Erweiterte Live-Bildgebung von weiblichen Drosophila melanogaster Keimbahn-Stammzellnischen

Live-Bildgebung biologischer Prozesse ist entscheidend für die Erlangung direkter experimenteller Beweise. Die Kombination aus fortschrittlicher konfokaler Mikroskopie und der Optimierung der Methoden ermöglicht die Erforschung mehrerer biologischer Ereignisse mit hoher Präzision. Die Optimierung von Protokollschritten wie Gewebemanipulation und -dissektion, Probenvorbereitung und -konservierung sowie Einstellungen für die Mikroskopieerfassung ist entscheidend, um die Zuverlässigkeit und Robustheit der erzielten Ergebnisse zu maximieren. Hier stellen wir ein Protokoll zur Überwachung von Proben für die erweiterte Bildgebung vor, das sich speziell auf die Eierstöcke von Drosophila melanogaster konzentriert. Der Ovarial von Drosophila melanogaster ist ein hervorragendes Modellsystem für die Analyse einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen. Dieses Fortpflanzungsorgan der Fruchtfliege Drosophila melanogaster enthält neben vielen anderen eine sehr gut definierte adulte Stammzellnische. Diese GSC-Nische unterstützt die Entwicklung der weiblichen Gameten im Erwachsenenalter. Die Eierstöcke der Drosophila bestehen aus etwa 18 Eierstöcken, in denen sich im Germarium Eikammern entwickeln. In der Spitze jedes Germariums befinden sich 2-4 GSCs in einer somatischen zellulären Nische, die hauptsächlich aus einem terminalen Filament von 8-10 Zellen, einer Rosette von 5-8 Kappenzellen und 2-3 vorderen Begleitzellen besteht (Abbildung 1A). Diese somatische Nische versorgt die GSCs mit wesentlichen Signalen und physischer Unterstützung, um ihre Stammheit zu erhalten, die Proliferation zu kontrollieren und Differenzierung zu verhindern^1,2,3,4,5.

Die GSCs teilen sich normalerweise asymmetrisch, um eine neue Stammzelle zu erzeugen, die Kontakt mit der somatischen Nische hält, und eine Tochterzelle, den Cystoblast (CB), der den direkten Kontakt mit den somatischen Kapzellen verliert und sich differenziert. GSCs und CBs enthalten eine hochdynamische und zytoplasmatische Organelle, das Spektrosom, dessen Hauptfunktion die korrekte Ausrichtung der mitotischen Spindel während der Mitose ist⁶. Das CB teilt sich 4-mal mit unvollständiger Zytokinese, um 16-zellige Zysten zu entwickeln, wobei eine der Keimbahnzellen in die Eizelle spezifiziert wird und die anderen 15 Zellen zu Ammenzellen werden. Das CB-Spektrosom wächst zu einer verzweigten Struktur heran, die als Fusom bezeichnet wird und die 16-zelligen, miteinander verbundenen Keimbahnzellen verbindet. Das Spektrosom ist mit kleinen Vesikeln und Skelettproteinen wie der Serin-Threonin-Kinase Par-1 und der Membrankomponente Hu-li tai shao (Hts)^{7 angereichert}. Während des GSC-Zellzyklus wächst das Spektrosom durch die Zugabe von neuem Material und ändert seine Form, was die Identifizierung der Phasen G1, S, G2 und M ermöglicht (Abbildung 1B)^8,9.

Wir haben kürzlich eine ex vivo Kulturmethode des Drosophila germarium implementiert, die die Bildgebung von lebenden GSCs für bis zu 16 Stunden ermöglicht. Da sich diese Zellen durchschnittlich alle 15,5 h teilen⁸, ermöglicht diese Methode das Filmen großer Teile des GSC-Zellzyklus. In Kombination mit anderen Werkzeugen hat unsere Kultivierungsmethode die Beschreibung der Spektrosomenmorphologie während des GSC-Zellzyklus und die Analyse der Dauer der verschiedenen Zellzyklusphasen in vivo ermöglicht⁸ (Abbildung 1C). Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll dieses erweiterten Live-Imaging-Verfahrens zur Verfügung, das durch ein Schritt-für-Schritt-Video unterstützt wird, das die Methodik beschreibt (Abbildung 2).

