Untersuchung der murinen CD4-T-Zell-Differenzierung mittels CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex-vermittelter Genablation

Zusammenfassung

Wir skizzieren einen hochgradig anpassungsfähigen Ansatz für die Verwendung der CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex-vermittelten Genablation in murinen naiven CD4-T-Zellen, um die Genfunktion bei der CD4-T-Zelldifferenzierung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die weit verbreitete Zugänglichkeit der CRISPR-Cas9-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) hat das Gen-Targeting in Primärzellen zu einer Routinemethode zur Bewertung der Genfunktion in T-Zellen gemacht. Angesichts der Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit von Knockout-Mausstämmen (KO) kann das Testen vorläufiger Hypothesen über die Genfunktion in T-Zellen mit gengesteuerten Tiermodellen unerschwinglich sein. Mit kommerziell verfügbaren Ressourcen, einschließlich vorgefertigter Guide-RNAs (gRNAs), können Forscher jedoch bequem gengesteuerte naive T-Zellen erzeugen, die für T-Zell-Aktivierungs- und Differenzierungsstudien verwendet werden können.

Hier skizzieren wir ein Protokoll für die Verwendung von CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplexen (RNPs) mit Nukleofektion zur effizienten Generierung von gen-KO-murinen naiven CD4-T-Zellen, die zur Bewertung der Genfunktion bei der CD4-T-Zelldifferenzierung in vitro verwendet werden können. Die Isolierung naiver CD4-T-Zellen aus sekundären lymphatischen Organen der Maus, gefolgt von der Nukleofektion mit Cas9-gRNA-Komplexen, stellt sicher, dass das Gen-KO vor der nachgeschalteten T-Zell-Aktivierung initiiert wird, was einen strategischen Vorteil gegenüber der retroviralen gRNA-Verabreichung bietet, die typischerweise eine Präaktivierung von T-Zellen erfordert, wodurch die Bewertung von Effekten in naiven T-Zellen verhindert wird. Darüber hinaus umgeht diese auf Nukleofektion basierende Methode potenzielle Entwicklungsprobleme, die mit Gen-KO-Tieren verbunden sind.

Im Anschluss an die Cas9-gRNA-Verabreichung beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der CD4-T-Zell-Differenzierung in Th1-, Th2-, Th17- und Treg-Linien unter Verwendung von in vitro-Polarisation . Darüber hinaus ist dieses Protokoll anpassbar an die Verwendung von gengesteuerten CD4- oder CD8-T-Zellen für zahlreiche Downstream-Anwendungen, einschließlich anderer T-Zell-Aktivierungsstudien in vitro und adoptiver Transferstudien in vivo. Der Einsatz von CRISPR-Cas9-Methoden hat unsere Fähigkeit zur Bewertung der Genfunktion in T-Zellen optimiert und ermöglicht die routinemäßige KO vieler Gene von Interesse, wodurch die Forscher von den Einschränkungen befreit werden, die mit der Untersuchung von Gen-KO-Tieren verbunden sind.

Einleitung

Die Verwendung von CRISPR-basierten Technologien (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) hat unsere Fähigkeit, genomische DNA-Sequenzen zu manipulieren, verändert und unsere Fähigkeit, die Genfunktion in unzähligen biologischen Systemen zu untersuchen, erheblich verbessert. In Bezug auf CD4-T-Zellen haben sich Methoden entwickelt, die CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe verwenden, die einen effizienten Gen-Knock-out (KO) in primären naiven T-Zellen ermöglichen, der für in vitro und in vivo Studien verwendet werden kann 1,2,3,4. Die Identifizierung neuer mutmaßlicher Gene, die die Differenzierung von CD4-T-Zellen regulieren, wird häufig durch transkriptomische und epigenomische Analysen vorangetrieben und generiert neuartige Ziele, für die es nur wenige oder schwer zu beschaffende Ressourcen gibt, insbesondere wenn das Gen mehrere Gewebe betrifft und möglicherweise eine Evaluierung mit bedingten Gen-zielgerichteten Mäusen erfordert. Gen-Targeting über retrovirale Transduktion von gRNAs ^5,6 wurde zur Bewertung der Genfunktion in T-Zellen verwendet, erfordert jedoch eine T-Zell-Aktivierung für retrovirale Infektionen und kann nicht verwendet werden, um Gene in naiven T-Zellen anzugreifen. Nukleofektionsabgegebenes CRISPR-Cas9 in naiven T-Zellen bietet ein relativ kostengünstiges und schnelles alternatives Werkzeug, um neue Gene von Interesse zu validieren und abzufragen, bevor in zeitaufwändige und kostspielige Mausmodelle investiert wird.

