Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

1.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/67389

⸱

20. Dezember 2024

 ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide/JA, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Live-Bildgebung der asymmetrischen Teilung von Keimbahnstammzellen (GSCs) in der ovariellen Nische von Drosophila durchzuführen. Wir verwenden eine transgene Linie, die ubiquitär eine grün fluoreszierende Protein (GFP)-Fusion des Spektrosomproteins Par-1 exprimiert.

Zusammenfassung

Live-Bildgebungsverfahren ermöglichen die detaillierte Analyse dynamischer zellulärer Prozesse in Echtzeit. Der Drosophila-Eierstock stellt ein hervorragendes Modell dar, um die Dynamik einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen wie Zellteilung, Stammzellbildung, Differenzierung, Migration, Apoptose, Autophagie, Zelladhäsion usw. im Laufe der Zeit zu erforschen. Vor kurzem haben wir eine erweiterte ex vivo-Kultur und Live-Bildgebung der weiblichen Drosophila-GSC-Nische implementiert. Am Beispiel einer Drosophila-Linie, die ein GFP::P ar-1-Transgen beherbergt, ermöglicht diese Methode die Visualisierung der asymmetrischen Teilung der GSCs innerhalb ihrer Nische und die Beschreibung der Veränderungen in der Spektrosomenmorphologie entlang des Zellzyklus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die ex vivo-Kultur von Drosophila germaria vor, das eine längere Visualisierung der weiblichen GSC-Nische ermöglicht. Wichtig ist, dass dieses Protokoll auf breit angelegte lebende GSCs mit mehreren fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse anwendbar ist, die in Stock-Centern und/oder in der Drosophila-Forschungsgemeinschaft verfügbar sind.

Einleitung

Live-Bildgebung biologischer Prozesse ist entscheidend für die Erlangung direkter experimenteller Beweise. Die Kombination aus fortschrittlicher konfokaler Mikroskopie und der Optimierung der Methoden ermöglicht die Erforschung mehrerer biologischer Ereignisse mit hoher Präzision. Die Optimierung von Protokollschritten wie Gewebemanipulation und -dissektion, Probenvorbereitung und -konservierung sowie Einstellungen für die Mikroskopieerfassung ist entscheidend, um die Zuverlässigkeit und Robustheit der erzielten Ergebnisse zu maximieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung von Proben für die erweiterte Bildgebung vor, das sich speziell auf die Eierstöcke von Drosophila melanogaster konzentriert. Der Ovarial von Drosophila melanogaster ist ein hervorragendes Modellsystem für die Analyse einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen. Dieses Fortpflanzungsorgan der Fruchtfliege Drosophila melanogaster enthält neben vielen anderen eine sehr gut definierte adulte Stammzellnische. Diese GSC-Nische unterstützt die Entwicklung der weiblichen Gameten im Erwachsenenalter. Die Eierstöcke der Drosophila bestehen aus etwa 18 Eierstöcken, in denen sich im Germarium Eikammern entwickeln. In der Spitze jedes Germariums befinden sich 2-4 GSCs in einer somatischen zellulären Nische, die hauptsächlich aus einem terminalen Filament von 8-10 Zellen, einer Rosette von 5-8 Kappenzellen und 2-3 vorderen Begleitzellen besteht (Abbildung 1A). Diese somatische Nische versorgt die GSCs mit wesentlichen Signalen und physischer Unterstützung, um ihre Stammheit zu erhalten, die Proliferation zu kontrollieren und Differenzierung zu verhindern1,2,3,4,5.

Die GSCs teilen sich normalerweise asymmetrisch, um eine neue Stammzelle zu erzeugen, die Kontakt mit der somatischen Nische hält, und eine Tochterzelle, den Cystoblast (CB), der den direkten Kontakt mit den somatischen Kapzellen verliert und sich differenziert. GSCs und CBs enthalten eine hochdynamische und zytoplasmatische Organelle, das Spektrosom, dessen Hauptfunktion die korrekte Ausrichtung der mitotischen Spindel während der Mitose ist6. Das CB teilt sich 4-mal mit unvollständiger Zytokinese, um 16-zellige Zysten zu entwickeln, wobei eine der Keimbahnzellen in die Eizelle spezifiziert wird und die anderen 15 Zellen zu Ammenzellen werden. Das CB-Spektrosom wächst zu einer verzweigten Struktur heran, die als Fusom bezeichnet wird und die 16-zelligen, miteinander verbundenen Keimbahnzellen verbindet. Das Spektrosom ist mit kleinen Vesikeln und Skelettproteinen wie der Serin-Threonin-Kinase Par-1 und der Membrankomponente Hu-li tai shao (Hts)7 angereichert. Während des GSC-Zellzyklus wächst das Spektrosom durch die Zugabe von neuem Material und ändert seine Form, was die Identifizierung der Phasen G1, S, G2 und M ermöglicht (Abbildung 1B)8,9.