HINWEIS: Schritt 1.4 muss mindestens 2 Tage im Voraus durchgeführt werden. Die Schritte 2.1 und 2.2 können 1 Tag im Voraus durchgeführt werden.

1. Aufbau vor dem Versuch I

1. Bereiten Sie 100 μl Aliquots einer Streptomycin/Penicillin-Antibiotikamischung (10.000 μl/ml Penicilin und 10 mg/ml Streptomycin) vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
2. Bereiten Sie 15 ml der folgenden Lösungen mit autoklaviertem Reinwasser vor, lagern Sie sie bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb eines Monats: Natriumbicarbonat (NaHCO₃) 0,1 M pH 8,0 und 0,1 % Tween 20.
3. Bereiten Sie das folgende Kulturmedium und die Lösung in einer Laminar-Flow-Haube vor, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie sterilisierte Filterspitzen und -schläuche.
   1. Bereiten Sie 2 ml Aliquots unverdünntes fötales Rinderserum (FBS) vor und lagern Sie es bei -20 °C, bis es unter aseptischen Bedingungen verwendet wird.
   2. Bereiten Sie Schneider's Drosophila-Medium zu, das mit 15 % FBS und 0,6 % Streptomycin/Penicillin-Antibiotika-Mix ergänzt wird. 7 ml Aliquots vorbereiten und bei 4 °C lagern. Ein Aliquot reicht für zwei MatTek-Platten (siehe Abschnitt 2).
      1. Bereiten Sie die Ringer-Lösung vor (128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 4 mM MgCl₂, 35,5 mM Saccharose, 5 mM Hepes in autoklaviertem reinem Wasser; pH 6,9). Bereiten Sie 1 ml Aliquots vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei -20 °C.
4. Sammeln Sie 1-2 Tage alte Fliegen, die das mit GFP fusionierte Par-1-Protein konstitutiv und ubiquitär exprimieren (Poly Ubiquitin-mGFP6::p ar-1-Linie), in ein neues Röhrchen mit Fliegenfutter, das mit Hefepulver ergänzt wird. Kultivieren Sie sie 2 Tage lang bei 25 °C in einem Inkubator, bevor Sie sie sezieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann mit jedem fluoreszierend markierten Reporter von Interesse durchgeführt werden.

2. Beschichtung und Vorbereitung der Glasbodenplatte

1. Geben Sie einen 3 μL-Tropfen eines speziellen Cell-Tak-Klebstoffs (im Folgenden als Zell- und Gewebekleber bezeichnet) in die Mitte des Deckglases einer 35 mm Poly-D-Lysin-beschichteten Platte (Glasbodenschale, siehe Materialtabelle) ohne manuelles Verteilen. Verwenden Sie sterile Spitzen.
   HINWEIS: Der Zell- und Gewebekleber sollte bei 4 °C gelagert werden. Bei Experimenten mit zwei genetischen Bedingungen (typischerweise Kontroll- und Mutantenbedingungen) werden zwei einzelne, gut voneinander getrennte Tropfen des Klebstoffs in dieselbe Glasbodenplatte gegeben. Dadurch wird sichergestellt, dass beide genetischen Hintergründe unter den gleichen Bedingungen abgebildet werden.
2. Geben Sie unmittelbar danach ein gleiches Volumen (3 μl in diesem Protokollaufbau) von 0,1 M NaHCO₃ pH 8,0 vorsichtig in den 3 μl Klebetropfen, wie vom Hersteller empfohlen, und mischen Sie es durch Pipettieren.
3. Für eine vollständige Verdunstung die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubieren und dann über Nacht bei 4 °C aufbewahren, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Alternativ können Sie die vorbereitete Platte bei 37 °C 25 Minuten lang bis zur vollständigen Verdampfung inkubieren und direkt zum nächsten Schritt übergehen. Pflegen Sie in beiden Fällen die Platte mit ihrer Abdeckung. Verwenden Sie sterile Spitzen.
4. Lassen Sie die vorbereitete Glasbodenschale RT erreichen, indem Sie sie vor Gebrauch 15-20 Minuten auf die Bank stellen.
5. Waschen Sie den vorbereiteten Teller 3 Mal sorgfältig. Vermeiden Sie es, die Klebeschicht(en) zu berühren und zu stören. Fügen Sie bei jeder Wäsche 6 μl autoklaviertes Reinwasser hinzu und entfernen Sie das Wasser dann mit einer sauberen Spitze für jede der drei Wäschen, um Rückstände der NaHCO_3-Lösung zu entfernen.
6. Lassen Sie das Wasser vollständig verdunsten, indem Sie die saubere und vorbereitete Platte unter RT stellen und 5-10 Minuten lang mit aufgesetztem Deckel präparieren, um Staubpartikel zu vermeiden.

