Methodenartikel

Schachbrettartiges Brandwundenheilungsmodell von Mäusen basierend auf digitalem Heizgerät

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DOI:

10.3791/67375

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27. Dezember 2024

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Etablierung eines Brandwundenheilungsmodells bei Mäusen mit einem digitalen Heizgerät vorgestellt. Die auf der Haut angelegten schachbrettartigen Experimentierstellen ermöglichen die weitere Funktionsanalyse für den Wundheilungstest.

Zusammenfassung

Schwere Brandverletzungen gehören zu den traumatischsten und körperlich belastendsten Erkrankungen, die fast jedes Organsystem betreffen und zu einer erheblichen Morbidität und Mortalität führen. Aufgrund ihrer Komplexität und der Beteiligung mehrerer Organe wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt, um verschiedene Facetten von Brandverletzungen nachzubilden. Die Methoden, die zur Herstellung verbrannter Oberflächen verwendet werden, variieren zwischen den experimentellen Tiermodellen. Diese Studie beschreibt ein einfaches, kostengünstiges und benutzerfreundliches Mausbrennmodell zur Erzeugung konsistenter Verbrennungen in voller Dicke mit einem digitalen Heizgerät. Die Spitze dieses Gerätes wurde 10 s lang bei 97 °C auf den Rücken von Mäusen aufgebracht, um eine schachbrettartige Verbrennung zu etablieren und die Wundheilung unter der Behandlung eines experimentellen Verbandes zu untersuchen. Hautproben wurden für die histologische Analyse entnommen, einschließlich der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und der Masson-Färbung. Die Wundheilung wurde durch Analyse des Wundbereichs und mikroskopische Untersuchung der entzündlichen Infiltration, der Reepithelisierung und der Bildung von Granulationsgewebe beurteilt. Das Modell der Verbrennung von Mäusen kann als grundlegendes Werkzeug für die Untersuchung der Pathophysiologie thermischer Verletzungen und die Bewertung therapeutischer Interventionen dienen.

Einleitung

Verbrennungen gelten als eine der kritischen Verletzungen der Haut, die durch Hitzeeinwirkung, Elektrizität, chemische Materialien und Strahlenbelastung verursachtwerden 1,2. Sie kann je nach Tiefe der Verletzung in vier Grade eingeteilt werden, die von der Epidermis über die gesamte Dicke der Haut bis hin zu den Muskeln und Knochen reichen. Kleine Verbrennungen können zur Narbenbildung führen und das Infektionsrisiko erhöhen. Eine großflächige Brandverletzung verursacht nicht nur lokale Schäden, sondern stimuliert auch Erkrankungen des Herzens, der Nieren und anderer Organe oder Systeme des Körpers durch schwere und langfristige Entzündungen und Immunreaktionen, was zu schwerwiegenden systemischen Folgen und hoher Morbidität führt3. Die meisten Überlebenden von Brandverletzungen gehen mit lang anhaltenden körperlichen Behinderungen, emotionalen Belastungen und einer verminderten Lebensqualität einher 4,5. Daher ist es wichtig, den pathologischen Prozess von Verbrennungen und die Mechanismen der Regeneration von verbranntem Gewebe zu untersuchen.

In-vitro-Studien, die an Immunantworten, Geweberegeneration und systematischer Homöostase beteiligt sind, konnten den pathologischen Prozess der Heilung von Brandwunden nicht umfassend untersuchen. Um mögliche therapeutische Interventionen zu erforschen, wurden daher in den letzten zwei Jahrzehnten verschiedene Tiermodelle zur Heilung von Brandwunden entwickelt, um die verschiedenen Merkmale der Brandverletzung zu replizieren 6,7. Brandwunden entstehen in der Regel auf der Rückenoberfläche von Schweinen, Ratten, Mäusen, Kaninchen und anderen Tieren nach der Haarentfernung. Die Brenndauer kann 3 s bis 30 s betragen, um teilweise bis vollständige thermische Schäden mit einem Bereich von 5 % bis 30 % der gesamten Körperoberfläche (TBSA)8 zu bilden. Aufgrund der hohen Variabilität der angewandten Techniken gibt es derzeit keine standardisierten Modelle dieser Methoden in der Verbrennungstierforschung. Die Verfahren zur Herstellung verbrannter Oberflächen variieren je nach Versuchstiermodell, einschließlich Gasflamme9, brennendes Ethanolbad10, vorgewärmte einzelne Metallplatte/-stange11,12, siedendes oder heißes Wasser13,14. Die Technik der Brandzufügung und die erzeugte Verbrennungstiefe sind jedoch in früheren Studien oft widersprüchlich und schlecht beschrieben, was für die Bestimmung der Schwere der Verbrennung und der Methode der Verbrennungsbehandlung von entscheidender Bedeutung ist.