Wir haben kürzlich eine ex vivo Kulturmethode des Drosophila germarium implementiert, die die Bildgebung von lebenden GSCs für bis zu 16 Stunden ermöglicht. Da sich diese Zellen durchschnittlich alle 15,5 h teilen8, ermöglicht diese Methode das Filmen großer Teile des GSC-Zellzyklus. In Kombination mit anderen Werkzeugen hat unsere Kultivierungsmethode die Beschreibung der Spektrosomenmorphologie während des GSC-Zellzyklus und die Analyse der Dauer der verschiedenen Zellzyklusphasen in vivo ermöglicht8 (Abbildung 1C). Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll dieses erweiterten Live-Imaging-Verfahrens zur Verfügung, das durch ein Schritt-für-Schritt-Video unterstützt wird, das die Methodik beschreibt (Abbildung 2).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Schritt 1.4 muss mindestens 2 Tage im Voraus durchgeführt werden. Die Schritte 2.1 und 2.2 können 1 Tag im Voraus durchgeführt werden.

1. Aufbau vor dem Versuch I

  1. Bereiten Sie 100 μl Aliquots einer Streptomycin/Penicillin-Antibiotikamischung (10.000 μl/ml Penicilin und 10 mg/ml Streptomycin) vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
  2. Bereiten Sie 15 ml der folgenden Lösungen mit autoklaviertem Reinwasser vor, lagern Sie sie bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb eines Monats: Natriumbicarbonat (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 und 0,1 % Tween 20.
  3. Bereiten Sie das folgende Kulturmedium und die Lösung in einer Laminar-Flow-Haube vor, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie sterilisierte Filterspitzen und -schläuche.
    1. Bereiten Sie 2 ml Aliquots unverdünntes fötales Rinderserum (FBS) vor und lagern Sie es bei -20 °C, bis es unter aseptischen Bedingungen verwendet wird.
    2. Bereiten Sie Schneider's Drosophila-Medium zu, das mit 15 % FBS und 0,6 % Streptomycin/Penicillin-Antibiotika-Mix ergänzt wird. 7 ml Aliquots vorbereiten und bei 4 °C lagern. Ein Aliquot reicht für zwei MatTek-Platten (siehe Abschnitt 2).
      1. Bereiten Sie die Ringer-Lösung vor (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35,5 mM Saccharose, 5 mM Hepes in autoklaviertem reinem Wasser; pH 6,9). Bereiten Sie 1 ml Aliquots vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
  4. Sammeln Sie 1-2 Tage alte Fliegen, die das mit GFP fusionierte Par-1-Protein konstitutiv und ubiquitär exprimieren (Poly Ubiquitin-mGFP6::p ar-1-Linie), in ein neues Röhrchen mit Fliegenfutter, das mit Hefepulver ergänzt wird. Kultivieren Sie sie 2 Tage lang bei 25 °C in einem Inkubator, bevor Sie sie sezieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann mit jedem fluoreszierend markierten Reporter von Interesse durchgeführt werden.