3. Drosophila-Ovarialdissektion und Isolierung und Montage von Ovariolen

HINWEIS: Die Eierstockdissektion wird in Ringer-Lösung (anstelle von Schneiders Medium) ohne FBS durchgeführt, um das Vorhandensein von Proteinen zu verhindern, die das Anhaften des Probengewebes am Klebstoff beeinträchtigen könnten.

1. Reinigen Sie eine Disparierschale mit drei Vertiefungen, eine Pinzette und Präpariernadeln mit 70 % Ethanol, bevor Sie beginnen.
2. Geben Sie in jede der drei Vertiefungen ein ausreichendes Volumen (~200 μL) Ringer-Lösung.
3. Präparieren Sie die Eierstöcke von 5 mit Hefe gefütterten Weibchen in 200 μl Ringer-Lösung in der ersten Vertiefung mit Hilfe von zwei Pinzettenpaaren nach den üblichen Verfahren^10,11. Fassen Sie das Drosophila-Weibchen an der Schnittstelle von Brustkorb und Bauch mit einer der Pinzetten. Reißen Sie dann vorsichtig die Nagelhaut am hinteren Bauch ab und ziehen Sie an der Nagelhaut des Bauches, bis die beiden Eierstöcke freiliegen.
4. Übertragen Sie die präparierten Eierstöcke in die zweite Vertiefung, um die Kontamination mit Resten anderer Gewebe oder Ablagerungen aus der Sektion zu reduzieren.
5. Entfernen Sie die Muskelhülle von 15-20 Eierstöcken mit Hilfe eines Stereomikroskops (Zoom 8X-13,5X) mit Leuchtdiodenbeleuchtung (LED) und Feinpunktzange. Verwenden Sie eine Pinzette, um den gesamten Körper des Eierstocks zu verankern, und verwenden Sie die zweite, um eine Eikammer im späten Stadium sanft zu greifen und sanft zu dehnen, bis der Muskel bricht und zurückbleibt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine Schädigung der Germaria zu vermeiden, indem der Kontakt mit diesem Teil der Eierstöcke reduziert wird. Entfernen Sie Eikammern, die älter als die Stadien 8-9 sind.
6. Übertragen Sie die 15-20 muskelscheidenfreien Ovariolen nacheinander mit der Pinzette in die dritte Vertiefung mit 200 μl Ringer-Medium.
7. Befeuchten Sie eine 20-200 μl Spitze durch Pipettieren mit 0,1 % Tween 20. Dadurch wird die Adhäsion der Eierstöcke an den Kunststoffwänden der Spitze verhindert.
8. 6 μl der Ringer-Lösung, die die muskelscheidenfreien Ovariolen enthält, werden mit einer vorbenetzten Spitze auf die vorbereitete Klebeplatte (bei RT aufbewahrt) übertragen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen der Spitze und der Klebeschicht, um eine Ablösung der Keime nach der Ovariolenablagerung zu verhindern (nächster Schritt). Etwa 30% der Germarien haften nicht wie erwartet.
9. Um sicherzustellen, dass die übertragenen Ovariolen auf der Klebefläche haften, drücken Sie sie mit einer Präpariernadel oder Pinzette vorsichtig bis zum Boden des Ringer-Tropfens, bis sie die Klebefläche berühren.
   HINWEIS: Versuchen Sie nicht, die Eierstöcke neu anzuordnen, sobald sie sich gesetzt haben.
10. Füllen Sie die MatTek-Platte vorsichtig mit 3 ml Schneider-Medium, ergänzt mit der Antibiotikamischung aus 15 % FBS und 0,6 % Streptomycin/Penicillin (Schritt 1.3). Um das Ablösen der Eierstöcke zu verhindern, geben Sie langsam 1 ml auf einmal um den äußeren Rand der Platte herum.
11. Transportieren Sie die Platte mit den muskelscheidenfreien Ovariolen auf einer ebenen Fläche zur Mikroskopstation.