Ziel dieser Studie ist es, ein einfaches, kostengünstiges und benutzerfreundliches Tiermodell für Mausverbrennungen zu entwickeln, um konsistente Verbrennungen in voller Dicke in simulierten klinischen Szenarien zu erzeugen. In diesem Protokoll haben wir ein praktisches digitales Heizgerät verwendet, um die Tiefe der Verbrennung zu steuern, indem wir die auf die Haut ausgeübte Temperatur anpassen. Die Spitze dieses Geräts kann auf verschiedene Größen umgeschaltet werden, um thermische Verbrennungen mit unterschiedlichen TBSA-Bereichen zu induzieren. Dies ermöglicht die Erzeugung einer schachbrettartigen Brandwunde auf dem Rücken der Maus, die den Vergleich mehrerer Versuchs- und Kontrollbehandlungen innerhalb desselben Tieres ermöglicht. Wir beobachteten und protokollierten den Prozess des Wundverschlusses. Hautproben wurden für die histologische Beurteilung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Masson-Trichrom-Färbung) in verschiedenen Stadien der Wundheilung entnommen. Dieser Ansatz reduziert die Anzahl der im Versuch verwendeten Tiere und senkt somit die wirtschaftlichen Kosten, während er gleichzeitig besser mit der Tierethik vereinbar ist. Diese Studie wird den Forschern wichtige Werkzeuge an die Hand geben, um die Entwicklung neuartiger Behandlungen für Verbrennungsverletzungen zu erleichtern und die pathophysiologischen Mechanismen der Heilung von Brandwunden aufzudecken.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan überprüft und genehmigt (WCHSIRB-D-2024-499). Für die vorliegende Studie wurden vierundzwanzig acht Wochen alte C57BL/6-Mäuse (weiblich, Körpergewicht 25-30 g) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Ausrüstung und Maus vor Verbrennungen

  1. Erwerben Sie die Tiere und halten Sie sie nach ihrer Ankunft 7 Tage lang in Käfigen, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können.
  2. Sterilisieren Sie den Arbeitsbereich durch Besprühen und Wischen mit 70% Ethanol (v/v). Decken Sie den Operationstisch mit sterilen chirurgischen Saugeinlagen ab.
  3. Stellen Sie die Temperatur des digitalen Heizgeräts auf 97 °C ein. Die Heizvorrichtung besteht aus drei Teilen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die Temperatur von 50 bis 450 °C kann über den Temperaturregler eingestellt werden (Abbildung 1A). Der Stativfuß wird zum Platzieren der Spitze (Abbildung 1B) verwendet, die demontiert werden kann (Abbildung 1C), um verschiedene Instrumentengrößen zu ersetzen. Desinfizieren Sie die Spitze mit Jodophor oder Alkohol.
  4. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in 100% Sauerstoff in einer Induktionskammer für 3 min (Durchflussrate: 4 L/min), bis sich die Atmung verlangsamt hat. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenquetschtest.
    HINWEIS: Das Einatmen von Isofluran kann zu Schläfrigkeit führen und das Herz-Kreislauf-System schädigen. Es ist wichtig, Schutzausrüstung zu tragen und sie in einem Abzug in einem gut belüfteten Bereich zu handhaben.
  5. Sobald die Maus tief betäubt ist, legen Sie sie in Bauchlage auf ein beheiztes Pad, um die Wärme zu erhalten und eine Unterkühlung während der Genesung von der Narkose zu verhindern. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1. 5 % Sauerstoff für die Wartung über einen Nasenkonus.
  6. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen Gleitgel auf beide Augen der Maus auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.