2. Beschichtung und Vorbereitung der Glasbodenplatte

  1. Geben Sie einen 3 μL-Tropfen eines speziellen Cell-Tak-Klebstoffs (im Folgenden als Zell- und Gewebekleber bezeichnet) in die Mitte des Deckglases einer 35 mm Poly-D-Lysin-beschichteten Platte (Glasbodenschale, siehe Materialtabelle) ohne manuelles Verteilen. Verwenden Sie sterile Spitzen.
    HINWEIS: Der Zell- und Gewebekleber sollte bei 4 °C gelagert werden. Bei Experimenten mit zwei genetischen Bedingungen (typischerweise Kontroll- und Mutantenbedingungen) werden zwei einzelne, gut voneinander getrennte Tropfen des Klebstoffs in dieselbe Glasbodenplatte gegeben. Dadurch wird sichergestellt, dass beide genetischen Hintergründe unter den gleichen Bedingungen abgebildet werden.
  2. Geben Sie unmittelbar danach ein gleiches Volumen (3 μl in diesem Protokollaufbau) von 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 vorsichtig in den 3 μl Klebetropfen, wie vom Hersteller empfohlen, und mischen Sie es durch Pipettieren.
  3. Für eine vollständige Verdunstung die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und dann über Nacht bei 4 °C aufbewahren, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Alternativ können Sie die vorbereitete Platte bei 37 °C 25 Minuten lang bis zur vollständigen Verdampfung inkubieren und direkt zum nächsten Schritt übergehen. Pflegen Sie in beiden Fällen die Platte mit ihrer Abdeckung. Verwenden Sie sterile Spitzen.
  4. Lassen Sie die vorbereitete Glasbodenschale RT erreichen, indem Sie sie vor Gebrauch 15-20 Minuten auf die Bank stellen.
  5. Waschen Sie den vorbereiteten Teller 3 Mal sorgfältig. Vermeiden Sie es, die Klebeschicht(en) zu berühren und zu stören. Fügen Sie bei jeder Wäsche 6 μl autoklaviertes Reinwasser hinzu und entfernen Sie das Wasser dann mit einer sauberen Spitze für jede der drei Wäschen, um Rückstände der NaHCO3-Lösung zu entfernen.
  6. Lassen Sie das Wasser vollständig verdunsten, indem Sie die saubere und vorbereitete Platte unter RT stellen und 5-10 Minuten lang mit aufgesetztem Deckel präparieren, um Staubpartikel zu vermeiden.

3. Drosophila-Ovarialdissektion und Isolierung und Montage von Ovariolen

HINWEIS: Die Eierstockdissektion wird in Ringer-Lösung (anstelle von Schneiders Medium) ohne FBS durchgeführt, um das Vorhandensein von Proteinen zu verhindern, die das Anhaften des Probengewebes am Klebstoff beeinträchtigen könnten.

  1. Reinigen Sie eine Disparierschale mit drei Vertiefungen, eine Pinzette und Präpariernadeln mit 70 % Ethanol, bevor Sie beginnen.
  2. Geben Sie in jede der drei Vertiefungen ein ausreichendes Volumen (~200 μL) Ringer-Lösung.
  3. Präparieren Sie die Eierstöcke von 5 mit Hefe gefütterten Weibchen in 200 μl Ringer-Lösung in der ersten Vertiefung mit Hilfe von zwei Pinzettenpaaren nach den üblichen Verfahren10,11. Fassen Sie das Drosophila-Weibchen an der Schnittstelle von Brustkorb und Bauch mit einer der Pinzetten. Reißen Sie dann vorsichtig die Nagelhaut am hinteren Bauch ab und ziehen Sie an der Nagelhaut des Bauches, bis die beiden Eierstöcke freiliegen.
  4. Übertragen Sie die präparierten Eierstöcke in die zweite Vertiefung, um die Kontamination mit Resten anderer Gewebe oder Ablagerungen aus der Sektion zu reduzieren.
  5. Entfernen Sie die Muskelhülle von 15-20 Eierstöcken mit Hilfe eines Stereomikroskops (Zoom 8X-13,5X) mit Leuchtdiodenbeleuchtung (LED) und Feinpunktzange. Verwenden Sie eine Pinzette, um den gesamten Körper des Eierstocks zu verankern, und verwenden Sie die zweite, um eine Eikammer im späten Stadium sanft zu greifen und sanft zu dehnen, bis der Muskel bricht und zurückbleibt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Schädigung der Germaria zu vermeiden, indem der Kontakt mit diesem Teil der Eierstöcke reduziert wird. Entfernen Sie Eikammern, die älter als die Stadien 8-9 sind.
  6. Übertragen Sie die 15-20 muskelscheidenfreien Ovariolen nacheinander mit der Pinzette in die dritte Vertiefung mit 200 μl Ringer-Medium.
  7. Befeuchten Sie eine 20-200 μl Spitze durch Pipettieren mit 0,1 % Tween 20. Dadurch wird die Adhäsion der Eierstöcke an den Kunststoffwänden der Spitze verhindert.
  8. 6 μl der Ringer-Lösung, die die muskelscheidenfreien Ovariolen enthält, werden mit einer vorbenetzten Spitze auf die vorbereitete Klebeplatte (bei RT aufbewahrt) übertragen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen der Spitze und der Klebeschicht, um eine Ablösung der Keime nach der Ovariolenablagerung zu verhindern (nächster Schritt). Etwa 30% der Germarien haften nicht wie erwartet.
  9. Um sicherzustellen, dass die übertragenen Ovariolen auf der Klebefläche haften, drücken Sie sie mit einer Präpariernadel oder Pinzette vorsichtig bis zum Boden des Ringer-Tropfens, bis sie die Klebefläche berühren.
    HINWEIS: Versuchen Sie nicht, die Eierstöcke neu anzuordnen, sobald sie sich gesetzt haben.
  10. Füllen Sie die MatTek-Platte vorsichtig mit 3 ml Schneider-Medium, ergänzt mit der Antibiotikamischung aus 15 % FBS und 0,6 % Streptomycin/Penicillin (Schritt 1.3). Um das Ablösen der Eierstöcke zu verhindern, geben Sie langsam 1 ml auf einmal um den äußeren Rand der Platte herum.
  11. Transportieren Sie die Platte mit den muskelscheidenfreien Ovariolen auf einer ebenen Fläche zur Mikroskopstation.