In unserem hier beschriebenen Protokoll wird die CRISPR-Cas9-vermittelte Geneditierung unter Verwendung von rekombinanten Cas9-Proteinen durchgeführt, die mit Guide-RNA (gRNA)-Molekülen komplexiert sind, die über Nukleofektion in naive CD4-T-Zellen eingebracht werden. Die gRNA besteht aus zwei unterschiedlichen Komponenten, einer trans-aktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA) und einer CRISPR-RNA (crRNA). Funktionell erleichtern tracrRNA-abgeleitete Sequenzen die Assoziation der gRNA mit Cas9, während die crRNA-Sequenzen Spezifität für Ziel-DNA-Regionen von Interesse enthalten. Cas9-gRNA-Komplexe vermitteln gezielte Brüche doppelsträngiger DNA (dsDNA), wobei gRNAs die Sequenzspezifität der Cas9-Endonukleaseaktivität vermitteln ^7,8. Die Cas9-vermittelte Spaltung der dsDNA führt zur Geninaktivierung durch die Erzeugung von Indel-Mutationen nach nicht-homologen Endverbindungen in Zielzellen⁹. In diesem Protokoll empfehlen wir die Verwendung mehrerer gRNAs, die auf Gene von Interesse abzielen, um eine robuste KO in naiven CD4-T-Zellen zu gewährleisten.

Helfer CD4-T-Zellen sind wichtige Akteure im Immunsystem und steuern die Immunreaktionen durch die Produktion einer Vielzahl von Zytokinen, die die Funktion vieler Immunzelltypen modulieren. Nach Stimulation durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) in Gegenwart spezifischer Zytokine können sich naive CD4-T-Zellen in unterschiedliche Linien von T-Helfer (Th) CD4-T-Zellen differenzieren, einschließlich Th1, Th2, Th17 und regulatorische T-Zellen (Treg)10,11,12. Die Definition dieser unterschiedlichen CD4-T-Zelllinien ist die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren (TFs) und Zytokine, die die Abstammungslinie definieren (Abbildung 1). Die Differenzierung von CD4-T-Zellen kann unter Verwendung der In-vitro-Polarisation 13,14,15 modelliert werden, wobei naive CD4-T-Zellen, die durch den TCR aktiviert werden, in Gegenwart von linienfördernden Zytokinen und blockierenden Antikörpern verwendet werden, die eine unangemessene Übernahme der Abstammungslinie verhindern.

Die Kombination von CRISPR-Cas9-Gen-Targeting in naiven CD4-T-Zellen mit der in vitro CD4-T-Zellpolarisation bietet ein robustes System zur Bewertung der Genfunktion in diesen Zellen (Abbildung 2). Angesichts der weit verbreiteten Verfügbarkeit von Reagenzien zur Beurteilung der CD4-Differenzierung durch Durchflusszytometrie können Schlüsselaspekte der CD4-T-Zell-Differenzierung, einschließlich der TF-Expression und der Zytokinproduktion, mit den hier beschriebenen Protokollen leicht abgefragt werden. Die Identifizierung neuer Gene, die die Funktion von CD4-T-Zellen regulieren, verbessert unser Verständnis dieser Zellen, und CRISPR-Cas9-Methoden in Kombination mit In-vitro-Polarisation bieten eine robuste Modalität zur Beurteilung der Genfunktion, bevor sie sich auf Gen-KO-Mausmodelle festlegen.

Protokoll

Für alle hier beschriebenen Verfahren haben wir Wildtyp-(WT) C57/BL6J-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des NIAID (Protokoll LISB-22E) und der Animal Care and Use Committees des NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01) gehalten und behandelt.

1. Überlegungen vor dem Start

1. Auswahl von gRNA-Reagenzien
   HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Informationen zum Erhalt von vorgefertigten gRNA-Reagenzien, die auf das in diesem Protokoll verwendete Mausgenom abzielen.
   1. Suchen Sie nach dem interessierenden Gen (Table of Materials, Desired crRNAs) und wählen Sie die drei besten vordefinierten crRNAs (2-nmol-Format) aus. Darüber hinaus erhalten Sie negative Kontroll-crRNA, die parallel verwendet werden kann (Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Bildung funktioneller gRNAs erfordert die Duplexisierung von crRNA mit tracrRNA; Besorgen Sie sich ein tracrRNA-Reagenz und befolgen Sie die Schritte in Abschnitt 3.
   2. Entwerfen Sie benutzerdefinierte zielgerichtete gRNA-Sequenzen.
      HINWEIS: Das Design von benutzerdefinierten gezielten gRNA-Sequenzen liegt außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls, kann aber mit öffentlich zugänglichen Tools wie CRISPick (Table of Materials) durchgeführt werden.
2. Puffer, Medien und Geräte
   HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie kalte (4 °C) Puffer und Reagenzien.
   1. Bereiten Sie den MACS-Puffer, den FACS-Puffer, den 0,5 % Triton X-100-Puffer, 1x Permeabilisierungspuffer, das vollständige RPMI-Medium und das vollständige IMDM-Medium (Materialtabelle) vor, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, und lagern Sie es bei 4 °C.
   2. Besorgen Sie sich naive CD4-T-Zell-Isolations- und Anti-FITC-Mikrobead-Kits (Materialtabelle), bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen.
   3. Vor Beginn der Nukleofektion (Abschnitt 4) sind 5 ml vollständiges IMDM-Medium vorzuwärmen (37 °C) und mindestens 10 ml vollständiges IMDM mit IL-7 bei 5 ng/μl zu erhitzen auf 37 °C vorzubereiten (Materialtabelle). Passen Sie das Volumen des vorgewärmten Mediums nach Bedarf an, um die Zugabe von 125 μl pro Probe nach der Nukleofektion zu berücksichtigen. Das Volumen des IL-7-haltigen vollständigen IMDM wird nach Bedarf angepasst, basierend auf der Anzahl der nukleofectierten Zellen (Abschnitt 4).
   4. Bevor Sie mit der Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) beginnen, bereiten Sie das Mitomycin-C-Reagenz vor, indem Sie 4 ml steriles H₂O in das 2-mg-Fläschchen mit Mitomycin C geben (0,5 mg/ml Stammkonzentration).
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Gewebekulturhaube durch und verwenden Sie sterile aseptische Techniken.

