz dazu verwendete das aktuelle Protokoll akute Hyperglykämie in Kombination mit MCAO und erzielte eine signifikante Erfolgsrate von HT bei Mäusen. Bemerkenswert ist, dass zwischen den Hyperglykämie-induzierten HT-Modellen eine Variabilität in Bezug auf die Glukosekonzentration, die Dauer der Ischämie, die Modellzuverlässigkeit und das Auftreten von HT 21,22,23,24 besteht. In einigen Studien wurde eine 50%ige Glukoseinjektion verwendet, um signifikant höhere Blutzuckerspiegel (20-28 mmol/L) zu induzieren, was über dem typischen Bereich liegt, der bei Schlaganfallpatienten beobachtet wird. Die HT-Rate in diesen Experimenten liegt zwischen 70 % und 73,3 %, wobei in einem experimentellen Modell eine Mortalitätsrate von 37,5 % erreicht wurde. Im Gegensatz dazu beinhalteten die aktuellen experimentellen Verfahren die Verwendung einer 30%igen Glukoseinjektion, um eine akute Hyperglykämie zwischen 14,3 mmol/l und 20,3 mmol/l zu induzieren, was besser mit dem Bereich der bei Patienten gefundenen Blutzuckerwerte übereinstimmte. Darüber hinaus erforderten diese Verfahren bei Versuchsmäusen vor der Operation eine Fastenperiode, um ihren präoperativen Blutzuckerspiegel auf etwa 5 mmol/l zu regulieren; Andernfalls kann es zu einem erhöhten Ausgangsblutspiegel von etwa 10 mmol/l kommen, was in der Folge zu übermäßig hohen Blutzuckerspiegeln und letztendlich zu höheren Sterblichkeitsraten bei den Mäusen führt.

In einer kürzlich durchgeführten Studie entdeckten MacDougall et al., dass Hyperglykämie zu einer Zunahme der Größe des Infarkts führte, insbesondere bei einem Typ-1-Diabetes-Modell25. Die aktuellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gruppe, der Glukose verabreicht wurde, nach 60 Minuten Ischämie eine größere Infarktgröße aufwies als die Gruppe unter Kochsalzlösung. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einem früheren Experiment, das den nachteiligen Einfluss eines hohen Glukosespiegels auf das Fortschreiten des Infarkts im Halbschattenbereich zeigte18. In diesem Protokoll führte eine präoperative 30%ige Glukoseinjektion nach 24 Stunden nach der MCAO zu einer zerebralen punktförmigen Blutung. In Übereinstimmung mit den makroskopischen Abstufungsbefunden zeigte die histologische Analyse mit H&E-Färbung eine signifikante Infiltration von Blutzellen in das ischämische Striatum und den Kortex bei Mäusen mit akuter Hyperglykämie. Selbstverständlich stehen auch andere Methoden zur Beurteilung der HT zur Verfügung, wie z. B. die Hämoglobinmessung mittels ELISA oder die Magnetresonanztomographie (MRT). Obwohl der pathophysiologische Mechanismus, der der HT zugrunde liegt, schwer fassbar ist, wird eine BHS-Störung als die Hauptursache nach zerebraler Ischämie angesehen26. Daher kann eine BHS-Störung indirekt den Schweregrad der HT widerspiegeln. In diesem Protokoll wurde die EB-Färbung verwendet, um die BHS-Permeabilität zu testen. EB-gefärbte Hirnschnitte zeigen visuell Veränderungen der BHS-Permeabilität und ermöglichen die quantitative Messung des EB-Farbstoffgehalts, der in das Hirngewebe eingedrungen ist. In den letzten Jahren wurden andere Tracer wie Fluorescein-Natrium und FITC-Dextran ausgiebig eingesetzt, um die BHS-Permeabilität in Tiermodellen für neurologische Erkrankungen zu beurteilen27,28. Daher führten wir auch ein Dextran-Färbeexperiment durch, um den Ort und das Ausmaß der vaskulären Endothelverletzung durch Beobachtung des Leckgrades von FITC-Dextran genauer abzugrenzen.