2. Induktion von Verbrennungen in voller Dicke

HINWEIS: Der allgemeine Prozess der Verbrennungsinduktion und -analyse ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Rasieren Sie die Haut der Maus mit einem Elektrorasierer auf einer Fläche von ca. 5 cm Länge und 4 cm Breite vom Hals bis zum Schwanz. Arbeiten Sie vorsichtig, um Verletzungen der Haut bei der Rasur zu vermeiden (Abbildung 3C).
  2. Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze 3 Minuten lang Enthaarungscreme auf die rasierte Hautpartie auf (Abbildung 3D).
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Enthaarungscreme auf andere Teile der Maus aufzutragen, um Verbrennungen zu vermeiden, die schwer zu erkennen sein können. Die Creme verursachte Hautausschläge, wenn sie länger als 5 Minuten verwendet wurde. Die genaue Dauer für eine optimale Wirksamkeit variiert je nach Produkt und sollte vom Bediener festgelegt werden.
  3. Wischen Sie die Creme mit feuchter Gaze ab, bis Creme und Haare nicht mehr zu erkennen sind. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Chlorhexidin-Peeling, gefolgt von jeweils dreimal 70% Ethanol (v/v). Reinigen und trocknen Sie den Bereich mit steriler Gaze.
  4. Verwenden Sie eine sterilisierte 1-ml-Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 9 mm (Abbildung 3A), die in sterilisierte Tinte getaucht ist, um die gewünschten Wundstellen genau zu lokalisieren. Die Rückenhaut der Maus zeichnet sich durch eine unebene Topographie aus. Die Definition des Wundbereichs abseits des Rückenmarks von Mäusen ist wichtig, um die Wiederholbarkeit zu gewährleisten.
  5. Decken Sie die Haut mit einem zuvor getrimmten sterilen Tuch ab und lassen Sie den Operationsbereich frei (Abbildung 3). Ziehen Sie hitzebeständige Handschuhe an und überprüfen Sie die Temperatur des digitalen Heizgeräts. Desinfizieren Sie die Spitze des Geräts vor und nach der Verbrennungsinduktion mit 70 % Ethanol (v/v).
  6. Setzen Sie die Spitze des Heizgeräts in die Mitte der lokalisierten Wundstellen (97 °C für 10 s), um sechs runde Wunden mit einem Durchmesser von 4 mm zu erzeugen (Abbildung 3B). Der Abstand zwischen benachbarten Verbrennungen beträgt 0,5-1 cm. Bestimmen Sie die Anzahl der Verbrennungen gemäß dem Versuchsplan.
    HINWEIS: Die Verbrennung wird hauptsächlich durch Wärmeleitung verursacht; Daher ist es nicht notwendig, Druck auf den Stab auszuüben, d.h. ihn während der Verbrennungsinduktion durch die Schwerkraft mit der Haut in Kontakt zu halten. Für das Versuchsdesign gab es sechs Verbrennungen. Dies ist die maximale Anzahl an Brandwunden, die je nach verwendetem Gerät und der Fläche des Mausrückens gebaut werden kann. Auf dieser Basis können mehrere Replikate derselben Versuchsgruppe erreicht werden.

3. Pflege und Messung nach der Verbrennung

  1. Tragen Sie 5 Minuten lang Eis auf die Brandwunde auf, um mögliche Schmerzen für die Schmerzbehandlung zu reduzieren (Abbildung 3G).
  2. Schalten Sie das Isofluran aus und entfernen Sie den Nasenkegel nach der Verbrennungsverletzung. Schieben Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis sich die Maus normal bewegt (z. B. nicht geduckt oder zittert).
  3. Legen Sie jede Maus in einen Bergungskäfig, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig zerkratzen. Machen Sie einige Futterpellets weich, indem Sie 5-10 Tropfen Trinkwasser zu jedem Pellet geben und legen Sie sie auf den Käfigboden, um die Fütterung zu erleichtern.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie die Käfige durch Besprühen und Wischen mit 70% Ethanol (vol/vol). Die Einstreu sollte regelmäßig gewechselt werden, um die Mäuse warm zu halten und Urin aufzunehmen.
  4. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) subkutan zweimal täglich an einer kaudalen Stelle für insgesamt 3 Tage, wobei ein Abstand von mindestens 8 Stunden zwischen den Injektionen sichergestellt wird.
  5. Reinigen Sie alle Wunden mit steriler, mit Kochsalzlösung angefeuchteter Gaze nach 24 Stunden Verbrennungseinleitung. Tupfen Sie die Haut mit Gaze ab und tragen Sie eine kleine Menge antibakterielles Gel (TKH-Hydrogel) mit einer Spritze auf, um die Brandwunde zu bedecken12,14. Wiederholen Sie diesen Vorgang an den Tagen 3, 7 und 10 danach.
  6. Verwenden Sie einen atmungsaktiven, transparenten Verband, um die Wunden abzudecken. Die Größe des Verbandes sollte ca. 1 cm um die Wunde herum abdecken und den Bereich ohne Haarentfernung nicht abdecken.
    HINWEIS: Wechseln Sie den Wundverband mindestens alle 2 Tage. Eine längere Anwendung des Verbandes ohne Ersatz kann zu einer Wundinfektion mit Eiterbildung führen, was zu einer verzögerten Wundheilung führt.
  7. Messen Sie während der Nachbeobachtungszeit alle 2-3 Tage das Gewicht. Im Allgemeinen sollten Mäuse, die 15 % bis 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren, getötet und aus dem Experiment entfernt werden.