2. Naive CD4-T-Zell-Isolierung

HINWEIS: Naive CD4-T-Zellen können durch magnetische Isolierung oder durch Zellsortierung isoliert werden. Die Reinheit durch magnetische Isolierung beträgt in der Regel 97 % und die Zellviabilität ist sehr hoch, während die elektronische Sortierung die Zellreinheit auf Kosten der Zellviabilität verbessern kann. Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine magnetische Isolation, kann aber an beide Szenarien angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass die LS-Säulen ordnungsgemäß vorbereitet sind (Materialtabelle).

1. Isolieren Sie die Milz und die Lymphknoten (Leisten-, brachial-, axial- und zervikal) von den Mäusen (hier verwendete WT C57BL/6J-Mäuse).
2. Platzieren Sie ein 70-μm-Sieb in einer 60-mm-Schale mit 5 mL vollständiger RPMI (Table of Materials) für jedes verarbeitete Gewebe. Verarbeiten Sie die Lymphknoten und die Milz in verschiedenen Gerichten, um die Ausbeute zu steigern. Reiben Sie das Taschentuch vorsichtig mit einem Kolben aus einer 3-ml-Spritze durch den Filter. Spülen Sie den Filter mit 1-3 mL Medium und überführen Sie die einzelligen Suspensionen in konische 15-ml-Röhrchen.
3. Wiederholen Sie Schritt 2.2 bei Bedarf für weitere Lymphknoten und Milzgewebe.
4. Die einzelligen Suspensionen werden bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
5. Bereiten Sie sich darauf vor, die Zellen wie folgt zu zählen.
   1. Bei Milzproben aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 1 ml ACK-Lysepuffer, inkubieren Sie 2-5 Minuten lang bei RT, fügen Sie dann 2 ml vollständiges RPMI hinzu, schleudern Sie es herunter, resuspendieren Sie es in 5 ml vollständigem RPMI und zählen Sie die Zellen.
   2. Bei Lymphknotenzellen aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren das Zellpellet in 5 ml frischem vollständigem RPMI und zählen die Zellen.
6. Für die Eingabe in das naive CD4-Isolationskit mischen Sie die Splenozyten mit Lymphknotenzellen, um die gewünschte Zellzahl für die Isolierung zu erreichen.
   HINWEIS: Typischerweise ergeben 1 × 10⁸ Lymphknoten- und Milzzellen von WT-B6-Mäusen 2-8 × 10⁶ naive CD4-T-Zellen.
7. Die gepoolten Milz- und Lymphknotenzellen werden 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet in dem entsprechenden Volumen von MACS-Puffer (Table of Materials) resuspendiert, wie im Protokoll des Herstellers angegeben (naives CD4-T-Zell-Isolationskit).
8. Befolgen Sie genau das Protokoll des Herstellers zur Isolierung naiver CD4-T-Zellen durch Negativselektion (Materialtabelle) unter Verwendung von naiven CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktails, Anti-Biotin-Mikrokügelchen und CD44-Mikrokügelchen; Verwenden Sie für diese Isolierung LS-Säulen und sammeln Sie die Zellen in konischen 15-ml-Röhrchen.
9. Nach der Isolierung werden die Zellen bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert, der Überstand entfernt, das Zellpellet in 2 ml vollständigem RPMI-Medium resuspendiert und die Zellen gezählt.
10. Lagern Sie die Zellen bei 4 °C, bis Sie mit der Nukleofektion beginnen können.

3. Bildung des Cas9-gRNA-Komplexes

HINWEIS: Bereiten Sie Negativkontrollen und genspezifische crRNA-Stämme vor. Wir skizzieren die Verwendung einer einzigartigen crRNA für negative Kontrollbedingungen und drei einzigartiger crRNAs für Gen-Targeting-Bedingungen. Die gleichzeitige Verwendung von drei verschiedenen crRNAs gewährleistet die KO der interessierenden Gene.