4. Live-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop

1. Setzen Sie die Platte auf das 63x-Objektiv eines Spinning-Disk-Mikroskops oder eines Konfokalmikroskops (ähnliche Geräte können verwendet werden) und fokussieren Sie die Probe. Wählen Sie die mittlere Z-Ebene für jedes Germarium aus.
2. Konfigurieren Sie die folgenden experimentellen Parameter: Aufnahmetyp: 3D-Zeitraffer, Einstellung der Laserleistung von 70/100, Anregungswellenlänge: 488 nm, Bereich des Z-Stapels: 30 μm und Abstand zwischen den Z-Stapeln: 1,2 μm, Dauer: 17 h, Intervall zwischen den Zeitpunkten: alle 10 min.
3. Falls verfügbar, definieren Sie mit einer Option für mehrere Positionen die XY-Koordinaten der Samples neu und wählen Sie eine Z-Ebene in der Mitte jedes Germariums, da die Z-Stapel in dieser Position zentriert werden. Starten Sie die Akquise.
   HINWEIS: Da die normale Breite eines Germariums 30 μm beträgt, besteht jeder Z-Stapel aus ~25-27 Abschnitten. Je nach Konfokal können innerhalb der 10-Minuten-Intervalle mindestens 25 Germarien abgebildet werden. Normalerweise werden planapokorrigierte Objektive mit 40x/1,30 NA oder 63x/1,40 NA Ölimmersion verwendet.
4. Analysieren Sie die Bilder in der Zeit und auf der Z-Achse, um spezifische Änderungen in der Spektrosomenmorphologie mit der Software Imaris oder ImageJ (Fidschi) zu visualisieren^12,13. Spezifische Zeiten ihrer Beobachtung werden angezeigt (Abbildung 1B"). Um die Filme zu mounten, wählen Sie manuell die beste Z-Ebene zu jedem Zeitpunkt aus.

Mit diesem erweiterten Live-Imaging-Protokoll können wir die asymmetrische Mitose von weiblichen GSCs in ihrer Nische ohne offensichtliche biologische Störungen aufzeichnen. Zu diesem Zweck verwenden wir Germaria, die ubiquitär das GFP::P ar-1-Protein exprimiert, das zwischen fünf verschiedenen Spektrosomenmorphologien im GSC-Zellzyklus unterscheidet: Round, Plug, Bar, Fusing und Exclamation point (Abbildung 1B,C). In einer detaillierteren Beschreibung haben wir beobachtet, dass das starke GFP:Par1-Signal des Round-G2-Spektrosoms (Abbildung 1C, Panel a) während der G2-M-G1-Phasen drastisch reduziert ist. Wichtig ist, dass die Verwendung dieser transgenen Linie auch die Visualisierung des GSC-Eintritts in die Mitose ermöglicht, da der größte Teil des GFP::P ar-1 das Spektrosom verlässt und das Zytoplasma während der frühen Prophase füllt (Abbildung 1C, Tafel b). Darüber hinaus ermöglicht das zytoplasmatische GFP::P ar-1 die präzise Detektion der Kernhüllenpermeation (NEP) step8,14, da das GFP-Signal genau zu diesem Zeitpunkt in das Nukleoplasma eintritt (Abbildung 1C, Panel b). Nach der Mitose und der Reformation der Kernhülle wird das GFP:Par1-Signal allmählich im Round-G1-Spektrosom wiederhergestellt (Abbildung 1C, Feld c). Die De-novo-Zugabe des GFP:Par1-Materials zum Round-G1-Spektrosom fördert die Bildung der Spektrosomenmorphologien Plug (Abbildung d), Bar (Abbildung 1C, Panel e) und Fusing (Abbildung 1C, panel f). Schließlich ermöglicht der GFP:Par1-Marker die Visualisierung des Ausrufezeichen-Spektrosoms (Abbildung 1C, Panel e) als Folge der Bildung des Mittelkörpers, einer mikrotubulireichen proteinhaltigen Struktur, die während der Zytokinese zusätzlich zum kontraktilen Aktomyosinring gebildet wird.