4. Wundsammlung

  1. Markieren Sie die Wunde nach 0, 3, 7, 10 und 14 Tagen mit der Spitze einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze und zeichnen Sie sie mit einer Digitalkamera auf.
  2. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Überdosierung von Anästhesie und Gebärmutterhalsluxation (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
    HINWEIS: Seien Sie während der Gebärmutterhalsluxation vorsichtig, um übermäßiges Ziehen zu vermeiden, das die Rückenwunden beschädigen kann.
  3. Isolieren Sie mit einer Schere die Wundstelle und die umliegende Haut einschließlich der darunter liegenden Muskulatur (1 cm x 1 cm). Bereiten Sie sich auf mindestens drei Proben für jede Gruppe vor.
  4. Die Hautproben 24 h in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixieren und bei 4 °C lagern. Das Volumen des Fixiermittels muss das 30-fache des Gewebevolumens15,16 betragen.
    HINWEIS: PFA ist gefährlich. Stellen Sie sicher, dass Sie in einem gut belüfteten Bereich arbeiten und geeignete Schutzausrüstung verwenden.

5. Bewertung der Wundheilung

  1. Waschen Sie das Wundtuch zweimal mit PBS und verteilen Sie es mit Filterpapier, das auf eine geeignete Größe zugeschnitten werden sollte (Abbildung 2H). Aufgrund des Vorhandenseins eines gewissen Schleimgehalts in der subkutanen Gewebeschicht haftet es an der Oberfläche des Filterpapiers, ohne dass sich das Gewebe bewegt oder sich kräuselt.
    1. Das Filterpapier und die Probe werden in eine Gewebekassette zur Paraffindehydratisierung gegeben, um relativ glatte Gewebeproben zu erhalten, und dann das Gewebe15,16 einbetten. Die Proben werden bei 4 °C gelagert.
      HINWEIS: Dehnen Sie das Gewebe so weit wie möglich und vermeiden Sie jegliche Faltenbildung, da diese Falten nach der Fixierung dauerhaft werden.
  2. Schneiden Sie die in Paraffin eingebetteten Proben in 5 μm dicke Schnitte und färben Sie Objektträger über H&E und Massons Trichrom, um das Ausmaß des Granulationsgewebes, die Angiogenesebildung und die Kollagenablagerung zu beurteilen und Beweise für die Beurteilung der verschiedenen Stadien und des Fortschritts der Wundheilung zu liefern17,18.
  3. Nehmen Sie Bilder aller Proben mit einem Mikroskop mit einem 40-fach-Objektiv auf.
  4. Verwenden Sie eine kompatible Software, um den verfärbten Hautabschnitt zu analysieren, einschließlich der Epidermis, der Dermis, des Unterhautgewebes und des Muskelzustands.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurden schachbrettartige Brandwunden mit einer Brenndauer von 10 s bei 97 °C durch das digitale Heizgerät erzeugt (Abbildung 1). Die Spitze des Geräts besteht aus reinem Kupfer, das für seine hervorragende Wärmeleitung und schnelle Aufheizfähigkeit bekannt ist. Der Griff, den der Experimentator hält, besteht aus Polycarbonat-Material, das Hitzebeständigkeit und Nichtbrennbarkeit bietet. Im Vergleich zu den vorgewärmten Methoden mit einer einzelnen Metallplatte/-stange oder mit kochendem oder heißem Wasser zeigt dieses Gerät eine überlegene Sicherheitsleistung und reduziert die Anästhesiezeit bei Mäusen, wodurch die Gesamtversuchsdauer verkürzt wird.

Der allgemeine Prozess der Brandinduktion und -analyse ist in Abbildung 2 dargestellt. Jedes Tier hatte sechs Brandwunden am Rücken, die wie in Abbildung 2E dargestellt angeordnet waren. Die Wundgröße bei diesen Tieren wurde untersucht, und es wurden Hautproben für die histologische Analyse entnommen, einschließlich H&E- und Masson-Trichrom-Färbung an den Tagen 1, 3, 7, 10 bzw. 14 nach der Verbrennung.