1. Resuspendieren Sie die crRNAs und tracrRNA mit Hilfe von Duplexpuffer auf 100 μM Stammkonzentrationen (Materialtabelle). Dies entspricht 10 μL Puffer pro 1 nmol RNA.
2. Kombinieren Sie einzelne crRNAs mit tracrRNA im Verhältnis 1:1 in sterilen PCR-Röhrchen und mischen Sie sie durch Pipettieren. In einem Thermocycler 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzen. Lassen Sie die Komplexe dann mindestens 10 Minuten lang auf einer Tischplatte auf RT abkühlen.
   HINWEIS: crRNA/tracrRNA-Duplexe werden ab diesem Zeitpunkt als gRNAs bezeichnet. Die Komplexe sind bei einer Lagerung bei -20 °C mindestens 6 Monate haltbar. In der Regel stellen wir 6 μl gRNA (3 μl crRNA + 3 μl tracrRNA) pro Lauf her, was ausreichend Material für etwa fünf Proben (1 μl/Probe) liefert.
3. Für gRNAs, die auf Gene abzielen: Fügen Sie in sterilen PCR-Röhrchen 3 μl gRNAs (je 1 μl von drei einzigartigen gRNAs pro Ziel), 1 μl Cas9-Protein und 1 μl Duplex-Puffer (insgesamt 5 μl pro Probe) hinzu. Pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen, und stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Material am Boden des Röhrchens befindet. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT. Synchronisieren Sie das Timing dieses Schritts mit der Nukleofektion (Schritte 4.1-4.2).
4. Für Negativkontroll-gRNA: In sterilen PCR-Röhrchen 1 μl gRNA, 1 μl Cas9-Protein und 3 μl Duplex-Puffer (insgesamt 5 μl pro Probe) hinzufügen. Pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen, und stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Material am Boden des Röhrchens befindet. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT. Synchronisieren Sie auch hier das Timing dieses Schritts mit der Nukleofektion (Schritte 4.1-4.2).
   HINWEIS: Die Verwendung von 50 pmol gRNA für die Negativkontrolle (im Gegensatz zu 3 x 50 pmol für den Test) ist kostengünstiger und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse.

4. Nukleofektion - Cas9-gRNA-vermittelte Genablation

1. Zentrifugieren Sie 1-8 × 10⁶ gereinigte T-Zellen bei 500 × g für 5 min, 4 °C pro Nukleofektionsprobe. Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 μl P3-Puffer (16,4 μl P3 + 3,6 μl Supplement pro Probe; Nucleofector Kit, Table of Materials) und überführen Sie die Suspension in PCR-Röhrchen, die die Cas9-gRNA-Komplexe enthalten. Mischen und in unabhängige Vertiefungen einer 16-Well-Nukleocuvette überführen (Nucleofector Kit, Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass sich beim Transfer der Zellen in die Küvette keine Blasen gebildet haben, da dies die Effizienz der Nukleofektion negativ beeinflussen kann. Klopfen Sie die Küvette gegen eine Arbeitsfläche, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Material am Boden jeder Vertiefung befindet und frei von Blasen ist.
3. Führen Sie die Nukleofektion mit dem DN100-Programm des referenzierten Nukleofektors durch (Materialtabelle). Geben Sie sofort 125 μl vorgewärmtes vollständiges IMDM-Medium in die Nukleocuvetten-Wells und überführen Sie die Zellen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie jede Vertiefung ein weiteres Mal mit 125 μl vorgewärmtem Medium aus, um die Entnahme aller Zellen zu gewährleisten.
4. Die Zellen werden 5 min lang bei 500 × g und 4 °C zentrifugiert, alle Medien entfernt und in 200 μl erwärmtem vollständigen IMDM-Medium + 5 ng/ml IL-7 resuspendiert (Materialtabelle).
5. Übertragen Sie 200 μl der Zellen auf die Kulturplatte und fügen Sie erwärmtes vollständiges IMDM-Medium + 5 ng/mL IL-7 hinzu, um das endgültige gewünschte Volumen entsprechend der Plattengröße wie folgt zu erhalten: 1-2 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung auf einer 48-Well-Platte (1 ml Medium pro Vertiefung), 2-4 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung auf einer 24-Well-Platte (1,5 ml Medium pro Vertiefung) Volumen, 4-6 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung auf einer 12-Well-Platte (2 ml Medien pro Vertiefung) und 6-10 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-Platte (4 ml Medien pro Vertiefung). Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ für 3 Tage.
   HINWEIS: Abhängig vom Proteinumsatz und dem nachgeschalteten Assay ist diese Kulturperiode zu optimieren. Wir haben eine optimale Ruhephase von 3 Tagen gefunden, die jedoch je nach Zielgen unter diesen Bedingungen auf 1 bis 7 Tage angepasst werden kann.
6. Nach der Kultur in vollständigem IMDM-Medium + 5 ng/ml IL-7 resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren und ernten Sie sie in konische 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min, 4 °C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL vollständigem RPMI-Medium.
7. Zählen Sie die Zellen, um die Anzahl der lebenden naiven CD4-T-Zellen zu bestimmen, die den interessierenden gRNA-nukleofektierten Zellen entsprechen.
   HINWEIS: Rechnen Sie bei der Nukleofektion mit einem Verlust von ~ 50% der Eingangszellen im Verlauf dieses Protokolls und passen Sie die Anzahl der verwendeten naiven CD4-T-Zellen entsprechend an. An dieser Stelle können Sie auch die Wirksamkeit des Gen-Targetings in naiven CD4-T-Zellen mit einer Vielzahl von Techniken (Durchflusszytometrie, Western Blot, qPCR oder T7EI-Assay) testen.

5. Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APC)

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Mitomycin-Reagenz vorbereitet wurde, das zur Behandlung von APCs nach der Isolierung verwendet wird (Materialtabelle). Lesen Sie vor dem Start das Anti-FITC-Protokoll des Herstellers für Mikroperlen und stellen Sie sicher, dass die LS-Säulen ordnungsgemäß vorbereitet sind (Materialtabelle).

1. Isolieren Sie Milz von WT-Mäusen, die für die APC-Isolierung vorgesehen sind.
2. Erythrozyten werden wie oben beschrieben (2.2, 2.5.1) mit ACK-Lysepuffer hergestellt, das Zellpellet in 5 ml vollständiger RPMI (4 °C) resuspendiert und die Zellen gezählt.
   HINWEIS: Nach der APC-Isolierung ist damit zu rechnen, etwa die Hälfte der Anzahl von Eingangszellen zu erhalten, z. B. ergeben 1 × 10⁸ Eingangssplenozyten ~40-50 × 10⁶ APCs. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl an Splenozyten für die Isolierung vor.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min, 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 800 μl MACS-Puffer (Materialtabelle).
4. Geben Sie je 4 μl FITC-konjugierte Anti-CD4- und Anti-CD8-Antikörper (Materialtabelle) zu den Splenozyten. Gut mischen und bei 4 °C 15 min inkubieren.
5. Die Zellen werden bei 500 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert und der Überstand entfernt. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, resuspendieren Sie die Zellen im empfohlenen Volumen an MACS-Puffer und fügen Sie die entsprechende Menge an Anti-FITC-Mikrokügelchen hinzu (Materialtabelle).
6. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 15 Minuten. Die Zellen werden bei 500 × g 5 min, 4 °C zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl MACS-Puffer und leiten Sie die Zellen durch die vorbereitete LS-Säule, wie im Protokoll des Herstellers beschrieben, wobei Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen sammeln.
7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 × g für 5 min, 4 °C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2,7 ml sterilem 1x PBS.
   HINWEIS: APCs können schlecht pelletieren; Verwenden Sie eine erhöhte Geschwindigkeit für die Zentrifugation.
8. Geben Sie 300 μl Mitomycin-C-Lösung in die Zellen, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml zu erreichen. Gut mischen und bei 37 °C im Wasserbad 30 min oder 45 min bei 37 °C, 5 % CO₂ im Inkubator inkubieren.
9. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 × g für 5 min, 4 °C und waschen sie mit 10 mL sterilem 1x PBS. Verwenden Sie ein Vakuum, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang 2x.
10. Die Zellen werden erneut bei 600 × g für 5 min, 4 °C zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet in 5 mL vollständigem RPMI-Medium (4 °C) resuspendiert. Zählen Sie die Zellen. Lagern Sie APCs bei 4 °C, bis sie für die CD4-T-Zelldifferenzierung bereit sind.

6. Differenzierung von CD4-T-Zellen

HINWEIS: Dieses Protokoll ist so eingestellt, dass Zellen in einem 48-Well-Plattenformat kultiviert werden – 2 × 10⁵ naives CD4 + 1 × 10⁶ APC pro Well – ein Verhältnis von 1:5. Die Zellen werden in kompletten IMDM-Medien kultiviert. Hier werden wir Bedingungen für die Differenzierung von Th1-, Th2-, Th17- und Treg-CD4-T-Zellen schaffen; Je nach Fokus des Benutzers können jedoch individuelle Abstammungsbedingungen ausgewählt werden.