Das aktuelle Protokoll weist mehrere Einschränkungen auf, die nicht übersehen werden dürfen. Erstens erfordert die MCAO-Operation ein hohes Maß an Kompetenz vom Bediener. Es ist entscheidend, die rechtzeitige Abgabe des embolischen Fadens in das MCA sowie die genaue Platzierung und Tiefe der Okklusion sicherzustellen. Um diese Anforderungen zu erfüllen, ist eine umfangreiche Schulung des Experimentierers erforderlich. Zweitens ist die postoperative Versorgung aufgrund des Potenzials von HT, die Hirnschädigung zu verschlimmern, unerlässlich, um die Überlebensraten von Versuchstieren zu verbessern. Schließlich ist es wichtig anzuerkennen, dass klinische Schlaganfallpatienten oft mehrere Risikofaktoren für HT haben, wie z. B. Diabetes, Bluthochdruck, Vorhofflimmern undAlter von 29 Jahren. Daher kann das derzeitige Tiermodell die komplexen Mechanismen, die an diesen Risikofaktoren beteiligt sind, nicht vollständig replizieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die durch akute Hyperglykämie ausgelöste HT in einem zerebralen Ischämie-Reperfusions-Mausmodell effektiv replizierte. Dieses Modell weist eine gute Wiederholbarkeit, eine hohe Stabilität und eine hohe Überlebensrate der Tiere auf, wodurch es für den breiten Einsatz in der präklinischen Forschung von HT geeignet ist.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Abbildung 1 wurde mit der BioRender-Software (https://www.biorender.com/) erstellt. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem Leitprojekt der Natural Science Foundation der Provinz Hubei (Nr. 2022CFC057) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)Sigma-Aldrich108380Der Farbstoff für die TTC-Färbung
24-Well-KulturplatteCorning Incorporated CLS3527Das Gefäß für die TTC-Färbung
30% GlukoseinjektionKelun PharmaceuticalH42021188Akute Hyperglykämie-Induktion
4% ParaformaldehydWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Gewebefixierung
5.0 Polyglykolsäure resorbierbares NahtmaterialJinhuan Medical Co., LtdKCR531Ausrüstung für die Chirurgie
96-Well-KulturplatteCorning IncorporatedCLS3596EB-Gehaltsmessung
AnästhesiemaschineMidmark CorporationVMRAnästhesie für Tiere
Antifade-Eindeckmedium mit DAPIBeyotime BiotechP0131Halterung für Gewebeschnitte
Automatisierung-Gewebe-Dehydrierung 
Gerät		Leica BiosystemsTP1020Dehydriertes Gewebe
Konfokale MikroskopieLeica BiosystemsSTELLARIS 5Bildaufnahme
Diclofenac-Natrium-GelMaYinglong PharmazeutischesH10950214Analgesie für tierische
Eosin-FärbelösungServicebio TechnologyG1001Der Farbstoff für H& E-Färbung
Evans BlueAladdinE104208EB-Färbung
AugengelGuangzhou PharmazeutischeH44023098Material für die Chirurgie
Fitc-DextranSigma-Aldrich60842-46-8BHS-Permeabilitätsbewertung
FluoreszenzmikroskopOlympusBX51Bilderfassung
Gefrorenes MikrotomLeica BiosystemsCM1900Verwendung für Schnellschnitte
BlutzuckermessgerätYuWell580Blutzuckermessung
Hämatoxylin-FärbelösungServicebioG1004Der Farbstoff für H& E Färbung
JodLircon20020059Material für die Chirurgie
IsofluranRwd Life ScienceR510-22-10Anästhesie für Tiere
Laserdoppler BlutflussmesserMoor InstrumentsmoorVMSBlutflussüberwachung
MCAO NähteRwd Life Science907-00023-01Material für die Chirurgie
MeloxicamBoehringer-IngelheimJ20160020Analgesie für Tiere
Mikrochirurgisches InstrumentensetRwd Life ScienceSP0003-MGeräte für die Chirurgie
MikrotomThermo Fisher ScientificHM325Herstellung von Gewebeschnitten
MikrotomklingeLeica Biosystems819Herstellung von Gewebeschnitten
Mupirocin SalbeGlaxoSmithKlineH10930064Anti-Infektion für Tiere
Neutraler BalsamAbsin Bioscienceabs9177Dichtung für H& E Färbung
Paraffin-EinbettungszentrumThermo Fisher ScientificEC 350Herstellung von Paraffinblöcken
Pentobarbital-NatriumSigma-AldrichP3761Euthanasie für Tiere
Phosphatgepufferte KochsalzlösungBeyotime BiotechC0221ASpülung für Gewebeschnitt
ScannerEPSONV330Gewebescan-Rasierer
Verifizierter Lieferant - Shenzhen Codos Elektrogeräte Co., Ltd.CP-9200Ausrüstung für die
Chirurgie SpektralphotometerThermo Fisher Scientific1510-02362EB-Gehaltsmessung
SaccharoselösungShanghai Macklin Biochemical57-50-1Dehydrierung für Gewebe
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583Gewebeeinbettungsmedium
TrichloressigsäureSigma-AldrichT6399EB Messung des Inhalts

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Schlagwörter

Hyperglyk mie MausmodellVerschluss der Arteria cerebri mediaBlut Hirn Schrankezerebrales InfarktvolumenEvans Blue Permeabilit tFITC Dextran LeckageH matoxylin Eosin F rbungLaser Doppler Flowmetrie
Ein Mausmodell der hämorrhagischen Transformation, die durch akute Hyperglykämie in Kombination mit transienter fokaler Ischämie induziert wird
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