Jede Brandwunde hatte eine kreisförmige Form mit gleicher Fläche und gleichmäßiger Tiefe nach der Verbrennungsinduktion. Die Kantenfarbe der Brandverletzung verschob sich von wachsweißer zu roter Verletzung, begleitet von einer hyperämischen Zone aufgrund der unmittelbaren Entzündungsreaktion auf die Verletzung. Zusätzlich nahm die Größe der Brandwunde in den 72 Stunden nach der Verbrennung leicht zu (Abbildung 4A).

Die mikroskopische Analyse von H&E- und Masson-Trichrom-gefärbten Abschnitten der Wunden (Abbildung 4B) zeigte eine vollständige Zerstörung der Epidermisschicht und eine Schädigung der gesamten Dicke der Dermis, die sowohl das subkutane Fett als auch die Muskeln betraf. Die histologische Untersuchung zeigte, dass sich der Wundheilungsprozess am Tag 3 im Entzündungsstadium befand, das durch Vasodilatation und eine erhebliche Infiltration von Entzündungszellen gekennzeichnet war. Eine bemerkenswerte Verringerung der Wundfläche wurde am 7. Tag nach der Verbrennung im Vergleich zu Tag 3 beobachtet, wie auf mikroskopischen Bildern der Proben zu sehen ist. Granulationsgewebe und Herz-Kreislauf-Fasern bilden sich, und Kollagenfasern lagern sich am 14. Tag dicht ab, was bedeutet, dass die Wundheilung in die Umbauphase eintritt. Die Wunden erholten sich während des gesamten Heilungsprozesses ohne offensichtliche Infektion.

Zusätzlich wurden die Wundheilungsfähigkeiten durch die Quantifizierung von Wundheilungsdaten und die Analyse von Wundverfolgungen evaluiert (Abbildung 5). Es wurde beobachtet, dass die Wundheilung bei Wunden, die mit TKH-Peptid-Hydrogel12,14 behandelt wurden, verbessert wurde, was sich in signifikant kleineren Wundbereichen an den Tagen 7, 10 und 14 zeigte.

Das Intervall zwischen benachbarten Wunden (Abbildung 6), entweder quer oder längs, bestätigte keinen Unterschied im Vergleich zu nicht verbrannter Haut. Die Epidermis, die Dermis und das Unterhautgewebe waren intakt, und es gab keine Lymphozyteninfiltration und keine Vasodilatation. Der Heilungsprozess der beiden Wunden stört sich nicht gegenseitig. Daher können auf Basis des Modells verschiedene Medikamente oder Verbände zur Wundbehandlung appliziert werden, um die Wirkung in vivo zu bewerten.