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einer 48-Well-Platte, die verwendet werden soll, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für jeden Zelltyp benötigt werden.
   HINWEIS: Für 10 Vertiefungen wären z. B. 2 × 10⁶ naive CD4 und 10 × 10⁶ APCs erforderlich, um das Verhältnis von 1:5 aufrechtzuerhalten. Wenn die Zellzahlen es zulassen, berechnen Sie genügend Zellen für eine zusätzliche Vertiefung, um eventuelle Pipettierfehler beim Plattieren zu berücksichtigen.
2. Mischen Sie die gewünschte Anzahl an naiven CD4- und APCs im Verhältnis 1:5, zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 × g für 5 min, 4 °C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl vollständigem IMDM-Medium pro Vertiefung (z. B. Zellen, die 10 Vertiefungen in 5 mL Medien entsprechen).
3. Platten Sie 500-μl-Inkremente von Zellen in Vertiefungen einer 48-Well-Platte, wobei sichergestellt wird, dass jede Vertiefung 2 × 10⁵ naive CD4 + 1 × 10⁶ APCs enthält.
4. Für die gewünschten CD4-T-Zell-Differenzierungsbedingungen bereiten Sie 2x Zytokin + Antikörpermischungen in vollständiger IMDM vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Geben Sie 500 μl der 2x-Mischung in die zuvor plattierten 500-μl-Zellschritte, um die Endkonzentrationen der Reagenzien auf 1x zu erhöhen.
   HINWEIS: Diese Beispiele basieren auf der Herstellung von 2,5 ml 2x-Präparaten, ausreichend für fünf Vertiefungen für jede Bedingung. Auch hier gilt: Wenn die Reagenzienmengen es zulassen, nehmen Sie ein zusätzliches Inkrement von 2x Mix vor, um den Pipettierfehler zu berücksichtigen.
5. Geben Sie 500 μl 2x Zytokin + Antikörpermedien zu 500 μl CD4/APC-Zellen-haltigen Wells, um eine Endkonzentration der Reagenzien bei 1x zu erreichen.
6. Stellen Sie die 48-Well-Platte in einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂. Kultivieren Sie die Zellen 72 Stunden lang, um die CD4-Polarisation abzuschließen.
   HINWEIS: Untersuchen Sie die Platte nach der Kulturperiode, um ein robustes Wachstum zu gewährleisten. Das Medium sollte nach der Inkubation orange sein, wobei das gelbe Medium auf eine mögliche Zellüberwucherung hinweist.

7. Bewertung des Einflusses der Genablation auf die Differenzierung von CD4-T-Zellen

HINWEIS: Bereiten Sie für alle Färbeschritte einen Mastermix aus Antikörpern vor, die in der entsprechenden Verdünnung zum erforderlichen Färbepuffer hinzugefügt werden. Pro Probe wird ein Volumen von 50 μl des Antikörper-Puffer-Cocktails verwendet. Passen Sie die spezifischen Antikörper an, die auf der Grundlage des Experiments verwendet werden. Die Benutzer sollten Antikörper-Panels auswählen, die für ihre spezifischen Experimente relevant sind. Hier stellen wir eine Vorlage zur Verfügung, mit der man sich dem im Kontext der hier anvisierten Gene nähern kann.

1. Nach der CD4-Differenzierung werden vorsichtig 600 μl des Überstands entfernt und die Zellen in jeder Vertiefung durch Pipettieren resuspendiert.
2. Entnehmen Sie 200 μl der Zellen aus jeder Vertiefung und geben Sie sie zur Färbung des Transkriptionsfaktors auf eine markierte 96-Well-Platte. Die Proben werden pelletiert, indem sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 × g geschleudert werden, den Überstand abziehen und mit der Oberflächenfärbung fortfahren (Schritt 7.5).
3. Für die Zytokinanalyse werden die verbleibenden 200 μl der Zellen mit PMA (50 ng/ml), Ionomycin (500 ng/ml) und Golgi Stop (1/2.000 Verdünnung) in vollständiger IMDM restimuliert. Geben Sie 200 μl der 2x Restimulationsmischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ für 4 h.
   HINWEIS: In der 48-Well-Platte sollten noch 200 μl verbleiben. Daher wird durch Zugabe von 200 μl der 2x-Mischung aus PMA (2x, 100 ng/ml), Ionomycin (2x, 1 μg/ml) und Golgi Stop (2x, 1/1.000) eine Endkonzentration von 1x erreicht (Tabelle der Materialien).
4. Beginnen Sie in der Zwischenzeit mit der Färbung des Transkriptionsfaktors. Führen Sie eine Oberflächenantigenfärbung durch, indem Sie die Zellen in 50 μl FACS-Puffer resuspendieren, der die gewünschten Fluorochrom-konjugierten Antikörper pro Probe enthält (Tabelle 2). Im Dunkeln bei 4 °C 30 min inkubieren.
5. Geben Sie 150 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung, um den Färbepuffer abzuwaschen. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Schnippen Sie den Überstand ab. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen.
6. Fixieren Sie die Zellen mit 100 μl Foxp3-Fixierlösung (Table of Materials) im Dunkeln bei RT für 25 min.
7. Geben Sie nach 25 Minuten 100 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung, um das Fixiermittel abzuwaschen. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand abschnippen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen.
8. Führen Sie eine intrazelluläre Färbung durch, indem Sie die Zellen in 50 μl 1x Foxp3-Permeabilisierungspuffer mit direkt konjugierten Transkriptionsfaktor-spezifischen Antikörpern pro Probe (Tabelle 2) für mindestens 1 h bei 4 °C im Dunkeln resuspendieren.
9. Nachdem die intrazelluläre Färbung abgeschlossen ist, geben Sie 100 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand abschnippen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 200 mL für die Durchflusszytometrie.
10. Nach der Restimulation von PMA/Ionomycin/Golgi Stop resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren und übertragen Sie 400 μl jeder Zytokinprobe in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Proben werden bei 500 × g 5 min bei 4 °C pelletiert und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie die Zellproben in 100 μl FACS-Puffer und überführen Sie sie zur Oberflächenfärbung auf eine 96-Well-Platte. Die Proben werden erneut pelletiert, indem sie bei 500 × g 5 min bei 4 °C geschleudert werden, und den Überstand abschnippen.
11. Bereiten Sie einen Oberflächenfärbecocktail mit FACS-Puffer vor, der fluoreszierende Antikörper enthält, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind (Tabelle 2). Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl Färbepuffer pro Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln.
12. Geben Sie 150 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung, um den Färbepuffer abzuwaschen. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Schnippen Sie den Überstand ab. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen.
13. Fixieren Sie die Zellen in 100 μL 4% PFA (Table of Materials) im Dunkeln bei RT für 25 min.
14. Geben Sie 100 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung, um das Fixiermittel abzuwaschen. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Schnippen Sie den Überstand ab. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen.
15. Führen Sie eine intrazelluläre Zytokinfärbung durch, indem Sie die Zellen in 50 μl Antizytokin-Antikörper mit 0,5 % Triton X-100-Färbepuffer pro Probe (Tabelle 2) für mindestens 1 h bei 4 °C im Dunkeln resuspendieren.
16. Nachdem die intrazelluläre Färbung abgeschlossen ist, geben Sie 100 μl FACS-Puffer in jede Vertiefung. Die Platte bei 500 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand abschnippen. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 200 mL für die Durchflusszytometrie.
17. Analysieren Sie den Transkriptionsfaktor und die mit Zytokinen gefärbten Proben mittels Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Die erwarteten Durchflusszytometrie-Profile der skizzierten Färbepanels werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" angezeigt.