Abbildung 1: Dynamik des Spektrosomenzyklus in lebenden GSCs. (A) Schematische Darstellung der Nische der Keimbahnstammzelle (GSC), die aus terminalen Filamentzellen (TFCs, in blau), der Übergangszelle (TC, in rot), Kappenzellen (CpCs, in violett) und Begleitzellen (ECs, in grau) besteht. Die GSCs (in gelb) enthalten eine charakteristische Organelle, die als Spektrosom (in grün) bezeichnet wird. Während des GSC-Zellzyklus wechselt das Spektrosom von einer kugelförmigen Form zu einer länglichen und dann wieder zu einer Kugel. Das GSC teilt sich, um eine Tochterzelle, den Zystoblasten (CB, in orange), zu erzeugen, der den Kontakt zur Nische verliert und ebenfalls ein sphärisches Spektrosom enthält. Das CB teilt vier aufeinanderfolgende, synchrone Zeiten mit unvollständiger Zytokinese, um eine 2-, 4-, 8- und 16-zellige Zyste zu erzeugen, die durch das Fusom miteinander verbunden sind. (B) Diagramm, das die verschiedenen Spektrosomenformen darstellt, die während des Zellzyklus erzeugt werden. (B') Erwartete Zeit für die Beobachtung von Spektrosomenmorphologien. (C) Zeitpunkt-Bilder eines 17 h langen Films, der das GFP::P ar-1-Signal in der GSC-Nische zeigt. Die Zeit 0 min (0') entspricht der Nuclear Envelope Permeabilization (NEP). Das Panel zeigt fünf verschiedene Spektrosomenmorphologien (weiße und grüne Pfeilspitzen): Rund (sowohl in G2 als auch in G1; Panel a und c), Plug (Panel d), Bar (Panel e), Fusing (Feld f) und Ausrufezeichen (Panel e, grüne Pfeilspitze). Die letztgenannte Spektrosommorphologie gehört zur zweiten GSC (grün gestrichelte Linie), die bei 70' dargestellt ist. GSCs werden durch gelbe und grüne gestrichelte Linien begrenzt. Die sich nach der Unterteilung des GSC ergebenden Bescheinigenden Stellen sind durch orange gestrichelte Linien abgegrenzt. Maßstabsstab: 10 μm. Die Tafeln A und B wurden mit Genehmigung von Villa-Fombuena et al.8 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Montagemethode von Cell-Tak-Adhäsiven für die erweiterte Live-Bildgebung von Drosophila germaria. (1) Schritt für Schritt die Glasbodenschale mit dem Kleber vorbereiten. (2) Überblick über die Dissektion der Eierstöcke von Drosophila in Ringer-Lösung und die individuelle muskelfreie Ovariolenvorbereitung. (3) Übertragen Sie die Eierstöcke ohne Muskelhülle in die Glasbodenschale. (4) Füllen Sie die Glasbodenschale mit zugesetztem Schneider's Medium. (5) Aufnahme der Germaria für 10 bis 16 Stunden mit einem inversen Konfokalmikroskop. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Villa-Fombuena et al.8 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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