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Abbildung 1: Digitales Heizgerät für die Verbrennungsinduktion. Das digitale Heizgerät, das zur Herbeiführung von Brandverletzungen verwendet wird. (a) Der Temperaturregler ermöglicht Temperatureinstellungen von 50 bis 450 °C. (b) Der Standfuß dient zur Aufnahme der Brennspitze. (c) Die Spitze des Gerätes kann auf verschiedene Größen umgeschaltet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des schachbrettartig gewickelten Modells. Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Reproduktion des schachbrettartigen Wickelmodells, das in diesem Artikel beschrieben wird. (A) Eine 8 Wochen alte Maus wird als Modell für Wundheilungsexperimente verwendet. (B) Die Haare werden aus dem dafür vorgesehenen Verwundungsbereich entfernt. (C) Die sechs Verwundungsstellen werden mit einer 1-ml-Pipettenspitze markiert. (D) Ein digitales Heizgerät wird verwendet, um sechs Brandwunden in der Mitte jeder markierten Stelle (E) zu erzeugen. (F) Eine Nahaufnahme des Rückens nach der Verbrennungsinduktion. (G) Hautproben (ca. 1 cm × 1 cm) werden an den Tagen 3, 7, 10 und 14 entnommen. (H) Die Hautproben werden mit Filtpapier flach gedrückt und in Einbettkassetten überführt. (I) Es wird eine Paraffin-Dehydratisierung durchgeführt, und (J) die Proben werden auf eine Dicke von 5 μm geschnitten. (K) Die Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Masson-Trichrom gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Induktionsprozess bei einer Brandverletzung in voller Dicke. (A) Der Durchmesser einer 1-ml-Pipettenspitze und (B) der Spitze des digitalen Heizgeräts beträgt 9 mm bzw. 4 mm. (C) Der Rückenbereich der Maus wird mit einem Elektrorasierer rasiert. (D) Enthaarungscreme wird 3 Minuten lang aufgetragen. (E) Die rasierte Stelle wird gereinigt und getrocknet, und die Wundpunkte werden mit einer sterilisierten 1-ml-Pipettenspitze markiert. (F) Das digitale Heizgerät wird 10 s lang bei 97 °C angewendet, um sechs Brandwunden zu erzeugen. (G) Zur Schmerzbehandlung wird Eis auf die Brandwunden aufgetragen. (H) Auf dem gesamten Rücken der Maus sind die sechs Brandwunden in voller Dicke zu sehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Brandwunden und histologischer Analyse. (A) Bilder von Brandwunden an den Tagen 3, 7, 10 und 14, die den Fortschritt der Heilung zeigen. (B) Histologische Bilder, die mit H&E und Massons Trichrom gefärbt wurden, zeigen die Wundheilung und die Hautregeneration. Maßstabsstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Variation der Wundgröße im Laufe der Zeit. (A) Die Variation der Wundgröße bei Kontrolltieren und mit TKH-Hydrogel behandelten Tieren im Laufe der Zeit, analysiert mit der ImageJ-Software. (B) Entsprechende Wundspurendaten werden vorgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Benachbarte Brandwunden und histologische Analyse. (A) Repräsentative Bilder benachbarter Brandwunden an Tag 1. (B) Benachbarte Wundproben, die an Tag 3 für die histologische Analyse entnommen wurden (rot eingekreist). (C) Filterpapier wird verwendet, um die Gewebeproben vor der Paraffindehydrierung zu glätten. (D) H&E und Massons Trichrom-Analyse benachbarter Wunden. Maßstabsleisten: 1 mm und 200 μm (vergrößert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Für Studien zu Verbrennungen konzentrieren sich In-vitro-Modelle in der Regel auf die hemmende Wirkung lokaler antimikrobieller Wirkstoffe oder Antibiotika auf Bakterien, die mit Verbrennungen in Verbindung stehen, wie Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa19, sowie auf die Auswirkungen verschiedener Biomaterialien (wie Elastin, Seide und Hydrogelverbände14,20) an Entzündungszellen (wie Neutrophilen, Makrophagen) oder Stammzellen (wie mesenchymale Stammzellen). Diese Experimente werden in der Regel in künstlich kontrollierten Umgebungen durchgeführt, und in vitro kultivierte Zellen können Wachstumsmerkmale und Verhaltensweisen aufweisen, die sich von denen in vivo unterscheiden, wodurch die physiologischen Prozesse der Wundheilung von Verbrennungen, wie z. B. Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen und der Einfluss der extrazellulären Matrix, möglicherweise nicht vollständig repliziert werden können. Aus diesen Gründen sind Tiermodelle von Verbrennungen unerlässlich, um die pathologischen Mechanismen nach Verbrennungen aufzuklären und neue Therapieansätze zu evaluieren. Der Wundheilungsprozess bei Mäusen und Menschen durchläuft vier sich überschneidende, aber unterschiedliche Stadien: Entzündung, Proliferation, Re-Epithelisierung und Umbau 21,22. Die Verwendung von Mäusen als Versuchsobjekte bietet mehrere biologische Vorteile, darunter die Verfügbarkeit zahlreicher mausspezifischer Reagenzien und die Möglichkeit, transgene Modelle zu erstellen, um die molekularen Signalwege zu untersuchen, die am Genesungsprozess beteiligt sind. Damit ist die Maus eines der am häufigsten verwendeten Tiermodelle für die Erforschung von Verbrennungen und Wundheilung.