Ergebnisse

Um zu validieren, dass eine reine Population naiver CD4-T-Zellen mit unserem Protokoll (Abschnitt 2) erhalten wurde, verwendeten wir Durchflusszytometrie, um diese Zellen vor und nach der magnetischen Isolierung zu identifizieren. Mit unserem Ansatz erhielten wir nach der Isolierung eine hochreine Population von lebenden CD4⁺TCRb⁺CD25-CD44-CD62L⁺ naiven CD4-T-Zellen (Abbildung 3A). Um zu bestätigen, dass Cas9-gRNA-Komple...

Diskussion

Die Integration von Protokollen zur Verabreichung von CRISPR-Cas9-Komplexen in naive CD4-T-Zellen mit Methoden zur Untersuchung der CD4-T-Zelldifferenzierung bietet ein robustes Werkzeug zur Erforschung neuartiger Gene, die die CD4-T-Zellbiologie regulieren. Hier finden Sie einen umfassenden Leitfaden für die Verwendung kommerziell erhältlicher Cas9- und gRNA-Reagenzien, mit denen Sie einfach arbeiten können. Die Nukleofektion-vermittelte Verabreichung von Cas9-gRNA-Komplexen in naive CD...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5 M EDTA, pH = 8,0	IPM Scientific	11005-016
16 % Paraformaldehyd, PFA	Elektronenmikroskopie Sciences	15710	Mit PBS verdünnen, um 4 % PFA-Fixierlösung herzustellen
1x eBioscience Puffer (1x Permeabilisierungspuffer)	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00	Permeabilisierungspuffer aus dem Kit verwenden, um 1x Lösung
herzustellen 1x PBS, pH = 7,4	Qualität Biologisch	114-058-101
2-Mercaptoethanol (1000x)	Gibco	21985-023
4D Nucleofector Core Unit	Lonza	AAF-1003B
4D Nucleofector X Unit	Lonza	AAF-1003X
60 mm	Schüssel Falcon	353002
70 µ m Nylon-Mesh-Sieb	Fisherbrand	22363548
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-01
Amaxa P3 Primärzelle 4D-Nukleofector X Kit Lonza		V4XP-3032	Dieses Kit enthält: P3 Primary Cell Solution, Supplement 1 und 16-Well-Nukleocuvetten-Streifen
Anti-FITC-Mikrokügelchen	Miltenyi Biotec	130-048-701	Befolgen Sie das Miltenyi Anti-FITC-Mikrokügelchen-Protokoll
Anti-Maus CD28 (37.51)	bioXcell	BE0015-1	siehe Tabelle 1 zur Stammkonzentration
Anti-Maus CD3e (145-2C11)	bioXcell	BE0001-1	siehe Tabelle 1 zur Stammkonzentration
Anti-Maus IFNγ (XMG1.2)	bioXcell	BE0055	siehe Tabelle 1 für die Stammkonzentration
gegen Maus IL-12p40 (C17.8)	bioXcell	BE0051	siehe Tabelle 1 für die Stammkonzentration
gegen Maus IL-4 (11B11)	bioXcell	BE0045	siehe Tabelle 1 für die Stammkonzentration
BioLite 48-Well Mutlidish	Thermo Fisher Scientific	130187
Rinderserumalbumin, BSA	Sigma Life Science	A3059
Cas9 Enzym	IDT	1081059	Alt-R S.p. Cas9 Nuklease V3 (10mg/ml) - enthält die Kernlokalisierungssequenz
Vollständiges IMDM + IL-7 Medium			Vollständiges IMDM mit 5 ng/mL IL-7
Complete IMDM Medium			IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Pen/Strep, 0,1% BME
Vollständiges RPMI Medium			RPMI-1640, 10 % FBS, 1 % L-Glutamin, 1 % Pen/Strepto, 0,1 % BME
CRISPick			https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
Erwünschte crRNAs	IDT		Verwendet von der IDT-Website: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN
eBioscience FOXP3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00	Das Kit enthält drei Reagenzien: Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat (4x), Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel und Permeabilisierungspuffer (10x)
FACS-Puffer			1x PBS, 1% FBS, 1 mM EDTA
Fötales Rinderserum (FBS)	VWR Seradigm Life Science	97068-085	Hitze vor Gebrauch inaktivieren (erwärmen auf 56°; C für 45 Minuten)
FITC Anti-Maus CD4 (RM4-5)	Biolegend	100510	1/200 Verdünnung (0,5 mg/ml Stammkonzentration)
FITC Anti-Maus CD8α (53-6,7)	Biolegend	100706	1/200 Verdünnung (0,5 mg/ml Stammkonzentration)
Golgi Stop	BD Biosciences	51-2092KZ	1/2000 Verdünnung
IMDM (1x) + GlutMAX-1 Medien	Gibco	31980-030
Ionomycin Calciumsalz aus Streptomyces conglobatus (1 mg/ml)	Sigma Aldrich	10634	Empfohlene Endkonzentration von 500 ng/mL
L-Glutamin 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
LS Säulen	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Puffer			1x PBS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, Filter sterilisiert
Mitomycin C (0,5 mg/ml)	Millipore Sigma	M4287-2MG
Maus Naï ve CD4 T-Zell-Isolationskit	Miltenyi Biotec	130-104-453	Miltenyi Naï folgen; ve CD4-T-Zell-Isolationsprotokoll. Dieses Kit enthält Naï ve CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail, Anti-Biotin-Mikrokügelchen und CD44-Mikrokügelchen
Negativkontrolle	crRNA IDT	1072544	Alternative zur Entwicklung eigener
Duplex-Puffer	IDT	1072570 PCR-Röhrchenstreifen
	USA Scientific	1402-2700
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-023
Phorbol 12-Myristat-13-acetat, PMA (100 & Mikro; g/mL)	Sigma Aldrich	P8139	Empfohlene Endkonzentration von 50 ng/mL
ProSeries High Performance 15mL Zentrifugenröhrchen	Alkali Scientific	PS5600	15 mL konische Röhrchen
rekombinant human (h) IL-2	Peprotech	200-02	siehe Tabelle 1 für die Stammkonzentration
rekombinant human TGF-b1 (HEK293 abgeleitet)	Peprotech	100-21	siehe Tabelle 1 für Stock Konzentration
rekombinant murin IL-12p70	Peprotech	210-12	siehe Tabelle 1 für Stammkonzentration
rekombinant murine IL-4	Peprotech	214-14	siehe Tabelle 1 für Stammkonzentration
rekombinant murin IL-6	Peprotech	216-16	siehe Tabelle 1 für Stammkonzentration
rekombinant murin IL-7	Peprotech	217-17	Aufbereitung bei 100 ng/ml
RPMI 1640 Medien	Gibco	21870-076
Thermocycler	Angewandte Biosysteme	4375786	Wir verwenden dieses Thermocycler-Modell, jedoch funktioniert jedes ähnliche Gerät gut in diesem Protokoll
tracrRNA Atto550 markiert	IDT	1075928	Ermöglicht den Nachweis von Cas9-gRNA-Komplexen nach Nuceloefektion unter Verwendung von Atto550-Fluoreszenz als Auslese. Wir empfehlen dieses Reagenz, wenn möglich.
Triton-X Puffer			1x PBS, 0,5% TritonX-100, 0,1% BSA
TritonX-100	BioRad	161-0407
unmarkierte tracrRNA	IDT	1072534	Eine kostengünstigere tracrRNA-Option, die jedoch keine Bewertung der Nuzelofektionseffizienz von Cas9-gRNA-Komplexen ermöglicht
Veriti Thermal Cycler, 96 Well Fast	Thermo Fisher Scientific	4375305	Wir verwenden dieses Thermocycler-Modell, aber jedes ähnliche Gerät funktioniert in diesem Protokoll gut.