4. Live-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop

  1. Setzen Sie die Platte auf das 63x-Objektiv eines Spinning-Disk-Mikroskops oder eines Konfokalmikroskops (ähnliche Geräte können verwendet werden) und fokussieren Sie die Probe. Wählen Sie die mittlere Z-Ebene für jedes Germarium aus.
  2. Konfigurieren Sie die folgenden experimentellen Parameter: Aufnahmetyp: 3D-Zeitraffer, Einstellung der Laserleistung von 70/100, Anregungswellenlänge: 488 nm, Bereich des Z-Stapels: 30 μm und Abstand zwischen den Z-Stapeln: 1,2 μm, Dauer: 17 h, Intervall zwischen den Zeitpunkten: alle 10 min.
  3. Falls verfügbar, definieren Sie mit einer Option für mehrere Positionen die XY-Koordinaten der Samples neu und wählen Sie eine Z-Ebene in der Mitte jedes Germariums, da die Z-Stapel in dieser Position zentriert werden. Starten Sie die Akquise.
    HINWEIS: Da die normale Breite eines Germariums 30 μm beträgt, besteht jeder Z-Stapel aus ~25-27 Abschnitten. Je nach Konfokal können innerhalb der 10-Minuten-Intervalle mindestens 25 Germarien abgebildet werden. Normalerweise werden planapokorrigierte Objektive mit 40x/1,30 NA oder 63x/1,40 NA Ölimmersion verwendet.
  4. Analysieren Sie die Bilder in der Zeit und auf der Z-Achse, um spezifische Änderungen in der Spektrosomenmorphologie mit der Software Imaris oder ImageJ (Fidschi) zu visualisieren12,13. Spezifische Zeiten ihrer Beobachtung werden angezeigt (Abbildung 1B"). Um die Filme zu mounten, wählen Sie manuell die beste Z-Ebene zu jedem Zeitpunkt aus.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Mit diesem erweiterten Live-Imaging-Protokoll können wir die asymmetrische Mitose weiblicher GSCs innerhalb ihrer Nische ohne erkennbare biologische Störungen aufzeichnen. Dazu verwenden wir Keimleisten, die ubiquitär das GFP::Par-1-Protein exprimieren, welches fünf unterschiedliche Spektrosom-Morphologien während des GSC-Zellzyklus unterscheidbar macht: Rund, Stopfen, Stab, Verschmelzung und Ausrufezeichen (Abbildung 1B,C). Detaillierter beobachteten wir, dass das starke GF...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die GSC-Nische von Drosophila melanogaster über einen längeren Zeitraum von bis zu 16 Stunden zu überwachen. Die meisten Protokolle zur Ex-vivo-Folterung biologischer Prozesse von Drosophila konzentrieren sich auf kürzere Zeitfenster, und mehrere Beispiele finden sich für imaginale Flügelscheiben 15,16,17, embryonale Gonaden 18,19