In der vorliegenden Studie wurde ein schachbrettartiges Wundmodell für Verbrennungen in voller Dicke etabliert und die Wirksamkeit eines Hydrogelverbandes anhand dieses Modells untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Modell die klinische Leistung von experimentellen Verbänden effektiv überwachen kann. Bei jedem Tier waren sechs Brandwunden symmetrisch entlang der Wirbelsäule verteilt. Brandwunden können an ähnlichen Stellen, aber an unterschiedlichen Mäusen entstehen. Aufgrund der begrenzten Hautfläche des Rückens und der Anzahl der Wunden zeigte die histologische Analyse, dass die Wunden nicht miteinander interagierten, was eine unabhängige Bewertung jedes experimentellen Verbandes an verschiedenen Stellen am selben Mausrücken gewährleistete und die Verzerrung im Zusammenhang mit dem Wundheilungsprozess minimierte. Darüber hinaus profitiert dieses Modell auch davon, dass es sicherstellt, dass jede Maus als eigene Kontrolle dient, was es ermöglicht, experimentelle und Kontrollbehandlungen am Rücken derselben Maus zu vergleichen, was zu einer erheblichen Reduzierung der Anzahl der Tiere und der Versuchskosten führt. Aufgrund der unterschiedlichen Auswirkungen verschiedener Medikamente auf die allgemeine Gesundheit von Mäusen kann es notwendig sein, zu beobachten und zu überprüfen, ob die Anwendung eines einzelnen Arzneimittels oder die kombinierte Anwendung verschiedener Arzneimittel die allgemeine Gesundheit der Maus beeinflusst, wenn mehrere Arzneimittel zur Behandlung verschiedener Wunden und zum anschließenden Vergleich auf die Haut derselben Maus aufgetragen werden sollen. Zusätzlich sollte auf die Stabilität bzw. Adhäsion verschiedener Medikamente auf der Hautoberfläche geachtet werden, um eine Kreuzkontamination von Medikamenten oder Wundinfektionen durch das Kratzen der Maus während des Heilungsprozesses zu verhindern.

Die Entnahme von Hautproben ist für die anschließende histologische Analyse von entscheidender Bedeutung. Der Geweberand schrumpft und faltet sich im Fixiermittel ohne Behandlung16. Nach der Paraffindehydrierung und -sektion ist es auch auf dem Objektträger gekrümmt oder sogar teilweise überlappend, was zu unansehnlichen Bildern unter dem Mikroskop führt und möglicherweise weitere histologische Analysen, wie z. B. die statistische Analyse der Wundlänge oder -dicke, beeinträchtigt. Daher kann durch die Verwendung von Filterpapier zum Abflachen des Gewebes ein glatterer Schnitt auf dem Objektträger erzielt werden, was das histologische Bild sauber macht und eine weitere statistische Analyse erleichtert. Wir haben auch versucht, die Probe vor der Dehydrierung mit Büroklammern zu fixieren, was dazu beitrug, die Glätte des Gewebes zu gewährleisten. Das Anbringen von Büroklammern kann jedoch Druck auf das eingeklemmte Gewebe ausüben, was zu einer Quetschung und Verformung des Gewebes führt. Daher kann bei dieser Methode der Teil der Brandwunde nicht geklemmt werden, um die Beobachtung nicht zu beeinträchtigen.

Zahlreiche Faktoren können den Heilungsprozess beeinflussen, darunter Schmerzen, Juckreiz und bakterielle Infektionen23. Eine effektive Behandlung von Verbrennungsschmerzen ist entscheidend für die Genesung und Wiedereingliederung von Patienten mit Brandverletzungen. Eine unzureichende Schmerzkontrolle kann den Heilungsprozess behindern, was zu dauerhaften körperlichen und psychischen Herausforderungen sowie zu längeren Krankenhausaufenthalten führt24. Im Allgemeinen beeinflussen Schmerzen das Fressverhalten bei Mäusen. Daher wurde jede Wunde sofort nach der Verbrennung mit Eis behandelt und Buprenorphin (0,1 mg/kg) 3 Tage lang zweimal täglich subkutan zur Schmerzbehandlung injiziert. Zusätzlich wurden die Futterpellets aufgeweicht und auf den Käfigboden gelegt, um die Fütterung zu erleichtern. In Gemeinschaftsunterkünften können sich Mäuse gegenseitig an den Wunden kratzen und lecken, was möglicherweise die Wundheilung verzögert oder Infektionen verursacht. Daher wird die Einzelhaltung von Mäusen als vorbeugende Maßnahme notwendig. Die Verwendung eines atmungsaktiven Verbandes zur Abdeckung des Rückens nach der Verbrennungseinleitung kann verhindern, dass die Mäuse die Wunde zerkratzen, und das Infektionsrisiko verringern25. Es ist jedoch wichtig, die Verbände mit Bedacht auszuwählen und sie auf die richtige Größe zu schneiden, um eine normale Bewegung der Mäuse zu ermöglichen. Verbände sollten sofort ausgetauscht werden, wenn sie abfallen, mit der Empfehlung, sie mindestens alle zwei Tage zu wechseln. Längerer Gebrauch von Verbänden kann zu einer unzureichenden Resorption von Wundexsudat führen.

Das Mausmodell hat zwar seine spezifischen Vorteile, kann aber den Wundheilungsprozess beim Menschen noch nicht vollständig simulieren. Der Mensch heilt in erster Linie durch Re-Epithelisierung und Granulation. Im Gegensatz dazu weist die Haut von Mäusen einen einzigartigen Panniculus carnosus auf, eine dünne Schicht aus Skelettmuskulatur, die beim Menschen nur im Platysma des Halses vorkommt7, so dass die Wundheilung hauptsächlich durch Wundkontraktion erfolgt. Darüber hinaus kann die Haut von Mäusen über einen angereicherten Pool von Vorläuferzellen verfügen, was eine schnelle Hautheilung und Verhornung ermöglicht26,27. Diese Faktoren tragen zusammen zu einer erheblich verkürzten Heilungszeit bei. In Tiermodellen wurden Wund-Antikontraktionsringe verwendet, um die Auswirkungen der Wundkontraktion auf den Heilungsprozess zu mildern und eine menschenähnliche physiologische Wundheilung nachzuahmen, die mit Granulationsgewebe und Reepithelisierung heilt 12,17,28.

Die erfolgreiche Etablierung des Modells für Verbrennungsverletzungen bei Mäusen stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die Pathophysiologie thermischer Verletzungen zu untersuchen und mögliche therapeutische Interventionen zu evaluieren. Die beobachteten histologischen Veränderungen im verbrannten Hautgewebe stimmen mit den charakteristischen Merkmalen der thermischen Verletzung überein und unterstreichen die Zuverlässigkeit und Validität des Modells bei der Rekapitulation der klinischen Manifestationen von Verbrennungen.

Insgesamt bietet das Modell der Verbrennungsverletzung der Maus eine robuste Plattform für die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die verbrennungsinduzierten Gewebeschäden, Entzündungen und Wundheilungsprozessen zugrunde liegen. Zukünftige Studien, die dieses Modell nutzen, könnten zur Entwicklung neuartiger Therapieansätze beitragen, die darauf abzielen, die Ergebnisse für Verbrennungspatienten zu verbessern und die Belastung durch verbrennungsbedingte Morbidität und Mortalität zu verringern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Sichuan Science and Technology Program (23ZYZYTS0120), das West China Hospital of Stomatology der Sichuan University (RD-03-202011) und das Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC0614) unterstützt. Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. COM.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL PipettenspitzeKIRGEN, USAKG1333Wird verwendet, um Brandwunden zu lokalisieren
3 M Tegaderm Film3M, USA1624WCN 6 cm x 7 cmFür die Wundabdeckung nach der Verbrennungseinleitung
4% Paraformaldehyd (PFA)Biosharp, ChinaBL539AWird verwendet, um die Hautproben zu fixieren
BuprenorphinSigma-Aldrich, USAPHR8955-50MGFür die Schmerzbehandlung der Mäuse
C57BL / 6 MäuseChengdu Dashuo Versuchstierunternehmen, ChinakeineFür die Etablierung des Verbrennungsmodells
EnthaarungscremeVeet, China—Für die Rückenhaarentfernung der Mäuse
Digitales HeizgerätShenzhen Kapper Technology Company, ChinaNr. 936DFür die Verbrennungsinduktion der Mäuse
ElektrorasiererAUX, ChinaAUX-A5Für die Entfernung der Rückenhaarentfernung der Mäuse
Filterpapier—–Wird zum Entfalten der Hautproben verwendet
GraphPad-Software–GraphPad prism 9.5.0Für die Analyse von Brandwunden
Hitzebeständige Handschuhe––Wird verwendet, um die Spitze des digitalen Heizgeräts zu halten
Hämatoxylin- und Eosin-Flecken-KitSolarbio, ChinaG1120Für die histologische Analyse der Objektträger
ImageJ Software–ImageJ 1.54fFür die Analyse des Brandwundenbereichs
IsofluranRWD, ChinaR510-22-10Für die Anästhesie der Mäuse
Masson's Trichrome Stain KitSolarbio, ChinaG1340Für die histologische Analyse der Objektträger
MikroskopOlympus, Japan VS200 ASWWird zum Scannen des H& E und Masson gefärbte Objektträger
GewebekassetteCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China31050102WFür die Entwässerung von Gewebeparaffin und die Einbettung von Paraffin

Referenzen

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