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Acaimo González Reyes und María Olmedo López für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Diese Studie wurde unterstützt durch PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" von der Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" von der VI. und VII. PPIT-Universität Sevilla (P. R-R) und "Contrato de Acceso de I+D+i" von der VI. PPIT-Universität Sevilla (P. R-R). Wir danken der Company of Biologists Ltd für die freundliche Bereitstellung von Rechten zur Weitergabe von Bildern, die von der Originalveröffentlichung (doi:10.1242/DEV.199716) angepasst wurden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
9-Well-GlasplatteCorning 7220-85n/a
Calciumchlorid-DihydratSigma AldrichC3881CaCl2· 2H2O; Zur Herstellung von Ringer-Lösung
Cell-TakCorning 354240Zell- und Gewebeklebstoff Zum Befestigen von Zellen oder Gewebeschnitten an vielen Arten von Oberflächen, einschließlich Kunststoff, Glas, Metall, FEP-Polymer und biologischen Materialien.
Dumont #5 Pinzette Finescience11252-20n/a
Dumont #55 Pinzette Finescience11255-20Abmessungen 0,05 mm x 0,02 mm und Länge 11 cm
Fötales RinderserumGibco10500-064Qualifiziert, hitzeinaktiviert, EU-zugelassen, Südamerika Herkunft 
GlasbodenschalenMatTekP35GC-1.5-10-C35 mm Schale, Nr. 1.5 Deckglas, 10 mm Glasdurchmesser,  Poly-D-Lysin-beschichtetes
HEPESSigma AldrichH4034Zur Herstellung von Ringer-Lösung
Magnesiumchlorid Sigma AldrichM1028MgCl2; Zur Herstellung von Ringer's
Solution NadelhalterRoboz RS-6061Leichter, hohler Griff aus rostfreiem Stahl; 4 3/4" lang.
Nikon SMZ18 Fernglas Nikonhttps://www.microscope.
healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210.000 U/ml
KaliumchloridSigma AldrichP3911KCl; Zur Herstellung von Ringer's Lösung
Schneider's Drosophila MediumBiowest L0207Zellkulturmedium für Insektenzellen
NatriumbicarbonatSigma AldrichS8875 NaHCO3; ≥ 99,5%, Pulver
NatriumchloridSigma AldrichS9888NaCl; Zur Herstellung der Ringer-Lösung
SaccharoseSigma AldrichS9378≥ 99,5 % (GC); Zur Herstellung von Ringer-Lösung
Wolfram-DissektionsnadelRoboz RS-60640,25 mm, ultrafein, 1 Mikron Spitze (Pk 10)
Tween 20Sigma AldrichP9416für die Molekularbiologie, viskose flüssige
HefepulverSigma Aldrich51475n/a

Referenzen

  1. Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).
  2. Drummond-Barbosa, D. Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster. Genetics. 213 (1), e234(2019).
  3. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
  4. Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila. PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).
  5. Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair. Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).
  6. Deng, W., Lin, H. Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila. Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).
  7. Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila. Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).
  8. Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division. Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).
  9. De Cuevas, M., Spradling, A. C. Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification. Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).
  10. Wong Li, C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. (1), 52(2006).
  11. Merkle, J. A. Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries. Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).
  12. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  13. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 95(2020).
  14. Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown. Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).
  15. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  16. Dye, N. A. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).
  17. Sohr, A., Du, L., Roy, S. Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay. Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).
  18. Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).
  19. Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. J Vis Exp. 91, e51868(2014).
  20. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).
  21. Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis. Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).
  22. Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila. Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).
  23. Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics. Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).
  24. Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  25. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  26. Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).
  27. Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline. Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).
  28. Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila. Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).
  29. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).
  30. Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).
  31. Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals. Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).
  32. Lin, H., Spradling, A. C. Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria. Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Drosophila-KeimbahnStammzellnischeEx-vivo-KulturKeimbahnstammzellenasymmetrische TeilungSpectrosom-DynamikKonfokalmikroskopieFluoreszenzprotein-MarkierungZellzyklusanalyse
Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.